EA006965B1 - Закодированные самособирающиеся химические библиотеки - Google Patents

Закодированные самособирающиеся химические библиотеки Download PDF

Info

Publication number
EA006965B1
EA006965B1 EA200401107A EA200401107A EA006965B1 EA 006965 B1 EA006965 B1 EA 006965B1 EA 200401107 A EA200401107 A EA 200401107A EA 200401107 A EA200401107 A EA 200401107A EA 006965 B1 EA006965 B1 EA 006965B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
library
chemical
sub
self
oligonucleotides
Prior art date
Application number
EA200401107A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401107A1 (ru
Inventor
Дарио Нери
Саму Мелкко
Original Assignee
Айдгенёссише Текнише Хохшуле Цюрих
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Айдгенёссише Текнише Хохшуле Цюрих filed Critical Айдгенёссише Текнише Хохшуле Цюрих
Publication of EA200401107A1 publication Critical patent/EA200401107A1/ru
Publication of EA006965B1 publication Critical patent/EA006965B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/08—Liquid phase synthesis, i.e. wherein all library building blocks are in liquid phase or in solution during library creation; Particular methods of cleavage from the liquid support
    • C40B50/10—Liquid phase synthesis, i.e. wherein all library building blocks are in liquid phase or in solution during library creation; Particular methods of cleavage from the liquid support involving encoding steps
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Curing Cements, Concrete, And Artificial Stone (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)

Abstract

Данное изобретение касается химического соединения, содержащего химический фрагмент (р), способный вступать в реакцию связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени) и содержащий также олигонуклеотид (b) или его функциональный аналог. Согласно первому аспекту изобретения химическое соединение характеризуется тем, что олигонуклеотид (b) или его функциональный аналог содержит по меньшей мере одну самособирающуюся последовательность (b1), способную вступать в реакцию сочетания по меньшей мере с одной самособирающейся последовательностью (b1') комплиментарного олигонуклеотида или его функционального аналога, связанного с другим химическим соединением, содержащим химический фрагмент (q). Согласно второму варианту изобретения химическое соединение, которое содержит кодирующую последовательность (b1), для идентификации химического фрагмента (р), характеризуется тем, что химическое соединение содержит также по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (m), способный вступать в реакцию сочетания по меньшей мере с одним самособирающимся фрагментом (m') подобного химического соединения, содержащего химический фрагмент (q). Изобретение относится к соответствующим библиотекам химических соединений, а также способам биопэннинга молекул мишени и идентификации таких целей.

Description

Область техники
Выделение специфических молекул связывания (например, органических молекул) представляет собой центральную проблему в химии, биологии и фармацевтике. Для того, чтобы найти подходящего кандидата обычно приходится проводить скрининг миллионов соединений. Получение очень больших библиотек органических соединений обычно является трудоёмким. Кроме того, сложности, связанные с идентификацией специфических молекул связывания в пуле соединений-кандидатов, возрастают с увеличением размера химической библиотеки, подлежащей скринингу.
Согласно данному изобретению предлагается использовать самособирающиеся библиотеки органических молекул (обычно образующие димеры, тримеры или тетрамеры), в которых органические молекулы связаны с олигонуклеотидом, который вызывает самосборку библиотеки и/или обеспечивает код, ассоциированный с каждым фрагментом связывания. Полученная библиотека может быть очень большой (так как она возникает путём комбинаторной сборки подбиблиотек меньшего размера). После захвата желательных соединений специфического связывания целевой мишенью «код связывания» может быть декодирован с применением ряда экспериментальных методик (например, гибридизацией на чипах ДНК или цепной реакцией модифицированной полимеразы (РСК.) с последующим секвенированием).
Уровень техники
Выделение молекул специфического связывания (например, органических молекул) является основной проблемой в химии, биологии и фармацевтике. Например, огромное количество лекарственных веществ, одобренных и.8. Роок апк Эгид Акт1шк1га1юп, являются молекулами для специфического связывания с биологическими мишенями, которые относятся к одной из следующих категорий: ферменты, рецепторы или ионные каналы. Специфическое связывание с биологической мишенью само по себе не является достаточным для превращения молекулы связывания в лекарство, так как широко известно, что поведение лекарства зависит и от других свойств соединений (таких как фармакокинетические свойства и стабильность). Однако, отделение специфических молекул связывания от релевантной биологической мишени обычно представляет собой исходную точку в процессе, который приводит к созданию нового лекарства (Эге\ук I. Эгад Нксоуегу: а 1ик1опса1 регкресЬге. 8с1епсе (2000) 287: 1960-1964).
Способность быстро генерировать молекулы для специфического связывания целевых биологических мишеней была бы очень ценной в различных химических и биологических областях. Например, специфическая нейтрализация конкретного эпитопа внутриклеточного белка может обеспечивать информацию о функциональной роли этого эпитопа (и, соответственно, этого белка). В принципе, применение моноклональных антител, специфических для данного эпитопа, может обеспечить информацию того же типа (\Сш1ег С., СпГГййк Α. Ό., На\\'ктк К. Е., НоодеиЬоот Н. К. Мактд апйЬоНек Ьу р1аке к1кр1ау 1ес1то1оду. Аипи. Кеу. 1гитипо1. (1994) 12: 433-455). Однако большинство антител нелегко проникает через клеточную мембрану и должно быть искусственно введено в целевую клетку. В принципе, внутриклеточные антитела могут также экспрессироваться в клетки мишени путём доставки генов в клеткимишени (например, путём трансфекции клеток при помощи ДНК, управляющей экспрессией антитела). В этом случае часто в молекуле антитела нет складок, так как восстанавливающая внутриклеточная среда не позволяет образоваться дисульфидным связям, которые часто вносят существенный вклад в стабильность антитела (Эеыкегю А., Ргаисош К., Ьорех М., УШаш М. Е., УШ Р., СЫага1исе К., Сопка1у| V., Νοπ Ό., Веиуеии1о Е. А кеии-куШНеРс герейопе оГ 1и(г1и51са11у к!аЬ1е апкЬоку ГгадтеНк кепуек Ггот а ктд1еГгате^огк ксаГГо1к. 1. Мо1. Вю1. (2001) 310: 603-615).
Молекулы с высоким сродством к связыванию, склонные к химическим превращениям, могут являться ценной альтернативой антителам. В области химии и химических материалов не требующее усилий выделение специфических молекул связывания может быть полезным для различных целей, таких как генерирование биосенсоров, ускорение химических реакций, получение материалов с новыми свойствами, селективный захват/разделение/ иммобилизация молекул мишени.
Генерирование больших наборов молекул (например, путём комбинаторного синтеза: Ойо 8., Риг1аи К. Ь., 8апкегк 1. К. Оупатк сотЬта1опа1 сйет181гу. Эгид Э|ксоу. Токау. (2002) 7: 117-125), используемых в оригинальных методах скрининга, считается основным путём выделения нужных связывающих молекул. Например, большинство крупных фармацевтических компаний имеет собственные химические библиотеки, которые изучаются на предмет идентификации ведущих соединений. Эти библиотеки могут содержать более одного миллиона членов и всё-таки в некоторых случаях не содержат связывающих соединений, представляющих интерес (Во1т Н. 1., 81аЬ1 М. 81гис1иге-Ьакек НЬгагу кекдп: то1еси1аг токе11ид тегдек νίΐΠ сотЬта!опа1 сйет181гу. Сиггеи! Орйои ίη СЬет1са1 Вю1оду (2000) 4: 283-286). Скрининг библиотек, включающих миллионы соединений, может потребовать не только очень сложных методов, но также и сложной робототехники и инфраструктуры для хранения, скрининга и оценки членов библиотеки.
Генерирование большого набора высокомолекулярных соединений (например, библиотек пептидов или белков) вместе с эффективными биологическими и/или биохимическими методами идентификации специфичности связывания (такими как фаговый дисплей (ХСйНет 1994) пептидов на плазмидах [Си11 М. С., Мй1ег 1. Р., 8сЬа1х Р.] 8сгеешид Гог гесер!ог йдапкк иктд 1агде НЬгапек оГ рерйкек йпкек !о Не С 1егт1иик оГ Не 1ас гергекког. Ргос. №111 Асак. 8сг И8А. (1992) 89: 1865-1869, дисплей рибосом: ш уйго метод
- 1 006965 селекции и оценки антител из библиотек I 1ттипо1 Ме11обк (1999) 231: 119-135] уеак1 б1кр1ау [Вобег ЕТ, ХУШгир ΚΌ. Уеак1 кигГасе б1кр1ау Гог кстеешпд еотЫпа1опа1 ро1урерйбе 11Ьгаг1ез. №11 Вю1есйпо1. (1997) 15: 553-557], периплазматическая экспрессия цитометрическим скринингом (РЕС8). ΝηΙ Вю1есЬпо1. (2001) 19: 537-542] шетасйуе со1опу Й11ег кстеепшд [Сюуаппош Ь., νίίί Е., Ζιγ6ι Ь., №π И. 1ко1а11оп оГ апИапщодепемк апйЬоб1ек Ггот а 1агде сотЫпа1опа1 гереПойе Ьу со1опу й11ег кстеепшд. ШсЮс Аабк Кек. (2001) 29: Е27] е1с.) могут позволить выделить ценные полипептидные связывающие молекулы, такие как специфические моноклональные антитела, гормоны с улучшенными свойствами и новые ДНКсвязывающие белки. В противоположность обычным химическим библиотекам библиотеки белков, упомянутые выше, могут обеспечить эффективный скрининг 1-10 биллионов индивидуальных членов в процессе поиска специфичностей связывания. С одной стороны, генерирование библиотек генов (например, комбинаторным мутагенезисом генов антител; \Уш1ег, 1994; νίίί Е., №1ккоп Е., ЭетагОк 8., НиЬег А., Νοπ И. Эекщп апб ике оГ рйаде бйр1ау НЬтапек Гог 11е ье1ес(1оп оГ апйЬоб1ек апб епхутек. Ме11обк Епхуто1. (2000) 326: 480-505) может непрерывно трансформироваться в библиотеку белков с использованием подходящих систем экспрессии (например, бактерий, дрожжей, человеческих клеток). Далее, такие методы, как фаговый дисплей, приводят к образованию частиц, в которых фенотип (обычно связывающие свойства белка, проявленные на поверхности нитей фага) физически сочетается с соответствующим генотипом (то есть геном, кодирующим белок, проявленный на фаге) |^У1п1ег. 1994], что приводит к амплификации и идентификации связывающих членов библиотеки с нужной специфичностью связывания.
Однако, в то время как биологические/биохимические методы выделения специфических связывающих биомакромолекул могут обеспечить очень полезные специфичности связывания, их пределы существенно ограничены наборами полипептидов или нуклеиновых кислот [Вгобу Е. Ν., Со1б Ь. Ар1атегк ак Иегареийс апб б1адпок(1с адеп1к. 1. Вю1есйпо1. (2000) 74: 5-13]. Для некоторых областей применения большие биомакромолекулы (такие как белки или ДНК) не являются идеальными. Например, они часто не способны эффективно проникать в клеточную мембрану и могут подвергаться гидролитическому расщеплению ш у|уо.
Пытаясь имитировать биологические/биохимические методы идентификации органических молекул с желаемыми связывающими свойствами вне химической библиотеки, Вгеппег и Ьетпет (Вгеппег 8., Ьетпет К. А. Епсобеб сотЬша1опа1 сйетщйу. Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А (1992) 89: 5381-5383) предложили использовать закодированные химические библиотеки (ЕСЬ). Эти авторы предложили способ альтернативного параллельного комбинаторного синтеза для того, чтобы закодировать отдельные члены большой библиотеки химических веществ с уникальными нуклеотидными последовательностями. В частности, эти авторы обусловили условия комбинаторного синтеза полимерных химических соединений на твёрдом носителе (например, шариках), когда стадия комбинаторного синтеза сопровождается синтезом (на тех же шариках) последовательности ДНК, которая должна использоваться как «метка памяти» для химических реакций, осуществляемых на шариках. В обычных областях применения шарики с закодированной ДНК инкубируют с молекулой мишени (например, белка соответствующего назначения). После того, как шарики, меченные ДНК, содержащие полимерное химическое соединение, связываются с мишенью, можно амплифицировать генетическую метку методом репликации и использовать её для обогащения связанных молекул путём гибридизации с получением подраздела библиотеки. Природа полимерной химической структуры, связанной с рецептором, может быть декодирована путём секвенирования нуклеотидной метки.
Метод ЕСЬ имеет преимущество, заключающееся во введении концепции «кодирования» конкретного полимерного химического соединения, синтезированного на шариках, с соответствующей олигонуклеотидной последовательностью, которая может быть «прочитана» и амплифицирована путём РСК. Однако метод ЕСЬ имеет ряд недостатков. Во-первых, необходимо знание общей химии, которое позволяет осуществить альтернативный синтез полимерных органических молекул (часто с различной реакционной способностью) и синтез ДНК на шарике. Во-вторых, синтез, поддержание и контроль качества больших библиотек (например, более одного миллиона индивидуальных членов) является сложной задачей. В действительности, полезность метода ЕСЬ ещё должна быть продемонстрирована на примерах.
Из патента США 5573905 известна закодированная комбинаторная химическая библиотека, которая содержит множество бифункциональных молекул формулы А-В-С, где А - полимерный химический фрагмент, В - молекула линкера, соединяющего А и С, содержащая в цепи от 1 до примерно 20 атомов, и предпочтительно, представляющая собой средство для прикрепления к твёрдой подложке. «С» представляет собой идентификатор олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, которая идентифицирует структуру химического фрагмента. Прикрепление к твёрдой подложке особенно предпочтительно в случае постадийного синтеза химического соединения (полимер из звеньев Х1-п) и олигонуклеотида (образованного из нуклеотидов Ζι^, которые кодируют и идентифицируют структуру химических звеньев полимера). Описаны также бифункциональные молекулы библиотеки и методы применения библиотеки для идентификации химических структур в составе библиотеки, которые связаны с биологически активными молекулами путём заданных реакций связывания. Применение кода «С» для идентификации полимера А и прикрепление кода «С» к полимеру А при помощи молекулы линкера В позволяет точно идентифицировать полимер, однако решение задачи, предложенное в патенте США 5573905
- 2 006965 (который в основном повторяет публикацию Вгеппег и Ьетиет, 1992) ограничено особым типом химического фрагмента. Тот факт, что для каждого члена химической библиотеки должен быть осуществлён индивидуальный синтез, считается другим недостатком.
Сущность изобретения
Целью данного изобретения является создание химического соединения, содержащего химический фрагмент любого вида, способный участвовать в реакции связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени), и кроме того, содержащего олигонуклеотид или его функциональный аналог, причём нет необходимости индивидуально синтезировать химическое соединение, чтобы организовать химическую библиотеку.
Эта цель согласно первому аспекту изобретения достигается комбинацией признаков (указанных в независимом пункте 1 формулы), определяющих химическое соединение, включающее химический фрагмент (р), способный к реакции связывания с молекулой-мишенью (например, биологической мишенью) и кроме того, включающее олигонуклеотид (Ь) или его функциональный аналог, которое характеризуется тем, что олигонуклеотид (Ь) или его функциональный аналог содержит, по меньшей мере, одну самособирающуюся последовательностью (Ь1), способную к реакции комбинации по меньшей мере с одной самособирающейся последовательностью (Ь1'), комплиментарного олигонуклеотида или его функционального аналога, связанного с другим химическим соединением, содержащим химический фрагмент (ф.
Согласно другому аспекту изобретения указанная цель достигается комбинацией признаков (указанных в независимом пункте 3 формулы), определяющих химическое соединение, включающее химический фрагмент (р), способный к реакции связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени) и кроме того, включающее олигонуклеотид (Ь) или его функциональный аналог, который содержит кодирующую последовательность (Ь1) для идентификации химического фрагмента (р), и которое характеризуется тем, что химическое соединение дополнительно содержит по меньшей мере одну самособирающуюся часть (т), способную участвовать в реакции комбинации по меньшей мере с одной самособирающейся частью (т') молекулы другого химического соединения, включающего химический фрагмент (с.|).
Другие аспекты и признаки настоящего изобретения будут понятны из дальнейшего описания.
Данное изобретение основано на том, что по мнению его авторов ключевое значение для генерирования (и скрининга) очень больших химических библиотек может иметь «самосборка» закодированных молекул. В частности, показано, что самосборка (например, путём гомодимеризации, гетеродимеризации или мультимеризации) меченных при помощи ДНК химических соединений представляет простой способ генерирования очень больших меченных при помощи ДНК химических библиотек меньшего объёма. Например, самосборка (гетеродимеризация) двух библиотек, содержащих 1000 членов, обеспечивает образование 1 000 000 различных комбинаций, то есть 1 000 000 различных химических соединений. Соответственно, гомо- или гетеротримеризация закодированных библиотек, содержащих 1000 меченных при помощи ДНК членов, приведёт к получению библиотеки, содержащей 1 000 000 000 различных меченных ДНК комбинаций, то есть химических соединений. Таким образом, данное изобретение предусматривает химическое соединение, включающее химический фрагмент любого вида, способный к реакции связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени), и кроме того, включающее олигонуклеотид или его функциональный аналог, которое может быть получено отдельно и затем участвует в реакции сочетания. Полученное химическое производное(-ые) олигонуклеотида может затем «собираться» с другими подобными соединениями с получением структур высшего порядка и закодированных библиотек соединений.
Для целей иллюстрации один конкретный пример осуществления изобретения отражён на фиг. 1. Две химические библиотеки синтезируют путём химической модификации конца 3' и конца 5', соответственно, олигонуклеотидов, способных к образованию дуплексов и несущих отличительные «метки последовательностей» (ассоциированные с химическими фрагментами и, следовательно, кодирующие химический фрагмент, присоединённый к их концу). Полученная закодированная самособирающаяся химическая библиотека (Е8ЛСНЕБ) может быть очень большой (так как она образуется при комбинаторной самосборке двух библиотек меньшего размера) и может быть подвергнута скринингу для связывания с биологической мишенью (например, белком, представляющим интерес в фармацевтике). Члены библиотеки, которые обладают подходящей специфичностью связывания, могут быть захвачены мишенью, представляющей интерес (например, при использовании мишени иммобилизованной на твёрдой подложке). Их генетический код, кодирующий химическую часть молекулы, отвечающую за желаемую специфичность связывания, затем может быть извлечён с применением ряда подходящих методов, которые описаны в разделе «Описание изобретения» ниже.
Термин «Специфический», употребляемый в описании, может использоваться в ситуации, когда один член специфической пары связывания не проявляет сколько-нибудь заметной тенденции к связыванию с молекулами, отличными от партнёра (-ов) по специфическому связыванию. В общем, специфичность связана со значительной разницей величин сродства к связыванию по отношению к «неспецифическим» мишеням. Этот термин применяется также там, где, например, член пары связывания является
- 3 006965 специфическим для конкретной поверхности на молекуле мишени (называемой далее «эпитопом»), когда член пары специфического связывания с этой специфичностью будет способен к связыванию с различными молекулами-мишенями, несущими эпитоп.
Описание фигур
Фиг. 1: Пример осуществления метода ЕБАСНЕЬ:
В случае простого метода получения ЕБАСНЕЕЬ синтезируют две химические библиотеки путём индивидуальной химической модификации конца 3' и конца 5', соответственно, олигонуклеотидов, способных к частичному образованию гетеродуплексов, которые имеют отличительные «метки последовательностей» (ассоциированные с химическими фрагментами р и с.|. присоединёнными к их концам и, следовательно, кодирующие их). Полученная самосборкой закодированная химическая библиотека (ЕБАСНЕЬ) может быть очень большой (поскольку она образуется путём комбинаторной самосборки двух небольших библиотек) и может быть подвергнута скринингу для связывания с биологической мишенью (например, белком, представляющим интерес для фармацевтики). Эти члены библиотеки, проявляющие подходящие специфичности связывания, могут быть захвачены мишенью, представляющей интерес (например, при использовании мишени, иммобилизованной на твёрдой подложке). Их генетический код, кодирующий химический фрагмент, ответственный за нужную специфичность связывания, затем может быть извлечён при помощи простых методов.
Фиг.2: Генерализация ЕБАСНЕЬ.
Основными компонентами технологии ЕБАСНЕЬ являются химические соединения, содержащие олигонуклеотидный фрагмент (обычно ДНК-последовательность), связанный с олигомеризационным доменом (способным вызвать (гомо- или гетеро) димеризацию, тримеризацию или тетрамеризацию химических соединений), связанных с химической структурной единицей, которая может участвовать в реакции специфического связывания с молекулой мишени. Часть последовательности олигонуклеотидного фрагмента соединена исключительно с химической структурной единицей (действуя как «код»). Олигомеризационный домен и код могут быть различными частями одной и той же молекулы (обычно олигонуклеотида).
Фиг. 3: Самосборка индивидуальных химических соединений ЕБАСНЕЬ может приводить к образованию комбинаторных библиотек большого размера.
При практическом осуществлении метода ЕБАСНЕЬ количество η различных химических соединений, содержащих реакционноспособную по отношению к тиолу группу (например, малеимидо- или иодацетамидогруппу), реагируют (по раздельным реакциям) с η различными ДНК-олигонуклеотидов, содержащих тиольную группу на конце 3'. Соответствующий пул η конъюгатов показан на фигуре как «пул А». Подобным образом количество т различных химических соединений, содержащих реакционноспособную по отношению к тиолу группу (например, малеимидо- или иодацетамидогруппу), реагируют (по раздельным реакциям) с т различных ДНК-олигонуклеотидов, содержащих тиольную группу на конце 5'. Соответствующий пул т конъюгатов показан на этой фигуре как «пул В». Полученная самосборкой библиотека будет содержать т х η комбинаций.
Фиг. 4: Библиотеки большого размера могут быть получены по методу ЕБАСНЕЬ, когда тримеризационные домены или тетрамеризационные домены представляют собой ДНК-последовательности, образующие триплексы или квадруплексы.
Известно, что некоторые ДНК-последовательности способны образовывать стабильные гримерные комплексы или стабильные тетрамерные комплексы. Например, конъюгация по НоодЧсо ДНКтриплексов приведёт к самосборке пулов А х В х С, содержащих η, т и I членов, соответственно. Тетрамерная сборка ДНК-(химический фрагмент) конъюгатов позволяет получить библиотеки ещё большего размера, исходя из подбиблиотек А, В, С и Ό меньшего размера.
Фиг. 5: Один метод декодирования ЕБАСНЕЬ.
Олигонуклеотиды подбиблиотеки А содержат химические структурные единицы на конце 3'. ДНКпоследовательность в направлении 3' предназначена для гибридизации с последовательностями ДНК на конце 5' олигонуклеотидов подбиблиотеки В. Участок гибридизации прерывается небольшим сегментом. В подбиблиотеке А этот небольшой сегмент обычно состоит из цепи фосфодиэфира без оснований (на конце й-спейсер на фигуре); в подбиблиотеке В соответствующий короткий сегмент имеет уникальную последовательность для каждого члена подбиблиотеки (действует как «код» для подбиблиотеки В). В противоположность этому, олигонуклеотиды подбиблиотеки А имеют отличительный код в направлении 5'.
После биопэннинга олигонуклеотиды подбиблиотеки В остаются стабильно гибридизованными с олигонуклеотидами подбиблиотеки А и могут действовать как праймеры для полимеразной реакции ДНК на темплате А. Полученный сегмент ДНК, несущий и код А, и код В, может быть амплифицирован (обычно по РСК.) с использованием праймеров, которые гибридизуются на постоянных концах сегмента ДНК.
- 4 006965
Фиг. 6: Общий метод декодирования ЕЗАСНЕБ.
Идентичность специфических связывающих веществ, выделенных из подбиблиотек А и В, содержащих химические фрагменты на концах частично гибридизованных олигонуклеотидов, устанавливается гибридизацией с олигонуклеотидами-мишенями, иммобилизованными на одном или нескольких чипах. Такие чипы изготавливают предпочтительно из силиконовых дисков с прикреплёнными олигонуклеотидными фрагментами. Например, чип А позволяет определить идентичность (и частоту) членов подбиблиотеки А, полученных после биопэннинга. Подобным образом чип В позволяет установить идентичность (и частоту) членов подбиблиотеки В. На первой стадии метод декодирования, отображённый на этой фигуре, не даёт информации о конъюгации кода А и кода В в членах специфического связывания. Однако декодирование на чипе А и В позволяет выявить возможные кандидаты из подбиблиотек А и В для повторной гибридизации и скрининга в последовательном цикле биопэнинга. Всё увеличивающееся связывание в строгих условиях с мишенью отражается в уменьшении числа членов А и В, идентифицированных на чипе. Наконец, возможные комбинации кандидатов А и кандидатов В собираются индивидуально (или в маленьких пулах) и анализируются на связывание с мишенью.
Фиг. 7: Метод деконволюции Е8АСНЕБ на основе РСК.
Подбиблиотеки А и В образуют гетеродуплекс, фланкированный уникальными последовательностями, кодирующими члены различных библиотек, и постоянными сегментами ДНК на концах. После биопэнинга подходящие пары праймеров позволяют осуществить РСК-амплификацию двух нитей, что приводит к образованию продуктов РСК, последовательность в которых может быть идентифицирована с применением стандартных методов (например, соединением в виде цепочки продуктов РСК с последующим субклонированием и секвенированием). Может быть применена процедура деконволюции (состоящая из одного или более циклов пэннинга с последующим секвенированием и выбором ограниченного набора компонентов подбиблиотек для скрининга следующей ЕЗАСНЕЬ), что ограничивает число кандидатов - членов ЕЗАСНЕЬ, способных выявить вещества для специфического связывания после самосборки.
Фиг. 8: Превращение лигандов Е8АСНЕБ в ковалентно связанные химические фрагменты.
В случае многих Е8АСНЕБ химические производные самособирающихся олигонуклеотидов выделяют в конце одного или нескольких циклов пэннинга. Для многих областей применения желательно осуществить ковалентное связывание химических фрагментов, отвечающих за взаимодействие с молекулой мишени, представляющей интерес. Длина, жёсткость, стереоэлектронные химические свойства и растворимость линкера влияют на сродство к связыванию и характеристики полученной молекулы.
Фиг. 9: Химическое равновесие, способствующее хелитному эффекту.
Диаграмма показывает возможные состояния взаимодействий между бидентатным лигандом (А-В), связывающимся с молекулой мишени. В состоянии ηΐ оба фрагмента А и В связаны с соответствующими карманами связывания. В состоянии ηΐΐ и ηΐΐΐ только фрагмент А или В, соответственно, связаны. В состоянии ηΐν соединение А-В отсоединено от мишени.
Была написана компьютерная программа для приблизительной оценки вклада хелатного эффекта на время пребывания А-В на мишени в необратимых условиях диссоциации как функции констант кинетической ассоциации и диссоциации фрагментов А и В в направлении их соответствующих пакетов связывания и длины линкера между А и В. Возможность связывания одного фрагмента с мишенью в единицу времени обозначена как «ροη».
Фиг. 10: Сборка молекулы «р» с молекулярным набором <Ю».
Диаграмма показывает образование гетеродуплекса между олигонуклеотидом, соединённым со связывающим веществом р с низким сродством, и вторым классом олигонуклеотидов, которые содержат химические фрагменты с.| и отличительные коды, способные к идентификации молекул с.|. которые действуют совместно с р при связывании с молекулой мишени (например, белковой мишени).
Раскрытие изобретения
Основными компонентами метода создания Е8АСНЕБ являются химические соединения, содержащие олигонуклеотидный фрагмент (обычно ДНК-последовательность), связанный с олигомеризационным доменом (способным вызвать (гомо- или гетеро-) димеризацию, тримеризацию или тетрамеризацию химических соединений), связанным с химическим фрагментом, который может быть вовлечён в реакцию специфического взаимодействия с молекулой мишени (фиг. 2). Часть последовательности олигонуклеотидного фрагмента связана только с химическим фрагментом (действую как «код»). Во многих случаях части одного и того же олигонуклеотида будут служить как олигомеризационный домен и код.
Олигонуклеотидный фрагмент
Природу и строение олигонуклеотидных фрагментов при получении ЕЗАСНЕЬ легче понять при описании «кодирующей системы», описанной ниже и в примерах. Для начала достаточно сказать, что путём стабильной ассоциации химических структур с уникальной олигонуклеотидной последовательностью (например, ДНК-последовательностью или аналогами ДНК) обеспечивается эта химическая структура с уникальным кодом, который может быть «прочитан» различными способами (секвенированием, гибридизацией с чипами ДНК и т.д.) и которая может быть подвергнута амплификации (например, при применении полимеразной цепной реакции [РСК]). Далее, используя методы, описанные ниже, код одно
- 5 006965 го конкретного химического соединения может стать физически связанным с кодом другого химического соединения (соединений), когда эти химические соединения связаны посредством олигомеризационного домена.
Олигомеризационные домены
Подходящие ДНК-последовательности (способные к образованию гетеродуплекса, триплекса |§1гоЬс1 8. А., Эсгуап Р. В. 8тд1с-5Йс спхутаОе с1сауадс о£ усач денопис ΌΝΑ тсШа1сб Ьу 1г1р1с Ьейх £огтайои. №1Шгс (1991) 350: 172-174] или квадруплекса [Уапоик аи1Ьог8. Пкис о£ Вюро1утст8 (2000-2001), уо1итс 56(3)] могут рассматриваться как возможные олигомеризационные домены.
Кроме того, можно рассмотреть применение других самособирающихся полипептидов (например, амфипатические пептидные спирали, такие как «застёжки-молнии» лейцина). Многие химические фрагменты можно рассматривать как медиаторы химических олигомерных фрагментов. Например, могут быть предусмотрены комплексы атомов металла с подходящими лигандами (такими как производные с дипиридильными или трипиридильными группами). Далее, можно представить, что нековалентное взаимодействие может объединить различные химические соединения, которые затем могут реагировать друг с другом и становиться ковалентно связанными.
Некоторые практические аспекты метода Е8АСНЕБ
Для того, чтобы проиллюстрировать один возможный аспект метода Е8АСНЕЬ, рассмотрим следующий пример (отражённый на фиг. 3). η различных химических соединений, содержащих реакционноспособную группу (например, реакционноспособную по отношению к тиолу малеимидо- или иодацетамидо-группу) реагируют (по отдельным реакциям) с η различных ДНК-олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособный фрагмент (например, тиольную группу в положении 3'). Соответствующий пул η конъюгатов обозначен на фиг. 3 как «пул А». Олигонуклеотиды пула А построены так, чтобы они имели одну часть ДНК-последовательности, которая может гибридизоваться с соединениями пула В (см. фиг. 3 и надписи внизу), отличительную ДНК-последовательность для каждого из η членов пула А, дополнительные части ДНК-последовательности, предназначенные для «декодирования» комбинаций связывания (возможного; см. ниже в разделе «Декодирование» и в примерах).
Подобно, количество т различных химических соединений, содержащих реакционноспособные по отношению к тиолу группы (например, малеимидо- или иодацетамидогруппы) реагируют (по отдельным реакциям) с т различных ДНК-олигонуклеотидов, содержащих тиольную группу в положении 5'. Соответствующий пул т конъюгатов обозначен на рассматриваемой фигуре как «пул В». Олигонуклеотиды пула В должны иметь одну часть последовательности ДНК, которая может гибридизоваться с соединениями пула А (см. фиг. 3), отличительную ДНК-последовательность для каждого из т членов пула В, дополнительные части ДНК-последовательности, предназначенные для «декодирования» комбинаций связывания (возможно).
Частично комплиментарные нити ДНК-конъюгатов пула А и пула В могут легко подвергаться гетеродимеризации в растворе со сравнительной эффективностью для различных η членов пула А и т членов пула В. Если применяют подходящие стехиометрические отношения соединений пула А и пула В, η различных типов соединений пула А будут вступать в реакцию гетеродимеризации с т различных типов соединений пула В, что приводит к получению комбинаторной полученной самосборкой химической библиотеки размером т х η. Например, две библиотеки тысяч соединений приведут к получению миллионов различных комбинаций. Далее, полученные самосборкой комбинации т х η, будут нести уникальные ДНК-коды, соответствующие нековалентной, но стабильной ассоциации (гетеродимеризации) ДНК-кода члена пула А с ДНК-кодом члена пула В.
В качестве альтернативы спаривания химических структурных единиц с олигонуклеотидами, содержащими тиольные группы, может быть рассмотрен ряд стандартных химических альтернатив (например, олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирную связь на одном конце, образующие химические структуры, такие как -ΟΡ(Ο)2-Ο-(ί.Ή2),-ΝΗ-ί,Ό-Β. где К. может соответствовать числу различных химических структур и η находится в интервале от 1 до 10).
Предположим, что один конкретный член библиотеки способен к специфическому связыванию с мишенью, представляющей интерес (например, белком, иммобилизованным на шарике). Предположим также, что обе нити А и В способствовали реакции специфического связывания (обсуждение хелатного эффекта, который может способствовать этому специфическому связыванию, см. ниже). Можно предпочтительно обогатить эту конкретную комбинацию А и В, превысив т х η комбинацией (например, подвергая библиотеку действию белка-мишени на шарике с последующим удалением шарика из библиотеки с последующей промывкой шарика для уменьшения количества неспецифических связывающих веществ на шарике). Специалистам в данной области будет очевидной аналогия этой процедуры методам биопэннинга, используемым в фаговых библиотеках антител (УШ, 2000).
Получение конкретной комбинации А и В, проявляющей желательную специфичность связывания, может сопровождаться идентификацией химических структурных единиц, ответственных за связывание,
- 6 006965 идентификацией ДНК-кодов двух нитей А и В (см. ниже раздел «Декодирование для обсуждения возможной стратегии при идентификации ДНК-кодов»).
Для ряда областей применения в конце процедуры получения ЕБАСНЕЬ может быть желательным связать две химические структурные единицы А и В, ответственные за специфическое связывание с мишенью (фиг. 3). Может быть желательно попробовать ряд различных химических линкеров и оценить, проявляют ли полученные химические соединения, полученные из химических структур А и В, нужные молекулярные свойства (например, высокое сродство к мишени, высокую специфичность к мишени, подходящую химическую стабильность, подходящую растворимость, подходящие фармакологические свойства и т.д.). Например, длина химического линкера между А и В сильно влияет на связывающие свойства конъюгата (обсуждение см. ниже раздел о хелатном эффекте).
На фиг. 3 часть ДНК используется как домен гетеродимеризации, и образование тиоэфирной связи используется для спаривания ДНК-олигонуклеотидов с химическими компонентами библиотеки. Однако можно иметь в виду другие олигомеризационные домены, а также другие химические структуры для спаривания с ДНК.
Известно, что некоторые ДНК-последовательности способны к образованию стабильных тримерных комплексов |§1гоЬс1, 1991] или стабильных тетрамерных комплексов [различные авторы, 2000-2001]. Например, спаривание ДНК-триплексов по Ноод81еп приведёт к самосборке пулов А х В х С, содержащих п, т и I членов, соответственно (фиг. 4). Тетрамерная сборка ДНК-(химический фрагмент) конъюгатов позволит получить библиотеки даже большего размера, исходя из подбиблиотек А, В, С и Ό меньшего размера. Однако декодирование реакций связывания в некоторых случаях может быть более трудным для тримерных и/или тетрамерных полученных самосборкой закодированных библиотек по сравнению с димерными библиотеками. Далее, длина и гибкость линкеров между нитями ДНК и химическими фрагментами, расположенными на их концах, может или облегчить, или воспрепятствовать идентификации членов специфического связывания полученной самосборкой химической библиотеки (ЕБАСНЕЬ). Некоторая степень гибкости может позволить подходящим химическим фрагментам найти комплиментарные карманы на молекуле мишени (фиг. 4). С другой стороны, ожидается, что влияние сродства на хелатный эффект уменьшит длину линкера.
Заслуживает упоминания то, что при использовании подбиблиотек из 100 членов тримерные библиотеки ЕБАСНЕЬ будут содержать 106 членов, а тетрамерные библиотеки ЕБАСНЕЬ будут содержать 108 членов. Легко вычислить размер получающейся библиотеки, исходя из подбиблиотек различных размеров. Большая комбинаторная сложность закодированных полученных самосборкой химических соединений позволяет идентифицировать члены специфического связывания, которые до сих пор не могли идентифицировать, используя обычные комбинаторные химические методы. Можно провести аналогию с фаговой технологией антител, где было показано, что размер библиотеки играет ключевую роль при выделении антител с высоким сродством.
Коды ЕБАСНЕЬ и методы декодирования
При создании ЕБАСНЕЬ уникальные олигонуклеидные последовательности (обычно ДНКпоследовательности) позволяют получить химические структуры с уникальным кодом. Сколько различных последовательностей нужно для идентификации членов библиотеки?
Как упомянуто выше, ключевыми компонентами методики ЕБАСНЕЬ являются химические соединения, содержащие олигонуклеидный фрагмент (обычно ДНК-последовательность), связанный с олигомеризационным доменом, в свою очередь связанным с химической структурой. В большинстве случаев олигонуклеидный фрагмент также обеспечивает образование олигомеризационных доменов. Как следствие, в большинстве случаев компоненты ЕБАСНЕЬ представляют собой химические структуры, спаренные с предварительно выбранными ДНК-олигонуклеотидами. Обычно такие олигонуклеотиды содержат постоянную часть и изменяющуюся часть (уникальная характеристика каждого члена библиотеки).
Рассмотрим как пример случай, отражённый на фиг. 3 и обсуждённый в разделе «Некоторые практические аспекты методики ЕБАСНЕЬ» (см. выше). В этом примере подбиблиотека «А» (содержащая п соединений, присоединённых в положении 3' ДНК-олигонуклеотидов) собирается с подбиблиотекой «В» (содержащей т соединений, присоединённых в положении 5' олигонуклеотидов). Подбиблиотека А может быть представлена ДНК-последовательностью х оснований, где 4х больше или равно п.
Подбиблиотека В может быть представлена ДНК-последовательностью у оснований, где 4У больше или равно т. В большинстве случаев (см. ниже) идентификация кода членов подбиблиотеки даёт также информацию о том, к какой подбиблиотеке относится конкретный код (и следовательно, к какому конкретному соединению).
Существуют многие методы «декодирования» кодов ЕБАСНЕЬ. Ниже мы рассмотрим три метода, которые соответствуют различным условиям эксперимента и демонстрируют гибкость методики ЕБАСНЕЬ.
Для простоты рассмотрим вариант ЕБАСНЕЬ, показанный на фиг. 3. Подходящий дизайн олигонуклеотидов, на котором основываются подбиблиотеки А и В, отражены на фиг. 5. Олигонуклеотиды подбиблиотеки А содержат химические фрагменты в положении 3'. ДНК-последовательность в направлении 3' предназначена для гибридизации в ДНК-последовательностями в положении 5' олигонуклеоти
- 7 006965 дов подбиблиотеки В. Участок гибридизации прерывается сегментом небольшого размера. В подбиблиотеке А этот небольшой сегмент обычно содержит фосфодиэфирную цепь без оснований (б-спейсер на фигуре); в подбиблиотеке В соответствующий короткий сегмент содержит уникальную последовательность для каждого члена подбиблиотеки (действующий, следовательно, как «код» для подбиблиотеки В). В противоположность этому, олигонуклеотиды подбиблиотеки А содержат их отличительный код в направлении 5'.
Если в конце биопэннинга выделяют несколько членов специфического связывания, получается несколько продуктов РСК. (полимеразный цепной реакции) по способу, показанному на фиг. 5. Эти продукты будут иметь сходные последовательности за исключением участков, кодирующих члены подбиблиотек А и В. Для того, чтобы узнать больше об относительном множестве различных членов специфического связывания, можно создать конкатемеры на основе различных продуктов РСК в реакционной смеси. Такие конкатемерные последовательности можно «прочитать» путём секвенирования, выявляя и идентичность, и частоту пар кода А и кода В (что отвечает только конкретным членам библиотеки).
Альтернативная стратегия декодирования отражена на фиг. 6. Подбиблиотеки А и В содержат химические фрагменты на концах частично гибридизованных олигонуклеотидов. В большинстве случаев часть ДНК, образующая гетеродуплекс, в библиотеке будет постоянной. В противоположность этому можно сконструировать другие концы, которые затрудняют образование гетеродуплекса. Такие не спаренные нити ДНК становятся доступными для гибридизации с олигонуклеотидами-мишенями (например, ДНК-олигонуклеотидами, иммобилизованными на одном или нескольких чипах). Например, чип А позволяет читать идентичность (и частоту) членов подбиблиотеки А, полученных после биопэннинга. Подобным образом, чип В позволяет проводить чтение идентичности (и частоты) членов подбиблиотеки В. Можно применить различные стратегии (например, радиометку ДНК, биотинилирование ДНК с последующим детектированием при помощи реагентов на основе стрептавидина и т.д.) для визуализации реакции связывания на чипе.
На первой стадии метод декодирования, отражённый на фиг. 6, не даёт информации о спаривании кода А и кода В среди членов специфического связывания. Однако, декодирование на чипах А и В даёт возможность определить кандидаты-компоненты подбиблиотек А и В для повторной гибридизации и скрининга в последовательных циклах биопэннинга. Связывание во всё более строгих условиях с мишенью отражается в непрерывном уменьшении числа членов А и В, идентифицированных на чипе. Наконец, возможные комбинации кандидатов - членов в А и В, собираются в отдельности (или маленькими пулами) и анализируются на связывание с мишенью. Этот метод мы называет деконволюцией.
Очевидно, что метод декодирования, отражённый на фиг. 6, применим также для ЕЗАСНЕЬ, когда библиотеки самосбираются с образованием тримерных или тетрамерных комплексов (например, используя ДНК-триплексы или квадруплексы для олигомеризации соединений). В этих случаях можно использовать три или четыре чипа, соответственно, которые содержат отличительные олигонуклеотиды мишени для декодирования.
Если это желательно, ДНК выбранных фрагментов связывания на фиг. 6 может быть амплифицирована при помощи РСК до гибридизации на чипе. В этом случае дизайн олигонуклеотида будет напоминать дизайн, описанный в следующем параграфе (см. также фиг. 7).
Ещё один возможный метод декодирования показан на фиг. 7. Подбиблиотеки А и В образуют гетеродуплекс, фланкированный уникальными последовательностями, кодирующими различные члены библиотек, и постоянными сегментами ДНК на концах. После биопэннинга подходящие пары праймеров позволяют осуществить амплификацию двух нитей при помощи РСК с получением продуктов РСК, последовательность которых может быть идентифицирована стандартными методами (например, конкатенированием продуктов РСК с последующим субклонированием и секвенированием). Подобно методу, основанному на применении чипов и показанному на фиг. 6, метод на фиг. 7 в общем не даёт непосредственной информации о спаривании кода А и кода В в членах пары специфического связывания. Однако (подобно описанному на фиг. 6) может быть применён метод деконволюции (состоит из одного или нескольких циклов пэннинга с последующим секвенированием и выбором ограниченного набора компонентов подбиблиотек для скрининга следующей ЕЗАСНЕЬ), ограничивающий число членов ЕЗАСНЕЬкандидатов, способных после самосборки образовывать соединения для специфического связывания.
Конструирование библиотек
Конструирование библиотеки ЕЗАСНЕЬ облегчается не только за счёт большого размера, который может быть достигнут самосборкой подбиблиотек, но также за счёт более лёгкого генерирования и простой очистки химических производных ДНК-олигонуклеотидов.
Как упомянуто выше, ДНК-олигонуклеотиды, содержащие тиольную группу в положениях 3' и 5', могут быть приобретены у ряда производителей. Химия модификации тиольных групп реагентами, содержащими реакционноспособные группы, такие как иодацетамидная группа или малеимидная группа, хорошо разработана (см., например, каталог РтоЬек на сайте \\л\лт.ргоЬс5.еот). Далее из литературы известны несколько методов химической модификации 3'- и 5'-групп в ДНК-олигонуклеотидах, например, в процессе синтеза в твёрдой фазе.
- 8 006965
Химические производные ДНК (или некоторые аналоги ДНК) имеют свойство быть отрицательно заряженными при нейтральном рН. Это облегчает развитие общей стратегии очистки ДНК-производных. Например, анионообменная хроматография позволяет осуществлять нековалентную (но стабильную) иммобилизацию ДНК-олигонуклеотидов (и их производных) на смоле, в то время как другие компоненты реакционных смесей могут быть удалены промывкой. ДНК-производные затем можно элюировать путём буферного обмена. Можно применять другие методы очистки (например, хроматографию в обращенной фазе, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, хроматографию на гидроксиапатите и т.д.).
Доступность общепринятых методов очистки производных ДНК делает синтез компонентов Е8АСНЕЬ легко поддающимся роботизации (например, с применением станции ТЕСАЫ Сепекук 200-Ьакеб (ТЕСАЫ, МаппебогГ, 8^11хег1апб). снабжённый жидкостной системой и манипулятором-роботом). Роботизация может быть необходимой для создания подбиблиотек Е8АСНЕБ, содержащих несколько сотен различных соединений.
Методики, описанные в данной заявке, применимы не только для маленьких органических молекул, но также для пептидов и олигомерных белков (например, фрагментов Εν антител, состоящих из доменов УН и УЪ; см. пример 1). Действительно, прикрепление ДНК-гетеродуплекса на С-конце меченных цистеином доменов УН и УЪ обеспечивает экстрастабилизацию гетеродимера Εν.
Биопэннинг
Применение Е8АСНЕБ для идентификации соединений для специфического связывания основано на инкубации компонентов Е8АСНЕБ вместе с молекулой мишени (например, белка, представляющего интерес для фармакологии), с последующим физическим отделением полученного комплекса от компонентов Е8АСНЕБ, которые не связаны с мишенью. В этом отношении этот биопэннинг аналогичен биопэннингу, который может быть осуществлён с фаговыми библиотеками и/или библиотеками рибосом, о которых имеется много сведений и протоколов в литературе [^1и1ет, 1994; νίίί, 2000; ЗсйаГГйхек 1999]. Например, физическое отделение комплекса, образованного членами Е8АСНЕБ и молекулой мишени, от пула несвязанных членов Е8АСНЕБ может быть достигнуто путём иммобилизации молекулы мишени на твёрдой подложке (например, трубке из пластмассы, смоле, магнитных шариках и т.д.).
Хелатный эффект
Некоторые преимущества технологии Е8АСНЕБ при идентификации специфического связывания имеют отношение к химическому процессу, называемому «хелатным эффектом». Термин «хелат» впервые был применён в 1920 г сэром Гилбертом Т. Морганом и Н.Д. Дрю [I. Сйет. 8ос, 1920, 117, 1456], которые заявили: «Прилагательное «хелатный», образованное от слова «большая клешня» или «сйе1а» (сйе1у-греч.) лобстера или других ракообразных, предлагается для обозначения похожих на кронциркуль групп, которые функционируют как две связанные единицы и присоединены к центральному атому с образованием гетероциклических колец».
Хелатный эффект может быть виден при сравнении реакции хелатного лиганда и иона металла с соответствующей реакцией с участием сравнимых монодентатных лигандов. Например, сравнение реакции связывания 2,2'-дипиридина с пиридином или 1,2-диаминоэтана (этилендиамина) с аммиаком. Уже много лет известно, что сравнение этого типа всегда показывает, что комплекс, полученный в результате координации с хелатирующим лигандом, является гораздо более стабильным с точки зрения термодинамики.
Рассмотрим стадии диссоциации монодентатного лиганда по сравнению с мультидентатом (например, бидентатными лигандами). Когда монодентатная группа вытесняется, она теряется в массе раствора. С другой стороны, если один конец бидентатной группы вытесняется, другое «плечо» остаётся всё ещё присоединённым, и всё дело заключается во вращающемся плече и оно может быть снова присоединено (фиг. 8). В общем образование комплекса с бидентатными группами является более благоприятным, чем образование комплекса с соответствующими монодентатными группами.
Было показано, что хелатный эффект способствует связыванию с высоким сродством не только в случае мультидентатных лигандов металлов, но и во многих других ситуациях в химии, включая реакции связывания с макромолекулами (например, мультидентатное ДНК-связывание, хелатирующие рекомбинантные антитела) |№π Ό., Мото М., Ргокрего Т., ХУйНег С., Нщй-аГПпйу апБдеп Ьшбтд Ьу сйе1а1йщ гесотйтагИ апйЬоб1ек (СКАЬк) I. Мо1. Вю1, (1995)246:367-73].
При проверке некоторых вариантов Е8АСНЕБ, например, тех, когда два химических соединения олигомеризуются посредством образования ДНК-гетеродуплекса, полезно проиллюстрировать хелатный эффект в контексте стабильности ДНК-гетеродуплекса, который связывает два химических соединения, участвующих в реакции специфического связывания с мишенью. В большинстве случаев будет удобно иметь гетеродуплексы (или триплексы, или квадруплексы), которые бе ГасЮ не диссоциируют в условиях опыта, выбранных для биопэнинга Е8АСНЕБ. Полезную информацию и дискуссию об энергетике кооперативного связывания с короткими фрагментами ДНК-гетеродуплекса (8Ьр) можно найти в работе Э|81еГапо и Эеишс 1993 |Э|к1еГапо М. Ό., Эег\'ап Р. В. ЕпегдеБск оГ соореШАе Ьшбтд о£ о1щогшс1еоббек \\йй б!ксге1е бипеп/абоп боташк Ю ЭХА Ьу 1пр1е йейх ГогтаБоп. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А (1993), 90: 1179-1183].
- 9 006965
Рассмотрение процедур, следующих за биопэнингом Е8АСНЕБ
Что следует за опытами по созданию Е8АСНЕБ, когда члены пары специфического связывания определены? Для некоторых целей (например, некоторых биохимических экспериментов) можно использовать члены Е8АСНЕБ без дальнейших химических превращений. Например, может быть желательным измерить сродство к связыванию и кинетические константы связывания членов Е8АСНЕБ с молекулой мишени.
Для многих областей применения, однако, может быть желательным превращение полученных самосборкой молекул Е8АСНЕБ в аналоги, в которых химические фрагменты, ответственные за связывание, соединены ковалентно. Длина, жесткость, стереоэлектронные химические свойства и растворимость линкера будут влиять на сродство к связыванию и характеристики полученной молекулы [Зйикег 8. В, 11ад1ик Р. I., Меаскжъ К.Р, Еез1к 8. ^. В1зсоуеппд Н1дй-А£11ш1у Е1дапйз 1ог Рго1е1пз - 8аг Ьу Ншг. 8е1епее (1996) 274: 1531-1534] (см. также пример 4).
Примеры
Пример 1.
Как упоминается в предыдущих разделах, одним из преимуществ Е8АСНЕБ является совместимость с различными химическими фрагментами, включая пептиды и глобулярные белки (например, домены антител).
В этом примере показано, как простой вариант Е8АСНЕБ (фиг. 1), характеризующийся вариабельными доменами меченых цистеином антител, связанными ковалентно с ДНК-олигонуклеотидами, способными к образованию частичных гетеродуплексов, приводит к идентификации пары вариабельного тяжёлого домена (УН) и вариабельного лёгкого домена (УЬ), которые после гетеродимеризации обеспечивают специфическое связывание антигена.
Гены доменов УН и УБ антитела Б19 (специфического для ЕО-В-домена фибронектина [Ρΐπΐ А, УШ Е., 8ап1исс1 А., Сагпешойа В., 2агй1 Б., №π Р., №π Ό. Вез1§п апй изе о£ рйаде Шзр1ау ИЬгагу. Нитап ап11ЬоШез ^йй 8иЬпапото1аг айтйу адатз! а тагкег о£ апдюдепез1з е1и!ей 1гот а 1жо-Штепзюп де1. I. Вю1. Сйет. (1998) 273: 21769-21776]) антитела НуНЕБ-10 (специфического для лизозима куриного яйца [№п, 1995]; имеется в виду, что внутренний сайт ЕсоК! предварительно подвергнут мутагенезу без изменения белковой последовательности) и других антител, выделенных из библиотеки ЕТН-2 [УШ, 2000], подвергнуты амплификации с помощью РСК с использованием следующих пар праймеров, которые кодируют остаток цистеина, подвешенный на С-конце каждого У-домена:
Ь19 и ЕТН-2:
Ы9УН_Есо_Го
ТТТ САС АСА ΘΑΑ ТТС АТТ ААА ОАО ОАО ААА ТТА АСТ АТС САС СТС САС СТС
ТТС САС ТСТ
Г19\Т1НтдЬа
ТСА АТС ТСА ТТА АСС ТТА СТС АТС СТС АТС АСА ТСС АСС АСТ ССА САС СОТ
САС САС ССТ
Ы9УГЕсоДо
ТТТ САС АСА САА ТТС АТТ ААА ОАО САС ААА ТТА АСТ АТС САА АТТ СТС ТТС
АСС САС ТСТ ССА
Ы9УЬ_Нша_Ьа
ТСА АТС ТСА ТТА АСС ТТА СТС АТС СТС АТС СТС АТС АСА ТСС АСС ТТТ САТ
ТТС САС СТТ ОСТ ССС ТТС
НуНЕЬ-10:
ГШ10УНЕсо1о
ТТТ САС АСА САА ТТС АТТ ААА ОАО ОАО ААА ТТА АСТ АТС ОАО СТС ААС
СТС САС САС ТСТ
НН10УННш<1_Ьа
ТСА АТС ТСА ТТА АСС ТТА СТС АТС СТС АТС СТС АТС АСА ТСС АСС ТСС АСА
САС АСТ САС САС АСТ
- 10 006965
НН10УЬ_Есо_£о
ТТТ САС АСА ОАА ТТС АТТ ААА ОАО САС ААА ТТА АСТ АТС САС АТТ ОТО СТА
АТС САО ТСТ ССА
НН10УЪ_Нтс1_Ьа
ТСА АТС ТОА ТТА АОС ТТА СТС АТС СТС АТС СТС АТС АСА ТСС АСС ТТТ ТАТ
ТТС САС СТТ ОСТ ССС ССС
Полученные продукты РСК подвергают субклонированию с помощью стандартных методов молекулярной биологии в сайты ΕοοΚΙ/ΗΐηάΙΙΙ плазмиды ррЕ12 (Р1адеи, Оегтаиу). Полученные плазмиды кодируют У-домены, содержащие следующую последовательность на С-конце: -О1у-О1у-Су8-Н18-Н18Ηΐδ-Ηΐδ-Ηΐδ-Ηΐδ.
Плазмиды, кодирующие меченые цистеином У-домены, вводят методом электропорации в клетки Е.соЕ (предпочтительно, в штамме Опдат №уа«еп, который имеет слегка окисляющий цитоплазмический потенциал), подвергают экспрессии и очистке с помощью металлхелатной хроматографии на смоле Ν1ΝΤΑ (Р1адеи, Оегтаиу).
Меченые цистеином У-домены восстанавливают с помощью 1 мМ раствора дитиотреола в РВ8 (50 мМ фосфатного буфера + 100 мМ №С1, ρΗ = 7,4) с последующим обессоливанием на колонке ΡΌ-10 (АтегзЕат-РЕагтаОа, ОиЬепсСогГ, 8\уИ/ег1апС).
Параллельно получают от поставщика (например, М1сго8уи1Е, Ва1дасЕ, 8\уЕ/ег1апС) различные олигонуклеотиды, содержащие тиольную группу в положении 3' или 5'. Индивидуальные ДНКолигонуклеотиды с тиольной группой в положении 3' используются для спаривания с индивидуальными ΥΗ-доменами. Индивидуальные ДНК-олигонуклеотиды с тиольной группой в положении 5' используют для спаривания с индивидуальными УЕ-доменами.
Репрезентативные типы последовательностей показаны ниже. Олигонуклеотиды этих семейств способны к частичному образованию гетеродуплекса:
Ы9:
Ь19_58Н
5-Н8-ООА ССТ ТСТ ОАА ТТС ТОТ ОТО СТС САТ ААТ ССА САС ОАА ТТС СОС
АОС-3'
Ь19_38Н
5'-ТСО ООА ООО ОАА ТТС ОТС АТА ТАТ САО САС АСА ОАА ТТС АОА АОС ТСС8Н-3'
НуНЕЬ-10:
НуНЕЬ10_58Н
5-Н8-ООА ОСТ ТСТ ОАА ТТС ТОТ ОТО СТО САО ТОО СОА САС ОАА ТТС СОС
АОС-3'
НуНЕЫ0_38Н
5-ТСО СОА ООО ОАА ТТС ОТС АТА ООО САО САС АСА ОАА ТТС АОА АОС ТСС8Н-3'
Апй-С8Т (Ггот ЕТН-2 НЬгагу):
С8Т_58Н
5-Н8-ООА ОСТ ТСТ ОАА ТТС ТОТ ОТО СТО СТО АОО СОА САС ОАА ТТС СОС
АОС-3’
С8Т_38Н
5-ТСО СОА ООО ОАА ТТС ОТС ААО АОО САО САС АСА ОАА ТТС АОА АОС ТСС8Н-3'
В параллельных реакциях очищенные тиолсодержащие ДНК-олигонуклеотиды реагируют с мольным избытком бисмалеимидо-гексана (Р1егсе, Ве1дшт) в РВ8 + ΌΜ8Ο согласно инструкции изготовителя. Полученные производные очищают от не прореагировавшего бисмалеимидо-гексана с помощью анионообменной хроматографии, затем подвергают реакции с небольшим мольным избытком очищенно
- 11 006965 го УН-суз или УЬ-суз, соответственно, с концентрацией домена > 0,1 мг/мл. Полученные продукты реакции (V-домен)-ДНК отделяют от не прореагировавшего У-домена с помощью анионообменной хроматографии.
Эквимолярную смесь производных (У-домен)-ДНК смешивают в среде РВБ, нагревают при 70°С в течение 1 мин, затем выдерживают до достижения комнатной температуры. Затем полученную смесь соединений ЕБАСНЕЬ инкубируют вместе с 0,1 мкМ раствором биотина-ЕО-В в среде РВБ при комнатной температуре в течение 10 мин (Ρΐηΐ, 1998), затем связывают с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином, и тщательно промывают согласно стандартным методам.
Полученный препарат используют затем в качестве темплата для двух раздельных РСК-реакций, когда происходит амплификация (Ь19_58Н, НуНе110_5БН, ОБТ_5БН) и (ь19_3БН, НуНе110_3БН, ОБТ_3БН) олигонуклеотидов (см. выше), используя олигомеры:
1АВРСКЫ
5'-СгСтА СТС ТСТ САА ТТС ТОТ СТО СТО-3'
1АРСКЬа
5-ОТС ОСО ОАА ТТС СТС ТСС-3'
1В РСКЬа
5-ТСО ССАООО СААТТС СТС-3'
Полученные РСК-продукты обрабатывают ЕсоК1, лигируют для получения конткатенамеров, субклонируют в подходящую плазмиду с последующей электропорацией в Е.сой и секвенированием.
Анализ полученной последовательности показывает сильное смещение в сторону кодов Ь19 (САТ ААТ и АТА ТАТ) по сравнению с кодами НуУЕЕ.10 и ОБТ, что показывает предпочтительное наличие комбинации УН(Ь19)-УЬ(Ь19) по сравнению с другими возможными продуктами сборки.
Пример 2.
В этом примере описывается, как вариант ЕБАСНЕЬ, отражённый на фиг. 1, может быть осуществлён практически. Стратегия, описанная в данном примере, применима также для вариантов, изображённых на фиг. 4, когда для выявления химических фрагментов на концах получающихся самосборкой олигонуклеотидов используют ДНК-триплексы или ДНК-квадруплексы.
Конструирование двух библиотек осуществляют следующим образом. Создают подбиблиотеку «А» путём получения конъюгатов η соединений, присоединённых к 3'-концу η различных ДНКолигонуклеотидов. Среди многих возможных различных вариантов подходящим является присоединение иодацетамидных или малеимидных производных η химических соединений к индивидуальным ДНКолигонуклеотидам, которые содержат тиольную группу в положении 3'. Присоединение можно легко осуществить при комнатной температуре в среде РВБ (50 мМ фосфатного буфера + 100 мМ КаС1, рН = 7,4), путём простого смешения олигонуклеотида, содержащего тиольные группы (типичная концентрация: 10-100 мкМ), с мольным избытком производного, содержащего иодацетамидную группу или малеимидную группу (типичная концентрация: 50-500 мкМ) с последующей хроматографической очисткой аддукта ДНК-химическое соединение. Олигонуклеотиды, содержащие тиольные группы, можно приобрести у производителей. Каждый из них содержит постоянную часть последовательности (например, 5'ХХХХХСАОСАСАСАОААТТСАОААОСТСС-3'), способную к образованию гетеродуплекса с членами подбиблиотеки В (см. ниже). Часть ДНК-последовательности ХХХХХ в положении 5' (по меньшей мере, частично) в каждом члене подбиблиотеки А разная и действует как код.
Подобным образом создают подбиблиотеку «В» путём присоединения т соединений в положении 5' т разных ДНК-олигонуклеотидов. Присоединение иодацетамидных или малеимидных производных т химических соединений к индивидуальным ДНК-олигонуклеотидам, которые содержат тиольную группу в положении 5', осуществляют, как описано для подбиблиотеки «А». Такие олигонуклеотиды можно купить у производителей. Каждый из них содержит постоянную часть последовательности (например, 5'ООАОСТТСТОААТТСТОТОТОСТО¥¥¥¥¥-3'), способную к образованию гетеродуплекса с членами подбиблиотеки А (см. выше). Часть ДНК-последовательности ΥΥΥΥΥ в положении 3' в каждом члене подбиблиотеки В является разной (по меньшей мере, частично) и действует как код.
Сборка членов подбиблиотеки А с членами подбиблиотеки В осуществляется путём смешения подбиблиотек в среде РВБ, нагревания смеси при 70°С в течение 1 мин (если это согласуется со стабильностью химических соединений, использованных при конструировании подбиблиотек) с последующей выдержкой при комнатной температуре. Полученная подбиблиотека ЕБАСНЕЬ содержит η х т членов и может быть использована при проведении биопэннинга с последующим декодированием членов пары связывания.
Пример 3.
Этот пример иллюстрирует один из многих возможных методов декодирования для вариантов ЕБАСНЕЬ, отражённых на фиг. 1 и в примере 2. Стратегия декодирования, показанная схематически на
- 12 006965 фиг. 5, основана на том принципе, что после биопэннинга требующихся специфичностей связывания ЕЗЛСНЕБ получаются продукты РСК, каждый из которых содержит код пар членов подбиблиотеки, комбинация которых была получена при биопэннинге, что позволяет идентифицировать соответствующие гетеродимеризованные химические структуры.
Химические структуры подбиблиотек А и В (см. также фиг. 1 и пример 2) соединяются по отдельности с членами двух пулов ДНК-олигонуклеотидов со следующими свойствами:
Один пул олигонуклеотидов содержит химические фрагменты в положении 3' (пул А), а другой пул содержит химические фрагменты в положении 5' (пул В). Достаточное количество оснований в положении 5' олигонуклеотидов пула В позволяет осуществить специфическую димеризацию любого отдельного члена пула В с любым отдельным членом пула А. В этом димеризационном домене олигонуклеотиды из пула В содержат участок «кода», который кодирует химический фрагмент в положении 5'. Олигонуклеотиды пула А содержат достаточное число звеньев дезоксирибозы без оснований (й-спейсер) для предотвращения любого нежелательного присоединения к основаниям кода В. Олигонуклеотиды подбиблиотеки В остаются стабильно гибридизованными с олигонуклеотидами подбиблиотеки А и могут работать как праймеры для реакции ДНК-полимеразы на темплате А. Полученный сегмент ДНК, содержащий и код А, и код В, можно подвергнуть амплификации (обычно с помощью РСК.), используя праймеры, которые подвергаются гибридизации на постоянных кодах сегмента ДНК (фиг. 5).
Пример модели олигонуклеотидов А и В, которые могут быть использованы для получения продукта РСК, который содержит оба кода А и В, приведён ниже:
тип В_олиго
Химический фрагмент В - 5'-ОСА ТСА СОО ААТ ТСС САС САТ ААТ СЛТ ССС ТАТ ССС ТСС-3' тип А_олиго (й = й - элемент спейсера)
5'-ССТ САС СТС САА ТТС ТСС АТА ТАТ ОСА ССС АТА ССС АТС ΌΌΌ ΌΌΌ СТС ССА АТТ ССС СТА ТСС-З'-химический фрагмент А
СойеАВГо
5'-ССА ТАС ССС ААТ ТСС САС-3'
СойеАВЬа
5'-ССТ САС СТС САА ТТС ТСС-3'
Тип А_олиго и тип_В олиго смешивают в примерно эквимолярных количествах. Полученную смесь нагревают при 70°С и охлаждают до комнатной температуры для осуществления гетеродимеризации типа А олиго и типа В олиго. Полученную смесь смешивают с подходящим буфером для РСК, йЛТР3 (250 мкМ на нуклеотид, РЬагшас1а). Затем добавляют Тад-полимеразу (1 ед., АррНдеп) и осуществляют инкубацию смеси при 40°С в течение 5 мин. Затем после добавления праймеров СойеАВ£о и СойеАВЬа (400 мкМ) запускают программу РСК с 30 циклами (90°/1 мин) - (50°С/1 мин) - (72°/15 с). После завершения программы длину фрагмента РСК проверяют стандартным методом с использованием полиакрилимидного геля Ыоуех. Идентичность последовательности может быть установлена обработкой продукта ЕсоК1 с последующим клонированием в подходящую плазмиду и секвенированием.
Пример 4.
Как и в случае рекомбинантных антител (СКАЬк) |№гг 1995] и маленьких органических лигандов, идентифицированных с использованием 8АК с помощью ЯМР [§Ьики, 1996], связывание с высоким сродством членов Е8АСНЕЕ с молекулами мишени может основываться на хелатном эффекте.
Считают, что положительный вклад величины сродства в хелатный эффект зависит от длины, жёсткости, стереоэлектронных химических свойств и стабильности связи между двумя (или несколькими) химическими структурами в контакте с антигеном-мишенью. Далее, влияние сродства непосредственно зависит от величины констант скорости ассоциации и диссоциации (коп и к,о[3) индивидуальных химических соединений, присоединяющихся к мишени.
В этом примере описана компьютерная модель, которая даёт информацию о вкладе хелатного эффекта по отношению к вышеупомянутым параметрам (длина линкера, коп и ко££).
Как показано на фиг. 9, два различных химических соединения А и В присоединяются к разным сайтам связывания одной и той же молекулы мишени и связаны линкером определённой длины. Удобно обозначить четыре различные состояния (ηΐ, ηΙΙ, пШ и п1У), которые могут взаимопревращаться путём химического связывания:
ηΙ: и «А», и «В» связаны со своим карманом связывания;
ηΙΙ: «А» связано со своим карманом связывания, а «В» не связано с карманом связывания; пШ:«В» связано со своим карманом связывания, а «А» не связано с карманом связывания; пГУ: и «А», и «В» не связаны со своими карманами связывания.
Кинетические параметры копА, ко££А, копВ и ко££В, описывающие связывание индивидуальных химических соединений А и В с соответствующими карманами связывания, известны. На основе этих констант можно определить вероятность отсоединения связанной молекулы от кармана связывания (ро££) и связывания несвязанной молекулы со своим карманом связывания (роп) в определённый отрезок времени.
ро££ = ко££ -А1 [1]
- 13 006965
Согласно кинетике первого порядка полупериод связывания может быть выражен следующим образом:
τοη = 1η2 /(κοη · [В]) [2]
Если в момент времени ΐ = 0 все молекулы В не связаны с соответствующим карманом связывания (и если пренебречь процессами диссоциации в первом приближении), фракция связанных молекул через промежуток времени Δΐ может быть выражена следующим образом:
Ν(Δΐ)/Ν(ΐ=θ) = е Δΐ к01г[В] [3]
Если выбрать достаточно большое количество молекул, уравнение [3] можно аппроксимировать для возможности связывания молекулы В с карманом в промежуток времени Δΐ.
Эти уравнения соответствуют химическим соединениям А и В, которые связываются с соответствующими карманами независимо друг от друга. Предположим, однако, что А и В соединены линкером и что соединение А присоединено к своей мишени. Удобно выразить концентрацию В вблизи кармана связывания как эффективную концентрацию «ес».
ροη = еЛк0-ес [4]
В случае модели согласно изобретению вклад хелатного эффекта в процесс связывания бидентатной молекулы А-В с мишенью обусловлен увеличением эффективной концентрации одной из двух молекул присоединения, когда другая связана со своим карманом связывания (фиг. 9). Предположим для простой модели, что если молекула А связана, молекула В может быть расположена с равной вероятностью в каждом положении в полусферическом пространстве вокруг молекулы А, причём радиус «гай» (измеренный в м) равен длине линкера. Стерические препятствия линкера, эффекты отталкивания и т.д. в простой модели не учитываются. То же предположение используется и в случае, когда молекула В связана, а молекула А остаётся несвязанной. В результате мольная эффективная концентрация «ес» может быть вычислена как:
ес = 1 / [1/2·(4/3·π·Γαά3)·6,01·1026] [5]
Основываясь на этих предположениях, авторы изобретения создали компьютерную программу для оценки вклада хелатного эффекта в остаточный полупериод связывания бидентатной молекулы А-В, где два индивидуальных соединения А и В, связанные с двумя разными карманами связывания той же самой молекулы мишени, связаны линкером длиной «гай». Возможностью связывания А и В с двумя разными молекулами мишени пренебрегают.
В популяции η молекул А-В четыре состояния, отражённые на фиг. 9, могут включать отдельные молекулы, и понятно, что отдельные молекулы находятся в разных состояниях в разные моменты наблюдения. Для нашей модели мы определили возможность ροη и ροίΐ индивидуальных молекул А и В менять состояние в промежуток времени Δΐ.
Как практический пример рассмотрим случай, когда в момент времени ΐ = 0 все молекулы А-В находятся в состоянии ηΐ (и А, и В связаны). В каждый промежуток времени Δΐ (равный 1 с в программе) возможности молекул А и В изменить свой статус связывания дают толчок новому распределению молекул А-В в четырёх разных состояниях. При моделировании учитываются условия необратимой диссоциации (а именно, диссоциированные молекулы А-В в состоянии ηΐν не имеют возможности снова связываться с мишенью). Программа повторяет эти расчёты в каждый промежуток времени, до тех пор, пока популяция молекул А-В, связанных с мишенью (сумма ηΐ, ηΐΐ и ηΐΐΐ) не уменьшится наполовину от первоначального количества. Сумма промежутков времени представляет собой величину полупериода связывания молекулы А-В с мишенью.
Варьируя или начальную конфигурацию семейства молекул, или параметры кйА, к^, Ι<οι1Β и «гай», можно оценить вклад в хелатный эффект различных связанных химических молекул в терминах кинетической стабилизации комплекса.
Код соответствующей программы СНЕЬАТЕ (написана на языке РА8С8Ь) приведён ниже.
рго£гат сйе1аке;
уаг
- 14 006965 η, ηΟ, ко££А, койВ, койАВ, копА, копВ :боиЫе;
112Р, 112В, 112АВ, габ, сопс: боиЫе;
линкерА : целый;
ηΐ, ηΠ, ηΙΙΙ, ηΐν , бека1, бекаП, бекаШ, бека1У :боиЫе; ρΑοίί, ρΑοη, ρΒοίί, рВоп, : боиЫе;
начало λντίίεΐη;
νντίΐεΐη (молекулы А и В соединены линкером); ν/πΐεΐη;
νντΐίβΐη ('коРРА [8-1] ='); (*1уре ΐη уа1иез*) геаб1п (коРРА);
νντΐίεΐη (' копА [М-18-1] =');
геаскп (копА);
λντΐίεΐη ('коРРВ [8-1] = ');
геаб1п (коРРВ);
ννπΐεΐη ('копВ [з-1] = ');
геаб1п (копВ);
мтке1п;
ννπΐεΐη (' длина линкера [А] =');
геаб!п (линкер А);
112А:=1п(2)/коРРА; (*рассчитать 112 и концентрацию*) 112В:=1п(2)/коРРВ;
габ: линкер А*1е-10;
сопс:=1 /((2/3 *Р1*габ*габ*габ)*6.01 е26);
ννπΐεΐη ('коРРА-,койА,' 112 А-,112А,' копА-,копА); ννπΐεΐη (‘койВ=’,койВ, ‘ 112В=’,112В,’ копВ-,копВ); λντΐΐεΐη ('длина линкера [ш] = ’,габ);
νντίΐεΐη ('эффективная концентрация [М]=',сопс);
νντϊΐεΐη
- 15 006965 ί12ΑΒ:=0; (* Параметры*) пО:=1еЮ;
ηΙ:=0; ηΙΙ:=0; пШ:=0; пГУ:=0; (*в этом варианте программы только состояние ηΐ содержит молекулы в момент времени 0*) η:ηΙ + ηΙΙ + пШ;
ρΑοίΓ:=κοίϊΆ;
ρΑοη.-1 -ехр(-1 *копА*сопс);
рВо££:=койВ;
рВоп:=1-ехр(-1 *копВ*сопс);
при условии η > пО/2 начало <1е1Га1:=0; кекаП:=0; йе11аШ:=0; кекаУ1:=0;
П2АВ:=112АВ+1; (*одна петля равна 1с*) (*п1*) кекаУ1:= 0е11аУ1 +(ηΙ*ρΑοίϊ*ρΒοίϊ);
0ека1П:= кекаШ +(ηΙ*ρΑοίϊ*(1-ρΒο£ί));
кекаЛ:= кекаП +(п1*(1-рАой)*рВой);
кека1:= кека1 -(ηΙ*ρΑοίϊ*ρΒοίϊ);
кека1:= кека1 -(п1*рАо£Е*(1-рВой));
ие1!а1:= иека! -(ηΙ*(1-ρΑο£ι)*ρΒο£ί);
(*пП*) кекаШ:= кекаШ +(ηΙΙ*ρΑοίΡρΒοη);
кекаУ1:= кекаУ1 +(ηΙΙ*ρΑοίϊ*(1-ρΒοη));
кека1:= кека1 +(ηΙΙ*(1-ρΑοίϊ)*ρΒοη);
кекаП:= кекаП -(ηΠ*ρΑοίϊ*ρΒοη); .
кека11:= кекаП -(ηΙΙ*ρΑο£Π(1-ρΒοη));
ке11аП:= кекаП -(ηΙΙ*(1-ρΑο£ί)*ρΒοη);
(*пШ*)
- 16 006965 кекаП:= кекаП +(пШ*рАоп*рВой);
кекак= кека1 +(пШ*рАоп)*(1-рВо£Е);
кекаУ1:= кекаУ1 +(пШ*(1-рАоп)*рВо£Е); кекаШ:= кекаШ -(ηΙΠ*ρΑοη*ρΒοίϊ);
кекаШ:= кекаШ -(пШ*рАоп*(1-рВо££)); кекаЛ:= кекаШ -(пШ*(1-рАоп)*рВо£Е);
ηΐ :=ηΙ + кека1;
ηΙΙ :=ηΙΙ + кекаП;
ηΙΙΙ :=ηΠΙ + кекаШ;
п1У :=п1У + кекаГУ;
η:=ηΙ+ηΙΙ+ηΙΙΙ (* пГУ удалено из оставшейся популяции*) νντίΐεΐη (η,' 'Д12АВ);
конец;
νντίΐεΐη;
νντίΐεΐη ('ко£ЕА=', ко££А,' ΐ12Α-,ΐ12Α,' копА=',копА);
у/гке1п ('ко£ЕВ=', койВ, 'ΐ12Β=',ΐ12Β,' копВ=',копВ);
ννπΐβΐη ('длина линкера [ш]=',гак);
У¥гке1п ('эффективная концентрация [М]~ ,сопс);
νντίΐβΐη;
ν/πίεΐη ('ΐ12ΑΒ=',ΐ12ΑΒ,' §');
у/гке1п;
геак1п; конец.
Пример 5.
Во многих случаях желательно повысить сродство существующего соединения к связыванию с молекулой мишени (например, фармацевтической мишени). Для достижения этой цели технологию Е8АСНЕЬ можно использовать следующим образом, а именно, исключить «код» олигонуклеотидной последовательности из оптимизируемого соединения, участвующего в связывании. Предположим, что химическое соединение р связывается с молекулой мишени (например, белка) с недостаточным сродством. Можно связать р с одним концом (например, 5') подходящего олигонуклеотида, способного к самосборке с другими производными олигонуклеотидов (обычно путём образования гетеродуплекса, как отражено на фиг. 10). Например, химический фрагмент р спаривается в положении 5' с олигонуклеотидом 5' - 5'
- 17 006965
ОСА ОСТ ТСТ САА ТТС ТОТ СТС СТС -3'. Можно по отдельным реакциям химически присоединять многие различные соединения с.| к З'-концу олигонуклеотидов с общей последовательностью 5'-ХХ....ХХΥ-САС САС АСА САА ТТС АСА АСС ТСС-3', где часть ХХ....ХХ будет разной для разных соединений; Υ представляет собой биотинилированный аналог основания;
последовательность 5'-САС САС АСА САА ТТС АСА АСС ТСС-3' одинакова во всех случаях, что позволяет образоваться гетеродуплексу с последовательностью 5'-ССА ССТ ТСТ САА ТТС ТСТ СТС СТС-3', химически соединённой с р, для всех членов семейства молекул с.|.
Полученная библиотека содержит пары р с молекулами ср каждая из которых содержит отличительный олигонуклеотидный код. Полученная самосборкой библиотека подвергается биопэннингу в строгих условиях. Связывающие соединения, полученные в конце биопэннинга, идентифицируются с помощью кода. Например, коды молекул ср которые вместе с р образуют соединения с высоким сродством к связыванию с молекулой мишени, могут быть прочитаны с помощью гибридизации с олигонуклеотидным чипом, в котором разные положения заняты олигонуклеотидами, которые являются комплиментарными последовательностям ХХ.....ХХ членов подбиблиотеки О. Биотиновый фрагмент в молекулах членов подбиблиотеки О позволяет обнаружить моменты связывания на чипе.
Химические соединения-кандидаты с.| затем химически соединяются с р и полученные конъюгаты используются для специфического связывания с молекулами мишени, представляющей интерес.

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Продукт реакции сочетания по меньшей мере двух химических соединений, каждое из которых содержит химический фрагмент (р,д,г,8), потенциально способный вступать в реакцию связывания с единственной молекулой мишени, и олигонуклеотид (Ь,Ь',Ь,Ь') или его функциональный аналог, который включает по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (т,т',т,т'), причем химические соединения связаны друг с другом при помощи самособирающихся фрагментов (т,т',т,т'), отличающийся тем, что представляет собой стабильный продукт в отсутствие молекулы мишени, и олигонуклеотиды (Ь,Ь',Ь,Ь') или их функциональные аналоги, по меньшей мере, одного соединения включают вариабельную, уникальную кодирующую последовательность (Ь2,Ь2',Ь2,Ь2') для идентификации отдельного химического фрагмента (р,д,г,8).
  2. 2. Продукт реакции по п.1, отличающийся тем, что самособирающиеся фрагменты (т,т',т,т') представляют собой самособирающиеся последовательности (Ь1,Ь1',Ь1,Ь1') олигонуклеотидов (Ь,Ь',Ь,Ь'), их функциональные аналоги, лиганды (I), способные вступать в реакцию комплексообразования со специфическим ионом (ί), или пептиды, способные к ассоциации с другими молекулами.
  3. 3. Продукт реакции по п.1 или 2, отличающийся тем, что по меньшей мере два химических соединения каждый содержат химическую группу, при помощи которой они ковалентно связываются после образования стабильного продукта реакции сочетания.
  4. 4. Продукт реакции по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что олигонуклеотиды (Ь,Ь',Ь,Ь') или их функциональные аналоги ковалентно и непосредственно связаны с химическими фрагментами (р,д,г,8).
  5. 5. Продукт реакции по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что олигонуклеотиды (Ь,Ь',Ь,Ь') или их функциональные аналоги дополнительно содержат линкеры (Ь3,Ь3',Ь3,Ь3'), которые расположены между самособирающейся последовательностью (Ь1,Ь1',Ь1,Ь1') и химическим фрагментом (р,д,т,8).
  6. 6. Продукт реакции по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что кодирующая последовательность (Ь2,Ь2',Ь2,Ь2') олигонуклеотида (Ь,Ь',Ь,Ь') или его функциональный аналог расположены между химическим фрагментом (р,д,т,8) и самособирающейся последовательностью (Ь1,Ь1',Ь1,Ь1').
  7. 7. Продукт реакции по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что он представляет собой димер, тример или тетрамер, проявляющий химический фрагмент (р,д,т,8).
  8. 8. Библиотека химических соединений, содержащая продукт реакции сочетания по меньшей мере двух химических соединений, каждое из которых содержит химический фрагмент (р,д,т,8), потенциально способный вступать в реакцию связывания с единственной молекулой мишени, и олигонуклеотид (Ь,Ь',Ь,Ь') или его функциональный аналог, который включает по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (т,т',т,т'), причем химические соединения связаны друг с другом при помощи самособирающихся фрагментов (т,т',т,т'), отличающаяся тем, что продукт реакции представляет собой стабильный продукт в отсутствие молекулы мишени, и олигонуклеотиды (Ь,Ь',Ь,Ь') или их функциональные аналоги по меньшей мере одного соединения включают вариабельную, уникальную кодирующую последовательность (Ь2,Ь2',Ь2,Ь2') для идентификации отдельного химического фрагмента (р,д,г,8).
  9. 9. Библиотека по п.8, отличающаяся тем, что самособирающиеся фрагменты (т,т',т,т') представляют собой самособирающиеся последовательности (Ь1,Ь1',Ь1,Ь1') олигонуклеотидов (Ь,Ь',Ь,Ь'), их функциональные аналоги, лиганды (I), способные вступать в реакцию комплексообразования со специфическим ионом (ί), или пептиды, способные к ассоциации с другими молекулами.
    - 18 006965
  10. 10. Библиотека по одному из пп.8 или 9, отличающаяся тем, что по меньшей мере два химических соединения, каждый, содержат химическую группу, при помощи которой они ковалентно связываются после образования стабильного продукта реакции сочетания.
  11. 11. Библиотека по одному из пп.8-10, отличающаяся тем, что она включает продукт реакции по любому из пп.4-7.
  12. 12. Библиотека по одному из пп.8-11, отличающаяся тем, что индивидуальные комбинации фрагментов (р.с.|.г.5) получены путём образования гетеродуплексов, гетеротриплексов или гетероквадруплексов самособирающихся последовательностей (Ы,Ы',Ы,Ы') олигонуклеотидов (Ь,Ь',Ь,Ь').
  13. 13. Библиотека по одному из пп.8-11, отличающаяся тем, что индивидуальные комбинации фрагментов (р,д,т,8) получены хелатированием самособирающихся фрагментов (т,т',т,т') при помощи специфических ионов (ί).
  14. 14. Библиотека по п.12, отличающаяся тем, что она содержит индивидуально закодированные подбиблиотеки (А) и (В), причём подбиблиотека (А) содержит (п) соединений, присоединённых к 3'-концам (п) различных ДНК-олигонуклеотидов (Ь), и подбиблиотека (В) содержит (т) соединений, связанных с 5'-концом (т) различных ДНК-олигонуклеотидов (Ь').
  15. 15. Библиотека по п.14, отличающаяся тем, что в подбиблиотеке (А) или подбиблиотеке (В), соответственно, иодацетамидные или малеимидо-производные (п) или (т) химических соединений соединены с индивидуальными ДНК-олигонуклеотидами, которые содержат тиольную группу на концах 3' или 5'.
  16. 16. Библиотека по п.14, отличающаяся тем, что в подбиблиотеке (А) или в подбиблиотеке (В), соответственно, амидные производные, образующие химические структуры, такие как -ОР(О)2-О-(СН2)п— ЫН-СО-Я, где Я может соответствовать числу различных химических соединений и (п) находится в интервале между 1 и 10, соединены с олигонуклеотидами, содержащими фосфодиэфирную группу на одном конце.
  17. 17. Библиотека по одному из пп.14-16, отличающаяся тем, что в подбиблиотеке (А) самособирающаяся последовательность (Ь1) прервана б-спейсером в направлении, противоположном коду (В), причём б-спейсер предотвращает нежелательное спаривание с основаниями кода (В), который кодирует подбиблиотеку (В), и олигонуклеотид (Ь) подбиблиотеки (А) имеет различительный код (А) в направлении 5'конца.
  18. 18. Способ биопэннинга лигандов, специфических по отношению к молекулам мишени, при котором продукт реакции сочетания инкубируют с молекулой мишени, причем продукт реакции состоит из по меньшей мере двух химических соединений, каждое из которых содержит химический фрагмент (р,д,т,8), потенциально способный вступать в реакцию связывания с единственной молекулой мишени, и олигонуклеотид (Ь,Ь',Ь,Ь') или его функциональный аналог, который включает по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (т,т',т,т'), причем химические соединения связаны друг с другом при помощи самособирающихся фрагментов (т,т',т,т'), отличающийся тем, что продукт реакции представляет собой стабильный продукт в отсутствие молекулы мишени, и олигонуклеотиды (Ь,Ь',Ь,Ь') или их функциональные аналоги по меньшей мере одного соединения включают вариабельную, уникальную кодирующую последовательность (Ь2,Ь2',Ь2,Ь2') для идентификации отдельного химического фрагмента (р,д,т,8).
  19. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что для биопэннинга применяют продукт реакции по одному из пп.1-7.
  20. 20. Способ по п.18, отличающийся тем, что для биопэннинга применяют библиотеку продуктов реакции по одному из пп.8-17.
  21. 21. Способ идентификации молекулы мишени при помощи продукта реакции сочетания, содержащего химический фрагмент (р,д,т,8), способный вступать в реакцию связывания с этой молекулой мишени, и содержащего также олигонуклеотид (Ь,Ь',Ь,Ь') или его функциональный аналог, отличающийся тем, что продукт реакции связан с мишенью методом биопэннинга по одному из пп.18-20.
  22. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что РСЯ-фрагменты, образующиеся в процессе полимеразной цепной реакции (РСЯ), несут код пар членов подбиблиотек (А) и (В), причём подбиблиотека (А) содержит п соединений, присоединённых к 3'-концам п различных ДНК-олигонуклеотидов (Ь), и подбиблиотека (В) содержит т соединений, присоединённых к 5'-концам т различных ДНК-олигонуклеотидов (Ь').
  23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что в подбиблиотеке (А) или в подбиблиотеке (В), соответственно, иодацетамидопроизводные или малеимидопроизводные п или т химических фрагментов присоединены к индивидуальным ДНК-олигонуклеотидам, которые содержат тиольную группу в положении 3' или 5'.
  24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что в подбиблиотеке (А) самособирающаяся последовательность (Ь1) прервана б-спейсером в направлении, противоположном коду (В), при этом б-спейсер предотвращает любое нежелательное присоединение к основаниям кода (В), который кодирует подбиблиотеку (В), а олигонуклеотид (Ь) подбиблиотеки (А) содержит отличительный код (А) в направлении 5'конца.
    - 19 006965
  25. 25. Способ по одному из пп.22-24, отличающийся тем, что длина РСК-фрагментов определяется и идентичность их последовательности устанавливается путём расщепления РСК-фрагментов сайтом рестрикции для специфической эндопептидазы (например, ЕсоК1) с последующим клонированием с подходящей плазмидой и секвенированием.
  26. 26. Способ по одному из пп.22-25, при котором несколько членов специфического связывания выделены в конце биопэннинга, отличающийся тем, что на основе различных РСК-фрагментов, содержащихся в реакционной смеси, создаются конкатенамеры, причём конкатенированные последовательности «прочитываются» путём секвенирования, что позволяет выявить и идентичность, и частоту пар кода (А) и кода (В).
  27. 27. Способ по п.22, при котором члены специфического связывания выделяются в конце биопэннинга и подбиблиотеки (А) и/или (В) содержат химические фрагменты на концах частично гибридизованных олигонуклеотидов, отличающийся тем, что раздельные нити ДНК подвергаются гибридизации с олигонуклеотидными мишенями (например, ДНК-олигонуклеотидами), иммобилизованными на одном или нескольких чипах.
  28. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что путём использования чипа (А) или чипа (В), соответственно, осуществляют считывание идентичности и/или частоты членов подбиблиотеки (А) и подбиблиотеки (В), соответственно, которые получены после биопэннинга, и путём декодирования на чипах (А) и (В) выявляются кандидаты - соединения в подбиблиотеках (А) и (В), для повторной гибридизации и скрининга.
  29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что всё увеличивающееся связывание с мишенью в строгих условиях отражается в уменьшении членов (А) и/или (В), идентифицированных на соответствующем чипе, и возможные комбинации членов кандидатов (А) и (В) собираются в отдельности или в маленькие пулы и анализируются для связывания с мишенью.
  30. 30. Способ по одному из пп.27-29, отличающийся тем, что библиотеки самособираются для образования тримерных или тетрамерных комплексов с помощью трёх или четырёх чипов, соответственно, содержащих отличительные олигонуклеотидные мишени для декодирования.
  31. 31. Способ по одному из пп.27-30, отличающийся тем, что ДНК выбранных молекул связывания амплифицируют с помощью РСК до гибридизации чипа.
EA200401107A 2002-03-08 2002-04-15 Закодированные самособирающиеся химические библиотеки EA006965B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36259902P 2002-03-08 2002-03-08
PCT/EP2002/004153 WO2003076943A1 (en) 2002-03-08 2002-04-15 Encoded self-assembling chemical libraries (esachel)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401107A1 EA200401107A1 (ru) 2005-04-28
EA006965B1 true EA006965B1 (ru) 2006-06-30

Family

ID=27805199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401107A EA006965B1 (ru) 2002-03-08 2002-04-15 Закодированные самособирающиеся химические библиотеки

Country Status (12)

Country Link
US (6) US20060154246A1 (ru)
EP (1) EP1483585B1 (ru)
KR (1) KR100916889B1 (ru)
AT (1) ATE424561T1 (ru)
AU (1) AU2002310846B2 (ru)
CA (1) CA2478203C (ru)
DE (1) DE60231436D1 (ru)
DK (1) DK1483585T3 (ru)
EA (1) EA006965B1 (ru)
ES (1) ES2321067T3 (ru)
HK (1) HK1070427A1 (ru)
WO (1) WO2003076943A1 (ru)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6407816B1 (en) * 1998-02-23 2002-06-18 Zygo Corporation Interferometer and method for measuring the refractive index and optical path length effects of air
DE60213826T3 (de) * 2001-03-19 2013-10-17 President And Fellows Of Harvard College Entwicklung neuer molekularer funktionen
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US20060154246A1 (en) 2002-03-08 2006-07-13 Dario Neri Encoded self-assembling chemical libraries (esachel)
EP1487978B1 (en) 2002-03-15 2008-11-19 Nuevolution A/S An improved method for synthesising templated molecules
EP1539980B1 (en) 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules
WO2004016767A2 (en) * 2002-08-19 2004-02-26 The President And Fellows Of Harvard College Evolving new molecular function
AU2003273792B2 (en) 2002-10-30 2011-07-07 Nuevolution A/S Method for the synthesis of a bifunctional complex
EP2175019A3 (en) 2002-12-19 2011-04-06 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
WO2004074429A2 (en) 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
US8017323B2 (en) * 2003-03-26 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Free reactant use in nucleic acid-templated synthesis
DE602004023960D1 (de) 2003-09-18 2009-12-17 Nuevolution As Methode zur Gewinnung struktureller Informationen kodierter Moleküle und zur Selektion von Verbindungen
US7972994B2 (en) 2003-12-17 2011-07-05 Glaxosmithkline Llc Methods for synthesis of encoded libraries
CN101864412A (zh) * 2003-12-17 2010-10-20 普雷西斯药品公司 合成编码文库的方法
US20050153321A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-14 Saba James A. Libraries of multiple-ligand-conjugated nucleic acids
EP1718765A2 (en) * 2004-01-26 2006-11-08 Isis Innovation Limited Molecular analysis
JP5188808B2 (ja) * 2004-11-03 2013-04-24 アイリス モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 同種の分析物検出
CA2585675A1 (en) 2004-11-03 2006-12-28 Iris Molecular Diagnostics, Inc. Microbubbles for affinity separation
WO2007062664A2 (en) 2005-12-01 2007-06-07 Nuevolution A/S Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries
DK2064348T3 (da) 2006-09-18 2012-05-29 Ensemble Therapeutics Corp Profilering af receptorfamilie
AP3396A (en) 2009-02-13 2015-08-31 Chem Inc X Methods of creating and screening DNA-encoded libraries
EP2446033B1 (en) 2009-06-22 2013-10-23 Université de Strasbourg Method of preparing an adduct
US8895242B2 (en) * 2009-10-20 2014-11-25 The Regents Of The University Of California Single molecule nucleic acid nanoparticles
EP3540059A1 (en) 2010-04-16 2019-09-18 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
SG11201400374TA (en) 2011-09-07 2014-09-26 Chem Inc X Methods for tagging dna-encoded libraries
ES2693349T3 (es) 2012-06-06 2018-12-11 The Trustees Of Princeton University Aplicación de códigos de barras de ADN de bancos de matrices de cromatinas y mononucleosomas diseñadores para la creación de perfiles de lectores, escritores, borradores y moduladores de cromatina de los mismos
EP2872680B1 (en) 2012-07-13 2018-04-04 X-Chem, Inc. Dna-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases
GB201322692D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Philochem Ag Production of encoded chemical libraries
DE102014213783B3 (de) 2014-07-16 2015-06-18 Technische Universität Dresden Verfahren zur Identifizierung hochaffiner Komplexe aus zwei Liganden und einem Rezeptor, Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und selbst-assemblierende chemische Bibliothek zur Verwendung in dem Verfahren
EP3218479A1 (en) 2014-11-11 2017-09-20 Nanocore ApS Method for identification of molecules with desired characteristics
NL2013857B1 (en) * 2014-11-21 2016-10-11 Piculet Biosciences Tech B V Self-assembled bivalent ligand complex (SABLC) libraries and methods for screening such libraries.
EP3472376A4 (en) 2016-06-16 2019-12-18 Richard Edward Watts DIRECTED AND RECORDED COMBINATORY SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES OF CODED PROBE MOLECULES
US20200149034A1 (en) 2017-03-17 2020-05-14 Hitgen Ltd. Methods and Compositions for Synthesis of Encoded Libraries
US11795580B2 (en) 2017-05-02 2023-10-24 Haystack Sciences Corporation Molecules for verifying oligonucleotide directed combinatorial synthesis and methods of making and using the same
CN108866635B (zh) * 2017-05-09 2021-11-26 安升（上海）医药科技有限公司 多特异性蛋白药物及其文库、以及制备方法和应用
CN109468310B (zh) * 2018-10-25 2020-12-01 深圳劲宇生物科技有限公司 Dna编码碎片分子库的合成方法和连接基团的筛选方法
GB201821109D0 (en) 2018-12-21 2019-02-06 Philochem Ag Nucleic acid encoded chemical libraries
KR102376443B1 (ko) 2020-02-26 2022-03-17 포항공과대학교 산학협력단 나노구조체, 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 스크리닝 방법
EP4232578A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 ETH Zurich Self-purified nucleic acid encoded libraries

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8927365D0 (en) * 1989-12-04 1990-01-31 Ici Plc Reagent
US5573905A (en) * 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5695937A (en) * 1995-09-12 1997-12-09 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method for serial analysis of gene expression
US20020028442A1 (en) * 1997-05-09 2002-03-07 Christian Miculka Novel substance library and supramolecular complexes produced therewith
DE19619373A1 (de) * 1996-05-14 1997-11-20 Hoechst Ag Neue Substanzbibliothek und damit hergestellte supramolekulare Komplexe
DE19741716A1 (de) 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Adressierbares modulares Erkennungssystem, seine Herstellung und Verwendung
US6087103A (en) * 1998-03-04 2000-07-11 Lifespan Biosciences, Inc. Tagged ligand arrays for identifying target-ligand interactions
CA2346989A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Dna-templated combinatorial library chemistry
US20040058373A1 (en) * 2001-01-31 2004-03-25 Winkler Matthew M. Competitive amplification of fractionated targets from multiple nucleic acid samples
DE60213826T3 (de) * 2001-03-19 2013-10-17 President And Fellows Of Harvard College Entwicklung neuer molekularer funktionen
US20030148335A1 (en) * 2001-10-10 2003-08-07 Li Shen Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US20060154246A1 (en) 2002-03-08 2006-07-13 Dario Neri Encoded self-assembling chemical libraries (esachel)

Also Published As

Publication number Publication date
US20060154246A1 (en) 2006-07-13
CA2478203A1 (en) 2003-09-18
US8673824B2 (en) 2014-03-18
ES2321067T3 (es) 2009-06-02
ATE424561T1 (de) 2009-03-15
DE60231436D1 (de) 2009-04-16
US20100184611A1 (en) 2010-07-22
US20140128290A1 (en) 2014-05-08
US20110319278A1 (en) 2011-12-29
AU2002310846B2 (en) 2008-03-20
US10895019B2 (en) 2021-01-19
AU2002310846A1 (en) 2003-09-22
US20180245141A1 (en) 2018-08-30
US8642514B2 (en) 2014-02-04
EA200401107A1 (ru) 2005-04-28
US9783843B2 (en) 2017-10-10
EP1483585A1 (en) 2004-12-08
US20040014090A1 (en) 2004-01-22
WO2003076943A1 (en) 2003-09-18
HK1070427A1 (en) 2005-06-17
DK1483585T3 (da) 2009-06-22
KR100916889B1 (ko) 2009-09-09
EP1483585B1 (en) 2009-03-04
CA2478203C (en) 2011-06-14
KR20050002846A (ko) 2005-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA006965B1 (ru) Закодированные самособирающиеся химические библиотеки
Heinis et al. Encoded libraries of chemically modified peptides
JP7097627B2 (ja) 核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析
JP7010875B2 (ja) Ｄｎａコード化ライブラリを作製およびスクリーニングする方法
JP6703034B2 (ja) Ｄｎａコードライブラリーをタグ付けするための方法
O’Reilly et al. The evolution of DNA-templated synthesis as a tool for materials discovery
Wittrup Protein engineering by cell-surface display
JP2021501576A (ja) 核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する方法およびキット
JP2021501577A (ja) 核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する解析のためのキット
Blakskjaer et al. Fidelity by design: Yoctoreactor and binder trap enrichment for small-molecule DNA-encoded libraries and drug discovery
Angelini et al. Post-translational modification of genetically encoded polypeptide libraries
Agnew et al. Protein-catalyzed capture agents
Hacker et al. Direct, competitive comparison of linear, monocyclic, and bicyclic libraries using mRNA display
Gomes et al. Design of an artificial phage-display library based on a new scaffold improved for average stability of the randomized proteins
US20190352636A1 (en) Display of molecules on silently genetically encoded nanoscale carriers for determining synergistic molecular interactions
Dockerill et al. Translation of Deoxyribonucleic Acid into Synthetic Alpha Helical Peptides for Darwinian Evolution
Chan Harnessing DNA-Encoded Libraries to Discover Bioactive Small Molecules
US20170348666A1 (en) Methods of routing, compositions and uses thereof
CN113557299A (zh) 加速多肽分析反应的方法和组合物及相关用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU