ES2321067T3 - Bibliotecas quimicas de autoensamblaje codificadas (esachel). - Google Patents

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Abstract

Una biblioteca química que comprende productos de reacción de combinación de al menos dos compuestos químicos, comprendiendo cada uno de estos compuestos químicos: a) un resto químico (p,q) potencialmente capaz de realizar una interacción de fijación con una sola molécula diana; b) un oligonucleótido (b,b'') una parte del cual es un resto de autoensamblaje (m,m''); estando unidos los compuestos químicos uno a otro por los restos de autoensamblaje (m,m'') de sus oligonucleótidos (b,b'') caracterizada porque el producto de la reacción de combinación es estable en ausencia de dicha molécula diana, en donde los oligonucleótidos (b,b'') de cada uno de los compuestos químicos comprenden una secuencia codificante variable única (b2,b2'') que codifica individualmente la identificación del resto químico particular (p,q).

Description

Bibliotecas químicas de autoensamblaje codificadas (ESACHEL).
Problema a resolver
El aislamiento de moléculas de unión específicas (v.g. moléculas orgánicas) es un problema fundamental en la química, la biología y las ciencias farmacéuticas. Típicamente, millones de moléculas tienen que cribarse, con objeto de encontrar un candidato adecuado. La preparación de bibliotecas muy grandes de moléculas orgánicas es típicamente engorrosa. Además, la complejidad asociada con la identificación de moléculas de unión específicas a partir de un cúmulo de candidatos aumenta con el tamaño de la biblioteca química a cribar.
Solución
En esta invención, se utilizan bibliotecas de autoensamblaje de moléculas orgánicas (que forman típicamente dímeros, trímeros o tetrámeros), en las cuales las moléculas orgánicas están enlazadas a un oligonucleótido que media el autoensamblaje de la biblioteca y/o proporciona un código asociado a cada resto de unión. La biblioteca resultante puede ser muy grande (dado que se origina por el autoensamblaje combinatorio de sub-bibliotecas menores). Después de la captación de las especificidades de unión deseadas en la diana de interés, el "código de unión" puede ser descodificado por cierto número de técnicas experimentales (v.g. hibridación en chips de DNA o por una técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) modificada seguida por secuenciación).
Introducción
El aislamiento de moléculas de unión específicas (v.g., moléculas orgánicas) es un problema fundamental en la química, la biología y las ciencias farmacéuticas. Por ejemplo, la gran mayoría de los fármacos aprobados por la Administración de Alimentos y Fármacos de EE.UU. son ligantes específicos de dianas biológicas que caen en una de las categorías siguientes: enzimas, receptores o canales iónicos. La unión específica a la diana biológica no es suficiente per se para convertir una molécula de unión en un fármaco, dado que está generalmente reconocido que otras propiedades moleculares (tales como comportamiento farmacocinético y estabilidad) contribuyen a la eficiencia de un fármaco. Sin embargo, el aislamiento de ligantes específicos contra una diana biológica relevante representa típicamente el punto de partida en el proceso que conduce a un nuevo fármaco [Drews J. Drug discovery: A historical perspective. Science (2000) 287: 1960-1964].
La capacidad para generar rápidamente ligantes específicos contra las dianas biológicas de interés sería inestimable también para una diversidad de aplicaciones químicas y biológicas. Por ejemplo, la neutralización específica de un epítope particular de la proteína intracelular de elección puede proporcionar información en cuanto al papel funcional de este epítope (y por consiguiente de esta proteína). En principio, el uso de anticuerpos monoclonales específicos para un epítope dado puede proporcionar el mismo tipo de información [Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. (1994) 12:433-455]. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos no atraviesan fácilmente la membrana celular y tienen que introducirse artificialmente en la célula de interés. En principio, los anticuerpos intracelulares pueden expresarse también en células diana por suministro direccionado de genes (v.g., por transfección de células con DNA que dirige la expresión del anticuerpo). En este caso, el anticuerpo a menudo no se pliega, dado que el medio reductor intracelular no permite la formación de los enlaces disulfuro que contribuyen a menudo de manera esencial a la estabilidad de los anticuerpos [Desiderio A, Franconi R, Lopez M, Villani ME, Viti F, Chiaraluce R, Consalvi V, Neri D, Benvenuto E. A semi-synthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a single-framework scaffold. J Mol Biol. (2001) 310: 603-615]. Moléculas ligantes de afinidad alta susceptibles de síntesis química pueden proporcionar una alternativa valiosa a la tecnología de anticuerpos.
En Química y Ciencias de Materiales, el aislamiento fácil de moléculas de fijación específicas puede utilizarse para propósitos tan diversos como la generación de biosensores, la aceleración de reacciones químicas, el diseño de materiales con nuevas propiedades, y la captura/separación/inmovilización selectiva de moléculas diana.
La generación de grandes repertorios de moléculas (v.g., por química combinatoria; Otto S, Furlan RL, Sanders JK. Dynamic combinatorial chemistry. Drug Discov Today. (2002) 7: 117-125), acoplada con metodologías de cribado ingeniosas, está reconocida como una vía importante para el aislamiento de especificidades de fijación deseadas. Por ejemplo, la mayoría de las grandes compañías farmacéuticas tienen bibliotecas químicas patentadas, a las que acuden con objeto de la identificación de compuestos guía. Estas bibliotecas pueden ser tan grandes como > 1 millón de miembros y sin embargo, en algunos casos, no proporcionan las especificidades de fijación de interés [Böhm HJ, Stahl M. Structure-based library design: molecular modeling merges with combinatorial chemistry. Current Opinion in Chemical Biology (2000) 4: 283-286]. El cribado de bibliotecas que contienen millones de compuestos puede requerir no sólo métodos de síntesis muy sofisticados, sino también máquinas automáticas e infraestructura complejas para el almacenamiento, cribado y evaluación de los miembros de la biblioteca.
La generación de grandes repertorios macromoleculares (v.g., bibliotecas de péptidos o proteínas), junto con métodos biológicos y/o bioquímicos eficientes para la identificación de especificidades de fijación (tales como la presentación de fago [Winter, 1994], péptidos en plásmidos [Cull MG, Miller JF, Schatz PJ. Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the C terminus of the lac repressor. Proc Natl Acad Sci USA. (1992) 89: 1865-1869], presentación en ribosomas [Schaffitzel C, Hanes J, Jermutus L, Pluckthun A. Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J Immunol Methods. (1999) 231: 119-135], presentación en levadura [Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. (1997) 15: 553-557], la expression periplásmica con cribado citométrico [Chen G, Hayhurst A, Thomas JG, Harvey BR, Iverson BL, Georgiou G. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nat Biotechnol. (2001) 19:537-542], el cribado iterativo en filtro de colonias [Giovannoni L, Viti F, Zardi L, Neri D. Isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening. Nucleic Acids Res. (2001) 29: E27] etc.) pueden permitir el aislamiento de ligantes polipeptídicos valiosos, tales como anticuerpos monoclonales específicos, hormonas mejoradas y nuevas proteínas de fijación de DNA. En contraste con las bibliotecas químicas convencionales, las bibliotecas de proteínas en las realizaciones arriba mencionadas puede permitir el cribado eficiente de tantos como 1000-10.000 millones de miembros individuales, en la búsqueda de una especificidad de fijación de interés. Por una parte, la generación de bibliotecas de genes (v.g., la mutagénesis combinatoria de genes de anticuerpos; Winter, 1994; Viti F, Nilsson F, Demartis S, Huber A, Neri D. Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes. Methods Enzymol. (2000) 326:480-505) puede traducirse directamente en bibliotecas de proteínas, utilizando sistemas de expresión adecuados (v.g. bacterias, levaduras, células de mamífero). Adicionalmente, métodos tales como la presentación de fago producen partículas en las cuales un fenotipo (típicamente las propiedades de fijación de una proteína, presentada en la superficie de un fago filamentoso) está acoplado físicamente al genotipo correspondiente (es decir, el gen que codifica la proteína presentada en el fago) [Winter, 1994], permitiendo la fácil amplificación e identificación de miembros de fijación de la biblioteca con la especificidad de fijación deseada.
Sin embargo, aunque los métodos biológicos/bioquímicos para el aislamiento de biomacromoléculas de fijación específicas pueden proporcionar especificidades de fijación muy útiles, su alcance está limitado esencialmente a repertorios de polipéptidos o de ácidos nucleicos [Brody EN, Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J Biotechnol. (2000) 74:5-13]. Para algunas aplicaciones, no son ideales las biomacromoléculas de gran tamaño (tales como proteínas o DNA). Por ejemplo, aquéllas son a menudo inadecuadas para atravesar eficientemente la membrana celular, y pueden sufrir degradación hidrolítica in vivo.
En un intento de mimetizar los métodos biológicos/bioquímicos para la identificación de moléculas orgánicas con propiedades de fijación deseadas, de entre una biblioteca química, Brenner and Lerner [Brenner S, Lerner RA. Encoded combinatorial chemistry. Proc Natl Acad Sci USA. (1992) 89: 5381-5383] han propuesto el uso de bibliotecas químicas codificadas (ECL). En su invención, los autores concibieron un proceso de síntesis combinatoria paralela alternativa a fin de codificar miembros individuales de una gran biblioteca de productos químicos con secuencias nucleotídicas singulares. En particular, los autores proponían la síntesis combinatoria de compuestos químicos polímeros sobre un soporte sólido (v.g., una cuenta), donde un paso en la síntesis combinatoria iría seguido por la síntesis (en la misma cuenta) de una secuencia de DNA, para ser utilizada como una "marca de memoria" para las reacciones químicas realizadas sobre la cuenta. En aplicaciones típicas, cuentas codificadas con DNA se incubarían con una molécula diana (v.g., una proteína de relevancia farmacéutica). Después que la cuenta marcada con DNA que soporta la entidad química polímera se fija a la diana, debería ser posible amplificar la marca genética por replicación y utilizarla para el enriquecimiento de las moléculas fijadas por hibridación en serie a un subconjunto de la biblioteca. La naturaleza de la estructura química polímera unida al receptor podría descodificarse por secuenciación de la marca
nucleotídica.
El método ECL tiene la ventaja de introducir el concepto de "codificación" de un resto químico polímero particular, sintetizado sobre una cuenta, con una secuencia oligonucleotídica correspondiente, que puede ser "leída" y amplificada por PCR. Sin embargo, el método ECL presenta cierto número de inconvenientes. En primer lugar, se precisa una química general que permita la síntesis alternante de moléculas orgánicas polímeras (a menudo con propiedades de reactividad diferentes) y la síntesis de DNA sobre una cuenta. En segundo lugar, la síntesis, el tratamiento y el control de la calidad de grandes bibliotecas (v.g. > 1 millón de miembros individuales) sigue siendo una tarea formidable. De hecho, la utilidad del método ECL tiene que demostrarse todavía con ejemplos experimentales.
Por el documento US 5.573.905 se conoce una biblioteca química combinatoria codificada que comprende una pluralidad de moléculas bifuncionales de acuerdo con la fórmula A-B-C, donde A es un resto químico polímero, B es una molécula enlazadora que enlaza operativamente A y C, constituida por una longitud de cadena de 1 a aproximadamente 20 átomos y que comprende preferiblemente medios para fijación a un soporte sólido. C es un oligonucleótido identificador que comprende una secuencia de nucleótidos que identifica la estructura del resto químico. La fijación a un soporte sólido se prefiere especialmente cuando se sintetiza paso a paso el resto químico (un polímero constituido por subunidades X_{1-n}) y el oligonucleótido (construido por nucleótidos Z_{1-n} que codifican e identifican la estructura de las subunidades químicas del polímero). Se describen también las moléculas bifuncionales de la biblioteca, y métodos de utilización de la biblioteca para identificar estructuras químicas dentro de la biblioteca que se fijan a moléculas activas biológicas en interacciones de unión preseleccionadas. La utilización del código C para la identificación del polímero A y la fijación del código C al polímero A con una molécula enlazadora B permite que el polímero se identifique exactamente; sin embargo, la solución presentada en el documento US 5.573.905 (que es básicamente el mismo publicado por Brenner y Leer, 1992) se limita a este tipo especial de un resto químico. El hecho de que la síntesis individual tiene que llevarse a cabo para cada individuo de una biblioteca química está considerado como otra desventaja.
La química combinatoria dinámica se ha establecido en sí misma como una vía para el ensamblaje reversible (covalente o no covalente) de restos de unión, algunos de los cuales pueden estabilizarse por la presencia de una molécula diana (v.g., un proteína diana), permitiendo así la recuperación del complejo estabilizado [Ramström y Lehn (2002) "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries". Nature Reviews Drug Discovery, vol. 1, página
26-36].
El documento DE 19 619 373 describe una estrategia para la implementación de bibliotecas químicas combinatorias dinámicas, basada en el ensamblaje reversible de cadenas de oligonucleótidos (o análogos), estando modificada químicamente cada cadena con una entidad química polímera o monómera y siendo capaz de formar heterodúplex. Se ha comunicado que el ensamblaje y desensamblaje de oligonucleótidos modificados químicamente es esencial hasta que una molécula diana (v.g., una proteína diana o "sustrato") estabiliza ciertos ensamblajes supramoleculares. En una implementación típica de la tecnología, se utiliza un oligonucleótido largo (modificado químicamente) para dirigir el auto-ensamblaje transitorio con nucleótidos más cortos (modificados químicamente) formando heterodúplex reversibles con porciones distintivas del oligonucleótido largo. Típicamente, se utilizan las mismas secuencias de oligonucleótidos para compuestos químicos diferentes, dado que esto asegura las tendencias de rebarajadura equivalentes de los diferentes miembros de la biblioteca. Sin embargo, la tecnología descrita presenta los mismos problemas que la mayoría de las bibliotecas químicas combinatorias dinámicas, es decir, la difícil identificación de complejos de fijación (particularmente cuando se utilizan bibliotecas grandes). El documento WO 00/23458 describe una modificación de técnicas de química combinatoria convencionales de división y agrupación (limitadas normalmente a compuestos sobre cuentas). El vehículo para la síntesis de un compuesto químico polímero (o al menos modular) es una cadena larga de DNA que se caracteriza por la presencia simultánea de un sitio para el crecimiento del compuesto químico polímero y secuencias específicas de oligonucleótidos (separadas por regiones enlazadoras) que permiten la purificación específica y ortogonal de compuestos intermedios de síntesis en resinas que llevan una secuencia oligonucleotídica complementaria. Los intermedios de síntesis diferentes resultantes, que llevan códigos de oligonucleótidos diferentes, pueden modificarse químicamente con un monómero en un sitio específico de reacción y agruparse luego. El ciclo puede repetirse, permitiendo con ello el crecimiento de una estructura química codificada polímera (o al menos modular) enlazada al DNA. Esta estructura sintética se presta por sí misma a "barajadura del DNA" y nueva síntesis para estrategias selectivas de evolución dirigidas. Su diseño inherente limita esta estrategia a compuestos químicos polímeros (o al menos modulares), cuya síntesis no interfiere con la presencia simultánea de un oligonucleótido. El mismo límite es aplicable a cada compuesto en la biblioteca que requiere o bien la pre-síntesis o la síntesis creciente de moléculas de DNA individuales (a saber, 10^{6} moléculas de DNA para 10^{6} compuestos químicos). Debido a la longitud del oligonucleótido de DNA que soporta la estructura química, son de esperar problemas en su síntesis y durante la selección con moléculas diana. DE 197 41 716 describe un sistema de reconocimiento constituido por al menos una pareja de fijación inmovilizada A (capaz de fijarse al menos a B) y al menos una pareja de fijación B (capaz de fijarse a la pareja de fijación A). Se describe la marcación de moléculas individuales con marcadores oligonucleotídicos individuales (de modo análogo a lo que se describió previamente en US 5.573.905 o se ha publicado [Sano T, Smith CL, Cantor CR. (1992) Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science, vol. 258, páginas 120-122]), a fin de facilitar la identificación de moléculas marcadas enriquecidas por medio de dispositivos electroquímicos, que llevan oligonucleótidos complementarios al "lector". Por ejemplo, se propone la marcación de anticuerpos individuales con oligonucleótidos distintivos como un método para la detección de una reacción de fijación selectiva.
US 5.573.905 describe dos síntesis combinatorias paralelas alternativas, tales que un marcador genético está enlazado químicamente a una estructura química polímera que se sintetiza. En este método, la adición (típicamente en una cuenta) de una unidad química (v.g. un aminoácido) va seguida por la adición de una secuencia oligonucleotídica, que funciona como identificador para la estructura del compuesto polímero. Se acumula una biblioteca por el proceso repetitivo después de la agrupación y división de los productos de reacción obtenidos en cada paso. Las limitaciones de este método comprenden que el tamaño de la biblioteca que puede sintetizarse y utilizarse está restringido al número de cuentas requeridas para la síntesis, siendo necesaria al menos una cuenta-compuesto para una selección con éxito. La "codificación" de estructuras químicas polímeras es aplicable únicamente por síntesis químicas alternativas.
Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un compuesto químico que comprende un resto químico de cualquier clase capaz de realizar una interacción de fijación con una molécula diana (v.g. una diana biológica) y que comprende adicionalmente un oligonucleótido o análogo funcional del mismo, compuesto químico que no precisa ser sintetizado individualmente a fin de construir una biblioteca química.
Este objeto se cumple de acuerdo con un primer aspecto por la combinación de características de la reivindicación independiente 1, que define una biblioteca química que comprende productos de reacción de combinación de al menos dos compuestos químicos, comprendiendo cada uno de estos compuestos químicos:
a)
un resto químico (p,q) potencialmente capaz de realizar una interacción de fijación con una molécula diana simple;
b)
un oligonucleótido (b,b'), una parte del cual es un resto de autoensamblaje (m,m');
uniéndose los compuestos químicos uno a otro por los restos de autoensamblaje (m,m') de sus oligonucleótidos (b,b'). La biblioteca química de acuerdo con la invención se caracteriza porque el producto de la reacción de combinación es estable en ausencia de dicha molécula diana, en donde los oligonucleótidos (b,b') de cada uno de los compuestos químicos comprenden una secuencia codificante variable y única (b2,b2') que codifica individualmente la identificación del resto químico particular (p,q).
Aspectos y características adicionales de la presente invención se deducen de las reivindicaciones dependientes.
Sumario de la invención
En la presente invención, los autores exponen que una contribución fundamental a la generación (y el cribado) de bibliotecas químicas muy grandes puede conseguirse por el "autoensamblaje" de moléculas codificadas. En particular, los inventores razonaron que el autoensamblaje (v.g., por homodimerización, heterodimerización o multimerización) de entidades químicas marcadas con DNA podría representar una vía para la generación fácil de bibliotecas químicas muy grandes marcadas con DNA, a partir de bibliotecas químicas marcadas con DNA más pequeñas. Por ejemplo, el autoensamblaje (heterodimerización) de dos bibliotecas que contuvieran 1000 miembros podría producir un millón de combinaciones diferentes, es decir, un millón de entidades químicas diferentes. Particularmente, la homo- o heterotrimerización de bibliotecas codificadas que contuvieran mil miembros marcados con DNA produciría una biblioteca que contuviera 1000 millones de combinaciones, es decir entidades químicas marcadas con DNA diferentes. Así pues, la presente invención proporciona una biblioteca química que comprende productos de reacción de combinación de al menos dos compuestos químicos que comprenden un resto químico de cualquier clase capaz de producir una interacción de fijación con una molécula diana (v.g. una diana biológica) y que comprenden adicionalmente un oligonucleótido o análogo funcional del mismo que puede sintetizarse por separado y acoplarse luego conjuntamente. El o los derivados químicos resultantes del oligonucleótido puede ensamblarse ulteriormente con otros compuestos similares para generar estructuras de orden superior y bibliotecas codificadas de compuestos.
Para propósitos de ilustración, se representa una realización particular de la presente invención en la Figura 1. Se sintetizan dos sub-bibliotecas químicas por modificación química del extremo 3'y el extremo 5', respectivamente, de oligonucleótidos capaces de formación de dúplex y que llevan "marcadores de secuencia" distintivos (asociados con el [y por consiguiente "codificantes del"] resto químico unido a su extremo). La biblioteca química autoensamblada codificada resultante (ESACHEL) puede ser muy grande (dado que se origina por el autoensamblaje combinatorio de dos bibliotecas más pequeñas) y puede cribarse respecto a fijación a una diana biológica (v.g., una proteína de interés farmacéutico). Aquellos miembros de la biblioteca que exhiben especificidades de fijación adecuadas pueden ser capturados con la diana de interés (por ejemplo, utilizando una diana inmovilizada sobre un soporte sólido). Su código genético, que codifica la entidad química responsable de la especificidad de fijación de interés, puede recuperarse utilizando varios métodos ingeniosos, que se describen en la sección "Descripción de la Invención" (véase más adelante).
Definiciones Específico
Este término puede utilizarse para hacer referencia a la situación en la que un miembro de un par de fijación específico no exhibirá fijación significativa alguna a moléculas distintas de su(s) pareja(s) de fijación específica(s). En general, la especificidad está asociada con una diferencia significativa en afinidad de fijación, con relación a las dianas "inespecíficas". El término es aplicable también donde p.ej. un miembro de fijación es específico para una superficie particular en la molécula diana (designada en lo sucesivo "epítope"), en cuyo caso el miembro de fijación específico con esta especificidad será capaz de fijarse a diversas moléculas diana que lleven el epítope.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Una realización simple de la tecnología ESACHEL:
En una realización simple de la tecnología ESACHEL, se sintetizan dos sub-bibliotecas químicas por modificación química individual del extremo 3'y el extremo 5', respectivamente, de oligonucleótidos susceptibles de formación parcial de heterodúplex y que llevan "marcadores de secuencia" distintivos (asociados con [y por consiguiente "codificantes de"] los restos químicos p y q fijados a su extremo). La biblioteca química autoensamblada codificada resultante (ESACHEL) puede ser muy grande (dado que se origina para el autoensamblaje combinatorio de dos bibliotecas más pequeñas) y puede cribarse respecto a fijación a una diana biológica (v.g., una proteína de interés farmacéutico). Aquellos miembros de la biblioteca que exhiben especificidades de fijación adecuadas pueden ser capturados con la diana de interés (por ejemplo, utilizando una diana inmovilizada sobre un soporte sólido). Su código genético, que codifica la entidad química responsable de la especificidad de fijación de interés, puede recuperarse luego utilizando varios métodos ingeniosos.
Figura 2: Generación del diseño ESACHEL:
Los ingredientes principales de la tecnología ESACHEL son compuestos químicos, que comprenden un resto oligonucleotídico (típicamente una secuencia de DNA) enlazado a un dominio de oligomerización [capaz de mediar la (homo- o hetero-)dimerización, trimerización o tetramerización de los compuestos químicos], enlazado a una entidad química, que puede estar implicada en una interacción de fijación específica con una molécula diana. Parte de la secuencia del resto oligonucleotídico se asociará exclusivamente con la entidad química (actuando por tanto como un "código"). El dominio de oligomerización y el código pueden ser porciones distintas de la misma molécula (típicamente un oligonucleótido).
Figura 3: El autoensamblaje de compuestos químicos ESACHEL individuales puede proporcionar bibliotecas combinatorias de gran tamaño:
En una realización práctica de la tecnología ESACHEL, un número n de compuestos químicos diferentes, que llevan un resto reactivo con tiol (v.g., un grupo maleimido o un grupo yodoacetamido), se hacen reaccionar (en reacciones separadas) con n oligonucleótidos de DNA diferentes, que llevan un grupo tiol en el extremo 3'. La agrupación correspondiente de n conjugados se indica en la Figura como "agrupación A". Análogamente, un número n de compuestos químicos diferentes, que llevan un resto reactivo con tiol (v.g., un grupo maleimido o un grupo yodoacetamido), se hacen reaccionar (en reacciones separadas) con m oligonucleótidos de DNA diferentes, que llevan un grupo tiol en el extremo 5'. La agrupación correspondiente de m conjugados se indica en la Figura como "agrupación B". Los miembros de la biblioteca autoensamblada resultantes corresponderán a m x n combinaciones.
Figura 4: Pueden conseguirse grandes tamaños de biblioteca por realizaciones ESACHEL, en las cuales los dominios de trimerización o dominios de tetramerización son secuencias de DNA que forman agrupaciones tríplex o cuádruplex:
Se sabe que ciertas secuencias de DNA son capaces de formar complejos trímeros estables o complejos tetrámeros estables. Por ejemplo, el apareamiento Hoogsten de tríplex de DNA podría producir el autoensamblaje de agrupaciones A x B x C, que contendrían n, m y l miembros, respectivamente. El ensamblaje tetramérico de conjugados DNA-(resto químico) proporcionaría tamaños de biblioteca mayores aún, partiendo de sub-bibliotecas A, B, C y D de pequeña dimensión.
Figura 5: Un método de descodificación ESACHEL:
los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A llevan entidades químicas en el extremo 3'. Hacia el extremo 3', la secuencia de DNA está diseñada para hibridarse a las secuencias de DNA en el extremo 5' de los oligonucleótidos de la sub-biblioteca B. La región de hibridación está interrumpida por un pequeño segmento. En la sub-biblioteca A, este pequeño segmento está compuesto convenientemente de una cadena principal de fosfodiéster sin bases (denominada espaciador b en la Figura); en la sub-biblioteca B, el segmento corto correspondiente tendrá una secuencia exclusiva para cada miembro de la sub-biblioteca (actuando por tanto como "código" para la sub-biblioteca B). En contraste, los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A tienen su código distintivo hacia el extremo 5'.
Después del "biopanning" (biolavado en batea), los oligonucleótidos de la sub-biblioteca B se mantienen reasociados de manera estable a los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A, y pueden operar como iniciadores para una reacción de DNA-polimerasa sobre el molde A. El segmento de DNA resultante, que lleva a la vez el código A y el código B, puede amplificarse (típicamente por PCR), utilizando iniciadores que se hibridan en los extremos constantes del segmento de DNA.
Figura 6: Un método general de descodificación ESACHEL:
La identidad de ligantes específicos, aislados de las sub-bibliotecas A y B que llevan restos químicos en los extremos de oligonucleótidos parcialmente asociados, se establece por hibridación con oligonucleótidos diana inmovilizados en uno o más chips. Tales chips están constituidos preferiblemente por pastillas de silicio con fragmentos de oligonucleótidos unidos. Por ejemplo, el chip A permitirá la lectura de la identidad (y frecuencia) de los miembros de la sub-biblioteca A, rescatados después de un experimento de "biopanning". Análogamente, el chip B permitirá la lectura de la identidad (y frecuencia) de los miembros de la sub-biblioteca B. En un primer paso, el método de descodificación representado en la figura no proporcionará información acerca del apareamiento del código A y del código B dentro de miembros de fijación específicos. Sin embargo, la descodificación en los chips A y B sugerirá componentes candidato de las sub-bibliotecas A y B, que se reasocian y se criban en una tanda de "biopanning" sucesiva. La fijación progresivamente severa a la diana se reflejará por una reducción en el número de miembros de A y B, identificados en el chip. Finalmente, las posibles combinaciones de los miembros candidato A y B se ensamblarán individualmente (o en agrupaciones más pequeñas), y se ensayarán respecto a fijación a la diana.
Figura 7: Un método basado en PCR para desconvolución ESACHEL:
Las sub-bibliotecas A y B forman un heterodúplex, flanqueado por secuencias singulares que codifican loas diferentes miembros de la biblioteca, y por segmentos de DNA constantes en los extremos. Después del "biopanning", los pares adecuados de iniciadores permitirán la amplificación por PCR de las dos cadenas, dando lugar a productos PCR cuya secuencia puede identificarse utilizando métodos estándar (v.g. por concatenación de los productos PCR, seguida por sub-clonación y secuenciación. Puede aplicarse un procedimiento de desconvolución (constituido por una o más tandas de "lavado en batea", seguidas por secuenciación y por la elección de un juego restringido de componentes de sub-biblioteca para el cribado ESACHEL siguiente), restringiendo el número de miembros candidato de ESACHEL capaces de proporcionar ligantes específicos después de auto-ensamblaje.
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Figura 8: Conversión de los ligandos ESACHEL en restos químicos unidos por enlaces covalentes:
En muchas realizaciones ESACHEL, los derivados químicos de oligonucleótidos de autoensamblaje estarán aislados en el extremo de una o más tandas de "lavado en batea". Para muchas aplicaciones, será deseable enlazar covalentemente entre sí los restos químicos responsables de la interacción con la molécula diana de interés. La longitud, rigidez, las propiedades químicas estereoelectrónicas y la solubilidad del enlazador influirán en la afinidad de fijación y la eficiencia de la molécula resultante.
Figura 9: Equilibrios químicos que contribuyen al efecto quelato:
El diagrama muestra los posibles estados de las interacciones entre un ligando bidentado (A-B) que se une a una molécula diana. En el estado nI, ambos restos A y B están unidos a sus bolsas de fijación respectivas. En los estados nII y nIII únicamente están unidos el resto A o el resto B, respectivamente. En el estado nIV, el compuesto A-B se ha disociado de la diana.
Se ha descrito un programa de ordenador para la evaluación aproximada de la contribución del efecto quelato al tiempo de residencia de A-B en la diana en condiciones de disociación irreversibles, como función de las constantes cinéticas de asociación y disociación de los restos A y B hacia sus bolsas de fijación respectivas, y de la longitud del enlazador entre A y B. La probabilidad de que un resto se disocie por unidad de tiempo se indica como p_{off}. La probabilidad de que un resto se una a una diana por unidad de tiempo se indica como p_{on}.
Figura 10: Ensamblaje de la molécula p con el repertorio molecular Q: El diagrama muestra la formación de heterodúplex entre un oligonucleótido, acoplado a un ligante de afinidad baja p, y una segunda clase de oligonucleótidos, que llevan entidades químicas q y códigos distintivos, capaces de identificar las moléculas q que dan lugar a sinergia con p respecto a la fijación a una molécula diana (v.g., una proteína diana).
Descripción de la invención
Los ingredientes principales de la tecnología ESACHEL son compuestos químicos, que comprenden un resto oligonucleotídico (típicamente, una secuencia de DNA) enlazado a un dominio de oligomerización [capaz de mediar la (homo- o hetero-)dimerización, trimerización o tetramerización de los compuestos químicos], enlazado a una entidad química, que puede estar implicada en una interacción de fijación específica con una molécula diana (Figura 2). Parte de la secuencia del resto oligonucleotídico se asociará únicamente con la entidad química (actuando por tanto como un "código"). En muchos casos, porciones del mismo oligonucleótido servirán como el dominio de oligomerización y como el código.
Resto oligonucleotídico
la naturaleza y el diseño de los restos oligonucleotídicos en la tecnología ESACHEL se comprende mucho mejor por la descripción del sistema "codificante", proporcionado en las secciones siguientes y en los Ejemplos. Como introducción, puede ser suficiente decir que, por asociación estable de entidades químicas con una secuencia oligonucleotídica singular (v.g., una secuencia de DNA o análogos de DNA), se proporciona a dicha entidad química un código único, que puede ser "leído" de una diversidad de modos (secuenciación, hibridación a chips de DNA, etc.) y que puede ser susceptible de amplificación (v.g., por el uso de la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]). Adicionalmente, utilizando métodos ingeniosos descritos más adelante, el código de un compuesto químico particular puede llegar a enlazarse físicamente con el código de otro u otros compuestos químicos, cuando estos compuestos químicos se asocian por medio de un dominio de oligomerización.
Dominios de oligomerización
Secuencias de DNA adecuadas (susceptibles de formación de heterodúplex, tríplex [Strobel SA, Dervan PB. Single-site enzymatic cleavage of yeast genomic DNA mediated by triple helix formation. Nature. (1991) 350:172-174] o cuádruplex [varios autores. Issue of Biopolymers (2000-2001), volumen 56(3)]), pueden considerarse como posibles dominios de oligomerización.
Alternativamente, pero no como parte de la presente invención, podría considerarse el uso de otros polipéptidos de autoensamblaje (v.g. hélices de péptidos anfipáticas tales como cremalleras de leucina). Podrían considerarse muchos más restos químicos como mediadores de restos oligómeros químicamente definidos. Por ejemplo, podrían contemplarse complejos de átomos metálicos con ligandos adecuados [tales como derivados de dipiridilo o tripiridilo]. Adicionalmente, podría imaginarse que una interacción no covalente pusiera en contacto compuestos químicos diferentes, que podrían reaccionar luego entre sí y llegar a asociarse covalentemente.
Algunas realizaciones prácticas de la tecnología ESACHEL
Con objeto de ilustrar una posible realización práctica de la tecnología ESACHEL, puede considerarse el ejemplo siguiente (representado en la Figura 3).
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Un número n de compuestos químicos diferentes, que llevan un resto reactivo (v.g. un grupo maleimido o yodoacetamido reactivo con tiol), se hacen reaccionar (en reacciones separadas) con n oligonucleótidos de DNA diferentes, que llevan un resto reactivo (v.g. un grupo tiol en el extremo 3'). La agrupación correspondiente de n conjugados se indica en la Figura como "agrupación A". Los oligonucleótidos de la agrupación A se diseñan de modo que tengan:
-
una porción de la secuencia de DNA que puede hibridarse a los compuestos de la agrupación B (véase la Figura 3 y los comentarios que siguen)
-
una secuencia de DNA distintiva para cada uno de los n miembros de la agrupación A
-
porciones adicionales de la secuencia de DNA diseñadas sensatamente para "descodificar" las combinaciones de fijación (opcional; véase más adelante en la sección acerca de "descodificación" y en los Ejemplos).
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Análogamente, un número m de compuestos químicos diferentes, que llevan un resto reactivo con tiol (v.g. un grupo maleimido o un grupo yodoacetamido), se hacen reaccionar (en reacciones separadas) con m oligonucleótidos de DNA diferentes, que llevan un grupo tiol en el extremo 5'. La agrupación correspondiente de m conjugados se indica en la Figura como "agrupación B".
Los oligonucleótidos de la agrupación B se diseñan de modo que tengan:
-
una porción de la secuencia de DNA que puede hibridarse a los compuestos de la agrupación A (véase la Figura 3)
-
una secuencia de DNA distintiva para cada uno de los m miembros de la agrupación B
-
porciones adicionales de la secuencia de DNA diseñadas sensatamente para "descodificar" las combinaciones de fijación (opcional).
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Las cadenas parcialmente complementarias de los conjugados de DNA de la agrupación A y la agrupación B pueden formar fácilmente heterodímeros en solución, con eficiencia comparable dentro de los n miembros diferentes de la agrupación A y los m miembros de la agrupación B. Si se utilizan relaciones estequiométricas adecuadas de los compuestos de la agrupación A y la agrupación B, los n tipos diferentes de compuestos de la agrupación A formarán heterodímeros con los m tipos diferentes de los compuestos de la agrupación B, produciendo una biblioteca química combinatoria autoensamblada de dimensión m x n. Por ejemplo, dos bibliotecas de miles de compuestos producirían millones de combinaciones diferentes. Adicionalmente, las m x n combinaciones autoensambladas resultantes llevarán códigos de DNA únicos, correspondientes a la asociación no covalente pero estable (heterodimerización) del código de DNA del miembro de la agrupación A con el código de DNA del miembro de la agrupación B.
Como alternativa al acoplamiento de entidades químicas a oligonucleótidos portadores de tiol, pueden considerarse cierto número de alternativas químicas estándar (v.g. oligonucleótidos que lleven un enlace fosfodiéster en un extremo, formando estructuras químicas tales como -O-P(O)_{2}-O-(CH_{2})_{n}-NH-CO-R, donde R puede corresponder a varias entidades químicas diferentes, y n puede variar entre 1 y 10).
Supóngase que un miembro particular de la biblioteca es capaz de fijarse de modo específico a una diana de interés (v.g. una proteína inmobilizada en una cuenta). Supóngase también que ambas cadenas A y B contribuyeran a la interacción de fijación específica (para una exposición del efecto quelato que puede facilitar esta fijación específica véase más adelante). Sería posible enriquecer preferentemente esta combinación particular de A y B en las m x n combinaciones (por ejemplo, por exposición de la biblioteca a la proteína diana en la cuenta, seguido por la separación física de la cuenta de la solución de la biblioteca, y seguido por lavado concienzudo de la cuenta, para reducir la cantidad de ligantes inespecíficos en la cuenta). La analogía de este procedimiento con los procedimientos de "biopanning" utilizado con las bibliotecas de anticuerpos en fago (Viti, 2000), sería evidente para cualquier persona con experiencia en la técnica.
El rescate de la combinación particular de A y B, que presentan la especificidad de fijación deseada, puede ir seguido a continuación por la identificación de las entidades químicas responsables de la fijación, por identificación de los códigos de DNA de las dos cadenas A y B [véase la sección posterior acerca de "descodificación" por una exposición de las estrategias posibles para la identificación de los códigos de DNA].
Para cierto número de aplicaciones, al final del procedimiento ESACHEL, puede ser deseable enlazar las dos entidades químicas A y B, responsables de la fijación específica a la diana (Figura 3). Puede desearse intentar una diversidad de enlazadores químicos diferentes, y evaluar si los compuestos químicos resultantes, derivados de las entidades químicas A y B, exhiben propiedades moleculares deseadas (v.g., afinidad alta para la diana, especificidad alta para la diana, estabilidad química adecuada, propiedades de solubilidad adecuadas, propiedades farmacológicas adecuadas, etc.). Por ejemplo, la longitud del enlazador químico entre A y B influirá espectacularmente en las propiedades de fijación del conjugado (para una exposición, véase la sección siguiente sobre el efecto quelato).
En el caso de la Figura 3, se utiliza una porción de DNA como dominio de heterodimerización, y se utiliza la formación de enlaces tioéter para el acoplamiento de oligonucleótidos de DNA a las entidades químicas de la biblioteca. Sin embargo, podrían considerarse otros dominios de oligomerización, así como otras vías químicas para el acoplamiento de entidades químicas al DNA.
Se conocen ciertas secuencias de DNA que son capaces de formar complejos trímeros estables [Strobel, 1991] o complejos tetrámeros estables [diversos autores, 2000-2001]. Por ejemplo, el apareamiento de Hoogsten de tríplex de DNA podría permitir el autoensamblaje de agrupaciones A x B x C, que contuvieran n, m y l miembros, respectivamente (Figura 4). El ensamblaje tetramérico de conjugados DNA-(resto químico) permitiría tamaños de biblioteca mayores aún, partiendo de sub-bibliotecas A, B, C y D de pequeña dimensión. Sin embargo, la descodificación de interacciones de fijación puede, en algunos casos, ser más difícil para bibliotecas codificadas autoensambladas trímeras y/o tetrámeras, en comparación con las bibliotecas dímeras. Adicionalmente, la longitud y flexibilidad de los enlazadores entre las cadenas de DNA y los restos químicos presentados en su extremo puede facilitar o dificultar la identificación de miembros de fijación específicos de la biblioteca química autoensamblada codificada (ESACHEL). Un cierto grado de flexibilidad puede permitir que restos químicos adecuados encuentren bolsas complementarias en la molécula diana (Figura 4). Por otra parte, la contribución de afinidad del efecto quelato se espera que disminuya con la longitud del enlazador.
Es digno de mención que, partiendo de sub-bibliotecas de 100 miembros, las bibliotecas trímeras ESACHEL podían contener 10^{6} miembros, mientras que las bibliotecas ESACHEL tetrámeras podrían contener 10^{8} miembros. Es fácil calcular el tamaño de biblioteca resultante, partiendo de sub-bibliotecas de diferente dimensión. La gran complejidad combinatoria de los compuestos químicos autoensambladores codificados puede permitir la identificación de miembros de fijación específica, que han escapado hasta ahora a la identificación utilizando métodos químicos combinatorios convencionales. Puede extraerse una analogía del campo de la tecnología de anticuerpos en fago, en la que se demostró que el tamaño de la biblioteca juega un papel crucial en el aislamiento de anticuerpos de afinidad alta.
Códigos ESACHEL y métodos de descodificación
En la tecnología ESACHEL, secuencias oligonucleotídicas singulares (típicamente, secuencias de DNA) proporcionan entidades químicas con un código único. ¿Cuántas secuencias diferentes se necesitan a fin de identificar los miembros de una biblioteca?.
Como se ha mencionado arriba, los componentes clave de la tecnología ESACHEL son compuestos químicos, que comprenden un resto oligonucleotídico (típicamente, una secuencia de DNA) enlazado a un dominio de oligomerización, enlazado a su vez a una entidad química. En la mayoría de los casos, el resto oligonucleotídico proporcionará también los dominios de oligomerización. Como consecuencia, en la mayoría de los casos, los componentes ESACHEL serán entidades químicas acopladas a oligonucleótidos de DNA seleccionados sensatamente. Típicamente, tales oligonucleótidos contendrán una parte constante y una parte variable (características exclusivamente de cada miembro de la biblioteca).
Considérese, como ejemplo, el caso ilustrado en la Figura 3, y expuesto en la sección "Algunas realizaciones prácticas de la tecnología ESACHEL" (véase arriba). En este ejemplo, una sub-biblioteca "A" (que contiene n compuestos fijados en el extremo 3' de los oligonucleótidos de DNA) está autoensamblada con una sub-biblioteca "B" (que contiene m compuestos unidos al extremo 5' de los oligonucleótidos). La sub-biblioteca A puede representarse por una secuencia de DNA de x bases, donde 4^{x} es mayor o igual que n. La sub-biblioteca B puede representarse por una secuencia de DNA de y bases donde 4^{y} es mayor o igual que m. En la mayoría de los casos (véase más adelante), la identificación del código de los miembros de la sub-biblioteca proporciona también información acerca de a qué sub-biblioteca pertenece un código particular (y por consiguiente un compuesto particular).
Podrían idearse un gran número de métodos de "descodificación" de los códigos ESACHEL. A continuación, se ilustran tres, que corresponden a requisitos experimentales diferentes y que demuestran la flexibilidad de la tecnología ESACHEL.
Considérese primeramente por simplicidad la realización ESACHEL de la Figura 3. Un diseño conveniente de oligonucleótidos, en los cuales están basadas las sub-bibliotecas A y B, se representa en la Figura 5. Los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A llevan entidades químicas en el extremo 3'. Hacia el extremo 3', la secuencia de DNA está diseñada de modo que se hibride a las secuencias de DNA en el extremo 5' de los oligonucleótidos de la sub-biblioteca B. La región de hibridación está interrumpida por un pequeño segmento. En la sub-biblioteca A, este pequeño segmento está compuesto convenientemente de una cadena principal de fosfodiéster sin bases (denominada espaciador d en la Figura); en la sub-biblioteca B, el segmento corto correspondiente tendrá una secuencia exclusiva para cada miembro de la sub-biblioteca (actuando por tanto como un "código" para la sub-biblioteca B). En contraste, los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A tienen su código distintivo hacia el extremo 5'.
Después del "biopanning", es deseable estudiar el código de los miembros de fijación que exhiben una especificidad de fijación deseada. Los oligonucleótidos de la sub-biblioteca B se mantienen reasociados de manera estable a los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A, y pueden operar como iniciadores para una reacción de DNA-polimerasa en el molde A. El segmento de DNA resultante, que lleva a la vez el código A y el código B, puede amplificarse (típicamente por PCR) utilizando iniciadores que se hibridan en los extremos constantes del segmento de DNA (Figura 5).
Si varios miembros de fijación específicos están aislados al final de un experimento de "biopanning", se generarán varios productos PCR con el proceso ilustrado en la Figura 5. Estos productos tendrán secuencias similares, excepto en lo que respecta a las regiones codificantes de los miembros de la sub-biblioteca A y B. Con objeto de estudiar más a fondo la abundancia relativa de los diferentes miembros de fijación específica, será conveniente crear concatenámeros (sic), partiendo de los diversos productos PCR en la mezcla de reacción. Tales secuencias concatenadas pueden "leerse" por secuenciación, revelando a la vez la identidad y la frecuencia de los pares de código A y código B (que corresponden únicamente a miembros particulares de la biblioteca).
Una estrategia de descodificación alternativa se representa en la Figura 6. Las sub-bibliotecas A y B llevan restos químicos en los extremos de oligonucleótidos parcialmente reasociados. En la mayoría de los casos, la porción de DNA que forma un heterodúplex se mantendrá constante en la biblioteca. Inversamente, los otros extremos estarán diseñados de una manera tal que se vea desfavorecida la formación de heterodúplex. Tales cadenas de DNA no apareadas estarán disponibles para hibridación con oligonucleótidos diana (por ejemplo, oligonucleótidos de DNA inmovilizados en uno o más chips). Por ejemplo, el chip A permitirá la lectura de la identidad (y frecuencia) de miembros de la sub-biblioteca A, rescatados después de un experimento de "biopanning". Análogamente, el chip B permitirá la lectura de la identidad (y frecuencia) de miembros de la sub-biblioteca B. Pueden considerarse una diversidad de estrategias (v.g., radiomarcación de DNA, biotinilación de DNA seguida por detección con reactivos basados en estreptavidina, etc.) para la visualización de la región de fijación en el chip.
En un primer paso, el método de descodificación de la Figura 6 no proporcionará información acerca del apareamiento del código A y del código B dentro de miembros de fijación específicos. Sin embargo, la descodificación en el chip A y B sugerirá componentes candidato de sub-bibliotecas A y B, para reasociación y cribado en una tanda sucesiva de "biopanning". La fijación cada vez más severa a la diana se reflejará por una reducción continua en el número de miembros de A y B identificados en el chip. Finalmente, las posibles combinaciones de los miembros candidato A y B se ensamblarán individualmente (o en agrupaciones más pequeñas) y se ensayarán respecto a fijación a la diana. Se hace referencia a esta estrategia iterativa como desconvolución.
Evidentemente, el método de descodificación de la Figura 6 es válido también para ESACHEL, cuando se autoensamblan bibliotecas para formar complejos trímeros o tetrámeros (v.g. utilizando varios tríplex o cuádruplex de DNA para la oligomerización de los compuestos). En estos casos, pueden utilizarse 3 ó 4 chips, respectivamente, que lleven oligonucleótidos diana distintivos para descodificación.
En caso apropiado, el DNA de los restos de fijación seleccionados de la Figura 6 puede amplificarse por PCR antes de la hibridación con el chip. En este caso, el diseño de oligonucleótidos se asemejará al descrito en el párrafo siguiente (véase también la Figura 7).
Otro posible método de descodificación se ilustra en la Figura 7. Las sub-bibliotecas A y B forman un heterodúplex, flanqueado por secuencias singulares que codifican los miembros diferentes de la biblioteca y por segmentos de DNA constantes en los extremos. Después del "biopanning", pares adecuados de iniciadores permitirán la amplificación por PCR de las dos cadenas, dando lugar a productos PCR cuya secuencia puede identificarse utilizando métodos estándar (v.g. por concatenación de los productos PCR, seguida por subclonación y secuenciación). Análogamente al método basado en chips que se ilustra en la Figura 6, el método de la Figura 7 no proporcionará, por regla general, información directa acerca del apareamiento del código A y el código B en miembros de fijación específicos. Sin embargo (análogamente a lo descrito para la Figura 6), puede aplicarse un procedimiento de desconvolución (consistente en una o más tandas de lavado en batea, seguidas por secuenciación y por la elección de un juego restringido de componentes de sub-biblioteca para el cribado ESACHEL siguiente), que restringen el número de miembros ESACHEL candidato capaces de proporcionar ligantes específicos después del autoensamblaje.
Construcción de bibliotecas
La construcción de las bibliotecas ESACHEL se ve facilitada no sólo por la gran dimensión que puede alcanzarse por auto-ensamblaje de sub-bibliotecas, sino también por la fácil generación y purificación de derivados químicos de oligonucleótidos de DNA.
Como se ha mencionado arriba, los oligonucleótidos de DNA, que llevan un grupo tiol en su extremo 3' o 5', pueden adquirirse de una diversidad de suministradores comerciales. La química de la modificación de los grupos tiol con reactivos que llevan grupos capaces de reaccionar tales como restos yodoacetamido o restos maleimido está perfectamente establecida [véase por ejemplo el catálogo de Molecular Probes en www.probes.com]. Adicionalmente, están disponibles en la bibliografía varios métodos para la modificación química de los extremos 3' o 5' de oligonucleótidos de DNA, por ejemplo durante procedimientos de síntesis en fase sólida.
Los derivados químicos de DNA (o de algunos análogos de DNA) tienen la propiedad característica de adquirir altas cargas negativas a pH neutro. Esto facilita el desarrollo de estrategias generales de purificación de los derivados de DNA. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio de aniones permite la inmovilización no covalente (pero estable) de oligonucleótidos de DNA (y sus derivados) sobre una resina, mientras que otros componentes de una mezcla de reacción pueden eliminarse por lavado. Los derivados de DNA pueden eluirse luego por cambio de tampón. Alternativamente, podían considerarse otros métodos de purificación (v.g. cromatografía en fase inversa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía con hidroxiapatito, etc.).
La disponibilidad de procedimientos de purificación aplicables de modo general para derivados de DNA hace que la síntesis de los componentes ESACHEL sea susceptible de automatización [por ejemplo utilizando un ordenador central basado en TECAN Genesys 200 (TECAN, Männedorf, Suiza), equipado con un sistema de manipulación de líquidos y un brazo de manipulación automático]. La automatización puede ser necesaria, a fin de crear sub-bibliotecas ESACHEL que contengan varios centenares de compuestos diferentes.
Las metodologías descritas en esta patente son válidas no sólo para moléculas orgánicas pequeñas, sino también para péptidos y proteínas oligómeras [v.g. fragmentos de anticuerpos Fv, constituidos por un dominio VH y un dominio VL; véase el Ejemplo 1). De hecho, la fijación de un heterodúplex de DNA en el término C de dominios VH y VL marcados con cisteína proporcionará una estabilización adicional al heterodímero Fv.
Experimentos de "biopanning"
El uso de ESACHEL para la identificación de ligantes específicos está basado en la incubación de los componentes ESACHEL con la molécula diana (v.g., una proteína de interés farmacológico), seguido por la separación física del complejo resultante de los componentes ESACHEL que no se han fijado a la diana. A este respecto, los experimentos ESACHEL de "biopanning" son análogos a experimentos de "biopanning" que pueden realizarse con bibliotecas de fago y/o bibliotecas de presentación de ribosoma, para los cuales están disponibles una extensa bibliografía y varios protocolos experimentales [Winter, 1994; Viti, 2000; Schaffitzel, 1999]. Por ejemplo, la separación física del complejo entre los miembros ESACHEL y la molécula diana de la agrupación de miembros ESACHEL no fijados podría conseguirse por inmovilización de la molécula diana de un soporte sólido (v.g. un tubo de plástico, una resina, cuentas magnéticas, etc.).
El efecto quelato
Algunas de las contribuciones de la tecnología ESACHEL para la identificación de ligantes específicos están relacionadas con un fenómeno químico, denominado el "efecto quelato". El término quelato fue aplicado por primera vez en 1920 por Sir Gilbert P. Morgan y H.D.K. Drew [J. Chem. Soc., 1920, 117, 1456], que afirmaron: "se sugiere el calificativo quelato, derivado de la gran pinza o quelícero (del griego chely) de la langosta u otros crustáceos, para los grupos semejantes a pinzas que funcionan como dos unidades asociadas y que están unidos fuertemente al átomo central de tal modo que forman anillos heterocíclicos".
El efecto quelato puede observarse por comparación de la reacción de un ligando quelante y un ion metálico con la reacción correspondiente que implica ligandos monodentados comparables. Por ejemplo, la comparación de la unión de 2,2'-dipiridina con piridina o 1,2-diaminoetano (etileno-diamina) con amoniaco. Se sabe desde hace muchos años que una comparación de este tipo muestra siempre que el complejo resultante de la coordinación con el ligando quelante es mucho más estable termodinámicamente.
Considérense los pasos de disociación de un ligando monodentado, comparado con ligandos multidentados (v.g. bidentados). Cuando se suelta un grupo monodentado, el mismo se pierde en el seno de la solución. Por el contrario, si se suelta un solo extremo de un grupo bidentado, el obro brazo permanece todavía unido y se trata sólo de una cuestión de que el brazo gire alrededor de sí mismo y pueda unirse de nuevo (Figura 8). En general, la formación del complejo con los grupos bidentados se ve favorecida, comparada con el complejo con los grupos monodentados correspondientes.
Se ha demostrado que el efecto quelato es capaz de contribuir a una afinidad de fijación alta no sólo en el caso de ligandos metálicos multidentados, sino en muchas otras situaciones químicas, que incluyen interacciones de fijación con macromoléculas (v.g., fijación de DNA multidentado, formación de quelatos de anticuerpos recombinantes) [Neri D, Momo M, Prospero T, Winter G. High-affinity antigen binding by chelating recombinant antibodies (CRAbs). J Mol Biol. (1995) 246:367-73].
Cuando se examinan algunas de las realizaciones ESACHEL, por ejemplo aquéllas en las cuales dos restos químicos están oligomerizados por formación de heterodúplex de DNA, es útil ilustrar el efecto quelato en el contexto de la estabilidad del heterodúplex de DNA que puentea las dos entidades químicas implicadas en la interacción de fijación específica con una diana. En la mayoría de los casos, será conveniente disponer de heterodúplex (o tríplex o cuádruplex) que no se disocian de facto en las condiciones experimentales seleccionadas para el "biopanning" ESACHEL. Información útil y una exposición acerca de la energética de la fijación cooperativa con fragmentos cortos de heterodúplex de DNA (8 pb) puede encontrarse en Distefano y Dervan, 1993 [Distefano MD, Dervan PB. Energetics of cooperative binding of oligonucleotides with discrete dimerization domains to DNA by triple helix formation, Proc Natl Acad Sci USA. (1993) 90: 1179-1183.].
Consideraciones acerca de los procedimientos que siguen al "biopanning" ESACHEL
¿Qué ocurre después de los experimentos ESACHEL, cuándo se han identificado miembros de fijación específicos? Para ciertos propósitos (v.g. ciertos experimentos bioquímicos), puede imaginarse la utilización de los miembros ESACHEL sin transformaciones químicas ulteriores. Por ejemplo, podría desearse medir las afinidades de fijación y las constantes cinéticas para la fijación de los miembros ESACHEL a una molécula diana.
Para muchas aplicaciones, sin embargo, puede ser deseable convertir las moléculas ESACHEL autoensambladas en análogos, en los cuales las entidades químicas responsables de la fijación están enlazadas covalentemente. La longitud, rigidez, las propiedades químicas estereoelectrónicas y la solubilidad del enlazador influirán en la afinidad de fijación y el comportamiento de la molécula resultante [Shuker SB, Hajduk PJ, Meadows RP, Fesik SW. Discovering High-Affinity Ligands For Proteins - Sar by Nmr. Science (1996) 274:1531-1534] (véase también el Ejemplo 4).
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Ejemplos Ejemplo 1
Como se ha mencionado en las secciones anteriores, un punto fuerte de la tecnología ESACHEL es su compatibilidad con una diversidad de entidades químicas diferentes, que incluyen péptidos y proteínas globulares (v.g., dominios de anticuerpos).
En este ejemplo, se muestra de qué modo una realización simple de ESACHEL (Figura 1), que caracteriza dominios variables de anticuerpos marcados con cisteína enlazados covalentemente a nucleótidos de DNA capaces de formación parcial de heterodúplex, conduce a la identificación de un par de dominio variable pesado (VH) y dominio variable ligero (VL), que dan lugar a una fijación específica de antígeno después de heterodimerización.
Los genes de los dominios VH y VL del anticuerpo L19 (específico para el dominio ED-B de la fibronectina [Pini A, Viti F, Santucci A, Carnemolla B, Zardi L, Neri P, Neri D. Design and use of a phage display library. Human antibodies with sub-nanomolar affinity against a marker of angiogenesis eluted from a two-dimensional gel. J Biol Chem. (1998) 273:2179-21776]), del anticuerpo HyHEL-10 (específico de la lisozima del huevo de gallina [Neri, 1995]; téngase en cuenta que un sitio EcoRI interno había sido mutagenizado previamente sin alterar la secuencia de la proteína) y de otros anticuerpos aislados de la biblioteca ETH-2 (Viti, 2000), se amplifican por PCR utilizando los pares de iniciadores siguientes, que codifican un residuo cisteína, anexionados al extremo C-terminal de cada
dominio V:
1
100
2
Los productos PCR resultantes se subclonan, utilizando procedimientos estándar de biología molecular, en los sitios EcoRI/HindIII del plásmido pQE12 (Qiagen, Alemania). Los plásmidos resultantes codifican dominios V, que llevan la secuencia siguiente en su término C: -Gly-Gly-Cys-His-His-His-His-His-His.
Los plásmidos, que codifican los dominios V marcados con cisteína, se someten a electroporación en células de E. coli (preferiblemente, en la cepa Origami de Novagen, que tiene un potencial rédox citoplásmico ligeramente oxidante), se expresan y se purifican, utilizando cromatografía de quelatos metálicos sobre resina NiNTA (Qiagen, Alemania).
Los dominios V marcados con cisteína se reducen con solución 1 mM de ditiotreitol en PBS (tampón de fosfato 50 mM + NaCl 100 mM, pH = 7,4) seguido por desalado en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia, Dübendorf, Suiza).
En paralelo, se encargan diferentes oligonucleótidos, que lleven un grupo tiol en el extremo 3' o en el extremo 5', de un suministrador comercial (v.g., Microsynth, Balgach, Suiza). Los oligonucleótidos de DNA individuales con el grupo tiol en el extremo 3'se utilizan para acoplamiento a dominios VH individuales. Los oligonucleótidos de DNA individuales con el grupo tiol en el extremo 5'se utilizan para acoplamiento a dominios VL individuales.
Se ilustran a continuación tipos de secuencia representativos. Debe tenerse en cuenta que los oligonucleótidos de estas familias son capaces de la formación de heterodúplex parciales:
3
300
En reacciones paralelas, los oligonucleótidos de DNA que contienen tiol purificados se hacen reaccionar con un exceso molar de bis-maleimido-hexano (Pierce, Bélgica) en PBS + DMSO, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los derivados resultantes se purifican del bis-maleimido-hexano sin reaccionar utilizando cromatografía de intercambio aniónico, y se hacen reaccionar luego con un ligero exceso molar de VH-cys o VL-cys purificados, respectivamente, a una concentración de dominio >0,1 mg/ml. Los productos de reacción (dominio V)-DNA resultantes se separan del dominio V que no ha reaccionado por cromatografía de intercambio de aniones.
Una mixtura equimolar de derivados (dominio V)-DNA se mezcla en PBS, se calienta a 70ºC durante 1 minuto, y se deja equilibrar luego hasta que alcanza la temperatura ambiente. La mixtura resultante de compuestos ESACHEL se incuba luego con una solución 0,1 \muM de biotina-ED-B en PBS a la temperatura ambiente durante 10 minutos (Pini, 1998), se captura luego sobre cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se lava concienzudamente de acuerdo con procedimientos estándar.
La preparación de cuentas resultante se utiliza luego como molde para dos reacciones PCR separadas, que amplifican los oligonucleótidos (L19_5SH, HyHel10_5SH, GST_5SH) y (L19_3SH, HyHel10_3SH, GST_3SH) (véase arriba), utilizando los oligonucleótidos:
4 
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Los productos PCR resultantes se digieren con EcoRI, se ligan para formar concatenámeros (sic), y se subclonan en un plásmido hospedador adecuado, seguido por electroporación en E. coli y secuenciación. El análisis de la secuencia resultante muestra un sesgo acusado hacia los códigos L19 (CAT AAT y ATA TAT) con respecto a los códigos HyHEL-10 y GST, indicando un enriquecimiento preferencial de las combinaciones VH(L19)-VL(L19) con respecto a los otros productos de ensamblaje posibles.
Ejemplo 2
En este ejemplo, se describe de qué modo puede materializarse la realización ESACHEL de la Figura 1 en una implementación práctica. La estrategia experimental reseñada aquí es aplicable también para las realizaciones descritas en la Figura 4, en las cuales se utilizan tríplex de DNA o cuádruplex de DNA que exhiben entidades químicas en el extremo de los oligonucleótidos de autoensamblaje.
Se construyen dos sub-bibliotecas como sigue:
Se crea una sub-biblioteca "A", por acoplamiento de n compuestos en el extremo 3' de n oligonucleótidos de DNA diferentes. Entre las muchas implementaciones posibles diferentes, una conveniente está representada por el acoplamiento de yodoacetamido- o maleimido-derivados de n entidades químicas a oligonucleótidos de DNA individuales, que llevan un grupo tiol en el extremo 3'. El acoplamiento puede realizarse fácilmente a la temperatura ambiente en PBS (tampón de fosfato 50 mM + NaCl 100 mM, pH = 7,4), por simple mezcladura del oligonucleótido portador de tiol (intervalo de concentración típico: 10-100 \mum) con un exceso molar de derivado yodoacetamido o maleimido (intervalo de concentración típico: 50-500 \muM), seguido por purificación cromatográfica del aducto DNA-entidad química. Los oligonucleótidos que contienen tiol pueden adquirirse de suministradores comerciales. Cada uno de ellos contiene una porción de secuencia constante (v.g., 5'-XXXXXCAGCACACAGAATTCAGAAGCTCC-3') capaz de fracción de heterodúplex con miembros de la sub-biblioteca B (véase más adelante). La secuencia de la porción de DNA XXXXX en el extremo 5' es (al menos en parte) diferente en cada miembro de la sub-biblioteca A, actuando por tanto como un código.
Análogamente, se crea una sub-biblioteca "B", por acoplamiento de m compuestos al extremo 5 de m oligonucleótidos de DNA diferentes. El acoplamiento de yodoacetamido- o maleimido-derivados de m entidades químicas a oligonucleótidos de DNA individuales, que llevan un grupo tiol en el extremo 5', se realiza análogamente a lo descrito para la sub-biblioteca "A". Tales oligonucleótidos pueden adquirirse de suministradores comerciales. Cada uno de ellos contiene una porción de secuencia constante (v.g., 5'-GGAGCTTCTGAATTCTGTGTGCTGYYYYY-3') capaz de formación de heterodúplex con los miembros de la sub-biblioteca A (véase arriba). La porción de la secuencia de DNA YYYYY en el extremo 3' es (al menos en parte) diferente en cada miembro de la sub-biblioteca B, actuando por tanto como un código.
El ensamblaje de los miembros de la sub-biblioteca A con los miembros de la sub-biblioteca B se lleva a cabo por mezcladura de las sub-bibliotecas en PBS, calentando la mezcla a 70ºC durante 1 minuto (en caso de que sea compatible con la estabilidad de las entidades químicas utilizadas en la construcción de la sub-biblioteca), seguido por equilibración a la temperatura ambiente. La biblioteca ESACHEL resultante contiene n x m miembros, y puede utilizarse en experimentos de "biopanning", seguidos por descodificación de los miembros de fijación.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra una de las muchas metodologías de descodificación posibles, para realizaciones ESACHEL como se describen en la Figura 1 y en el Ejemplo 2.
La estrategia de descodificación, representada esquemáticamente en la Figura 5, está basada en el principio de que, después de biopanning de las especificidades de fijación ESACHEL deseadas, se generan fragmentos PCR, cada uno de los cuales lleva el código de pares de miembros de la sub-biblioteca, cuya combinación se rescató en el experimento de biopanning, permitiendo de este modo la identificación de las entidades químicas heterodimerizadas correspondientes.
Las entidades químicas de las sub-bibliotecas A y B (véanse también la Figura 1 el Ejemplo 2) se acoplan, individualmente, a miembros de dos agrupaciones de oligonucleótidos de DNA con las propiedades siguientes:
-
Una agrupación de oligonucleótidos lleva las entidades químicas en el extremo 3'(agrupación A), mientras que la otra agrupación lleva la entidad química en el extremo 5'(agrupación B).
-
Un número suficiente de bases en el extremo 5' de los oligonucleótidos de la agrupación B permiten la dimerización específica de cualquier miembro individual de la agrupación B con cualquier miembro individual de la agrupación A. Dentro de este dominio de dimerización, los oligonucleótidos de la agrupación B contienen una región de "código", que codifica la entidad química en el extremo 5'. Los oligonucleótidos de la agrupación A contienen un número suficiente de elementos de cadena principal desoxirribosa sin bases (espaciador D), a fin de prevenir cualquier apareamiento indeseable a las bases del código B.
-
Los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A tienen su código distintivo hacia el extremo 5'.
Los oligonucleótidos de la sub-biblioteca B se mantienen reasociados de manera estable a los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A, y pueden funcionar como iniciadores para una reacción de DNA-polimerasa en el molde A. El segmento de DNA resultante, que lleva a la vez el código A y el código B, puede amplificarse (típicamente por PCR), utilizando iniciadores que se hibridan en los extremos constantes del segmento de DNA (Figura 5).
Como un ejemplo de oligonucleótidos A y B modelo que pueden utilizarse para la generación de un producto PCR, que lleva a la vez el código A y el código B, se proporciona a continuación:
5
Se mezclan tipo A_oligo y tipo B_oligo en cantidades aproximadamente equimolares. La mixtura resultante se calienta a 70ºC, y se enfría a la temperatura ambiente, permitiendo la heterodimerización de tipoA_oligo y tipoB _oligo. La mixtura resultante se mezcla con un tampón adecuado para la reacción PCR, dNTPs (250 \muM por nucleótido, Pharmacia). Se añade luego polimerasa Taq (1U, Appligen), y la mixtura se incuba a continuación a 40ºC durante 5 minutos. Seguidamente se inicia un programa PCR con 30 ciclos de (90º/1 minuto)-(50ºC/1 minuto)-(72ºC/15 segundos) después de la adición de los iniciadores CódigoABfo y CódigoABba (400 \muM). Una vez completado el programa, se comprueba la longitud del fragmento PCR por metodología estándar en gel de poliacrilamida, utilizando geles Novex comerciales. Su identidad de secuencia puede establecerse por digestión del producto con EcoRI, seguido por clonación en un plásmido adecuado y secuenciación.
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Ejemplo 4
Al igual que la formación de quelatos con anticuerpos recombinantes (CRAbs) [Neri, 1995] y ligandos orgánicos pequeños identificados utilizando SAR por NMR [Shuker, 1996], la fijación con afinidad alta de los miembros ESACHEL a moléculas diana puede estar basada en el efecto quelato.
Es intuitivo que la contribución de ganancia de afinidad del efecto quelato dependerá de la longitud, rigidez, y propiedades químicas estereoelectrónicas y estabilidad del enlace entre las dos (o más) entidades químicas, en contacto con el antígeno diana. Adicionalmente, la ganancia de afinidad dependerá directamente de la magnitud de las constantes de velocidad de asociación y disociación (k_{on} y k_{off}) de las entidades químicas individuales, que se fijan a la diana.
En este ejemplo, se presenta un módulo de computación, que proporciona información acerca de la contribución del efecto quelato, en relación a los parámetros arriba mencionados (longitud del enlazador, k_{on} y k_{off}).
Como se representa en la Figura 9, dos entidades químicas diferentes A y B se fijan a sitios de fijación distintos de la misma molécula diana, y están conectadas por un enlazador de longitud definida. Es conveniente definir cuatro estados diferentes (nI, nII, nIII y nIV) que pueden interconvertirse por medio de equilibrios químicos de fijación:
nI:
A y B están fijadas a su bolsa de fijación
nII:
A está fijada a su bolsa de fijación, mientras que B no está fijada a su bolsa de fijación
nIII:
B esta fijada a su bolsa de fijación, mientras que A no está fijada a su bolsa de fijación
nIV:
ni A ni B están fijadas a sus bolsas de fijación
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Los parámetros cinéticos k_{onA}, k_{offA}, k_{onB} y k_{offB}, que describen las propiedades de fijación de las entidades químicas A y B individuales a las bolsas de fijación correspondientes, son conocidos. A partir de estas constantes, es posible determinar las probabilidades para que una molécula fijada sea desplazada de la bolsa de fijación (p_{off}), y para que una molécula no fijada se fije a su bolsa de fijación (p_{on}) en un incremento de tiempo definido.
6
En cinética de primer orden, la semi-vida de fijación puede expresarse como:
7
Si en el tiempo t = 0 todas las moléculas B no están fijadas a la bolsa de fijación correspondiente (y si se desprecian en una primera aproximación los procesos de disociación), la fracción de moléculas fijadas después del incremento de tiempo \Deltat puede expresarse como sigue:
8
Si se elige un conjunto de moléculas suficientemente grande, la ecuación [3] puede aproximarse a la probabilidad de que una molécula B se fije a su bolsa en el incremento de tiempo \Deltat.
Las ecuaciones descritas hasta ahora corresponden a entidades químicas A y B, que se fijan a las bolsas correspondientes independientemente una de otra. Supóngase, sin embargo, que A y B están conectadas por un enlazador, y que el resto A está fijado a su diana. Es conveniente expresar la concentración de B en la proximidad de su bolsa de fijación de diana como concentración eficaz, ec.
9
En el modelo considerado, la contribución del efecto quelato a las propiedades de fijación de la molécula bidentada A-B a la diana se debe a un aumento de la concentración eficaz de uno de los dos restos de fijación, cuando el otro está fijado a su bolsa de fijación (Figura 9). En un modelo simple, puede suponerse que, si la molécula de fijación A está fijada, la molécula B puede situarse con igual probabilidad en cualquier posición en un espacio hemisférico alrededor de la molécula A, donde el radio "rad" (medido en metros) es igual a la longitud del enlazador. Las limitaciones estéricas del enlazador, los efectos de repulsión, etc. se desprecian en este modelo simple. Se utiliza la misma suposición cuando la molécula B está fijada, y A no lo está. Como resultado, la concentración eficaz molar ec puede calcularse como:
10
Basándose en estas hipótesis, los autores de la invención diseñaron un programa de ordenador para estimar la contribución del efecto quelato a la semi-vida residual de una molécula de fijación bidentada A-B, donde los dos restos individuales A y B que se fijan a dos bolsas de fijación distintas en la misma molécula diana están conectados con un enlazador de la longitud rad. La posibilidad de fijación de A y B a dos moléculas diana diferentes se desprecia.
En una población de n moléculas A-B, los cuatro estados de la Figura 9 pueden estar poblados por las moléculas individuales, y es concebible que moléculas individuales se encuentren en estados diferentes en momentos de observación distintos. En el modelo presente, se determinaron las probabilidades p_{on} y p_{off} de las moléculas individuales A y B para cambiar su estado dentro de un incremento de tiempo \Deltat.
Como ejemplo práctico, considérese que en el tiempo t = 0, todas las moléculas A-B se encuentran en el estado nI (tanto A como B están fijadas). En cada incremento de tiempo \Deltat (que es 1 segundo en el programa) las probabilidades de los restos A y B para cambiar su estado de fijación dan lugar a una nueva distribución de las moléculas A-B en los cuatro estados diferentes. En la simulación, se utilizan condiciones de disociación irreversibles (es decir, las moléculas disociadas A-B, en el estado nIV no tienen posibilidad de fijarse de nuevo a la diana). El programa repite estos cálculos un incremento de tiempo tras otro, hasta que la población de moléculas A-B fijadas a la diana (suma de nI, nII y nIII) desciende a la mitad de la población inicial. La suma de los incrementos de tiempo proporciona una estimación de la semi-vida de una molécula A-B fijada a su diana.
Por variación de la configuración inicial del conjunto de moléculas, o de los parámetros k_{offA}, k_{offB}, k_{onA}, k_{onB} y rad, puede estimarse la contribución al efecto quelato de entidades químicas diferentes enlazadas, en términos de la estabilización cinética del complejo.
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El código del programa CHELATE correspondiente (descrito en PASCAL) se enumera a continuación:
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11
12 
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Ejemplo 5
En muchos casos, puede ser deseable aumentar la afinidad de un ligante existente hacia una molécula diana (v.g. una diana farmacéutica). Buscando esta meta, puede utilizarse la tecnología ESACHEL como sigue, es decir omitiendo la secuencia del oligonucleótido "código" del ligante a optimizar. Supóngase que el resto químico p se fija a una molécula diana (v.g., una proteína) con una afinidad insuficiente. Será conveniente enlazar p a una extremo (v.g., en el extremo 5') de un oligonucleótido adecuado, capaz de autoensamblaje con otros derivados oligonucleotídicos (típicamente, por formación de heterodúplex, como se representa en la Figura 10).
Por ejemplo, el resto químico p se acoplará al extremo 5' del oligonucleótido 5'-5'-GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG-3'. Será conveniente luego acoplar químicamente, en reacciones individuales, muchos restos químicos q diferentes en el extremo 3' de los oligonucleótidos, de secuencia general 5'-XX.....XX-Y-CAG CAC ACA GAA TTC AGA AGC TCC-3', en donde:
-
la porción XX.....XX será diferente para los distintos compuestos;
-
Y representa un análogo de base biotinilado;
-
la secuencia 5'-CAG CAC ACA GAA TTC AGA AGC TTC-3' será idéntica en todos los casos, permitiendo la formación de heterodúplex con la secuencia 5'-GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG-3', acoplada químicamente a p, para todos los miembros del conjunto de moléculas q.
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La biblioteca resultante apareará p con las moléculas q, cada una de las cuales lleva un código oligonucleotídico distintivo. La biblioteca autoensamblada puede someterse a biopanning, en condiciones de severidad adecuada. Los ligantes rescatados al final del procedimiento de biolavado en batea se identificarán por medio de su código. Por ejemplo, los códigos de las moléculas q, que junto con p dan lugar a ligantes de afinidad alta para la molécula diana, pueden leerse por hibridación a un chip oligonucleotídico, en el cual las diferentes posiciones están cubiertas con oligonucleótidos, que son complementarios a las secuencias XX.....XX de los miembros de la sub-biblioteca Q. El resto biotina en los miembros de la sub-biblioteca Q permitirá la detección de los sucesos de fijación en el chip.
Los restos químicos candidato q se enlazarán luego químicamente a p, y el conjugado resultante se utilizará como un ligante específico para la molécula diana de interés.

Claims (22)

1. Una biblioteca química que comprende productos de reacción de combinación de al menos dos compuestos químicos, comprendiendo cada uno de estos compuestos químicos:
a)
un resto químico (p,q) potencialmente capaz de realizar una interacción de fijación con una sola molécula diana;
b)
un oligonucleótido (b,b') una parte del cual es un resto de autoensamblaje (m,m');
estando unidos los compuestos químicos uno a otro por los restos de autoensamblaje (m,m') de sus oligonucleótidos (b,b') caracterizada porque el producto de la reacción de combinación es estable en ausencia de dicha molécula diana, en donde los oligonucleótidos (b,b') de cada uno de los compuestos químicos comprenden una secuencia codificante variable única (b2,b2') que codifica individualmente la identificación del resto químico particular (p,q).
2. La biblioteca química de la reivindicación 1, caracterizada porque los al menos dos compuestos químicos comprenden cada uno un grupo químico por el cual aquéllos se unen entre sí covalentemente después que se ha formado el producto estable de la reacción de combinación.
3. La biblioteca química de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque los oligonucleótidos (b,b') están enlazados covalente y directamente a los restos químicos (p,q).
4. La biblioteca química de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque los oligonucleótidos (b,b') comprenden adicionalmente una porción enlazadora (b3,b3') que está situada entre la secuencia de autoensamblaje (b1, b1') y el resto químico (p,q).
5. La biblioteca química de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia codificante (b2,b2') del oligonucleótido (b,b') está situada entre el resto químico (p,q) y la secuencia de autoensamblaje (b1, b1').
6. La biblioteca química de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el producto de la reacción de combinación es un dímero, trímero o tetrámero y porque sus combinaciones individuales de restos se derivan por formación de heterodúplex, heterotríplex, o heterocuádruplex de las secuencias de autoensamblaje (b1, b1') de los oligonucleótidos (b,b').
7. La biblioteca química de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque la misma comprende sub-bibliotecas (A) y (B) codificadas individualmente, en donde la sub-biblioteca (A) comprende n compuestos acoplados al extremo 3' de n oligonucleótidos de DNA diferentes (b) y la sub-biblioteca (B) comprende m compuestos acoplados al extremo 5' de m oligonucleótidos de DNA diferentes (b').
8. La biblioteca química de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque en la sub-biblioteca (A) o en la sub-biblioteca (B) respectivamente, se han acoplado derivados yodoacetamido o maleimido de n o m entidades químicas a oligonucleótidos de DNA individuales que llevan un grupo tiol en el extremo 3' o 5'.
9. La biblioteca química de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque en la sub-biblioteca (A) o en la sub-biblioteca (B) respectivamente, los amido-derivados - que forman estructuras químicas tales como -O-P(O)_{2}-O-(CH_{2})_{n}-NH-CO-R, donde R puede corresponder a diversas entidades químicas diferentes, y n puede estar comprendido entre 1 y 10 - se han acoplado a los oligonucleótidos que llevan un enlace fosfodiéster en una extremo.
10. La biblioteca química de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque en la sub-biblioteca (A) la secuencia de autoensamblaje (b1) está interrumpida por un espaciador d en dirección opuesta a un código (B), impidiendo el espaciador d cualquier apareamiento indeseable a las bases del código (B) que codifica la sub-biblioteca (B), mientras que el oligonucleótido (b) de la sub-biblioteca (A) tiene su código distintivo (A) hacia el extremo 5'.
11. Un método de biopanning de ligandos específicos para moléculas diana, en donde un producto de reacción de combinación se incuba con una molécula diana, estando constituido el producto de la reacción de combinación por al menos dos compuestos químicos, comprendiendo cada uno de estos compuestos químicos:
a)
un resto químico (p,q) potencialmente capaz de realizar una interacción de fijación con una sola molécula diana;
b)
un oligonucleótido (b,b'), una parte del cual es un resto de autoensamblaje (m,m');
en donde los compuestos químicos están unidos unos a otros por los restos de autoensamblaje (m,m') de sus oligonucleótidos (b,b'), caracterizado porque se utiliza para biopanning una biblioteca química de productos de reacción de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Un método de identificación de una molécula diana con un producto de reacción de combinación de una biblioteca química de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende un resto químico (p,q) capaz de realizar una interacción de fijación con esta molécula diana y que comprende adicionalmente un oligonucleótido (b,b'), caracterizado porque el producto de la reacción de combinación se fija a una diana por biopanning de acuerdo con la reivindicación 11.
13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque se generan fragmentos PCR por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cada uno de los cuales lleva el código de pares de miembros de sub-biblioteca (A) y (B), donde la sub-biblioteca (A) comprende n compuestos acoplados al extremo 3' de n oligonucleótidos de DNA diferentes (b) y la sub-biblioteca (B) comprende m compuestos acoplados al extremo 5' de m oligonucleótidos de DNA diferentes (b').
14. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque en la sub-biblioteca (A) o en la sub-biblioteca (B), respectivamente, yodoacetamido- o maleimido-deriva-dos de n o m entidades químicas se acoplan a oligonucleótidos de DNA individuales, que llevan un grupo tiol en el extremo 3' o 5'.
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque en la sub-biblioteca (A) la secuencia de autoensamblaje (b1) está interrumpida por un espaciador D en dirección opuesta a un código (B), impidiendo el espaciador D cualquier apareamiento indeseable a las bases del código B que codifica la sub-biblioteca (B), donde el oligonucleótido (b) de la sub-biblioteca (A) tiene su código distintivo (A) hacia el extremo 5'.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque la longitud de los fragmentos PCR se comprueba y su identidad de secuencia se establece por digestión de los fragmentos PCR con un sitio de restricción para una endopeptidasa específica (v.g. EcoRI), seguido por clonación en un plásmido adecuado y secuenciación.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en donde varios miembros de fijación específicos se aíslan al final de un experimento de biopanning, caracterizado porque se crean concatenámeros (sic), partiendo de los fragmentos PCR presentes en la mezcla de reacción, y las secuencias concatenadas se "leen" por secuenciación, revelando tanto la identidad como la frecuencia de los pares de código (A) y código (B).
18. El método de la reivindicación 12, en donde varios miembros de fijación específicos de aíslan al final de un experimento de biopanning y las sub-bibliotecas (A) y/o (B) llevan restos químicos en los extremos de oligonucleótidos parcialmente reasociados, caracterizado porque las cadenas de DNA no apaleeras se hibridan con oligonucleótidos diana (v.g. oligonucleótidos de DNA) que están inmovilizados en uno o más chips.
19. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque por la utilización del chip (A) o el chip (B) respectivamente, se lleva a cabo la lectura de la entidad y/o frecuencia de los miembros de la sub-biblioteca (A) o la sub-biblioteca (B) respectivamente, rescatados después de un experimento de biopanning, y por descodificación en el chip (A) y (B) se sugieren componentes candidato de las sub-bibliotecas (A) y (B), para reasociación y cribado en una tanda sucesiva de biopanning.
20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la fijación con severidad creciente a la diana se refleja por una reducción en el número de miembros de (A) y/o (B) como se identifican en el chip respectivo y las posibles combinaciones de los miembros candidato (A) y (B) se ensamblan individualmente o en agrupaciones más pequeñas y se ensayan respecto a fijación a la diana.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque permite que se autoensamblen bibliotecas a fin de formar complejos trímeros o tetrámeros por utilización de tres o cuatro chips, respectivamente, que llevan oligonucleótidos diana distintivos para descodificación.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque el DNA de restos de fijación seleccionados se amplifica por PCR antes de la hibridación al chip.
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