JP2021501576A - 核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する方法およびキット - Google Patents

核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する方法およびキット Download PDF

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Abstract

核酸エンコーディングを用いて、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含めた巨大分子を解析するための方法およびキットが開示される。試料解析キットでは、認識事象（例えば、抗原と抗体との間、修飾された末端アミノ酸残基間、または小分子もしくはペプチド治療薬と標的の間など）などの分子相互作用および／または反応の核酸エンコーディングおよび／または核酸記録を用いる。単一サイクルアッセイを含めた、コーディングタグと記録タグとの間の情報の周期的移行を必要としないアッセイも開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全内容があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月３１日に出願された「核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する方法およびキット（METHODS AND KITS USING NUCLEIC ACID ENCODING AND/OR LABEL）」という表題の米国仮出願第６２／５７９，８４０号、および２０１７年１１月７日に出願された「核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する方法およびキット（METHODSAND KITS USING NUCLEIC ACID ENCODING AND/OR LABEL）」という表題の米国仮出願第６２／５８２，９１６号に対する優先権の利益を主張する。本出願は、その開示があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月２日に出願された「核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析（MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding）」という表題の米国仮特許出願第６２／３３０，８４１号；２０１６年５月１９日に出願された「核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析（MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding）」という表題の米国仮特許出願第６２／３３９，０７１号；２０１６年８月１８日に出願された「核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析（MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding）」という表題の米国仮特許出願第６２／３７６，８８６号；２０１７年５月２日に出願された「核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析（MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding）」という表題の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０７０２号；２０１７年１０月３１日に出願された、「核酸エンコーディングおよび／または標識を使用した解析のためのキット（Kitsfor Analysis Using Nucleic Acid Encoding and/or Label）」という表題の、代理人案件番号第７７６５３３０００５００号を有する米国仮特許出願第６２／５７９，８４４号；２０１７年１０月３１日に出願された「ポリペプチド解析のための方法および組成物（Methodsand Compositions for Polypeptide Analysis）」という表題の、代理人案件番号第７７６５３３０００６００号を有する米国仮特許出願第６２／５７９，８７０号；２０１７年１０月３１日に出願された「核酸エンコーディングおよび／または標識を使用する方法およびキット（Methodsand Kits Using Nucleic Acid Encoding and/or Label）」という表題の、代理人案件番号第７７６５３３０００７００号を有する米国仮特許出願第６２／５７９，８４０号；および２０１７年１１月６日に出願された、「核酸エンコーディングおよび／または標識を使用した解析のためのキット（Kitsfor Analysis Using Nucleic Acid Encoding and/or Label）」という表題の、代理人案件番号第７７６５３３０００５０１号を有する米国仮特許出願第６２／５８２，３１２号に関連する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７７６５３３０００７０１ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年１１月７日、サイズ：４７，７２６バイト）。
本開示は、認識事象などの、分子相互作用および／または反応の核酸エンコーディングおよび／または核酸記録を使用した試料解析方法およびキットに関する。一部の態様では、方法およびキットは、ハイスループット、多重化、および／または自動化解析において使用され、プロテオームまたはそのサブセットの解析に適する。
タンパク質は、多くの異なる生物学的機能を実行および促進し、細胞生物学および生理学において不可欠な役割を果たす。異なるタンパク質分子のレパートリーは広範囲にわたり、翻訳後修飾（ＰＴＭ）によって導入される追加的な多様性に起因して、トランスクリプトームよりもはるかに複雑である。さらに、細胞内のタンパク質は、環境、生理的状況、および病態に応答して動的に変化する（発現レベルおよび修飾の状態）。したがって、タンパク質は、特にゲノム情報と比べて、莫大な量のほとんど明らかになっていない関連情報を含有する。一般に、プロテオミクス解析ではゲノミクス解析と比べて革新が遅れている。ゲノミクスの分野では、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、数十億のＤＮＡ配列を単一の計器における実行で解析することが可能になることによって当該分野が変容しているが、一方で、タンパク質解析およびペプチド配列決定では、スループットが今でも限られている。
それにもかかわらず、このタンパク質情報は健康および疾患におけるプロテオームダイナミクスをよりよく理解するため、ならびに高精度の医療を可能にするのを補助するために直接必要である。そのように、このプロテオミクス情報の収集を小型化および高度に並行化するための「次世代」ツールの開発に大きな関心が寄せられている。本開示は、これらおよび他の必要性に対処する。
概要は、特許請求された主題の範囲を限定するために使用されるものではない。特許請求された主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、付属図および添付の特許請求の範囲に開示されている態様を含めた詳細な説明から明らかになるであろう。
一態様では、（ａ）各タンパク質に記録タグが直接または間接的に付随しているタンパク質のセットを、作用物質のライブラリーであって、各作用物質が、（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）、および（ｉｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングタグを含む、作用物質のライブラリーと接触させるステップであって、各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各作用物質が支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の作用物質の小分子（複数可）、ペプチド（複数可）もしくはペプチドの模倣物（複数可）、ペプチド模倣物（複数可）（例えば、ペプトイド（複数可）、β−ペプチド（複数可）、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物（複数可））、多糖（複数可）、またはアプタマー（複数可）と結合および／または反応する各タンパク質に付随する記録タグと（ｉｉ）１つまたは複数の作用物質のコーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｃ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、支持体上で各タンパク質と他のタンパク質との間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける。前述の実施形態のいずれかでは、支持体上で各タンパク質およびそれに付随する記録タグと他のタンパク質およびそれらに付随する記録タグとの間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあけることができる。
前述の実施形態のいずれかでは、作用物質は、ポリペプチド、ペプチドもしくは修飾されたペプチド、多糖、ペプトイド、ペプチド模倣物、アプタマー、小分子、または別のタンパク質結合性分子、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質および／またはそれらに付随する記録タグの１つまたは複数は、支持体に共有結合により固定化することもでき（例えば、リンカーを介して）、支持体に非共有結合により固定化することもできる（例えば、結合対を介して）。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質および／またはそれらに付随する記録タグのサブセットを支持体に共有結合により固定化することができ、一方でタンパク質および／またはそれらに付随する記録タグの別のサブセットを支持体に非共有結合により固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグの１つまたは複数を支持体に固定化し、それにより、付随するタンパク質（複数可）を固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質の１つまたは複数を支持体に固定化し、それにより、付随する記録タグ（複数可）を固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、少なくとも１つのタンパク質をそれに付随する記録タグと共局在させることができるが、それぞれが独立に支持体に固定化される。
前述の実施形態のいずれかでは、少なくとも１つのタンパク質および／またはそれに付随する記録タグを固定化リンカーに直接または間接的に付随させることができ、固定化リンカーを支持体に直接または間接的に固定化し、それにより、少なくとも１つのタンパク質および／またはそれに付随する記録タグを支持体に固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、固定化された記録タグの密度は、固定化されたタンパク質の密度と等しいかまたはそれよりも大きくてよい。一部の実施形態では、固定化された記録タグの密度は、固定化されたタンパク質の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれよりも大きい。
前述の実施形態のいずれかでは、各タンパク質および／またはそれに付随する記録タグを支持体に直接または間接的に固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、各作用物質を支持体に直接または間接的に固定化することができる。そのような場合では、各作用物質と支持体に固定化された他の作用物質との間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあけることができる。一実施形態では、作用物質の１つまたは複数を支持体に共有結合により固定化する（例えば、リンカーを介して）、または支持体に非共有結合により固定化する（例えば、結合対を介して）。
前述の実施形態のいずれかでは、作用物質のサブセットを支持体に共有結合により固定化することができ、一方で作用物質の別のサブセットを支持体に非共有結合により固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、作用物質の１つまたは複数について、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーを支持体に固定化し、それにより、コーディングタグを固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、作用物質の１つまたは複数について、コーディングタグを支持体に固定化し、それにより、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーを固定化することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、情報を少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに移行させ、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグを生成することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、情報を少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに移行させ、それにより、少なくとも１つの伸長コーディングタグを生成することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグからの情報と記録タグからの情報とを含む少なくとも１つのジタグ構築物を生成することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質の少なくとも１つを２つまたはそれよりも多くの作用物質の小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに結合および／または反応させることができる。一実施形態では、伸長記録タグまたは伸長コーディングタグは、２つまたはそれよりも多くの作用物質の小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに関する識別情報を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質の少なくとも１つに２つまたはそれよりも多くの記録タグを付随させることができ、ここで、２つまたはそれよりも多くの記録タグは同じであっても異なってもよい。
前述の実施形態のいずれかでは、作用物質の少なくとも１つは、２つまたはそれよりも多くのコーディングタグを含んでよく、ここで、２つまたはそれよりも多くのコーディングタグは同じであっても異なってもよい。
前述の実施形態のいずれかでは、情報の移行を、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはそれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成することができる。一部の実施形態では、ライゲーションおよび／またはポリメラーゼ媒介性反応は、タンパク質と小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーとの間の結合占有時間または反応時間と比べて速いカイネティクスを有し、必要に応じて、ライゲーションおよび／またはポリメラーゼ媒介性反応用の試薬は、タンパク質と小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーとの間の結合または反応と同じ反応体積で存在する。
前述の実施形態のいずれかでは、各タンパク質にその記録タグを個々の付着によって付随させることができ、かつ／または、各小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーをそのコーディングタグに個々の付着によって付随させることができる。一部の実施形態では、付着は、記録タグおよび／またはコーディングタグ配列情報がｍＲＮＡ配列内に含有されているリボソームまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイを介して起こる。一部の実施形態では、記録タグおよび／またはコーディングタグは、ｍＲＮＡ配列の３’末端にユニバーサルプライマー配列、バーコード、および／またはスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、３’末端の記録タグおよび／またはコーディングタグは、制限酵素消化部位をさらに含む。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質のセットは、プロテオームまたはそのサブセットであってよく、必要に応じて、タンパク質のセットは、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質のセットは、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（ｒｅｃｅｐｔｏｍｅ）（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）；栄養プロテオーム（ｎｕｔｒｉｐｒｏｔｅｏｍｅ）；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／またはニトロシル化）によって規程されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（または脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはこれらの任意のサブセット、またはこれらの任意の組合せであってよい。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質のセットは、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、真菌、例えば、酵母、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウイルス、例えば、ＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来してよい。
前述の実施形態のいずれかでは、タンパク質のセットは、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位を含んでよい。前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含んでよく、例えば、ユニバーサルプライミング部位は、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む。前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでよい。前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、バーコードを含んでよい。前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、その３’末端にスペーサーを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体であってよく、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、方法を、小分子−タンパク質結合マトリックス、および／またはペプチド／ペプチドの模倣物−タンパク質結合マトリックス、および／またはペプチド模倣物−タンパク質結合マトリックス（例えば、ペプトイド−タンパク質結合マトリックス、β−ペプチド−タンパク質結合マトリックス、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物−タンパク質結合マトリックス）、および／または多糖−タンパク質結合マトリックス、および／またはアプタマー−タンパク質結合マトリックスを創出するために、タンパク質のセットと、小分子、および／またはペプチドもしくはペプチドの模倣物、および／またはペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、および／または多糖、および／またはアプタマーのライブラリーとの間の相互作用の並行解析のために使用することができる。一部の態様では、マトリックスのサイズは、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、またはそれよりも大きい、例えば、約２×１０１３である。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーを同定するエンコーダー配列を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーとコーディングタグを、リンカーまたは結合対によって接合することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーとコーディングタグを、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅによりＳｐｙＴａｇとＫＴａｇが接合され、したがって２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ＬＰＸＴＧ Ｔａｇ／Ｓｏｒｔａｓｅ（例えば、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ５、ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、または参照により本明細書に組み込まれるＵＳ９，２６７，１２７ Ｂ２に開示されている通り）などのソルターゼ、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、またはこれらの任意の組合せによって接合することができる。
別の態様では、ポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）（ｉ）各断片に記録タグが直接または間接的に付随している、ポリペプチドの断片のセットを、（ｉｉ）各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、各断片および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；（ｂ）結合性部分と断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）各断片に付随する記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｃ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸は、（ｉ）Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）；（ｉｉ）Ｎ末端ジペプチド配列；（ｉｉｉ）Ｎ末端トリペプチド配列；（ｉｖ）内部アミノ酸；（ｖ）内部ジペプチド配列；（ｖｉ）内部トリペプチド配列；（ｖｉｉ）Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）；（ｖｉｉｉ）Ｃ末端ジペプチド配列；または（ｉｘ）Ｃ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せを含み、必要に応じて、（ｉ）〜（ｉｘ）内のアミノ酸残基の任意の１つまたは複数が修飾または官能化されている。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸は、各残基において独立に、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで選択される。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、ポリペプチドもしくはその断片、タンパク質もしくはポリペプチド鎖もしくはその断片、またはタンパク質複合体もしくはそのサブユニット、例えば、抗体またはその抗原結合性断片などを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、アンチカリンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；あるいはアミノ酸（複数可）に結合する改変小分子、すなわち、バンコマイシンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変分子；あるいはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、官能化Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）、Ｎ末端ジペプチド配列、またはＮ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せに選択的かつ／または特異的に結合することが可能である。
１つの他の態様では、複数のポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）複数のポリペプチドの各分子を複数のユニバーサルタグで標識するステップと；（ｂ）複数のポリペプチドと複数のコンパートメントタグを、複数のユニバーサルタグと複数のコンパートメントタグのアニーリングまたは接合に適した条件下で接触させ、それにより、複数のポリペプチドを複数のコンパートメント（例えば、ビーズ表面、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せ）に分配するステップであって、複数のコンパートメントタグが、各コンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｃ）各コンパートメント内のポリペプチド（複数可）を断片化し、それにより、それぞれに少なくとも１つのユニバーサルポリヌクレオチドタグおよび少なくとも１つのコンパートメントタグを含む記録タグに付随するポリペプチド断片のセットを生成するステップと；（ｄ）ポリペプチド断片のセットを支持体に直接または間接的に固定化するステップと；（ｅ）固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと接触させるステップと；（ｆ）結合性部分と断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）各断片に付随する記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｇ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドは、同じタンパク質に属する。一部の実施形態では、同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドは、異なるタンパク質、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれよりも多くのタンパク質に属する。
前述の実施形態のいずれかでは、複数のコンパートメントタグを複数の基板に固定化することができ、各基板によりコンパートメントが規程される。一部の実施形態では、複数の基板は、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
前述の実施形態のいずれかでは、複数の基板はそれぞれが、バーコードが付された粒子、例えば、バーコードが付されたビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、支持体は、配列決定ビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体上で各断片およびそれに付随する記録タグと他の断片およびそれらに付随する記録タグとの間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあけることができる。
さらに別の態様では、複数のポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）複数のポリペプチドを複数の基板に固定化するステップであって、各基板が、それぞれがコンパートメントタグを含む複数の記録タグを含み、必要に応じて、各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せである、ステップと；（ｂ）各基板に固定化されたポリペプチド（複数可）を断片化し（例えば、プロテアーゼ消化によって）、それにより、基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するステップと；（ｃ）固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと接触させるステップと；（ｄ）（ｉ）結合性部分と各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｅ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドは、同じタンパク質に属する。一部の実施形態では、同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドは、異なるタンパク質、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれよりも多くのタンパク質に属する。
前述の実施形態のいずれかでは、各基板によりコンパートメントが規程され得る。
前述の実施形態のいずれかでは、複数の基板は、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、複数の基板はそれぞれが、バーコードが付された粒子、例えば、バーコードが付されたビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、官能化試薬は、化学薬剤、酵素、および／または生物学的薬剤、例えば、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（2,4-dinitrobenzenesulfonic）（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位；増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位；必要に応じて、一意の分子識別子（ＵＭＩ）；バーコード；必要に応じて、その３’末端のスペーサー；またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、方法を、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドの配列を決定するために使用することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、エンコーダー配列、必要に応じたスペーサー、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分とコーディングタグをリンカーまたは結合対によって接合することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分とコーディングタグをＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅによりＳｐｙＴａｇとＫＴａｇが接合され、したがって２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ＬＰＸＴＧ Ｔａｇ／Ｓｏｒｔａｓｅ（例えば、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ５、ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、または参照により本明細書に組み込まれるＵＳ９，２６７，１２７ Ｂ２に開示されている通り）などのソルターゼ、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、またはこれらの任意の組合せによって接合することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグおよび／または記録タグは、１つもしくは複数のエラー訂正コード、１つもしくは複数のエンコーダー配列、１つもしくは複数のバーコード、１つもしくは複数のＵＭＩ、１つもしくは複数のコンパートメントタグ、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。一部の実施形態では、エラー訂正コードは、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される。
前述の実施形態のいずれかでは、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップは、核酸配列解析を含んでよい。一部の実施形態では、核酸配列解析は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシング、またはこれらの任意の組合せなどの核酸配列決定法を含む。一部の実施形態では、核酸配列決定法は、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである。
前述の実施形態のいずれかでは、方法は、１つまたは複数の洗浄するステップをさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析前に増幅することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグは、解析前に標的濃縮アッセイを受けることができる。
前述の実施形態のいずれかでは、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグは、解析前にサブトラクションアッセイを受けることができる。
一態様では、（ａ）作用物質のライブラリーであって、各作用物質が、（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、および／またはアプタマー、ならびに（ｉｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングタグを含む作用物質のライブラリーと、必要に応じて（ｂ）各タンパク質に記録タグが直接または間接的に付随している、タンパク質のセットとを含み、各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各作用物質が支持体に直接または間接的に固定化されており、タンパク質のセット、記録タグ、および作用物質のライブラリーが、（ｉ）１つまたは複数の作用物質の小分子（複数可）、ペプチド（複数可）もしくはペプチドの模倣物（複数可）、ペプチド模倣物（複数可）（例えば、ペプトイド（複数可）、β−ペプチド（複数可）、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物（複数可））、多糖（複数可）、またはアプタマー（複数可）と結合および／または反応する、各タンパク質に付随する記録タグと（ｉｉ）１つまたは複数の作用物質のコーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されている、キットが本明細書に開示される。
別の態様では、ポリペプチドを解析するためのキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと、必要に応じて（ｂ）各断片に記録タグが直接または間接的に付随しているポリペプチドの断片のセット、または（ｂ’）プロテアーゼなどの、ポリペプチドを断片化するための手段とを含み、各断片および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されており、ポリペプチドの断片のセット、記録タグ、および結合性物質のライブラリーが、結合性部分と断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）各断片に付随する記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されている、キットが本明細書に開示される。
さらに別の態様では、複数のポリペプチドを解析するためのキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと、（ｂ）複数のポリペプチドが必要に応じて固定化された複数の基板であって、各基板が、それぞれがコンパートメントタグを含む複数の記録タグを含み、必要に応じて、各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せであり、各基板に固定化されたポリペプチド（複数可）が、断片化されて（例えば、プロテアーゼ切断によって）、基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するように構成されている、複数の基板とを含み、複数のポリペプチド、記録タグ、および結合性物質のライブラリーが、結合性部分と各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されている、キットが本明細書に開示される。
一態様では、以下の実施形態のキットおよびキット構成成分も本明細書に開示される。さらなる態様では、以下の実施形態のキットおよびキット構成成分を使用する方法が本明細書に開示される。
実施形態１．（ａ）分析物に直接または間接的に付随するように構成されている記録タグと；（ｂ）（ｉ）分析物に結合することが可能な結合性部分に関する識別情報を含み、結合性部分に直接もしくは間接的に付随して結合性物質を形成するように構成されているコーディングタグ、ならびに／または（ｉｉ）記録タグおよびコーディングタグが、結合性物質と分析物との間の結合時に記録タグおよびコーディングタグとの間の情報の移行を可能にするように構成されている、標識と；必要に応じて（ｃ）結合性部分とを含むキット。
実施形態２．記録タグおよび／または分析物が、支持体に直接または間接的に固定化されるように構成されている、実施形態１に記載のキット。
実施形態３．記録タグが、支持体に固定化され、それにより、記録タグに付随する分析物が固定化されるように構成されている、実施形態２に記載のキット。
実施形態４．分析物が、支持体に固定化され、それにより、分析物に付随する記録タグが固定化されるように構成されている、実施形態２に記載のキット。
実施形態５．記録タグと分析物のそれぞれが、支持体に固定化されるように構成されている、実施形態２に記載のキット。
実施形態６．記録タグと分析物が、両方が支持体に固定化された時に共局在するように構成されている、実施形態５に記載のキット。
実施形態７．（ｉ）支持体に直接または間接的に固定化され、かつ（ｉｉ）記録タグおよび／または分析物に直接または間接的に付随するように構成されている固定化リンカーをさらに含む、実施形態１から６までのいずれかに記載のキット。
実施形態８．固定化リンカーが、記録タグおよび分析物に付随するように構成されている、実施形態７に記載のキット。
実施形態９．固定化リンカーが、支持体に直接固定化され、それにより、固定化リンカーに付随する記録タグおよび／または分析物が固定化されるように構成されている、実施形態７または８に記載のキット。
実施形態１０．支持体をさらに含む、実施形態２から９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１．結合性物質と分析物との間の結合時にコーディングタグと記録タグとの間で情報を移行させるための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１から１０までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１２．１つまたは複数の試薬が、コーディングタグから記録タグに情報を移行し、それにより、伸長記録タグを生成するように構成されている、実施形態１１に記載のキット。
実施形態１３．１つまたは複数の試薬が、記録タグからコーディングタグに情報を移行し、それにより、伸長コーディングタグを生成するように構成されている、実施形態１１に記載のキット。
実施形態１４．１つまたは複数の試薬が、コーディングタグからの情報と記録タグからの情報とを含むジタグ構築物を生成するように構成されている、実施形態１１に記載のキット。
実施形態１５．記録タグの少なくとも２つを含む、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１６．それに付随する結合性部分に関する識別情報をそれぞれが含むコーディングタグの少なくとも２つを含む、実施形態１から１５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１７．結合性物質の少なくとも２つを含む、実施形態１から１６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１８．（ｉ）第１の結合性物質と分析物との間の結合時に第１の結合性物質の第１のコーディングタグから記録タグに情報を移行させて、一次伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質と分析物との間の結合時に第２の結合性物質の第２のコーディングタグから一次伸長記録タグに情報を移行させて、二次伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含み、（ｉ）の１つもしくは複数の試薬と（ｉｉ）の１つもしくは複数の試薬が同じであっても異なってもよい、実施形態１７に記載のキット。
実施形態１９．（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから二次伸長記録タグに情報を移行させて、三次（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１８に記載のキット。
実施形態２０．（ｉ）第１の結合性物質と分析物との間の結合時に第１の結合性物質の第１のコーディングタグから第１の記録タグに情報を移行させて、第１の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質と分析物との間の結合時に第２の結合性物質の第２のコーディングタグから第２の記録タグに情報を移行させて、第２の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含み、（ｉ）の１つもしくは複数の試薬および（ｉｉ）の１つもしくは複数の試薬が同じであっても異なってもよい、実施形態１７に記載のキット。
実施形態２１．（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態２０に記載のキット。
実施形態２２．第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグが、分析物に直接または間接的に付随するように構成されている、実施形態２０または２１に記載のキット。
実施形態２３．第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグが、支持体に固定化されるように構成されている、実施形態２０から２２までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態２４．第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグが、例えば、第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）コーディングタグと第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）記録タグとの間の情報の移行が可能になるように、それぞれ分析物と共局在するように構成されている、実施形態２０から２３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態２５．第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および／または第３の（またはより高次の）コーディングタグのそれぞれが、結合サイクル特異的スペーサー配列Ｃｎ、および／またはコーディングタグ特異的スペーサー配列Ｃｎなどの結合サイクル特異的バーコードを含み、ｎが整数であり、Ｃｎがｎ番目の結合性物質とポリペプチドとの間の結合を示す；または、結合サイクルタグＣｎが外因的に付加される、例えば、結合サイクルタグＣｎがコーディングタグ（複数可）に対して外因性であってよい、実施形態２０から２４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態２６．分析物が、ポリペプチドを含む、実施形態１から２５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態２７．結合性部分が、ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、実施形態２６に記載のキット。
実施形態２８．官能化試薬をさらに含む、実施形態２６または２７に記載のキット。
実施形態２９．ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸を（例えば、化学的切断または酵素的切断によって）除去するため、または官能化Ｎ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸（複数可）を除去するための排除試薬をさらに含み、必要に応じて、排除試薬が、カルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；穏やかなエドマン分解試薬；エドマナーゼ酵素；無水ＴＦＡ、塩基；またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態２６から２８までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態３０．１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸が、（ｉ）Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）；（ｉｉ）Ｎ末端ジペプチド配列；（ｉｉｉ）Ｎ末端トリペプチド配列；（ｉｖ）内部アミノ酸；（ｖ）内部ジペプチド配列；（ｖｉ）内部トリペプチド配列；（ｖｉｉ）Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）；（ｖｉｉｉ）Ｃ末端ジペプチド配列；または（ｉｘ）Ｃ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せを含み、必要に応じて、（ｉ）〜（ｉｘ）内のアミノ酸残基の任意の１つまたは複数が修飾または官能化されている、実施形態２６から２９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態３１．少なくとも（ａ）（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）または官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分および（ｉｉ）第１の結合性部分に関する識別情報を含む第１のコーディングタグを含む第１の結合性物質、必要に応じて（ｂ）ポリペプチドに直接または間接的に付随するように構成されている記録タグ、ならびに、さらに必要に応じて（ｃ）ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾して第１の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能な官能化試薬を含むキットであって、記録タグおよび第１の結合性物質が、第１の結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第１のコーディングタグと記録タグとの間の情報の移行が可能になるように構成されている、キット。
実施形態３２．第１のコーディングタグから記録タグに情報を移行させ、それにより、一次伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態３１に記載のキット。
実施形態３３．官能化試薬が、化学薬剤、酵素、および／または生物学的薬剤、例えば、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬を含む、実施形態３１または３２に記載のキット。
実施形態３４．第１の官能化ＮＴＡＡを（例えば、化学的切断または酵素的切断によって）除去して、すぐ隣のアミノ酸残基を第２のＮＴＡＡとして露出させるための排除試薬をさらに含む、実施形態３１から３３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態３５．第２のＮＴＡＡが、同じまたは異なる官能化試薬によって官能化して第１の官能化ＮＴＡＡと同じであっても異なってもよい第２の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能である、実施形態３４に記載のキット。
実施形態３６．（ｄ）（ｉ）第２の官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第２の（またはより高次の）結合性部分および（ｉｉ）第２の（またはより高次の）結合性部分に関する識別情報を含む第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質をさらに含み、第１のコーディングタグと第２の（またはより高次の）コーディングタグが同じであっても異なってもよい、実施形態３５に記載のキット。
実施形態３７．第１の官能化ＮＴＡＡおよび第２の官能化ＮＴＡＡが、互いに独立して、官能化Ｎ末端アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで選択される、実施形態３６に記載のキット。
実施形態３８．第２の（またはより高次の）コーディングタグから一次伸長記録タグに情報を移行させ、それにより、二次（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態３６または３７に記載のキット。
実施形態３９．少なくとも（ａ）それぞれが（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）もしくは官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な結合性部分および（ｉｉ）結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含む、１つもしくは複数の結合性物質、ならびに／または（ｂ）ポリペプチドに直接もしくは間接的に付随するように構成されている１つもしくは複数の記録タグ、ならびに必要に応じて（ｃ）ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾して第１の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能な官能化試薬を含むキットであって、１つまたは複数の記録タグおよび１つまたは複数の結合性物質が、各結合性物質とポリペプチドとの間の結合時にコーディングタグと記録タグとの間の情報の移行が可能になるように構成されている、キット。
実施形態４０．第１の官能化ＮＴＡＡを（例えば、化学的切断または酵素的切断によって）除去して、すぐ隣のアミノ酸残基を第２のＮＴＡＡとして露出させるための排除試薬をさらに含む、実施形態３９に記載のキット。
実施形態４１．第２のＮＴＡＡが、同じまたは異なる官能化試薬によって官能化して第１の官能化ＮＴＡＡと同じであっても異なってもよい第２の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能である、実施形態４０に記載のキット。
実施形態４２．第１の官能化ＮＴＡＡおよび第２の官能化ＮＴＡＡが、互いに独立して、官能化Ｎ末端アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで選択される、実施形態４１に記載のキット。
実施形態４３．（ｉ）第１の結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第１の結合性物質の第１のコーディングタグから第１の記録タグに情報を移行させて、第１の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第２の結合性物質の第２のコーディングタグから第２の記録タグに情報を移行させて、第２の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含み、（ｉ）の１つもしくは複数の試薬と（ｉｉ）の１つもしくは複数の試薬は同じであっても異なってもよい、実施形態３９から４２までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態４４．（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態４３に記載のキット。
実施形態４５．第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグが、ポリペプチドに直接または間接的に付随するように構成されている、実施形態４３または４４に記載のキット。
実施形態４６．第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグが、支持体に固定化されるように構成されている、実施形態４３から４５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態４７．第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグが、例えば、第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）コーディングタグと第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）記録タグとの間の情報の移行が可能になるように、それぞれポリペプチドと共局在するように構成されている、実施形態４３から４６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態４８．第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および／または第３の（またはより高次の）コーディングタグのそれぞれが、結合サイクル特異的スペーサー配列Ｃｎ、および／またはコーディングタグ特異的スペーサー配列Ｃｎなどの結合サイクル特異的バーコードを含み、ｎが整数であり、Ｃｎがｎ番目の結合性物質とポリペプチドとの間の結合を示す、実施形態４３から４７までのいずれか１つに記載のキット。あるいは、結合サイクルタグＣｎは外因的に付加されてよい、例えば、結合サイクルタグＣｎがコーディングタグ（複数可）に対して外因性であってよい。
実施形態４９．分析物またはポリペプチドが、タンパク質またはポリペプチド鎖またはその断片、脂質、炭水化物、または大環状分子を含む、実施形態１から４８までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５０．分析物またはポリペプチドが、巨大分子またはその複合体、例えば、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、実施形態１から４９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５１．記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、保護された塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態１から５０までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５２．記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態１から５１までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５３．記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、例えば、ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、実施形態１から５２までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５４．記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態１から５３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５５．記録タグが、バーコードを含む、実施形態１から５４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５６．記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、実施形態１から５５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５７．剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体を含み、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、実施形態１から５６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５８．ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む支持体を含む、実施形態１から５７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態５９．支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態５８に記載のキット。
実施形態６０．支持体を含み、複数の分析物またはポリペプチドを逐次的な反応、並行した反応、または逐次的な反応と並行した反応の組合せで解析するためのものである、実施形態１から５９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６１．支持体上で、分析物またはポリペプチドに、約１０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける、実施形態６０に記載のキット。
実施形態６２．結合性部分が、ポリペプチドもしくはその断片、タンパク質もしくはポリペプチド鎖もしくはその断片、またはタンパク質複合体もしくはそのサブユニット、例えば、抗体またはその抗原結合性断片を含む、実施形態１から６１までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６３．結合性部分が、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素もしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アンチカリンもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＣｌｐＳもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質もしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノ酸（複数可）を結合する改変小分子、すなわち、バンコマイシンもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変分子；またはこれらの任意の組合せを含む、あるいは各結合性物質において、結合性部分が小分子を含み、コーディングタグが小分子を識別するポリヌクレオチドを含み、それにより、複数の結合性物質が、ＤＮＡにコードされる小分子ライブラリーなどのコードされる小分子ライブラリーを形成する、実施形態１から６２までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６４．結合性部分が、分析物またはポリペプチドに選択的かつ／または特異的に結合することが可能である、実施形態１から６３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６５．コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、１つもしくは複数の保護された塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態１から６４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６６．コーディングタグが、バーコード配列、例えば、エンコーダー配列、例えば、結合性部分を識別するものを含む、実施形態１から６５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６７．コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含み、必要に応じて、各結合サイクル後に結合サイクル特異的配列が記録タグに付加される、実施形態１から６６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６８．結合性部分とコーディングタグが、リンカーまたは結合対によって接合されている、実施形態１から６７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態６９．結合性部分とコーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅによりＳｐｙＴａｇとＫＴａｇが接合され、したがって２つの部分が接合される）、ソルターゼ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、またはこれらの任意の組合せによって接合されている、実施形態１から６８までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７０．鋳型反応または非鋳型反応においてコーディングタグと記録タグとの間で情報を移行させるための試薬をさらに含み、必要に応じて、試薬が、（ｉ）化学的ライゲーション試薬または生物学的ライゲーション試薬、例えば、一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸をライゲーションするための、ＤＮＡリガーゼもしくはＲＮＡリガーゼなどのリガーゼ、または（ｉｉ）一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸のプライマー伸長のための試薬であり、必要に応じて、キットが、少なくとも２つのリガーゼもしくはそのバリアント（例えば、少なくとも２つのＤＮＡリガーゼ、または少なくとも２つのＲＮＡリガーゼ、または少なくとも１つのＤＮＡリガーゼおよび少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ）を含むライゲーション試薬をさらに含み、少なくとも２つのリガーゼもしくはそのバリアントが、アデニル化リガーゼおよび構成的にアデニル化されていないリガーゼを含む、または必要に応じて、キットが、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡ／ＲＮＡデアデニラーゼを含むライゲーション試薬をさらに含む、実施形態１から６９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７１．コーディングタグと記録タグとの間で情報を移行させるための、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などのポリメラーゼをさらに含む、実施形態１から７０までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７２．核酸配列解析のための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１から７１までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７３．核酸配列解析が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージング、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態７２に記載のキット。
実施形態７４．核酸増幅のため、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグを増幅させるための１つまたは複数の試薬をさらに含み、必要に応じて、核酸増幅が、指数関数的な増幅反応（例えば、鋳型スイッチングを低減または排除するためのエマルジョンＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））および／または線形増幅反応（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、または等温キメラプライマー開始核酸増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）（ＩＣＡＮ）による等温増幅）を含む、実施形態１から７３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７５．コーディングタグ情報を記録タグに移行させて伸長記録タグを形成するための１つまたは複数の試薬を含み、伸長記録タグ上のコーディングタグ情報の順序および／または頻度により、結合性物質が分析物またはポリペプチドに結合する順序および／または頻度が示される、実施形態１から７４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７６．標的濃縮のため、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグの濃縮のための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１から７５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７７．サブトラクションのため、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグのサブトラクションのための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１から７６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７８．例えば１つまたは複数の分析物またはポリペプチドなどの非常に豊富な種を減少させるための正規化のための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１から７７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態７９．少なくとも１つの結合性物質が、末端アミノ酸残基、末端２アミノ酸残基、または末端３アミノ酸残基に結合する、実施形態１から７８までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８０．少なくとも１つの結合性物質が、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合する、実施形態１から７９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８１．試料中の複数の分析物またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含み、各コンパートメントが、必要に応じて支持体（例えば、固体支持体）に接合した複数のコンパートメントタグを含み、複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、実施形態１から８０までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８２．複数の分析物またはポリペプチド（例えば、複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチド）を複数のポリペプチド断片に断片化するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含む、実施形態８１に記載のキット。
実施形態８３．複数のポリペプチド断片を複数のコンパートメントのそれぞれ内のコンパートメントタグとアニーリングまたは接合し、それにより、複数のコンパートメントタグ付きポリペプチド断片を生成するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含む、実施形態８１または８２に記載のキット。
実施形態８４．複数のコンパートメントが、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態８１から８３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８５．複数のコンパートメントのそれぞれが、平均して単一の細胞を含む、実施形態８１から８４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８６．試料中の複数の分析物またはポリペプチドを標識するための１つまたは複数のユニバーサルＤＮＡタグをさらに含む、実施形態８１から８５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８７．試料中の複数の分析物またはポリペプチドを１つまたは複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態８１から８６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８８．プライマー伸長またはライゲーションのための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態８１から８７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態８９．支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどのビーズを含む、実施形態８１から８８までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９０．コンパートメントタグが、一本鎖または二本鎖核酸分子を含む、実施形態８１から８９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９１．コンパートメントタグが、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含む、実施形態８１から９０までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９２．支持体がビーズであり、コンパートメントタグがバーコードを含む、実施形態８１から９１までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９３．支持体がビーズを含み、複数のコンパートメントタグが接合したビーズが、スプリット・アンド・プール（ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｐｏｏｌ）合成、個々の合成、または固定化によって形成される、実施形態８１から９２までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９４．スプリット・アンド・プール合成、個々の合成、または固定化のための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態８１から９３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９５．コンパートメントタグが、記録タグ内の成分であり、記録タグが、必要に応じてスペーサー、バーコード配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、実施形態８１から９４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９６．コンパートメントタグが、複数の分析物またはポリペプチド（例えば、タンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチド）の内部アミノ酸、ペプチド骨格、またはＮ末端アミノ酸と反応することが可能な機能的部分をさらに含む、実施形態８１から９５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９７．機能的部分が、アルデヒド、アジド／アルキン、マレイミド／チオール、エポキシ／求核試薬、逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）基、クリック試薬、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態９６に記載のキット。
実施形態９８．コンパートメントタグが、タンパク質リガーゼ認識配列などのペプチドをさらに含み、必要に応じて、タンパク質リガーゼが、ブテラーゼＩまたはそのホモログである、実施形態８１から９７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態９９．複数の分析物またはポリペプチドを断片化するための化学的または生物学的試薬、例えば、酵素、例えば、プロテアーゼ（例えば、メタロプロテアーゼ）をさらに含む、実施形態８１から９８までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１００．コンパートメントタグを支持体から遊離させるための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態８１から９９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０１．伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を形成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む、実施形態１から１００までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０２．記録タグの３’末端をブロッキングしてポリメラーゼによる記録タグの伸長を防止する、実施形態１０１に記載のキット。
実施形態１０３．コーディングタグが、エンコーダー配列、ＵＭＩ、ユニバーサルプライミング部位、その３’末端のスペーサー、結合サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１０１または１０２に記載のキット。
実施形態１０４．ジタグ構築物が、ギャップ充填、プライマー伸長、またはこれらの組合せによって生成される、実施形態１０１から１０３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０５．ジタグ分子が、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するコンパートメントタグ、記録タグに由来する一意の分子識別子、記録タグに由来する必要に応じたスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する一意の分子識別子、コーディングタグに由来する必要に応じたスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態１０１から１０４までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０６．結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態１０１から１０５までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０７．結合性物質が、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；あるいはアミノ酸（複数可）を結合する改変小分子、すなわち、バンコマイシンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変分子；あるいは抗体またはその結合性断片；あるいはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１０１から１０６までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０８．結合性物質が、分析物またはポリペプチドの単一のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基）、ジペプチド（例えば、Ｎ末端ジペプチド、Ｃ末端ジペプチド、または内部ジペプチド）、トリペプチド（例えば、Ｎ末端トリペプチド、Ｃ末端トリペプチド、または内部トリペプチド）、または翻訳後修飾に結合する、実施形態１０１から１０７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０９．結合性物質が、Ｎ末端ポリペプチド、Ｃ末端ポリペプチド、または内部ポリペプチドに結合する、実施形態１０１から１０７までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１０．コーディングタグおよび／または記録タグが、１つまたは複数のエラー訂正コード、１つまたは複数のエンコーダー配列、１つまたは複数のバーコード、１つまたは複数のＵＭＩ、１つまたは複数のコンパートメントタグ、１つまたは複数のサイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１から１０９までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１１．エラー訂正コードが、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される、実施形態１１０に記載のキット。
実施形態１１２．コーディングタグおよび／または記録タグが、サイクル標識を含む、実施形態１から１１１までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１３．コーディングタグおよび／または記録タグに依存しないサイクル標識をさらに含む、実施形態１から１１２までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１４．（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｃ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｄ）核酸で標識されたポリペプチド（例えば、ＤＮＡで標識されたタンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｅ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｆ）核酸配列決定のための試薬を含む、実施形態１から１１３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１５．（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｃ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｄ）ポリペプチド（例えば、タンパク質）を、固定化された記録タグを含む支持体に固定化するための試薬；（ｅ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｆ）核酸配列決定のための試薬を含む、実施形態１から１１３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１６．（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）変性試薬；（ｃ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｄ）ユニバーサルＤＮＡプライマー配列；（ｅ）ポリペプチドをユニバーサルＤＮＡプライマー配列で標識するための試薬；（ｆ）標識されたポリペプチドをプライマーによってアニーリングするためのバーコードが付されたビーズ；（ｇ）ビーズから標識されたポリペプチドにバーコードを書き込むためのポリメラーゼ伸長のための試薬；（ｈ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｉ）核酸で標識されたポリペプチド（例えば、ＤＮＡで標識されたタンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｊ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｋ）核酸配列決定のための試薬を含む、実施形態１から１１３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１７．（ａ）架橋試薬；（ｂ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｃ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｄ）ユニバーサルＤＮＡプライマー配列；（ｅ）ポリペプチドをユニバーサルＤＮＡプライマー配列で標識するための試薬；（ｆ）標識されたポリペプチドをプライマーによってアニーリングするためのバーコードが付されたビーズ；（ｇ）ビーズから標識されたポリペプチドにバーコードを書き込むためのポリメラーゼ伸長のための試薬；（ｈ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｉ）核酸で標識されたポリペプチド（例えば、ＤＮＡで標識されたタンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｊ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｋ）核酸配列決定のための試薬を含む、実施形態１から１１３までのいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１８．１つまたは複数の成分が、溶液中または支持体、例えば固体支持体上に提供される、実施形態１から１１７までのいずれか１つに記載のキット。
コンパートメントバーコーディング、コンビナトリアルバーコーディング、空間的バーコーディング、またはこれらの任意の組合せなどの追加的なバーコーディング試薬をキットに含めることができる。試料は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含めた巨大分子を含んでよく、記録により、分子相互作用および／もしくは反応情報、ならびに／またはポリペプチド配列情報を生成することができる。キットは、ハイスループット、多重化、および／または自動化解析に使用することができ、プロテオームまたはそのサブセットの解析に適する。
キット成分は、上記の例示的な方法において開示され、かつ／または使用されている任意の分子、分子複合体またはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的または生物学的）、作用物質、構造（例えば、支持体、表面、粒子、またはビーズ）、反応中間体、反応産物、結合複合体、または任意の他の製造品を含んでよい。本キットを、任意の適切な分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するために使用することができる。一部の実施形態では、本キットを、高度に並行な、ハイスループットなデジタル解析（例えば、巨大分子解析）、特にポリペプチド解析のために使用することができる。一部の実施形態では、本キットを、分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するための以下の例示的な方法において使用することができる。
前述の実施形態（例えば、上記の節Ａ〜Ｎに記載されているもの）のいずれかでは、エンコーディングタグおよび／または記録タグ、または任意のその一部（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、核酸ではない配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーを含むまたはそれに置き換えることができる。一部の態様では、エンコーディングタグおよび／または記録タグ、または任意のその一部（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、ナノポアに基づく配列決定によってなどで、明白に分解可能なシグナルを生じさせる。広範囲のポリマーを使用することができ、必要に応じて、クリックケミストリーを用い、エドマン型分解に適合するタグを使用して標的タンパク質および／またはポリペプチドの配列情報を読み取ることができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、増幅ステップを含む。他の実施形態では、増幅ステップを伴わず、分解可能なシグナルを生じさせるために、単一分子を、ナノポアを多数回通して処理して多数の読み取りを生じさせることができる。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、読み取られるポリマーを含み、ここで、コーディングタグ内のエンコーダーは、１つもしくは複数の小分子部分、配列決定可能な非核酸ポリマーの１つもしくは複数のサブユニット、配列決定可能な非核酸ポリマーの１つもしくは複数の単量体を含む、または１つもしくは複数の小分子部分、配列決定可能な非核酸ポリマーの１つもしくは複数のサブユニット、配列決定可能な非核酸ポリマーの１つもしくは複数の単量体である。この例では、エンコーダー部分は、つながり（例えば、伸長記録タグ）上のビーズと類似している。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、直鎖状である。他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、１つまたは複数の直鎖、１つまたは複数の分枝、１つまたは複数の環、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは架橋していない。他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、架橋している、例えば、弱く架橋している（例えば、架橋したポリマーは、約０．１％〜約１％の間の架橋剤を含む）。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、中性である、例えば、全体的に中性の電荷を有する。特定の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、アクリルアミド、アクリレート、スチレン、ナイロン、カプトン、ＮｉＰＡＭポリマー、ＰＥＧ、ポリラクタム、ポリラクトン、エポキシド、ポリシリコーン、ポリエステル、ポリカルボジイミド、ポリウレタン、ポリピロールジノン、ポリイソチオシアネート、またはこれらの任意の組合せを含む。
他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、荷電している。具体的な実施形態では、配列決定可能なポリマーは、負に荷電しており、例えば、配列決定可能なポリマーは、ポリスルホネート、および／または負に荷電したアクリルアミド（例えば、アクリル酸と共重合したもの）を含み得る。他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、正に荷電しており、例えば、配列決定可能なポリマーは、ポリアミン、ポリアニリン、ポリイミン、および／または置換されていても置換されていなくてもよいアミン官能基を有するアクリルアミドを含み得る。さらに他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、イオノマーを含み得る。
他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、ポリモルホリノおよび／または双性イオン性ポリマーを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、疎水性ポリマーおよび／または親水性ポリマーを含む。一部の態様では、配列決定可能なポリマーは、スチレン、カプトン、フルオロポリマー、またはイソプレン、またはこれらの任意の組合せなどの疎水性ポリマーを含む。他の態様では、配列決定可能なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリリシン、ポリエニミン、ポリイミン、アクリルアミド、またはアクリレート、またはこれらの任意の組合せなどの親水性ポリマーを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、メタセシス産物、例えば、開環または直鎖メタセシスによって形成されるポリマー産物を含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、共重合体、ブロック共重合体、ジブロック共重合体、またはトリブロック共重合体、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、ポリマー産物の連続重合またはライゲーションによって形成される。
他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、バイオポリマーを含む。具体的な実施形態では、配列決定可能なポリマーは、多糖、ポリペプチド、ペプチド、またはポリアミド、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、天然に存在するバイオポリマー、バイオポリマー模倣物、または合成バイオポリマー、またはそれらのハイブリッドを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、ペプトイドなどのバイオポリマー模倣物を含む。一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、星型ポリマーまたはデンドリマーを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、刺激により誘発される分解性ポリマーを含む。刺激の例としては、これだけに限定されないが、化学的刺激、生化学的刺激、酵素的刺激、光、時間、および温度が挙げられる。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、ケージ化または保護されたポリマーを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、可逆的共有結合ポリマーを含む。一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、ジスルフィド、チオ（チオール）エステル、ｔｅｍｐｏ由来ニトロキシドポリマー、またはポリイミン、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、低多分散指数（ＰＤＩ）または高ＰＤＩを有するポリマーを含む。多分散指数（ＰＤＩ）、または不均一性指数、または単に分散度（Ｄ）は、所与のポリマー試料中の分子質量の分布の尺度である。典型的な分散度は、重合の機構に基づいて変動し、種々の反応条件の影響を受ける可能性がある。合成ポリマーでは、分散度は、反応物の比、重合の完了度などに起因して著しく変動し得る。典型的な付加重合に関しては、Ｄは、約５〜２０の範囲であり得る。典型的なステップ重合に関しては、Ｄの最確値は、約２またはそれ未満である。特別な場合の付加重合であるリビング重合では１に非常に近い値が導かれる。これは生体高分子の場合もそうであり、分散度が１に非常に近いまたは１と等しく、これは、ただ１つの長さのポリマーが存在することを示す。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、リビング重合の産物などの、低ＰＤＩを有するポリマーを含む。他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、ＡＴＲＰまたは他の統計学的に駆動される分布の産物などの、より高いＰＤＩを有するポリマーを含む。
一部の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、発色団または伝導性材料として作用することができるコンジュゲートしたポリマーを含む。
他の実施形態では、配列決定可能なポリマーは、フォルダマーなどの、構造化されたまたは構造化されていない（例えば、フォールディングされたまたはフォールディングされていない）ポリマーを含む。一部の実施形態では、コーディングポリマーは、比較的短く、例えば、２つのサブユニットで構成されている。他の実施形態では、ポリマーは、大きく、例えば、総計約１００ｋＤａのサブユニットで構成されている。
ポリマー骨格の数は、配列決定可能なポリマーを含めるために適している。Ｏｕａｈａｂｉらにより記載されているポリリン酸骨格がナノポア配列決定に有用である（Al Ouahabi, Charles et al. 2015）。リン酸基により骨格に負電荷が付与され、ポアを通じた電気的に制御された転位置が可能になる。異なるＲ基を使用して異なる電流遮断シグネチャをもたらすことができる。ペプトイドポリマーにより別の有用なポリマーがもたらされる。ペプトイドは、ペプチドの場合のα炭素の代わりにペプチド様骨格の窒素に側鎖Ｒ基が接続したグリシン骨格からなる。ペプトイドの固相合成では、合成効率、高収率、およびＲ基側鎖多様性（数百の異なるＲ基が利用可能）がもたらされると同時に合成時間および費用が低減する（Knight,Zhou et al. 2015）。ペプトイド骨格は中性であるが、電気的に制御された転位置を促進するために、荷電Ｒ基をポリマーの長さに沿って用いることができる。例示的な荷電Ｒ基としては、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン（Ｎａｅ）およびＮ−（２−カルボキシエチル）グリシン（Ｎｃｅ）が挙げられる。ペプトイドの概説については、例えば、Setoet al., 2011, "Peptoids: Synthesis, Characterization, and Nanostructures",Comprehensive Biomaterials, vol. 2, pp. 53-76を参照されたい。
電流遮断のためのＲ基は、多くの機能的部分（参照により組み込まれるＵＳ２０１６００７５７３４）から選択することができる。機能的部分としては、アルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アリールオキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、チオエステル、カルボキシチオエステル、エーテル、アミド、アミジノ、硫酸、スルホキシル、スルホニル、スルホニル、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシルアシルアミノ、アミノアシルオキシ、グアニジノ、アルデヒド、ケト、イミン、ニトリル、リン酸、チオール、エポキシド、過酸化物、チオシアン酸、アミジン、オキシム、ニトリル、ジアゾ、ヘテロシクロなどの置換基および／または官能化基が挙げられ、これらの用語はこれらの基の組合せを含む。「複素環式基」または「ヘテロシクロ」は、単独でまたは別の基の一部として本明細書で使用される場合、脂肪族（例えば、完全にまたは部分的に飽和したヘテロシクロ）または芳香族（例えば、ヘテロアリール）単環式または二環式環系を指す。単環式環系は、酸素、窒素および硫黄から独立に選択される１つ、２つ、３つ、または４つのヘテロ原子を含有する任意の５員環または６員環によって例示される。５員環は、０〜２個の二重結合を有し、６員は０〜３個の二重結合を有する。単環式環系の代表的な例としては、これだけに限定されないが、アゼチジン、アゼピン、アジリジン、ジアゼピン、１，３−ジオキソラン、ジオキサン、ジチアン、フラン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、イソチアゾール、イソチアゾリン、イソチアゾリジン、イソキサゾール、イソキサゾリン、イソオキサゾリジン、モルホリン、オキサジアゾール、オキサジアゾリン、オキサジアゾリジン、オキサゾール、オキサゾリン、オキサゾリジン、ピペラジン、ピペリジン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、テトラジン、テトラゾール、チアジアゾール、チアジアゾリン、チアジアゾリジン、チアゾール、チアゾリン、チアゾリジン、チオフェン、チオモルホリン、チオモルホリンスルホン、チオピラン、トリアジン、トリアゾール、トリチアンなどが挙げられる。二環式環系は、本明細書で定義されているアリール基、本明細書で定義されているシクロアルキル基、または本明細書で定義されている別の単環式環系と融合した上記の単環式環系のいずれかによって例示される。二環式環系の代表的な例としては、これだけに限定されないが、例えば、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾキサゾール、ベンゾフラン、ベンゾピラン、ベンゾチオピラン、ベンゾジオキシン、１，３−ベンゾジオキソール、シンノリン、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、ナフチリジン、イソベンゾフラン、イソベンゾチオフェン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、フタラジン、プリン、ピラノピリジン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、キナゾリン、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、チオピラノピリジンなどが挙げられる。これらの環は、その四級化誘導体を含み、必要に応じて、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルコキシ、シクロアルコキシ、シクロアルキルアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、ヘテロシクロアルキルオキシ、メルカプト、アルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ、ハロアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ、アルケニル−Ｓ（Ｏ）ｍ、アルキニル−Ｓ（Ｏ）ｍ、シクロアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ、シクロアルキルアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ、アリール−Ｓ（Ｏ）ｍ、アリールアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ、ヘテロシクロ−Ｓ（Ｏ）ｍ、ヘテロシクロアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ、アミノ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、ハロアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、二置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホンアミド、尿素、アルコキシアシルアミノ、アミノアシルオキシ、ニトロまたはシアノから選択される基で置換されていてよく、ここで、ｍ＝０、１、２または３である。
本開示の非限定的な実施形態を、添付の図面を参照した例により説明するものとする。図面は模式的であり、正確な縮尺は意図されていない。例示が目的であるため、すべての構成要素がすべて図面で標記されているとは限らず、また、当業者による本開示の理解に例示が必要とされない場合は、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているとも限らない。
これらの図面に示されている例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／または記録タグ（および／または該当する場合は、ジタグ、コンパートメントタグ、もしくは分配タグ）またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーを含んでもよく、または置き換えられてもよい。
図１Ａは、図面に示されている機能的エレメントの凡例を示す。したがって、一実施形態では、本明細書には、１つもしくは複数のユニバーサルプライマー配列（または、１つもしくは複数の対のユニバーサルプライマー配列、例えば、対の一方のユニバーサルプライマーは記録タグもしくは伸長記録タグの５’末端にあり、対の他方は３’末端にある）、複数の記録タグもしくは伸長記録タグの中から記録タグもしくは伸長記録タグを識別することができる１つもしくは複数のバーコード配列、１つもしくは複数のＵＭＩ配列、１つもしくは複数のスペーサー配列、および／または１つもしくは複数のエンコーダー配列（例えばコーディングタグのコード配列とも呼ばれる）を含む記録タグもしくは伸長記録タグが提供される。ある特定の実施形態では、伸長記録タグは、（ｉ）１つのユニバーサルプライマー配列、１つのバーコード配列、１つのＵＭＩ配列、および１つのスペーサー（すべて非伸長記録タグに由来する）、（ｉｉ）縦列に配置された１つまたは複数の「カセット」であって、各カセットは結合性物質、ＵＭＩ配列、およびスペーサーのエンコーダー配列を含み、各カセットはコーディングタグに由来する配列情報を含むカセット、ならびに（ｉｉｉ）ｎ回目の結合サイクルにおいてコーディング物質のコーディングタグにより提供されてもよく、ｎは、その後のアッセイ読み出しが所望である結合サイクルの回数を表す整数である、別のユニバーサルプライマー配列を含む。一実施形態では、ユニバーサルプライマー配列を伸長記録タグに導入した後、結合サイクルを継続させてもよく、伸長記録タグをさらに伸長させてもよく、１つまたは複数の追加のユニバーサルプライマー配列を導入してもよい。その場合、伸長記録タグの増幅および／または配列決定は、ユニバーサルプライマー配列の任意の組合せを使用して実施してもよい。
図１Ｂは、タンパク質コードを核酸（例えば、ＤＮＡ）コードへと転換または変換するための基本的概要を示す。この転換または変換では、複数のタンパク質またはポリペプチドが複数のペプチドに断片化され、それらがその後複数のペプチドを表わす伸長記録タグのライブラリーへと変換される。伸長記録タグは、ペプチド配列を表わすＤＮＡにコードされるライブラリー（ＤＥＬ、ＤＮＡ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｌｉｂｒａｒｙ）を構成する。ライブラリーは、適切に修飾して、任意の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームで配列決定することができる。
図２Ａ〜２Ｄは、単一のまたは複数の記録タグと共局在化または共標識されている固定化タンパク質と相互作用するコーディングタグを含む結合性物質（例えば、抗体、アンチカリン、Ｎ−レコグニンタンパク質（Ｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＣｌｐＳ、またはＵＢＲボックスタンパク質など）およびそれらの変異体／ホモログ、ならびにアプタマーなど）の複数のサイクルを使用する、本明細書で開示されている方法によるポリペプチド（例えば、タンパク質）解析の例を示す。この例では、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位、バーコード（例えば、分配バーコード、コンパートメントバーコード、および／または画分バーコード）、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）配列、および必要に応じてコーディングタグと記録タグ（または伸長記録タグ）との間の情報移行に使用されるスペーサー配列（Ｓｐ）を含む。スペーサー配列（Ｓｐ）は、すべての結合サイクルにわたって一定であってもよく、結合性物質特異的であってもよく、および／または結合サイクル数特異的であってもよい（例えば、結合サイクルを「計時」するために使用される）。この例では、コーディングタグは、結合性物質（または結合性物質のクラス、例えば、図３に示されているような修飾Ｎ末端Ｑなどの、末端アミノ酸にすべて特異的に結合する結合物質のクラス）の識別情報を提供するエンコーダー配列、必要に応じたＵＭＩ、及び相補的なスペーサー配列を記録タグにハイブリダイズさせ、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を容易にする（例えば、本明細書ではポリメラーゼ伸長とも呼ばれるプライマー伸長によって）スペーサー配列を含む。また、配列情報の移行にライゲーションを使用してもよく、その場合、スペーサー配列を使用してもよいが必要ではない。図２Ａは、同種結合性物質と分析物（タンパク質またはタンパク質複合体など）とのサイクル結合により伸長記録タグを創出するプロセス、および結合性物質のコーディングタグから分析物の記録タグへの対応する情報移行を示す。一連の連続した結合およびコーディングタグ情報移行ステップの後、結合性物質（例えば、抗体１（Ａｂ１）、抗体２（Ａｂ２）、抗体３（Ａｂ３）、．．．抗体「ｎ」（Ａｂｎ））の識別情報を提供する、「ｎ」結合サイクルからのエンコーダー配列を含む結合性物質コーディングタグ情報、記録タグに由来するバーコード／必要に応じたＵＭＩ配列、結合性物質のコーディングタグに由来する必要に応じたＵＭＩ配列、ならびに増幅およびデジタル次世代シーケンシングによる解析を容易にするための、ライブラリー構築物の各末端にある隣接ユニバーサルプライミング配列を含む最終伸長記録タグが産生される。
図２Ｂは、ＤＮＡバーコード付き記録タグでタンパク質を標識するためのスキームの例を示す。上段パネルでは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、アミン反応性カップリング剤であり、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）は、固形基材の表面への「クリック」カップリングに有用な歪みアルキンである。このスキームでは、記録タグは、タンパク質のリシン（Ｋ）残基（および必要に応じてＮ末端アミノ酸）のεアミンに、ＮＨＳ部分を介してカップリングされる。下段パネルでは、ヘテロ二機能性リンカーであるＮＨＳアルキンを使用して、リシン（Ｋ）残基のεアミンを標識し、アルキン「クリック」部分を創出する。その後、アジド標識ＤＮＡ記録タグを、標準的クリック化学によりこれら反応性アルキン基に容易に付着させることができる。さらに、ＤＮＡ記録タグは、逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）反応によりｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）誘導体化配列決定基材と下流でカップリングするための直交性メチルテトラジン（ｍＴｅｔ）部分を用いて設計することもできる。
図２Ｃは、記録タグを使用したタンパク質解析法の２つの例を示す。上段パネルでは、タンパク質巨大分子などの分析物は、捕捉剤により固体支持体に固定化されており、必要に応じて架橋されている。タンパク質または捕捉剤はいずれも、記録タグと共局在化または標識されていてもよい。下段パネルでは、付随する記録タグを有するタンパク質は、固体支持体に直接固定化されている。
図２Ｄは、同種結合物質のＤＮＡエンコーディング、および得られた伸長記録タグの配列決定を使用した単純なタンパク質イムノアッセイの全体的なワークフローの例を示す。タンパク質は、記録タグによりバーコード付与（つまりインデックス付与）され、サイクル結合解析前にプールされ、試料スループットおよび結合試薬節約が大幅に増加される試料であってもよい。この手法は、多数の生体試料のタンパク質レベル（発現レベルなど）を定量的な様式で同時に測定することを可能にする、逆相タンパク質アッセイ（ＲＰＰＡ）を実施するための有効なデジタル式のより単純でより大規模化可能な手法である。
図３Ａ〜３Ｄは、ポリペプチド配列を表わす伸長記録タグ（例えば、ＤＮＡ配列）を構築することによる、分解に基づくポリペプチド配列決定アッセイのプロセスを示す。これは、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合、ポリペプチドに付着している記録タグへのコーディングタグ情報の移行、末端アミノ酸切断（ＮＴＡＡ切断など）のサイクルプロセスを使用し、このプロセスを、例えばすべて固体支持体にてサイクル様式で繰り返すエドマン分解様手法により達成される。ペプチドのＮ末端分解に由来する伸長記録タグの例示的な構築の概要が提供されている：（Ａ）ペプチドのＮ末端アミノ酸を標識する（例えば、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、スルホニルニトロフェニル（ＳＮＰ）、アセチル、またはグアニジンジル（ｇｕａｎｉｄｉｎｄｙｌ）部分で）；（Ｂ）は、標識ＮＴＡＡに結合された結合性物質および付随するコーディングタグを示す；（Ｃ）は、固体支持体（例えば、ビーズ）に結合され、記録タグに（例えば、三機能性リンカーを介して）付随するポリペプチドを示し、結合性物質がポリペプチドのＮＴＡＡに結合すると、コーディングタグの情報が記録タグに移行され（例えば、プライマー伸長、または一本鎖ライゲーションもしくは二本鎖ライゲーションもしくは平滑末端ライゲーションもしくは粘着末端ライゲーションを含むライゲーションにより）、伸長記録タグが生成される；（Ｄ）標識ＮＴＡＡを、化学的または生物学的（酵素的）な手段により切断して、新しいＮＴＡＡを露出させる。矢印により示されているように、このサイクルを「ｎ」回繰り返して、最終伸長記録タグを生成する。最終伸長記録タグは、必要に応じて、下流の増幅および／またはＤＮＡ配列決定を容易にするために、ユニバーサルプライミング部位により隣接されている。フォワードユニバーサルプライミング部位（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ５−Ｓ１配列）は、元の記録タグ設計の一部であってもよく、リバースユニバーサルプライミング部位（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ７−Ｓ２’配列）は、記録タグの伸長の最終ステップとして添加してもよい。この最終ステップは、結合性物質とは独立して実施してもよい。
図４Ａ〜４Ｂは、本明細書で開示されている方法による例示的なタンパク質配列決定ワークフローを示す。図４Ａは、例示的なワークフローを示し、代替モードが明灰色の破線で概説されており、四角の中に示されている特定の実施形態が矢印で関連付けられている。ワークフローの各ステップの代替モードが、矢印下方の四角の中に示されている。図４Ｂは、サイクル結合およびコーディングタグ情報移行ステップを実施する際の、情報移行の効率を向上させるための選択肢を示す。１分子当たり複数の記録タグを用いることができる。さらに、所与の結合事象毎に、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を複数回実施してもよく、またはその代わりに表面増幅ステップを用いて、伸長記録タグライブラリーなどのコピーを創出してもよい。
図４Ａ〜４Ｂは、本明細書で開示されている方法による例示的なタンパク質配列決定ワークフローを示す。図４Ａは、例示的なワークフローを示し、代替モードが明灰色の破線で概説されており、四角の中に示されている特定の実施形態が矢印で関連付けられている。ワークフローの各ステップの代替モードが、矢印下方の四角の中に示されている。図４Ｂは、サイクル結合およびコーディングタグ情報移行ステップを実施する際の、情報移行の効率を向上させるための選択肢を示す。１分子当たり複数の記録タグを用いることができる。さらに、所与の結合事象毎に、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を複数回実施してもよく、またはその代わりに表面増幅ステップを用いて、伸長記録タグライブラリーなどのコピーを創出してもよい。
図５Ａ〜５Ｂは、プライマー伸長を使用して、結合性物質のコーディングタグの識別情報を、巨大分子（例えば、ポリペプチド）などの分析物に付随する記録タグへと移行させて伸長記録タグを生成するための、伸長記録タグの例示的な構築の概要を示す。結合性物質に関する識別情報を有する一意のエンコーダー配列を含むコーディングタグは各末端が、必要に応じて、共通スペーサー配列（Ｓｐ’）により隣接されている。図５Ａは、記録タグで標識され、ビーズに連結されているポリペプチドのＮＴＡＡに結合するコーディングタグを含むＮＴＡＡ結合性物質を示す。記録タグは、相補的スペーサー配列を介してコーディングタグにアニーリングし（ＳｐはＳｐ’にアニーリングする）、プライマー伸長反応は、スペーサー（Ｓｐ）をプライミング部位として使用したコーディングタグ情報の記録タグへの移行を媒介する。コーディングタグは、結合性物質から遠位にある末端での一本鎖スペーサー（Ｓｐ’）配列との二本鎖として示されている。この構成は、記録タグの内部部位へのコーディングタグのハイブリダイゼーションを最小限に抑え、記録タグの末端スペーサー（Ｓｐ）配列と、コーディングタグの一本鎖スペーサー突出（Ｓｐ’）とのハイブリダイゼーションに有利に働く。さらに、伸長記録タグは、コーディングタグと内部記録タグ配列エレメントとのハイブリダイゼーションを阻止するために、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、エンコーダーおよび／またはスペーサー配列に相補的な）と事前にアニーリングされていてもよい。図５Ｂは、結合（「＊＊＊」は、伸長記録タグに示されていないその間の結合サイクルを表わす）、およびコーディングタグ情報の移行、およびユニバーサルプライミング部位の３’末端への付加の「ｎ」回のサイクル後に産生された最終伸長記録タグを示す。
図６は、コーディングタグ情報が、酵素的ライゲーションにより伸長記録タグへと移行されることを示す。それぞれの記録タグを有する２つの異なる分析物が示されており、記録タグ伸長は並行して進行する。ライゲーションは、スペーサー配列（Ｓｐ’）が、記録タグの相補的スペーサー（Ｓｐ）とアニーリングする「粘着末端」突出を一方の鎖に有するように、二本鎖コーディングタグを設計することにより容易になり得る。この「粘着末端」（「付着末端」としても知られている）は、長さが、０〜８塩基、例えばおよそ２〜４塩基であってもよい。二本鎖コーディングタグの相補鎖は、記録タグにライゲーションされた後、情報を記録タグへと移行させる。相補鎖は、ライゲーション前の記録タグのＳｐと同じであってもよくまたは異なっていてもよい別のスペーサー配列を含んでもよい。ライゲーションを使用して記録タグを伸長させる場合、伸長の方向は、示されているように、５’から３’であってもよく、または必要に応じて３’から５’であってもよい。
図７は、スペーサー配列を伸長記録タグに挿入せずに、記録タグまたは伸長記録タグの３’ヌクレオチドを、コーディングタグ（またはその相補体）の５’ヌクレオチドと連結させる化学的ライゲーションにより、コーディングタグ情報を記録タグへと移行させる「無スペーサー」手法を示す。また、伸長記録タグおよびコーディングタグの向きを逆にして、記録タグの５’末端が、コーディングタグ（または相補体）の３’末端にライゲーションされるようにしてもよい。示されている例では、記録タグの相補的「ヘルパー」オリゴヌクレオチド配列（「記録ヘルパー」）とコーディングタグとのハイブリダイゼーションを使用して、複合体を安定させ、記録タグのコーディングタグ相補鎖への特異的な化学的ライゲーションを可能にさせる。得られる伸長記録タグは、スペーサー配列を欠いている。また、ＤＮＡ、ＰＮＡ、または類似の核酸ポリマーを用いることができる「クリック化学」型の化学的ライゲーション（例えば、アジドおよびアルキン部分（３本線記号として示されている）が使用される）が示されている。
図８Ａ〜８Ｂは、Ｎ末端アミノ酸分解の前に、ポリペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）情報を伸長記録タグに書き込むための例示的な方法を示す。図８Ａ：結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む結合性物質（例えば、ホスホチロシン抗体の識別情報を有するコーディングタグを含むホスホチロシン抗体）を、ポリペプチドに結合させることが可能である。ホスホチロシンが、図示されているように記録タグ標識ポリペプチドに存在する場合、ホスホチロシン抗体がホスホチロシンに結合すると、コーディングタグおよび記録タグが、相補的スペーサー配列を介してアニーリングし、コーディングタグ情報が記録タグに移行され、伸長記録タグが生成される。図８Ｂ：伸長記録タグは、一次アミノ酸配列（例えば、「ａａ１」、「ａａ２」、「ａａ３」、．．．、「ａａＮ」）およびペプチドの翻訳後修飾（例えば、「ＰＴＭ１」、「ＰＴＭ２」）の両方のコーディングタグ情報を含んでいてもよい。
図９Ａ〜９Ｂは、結合性物質を分析物（例えば、ポリペプチドなどの巨大分子）に結合させ、結合性物質に付着しているコーディングタグの情報を、例えば、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着している単一の分析物の部位に共局在化されている複数の記録タグのうちの個々の記録タグへと移行させ、それにより分析物情報（例えば、試料中の存在もしくは非存在、レベル、もしくは量、結合物質のライブラリーへの結合プロファイル、活性もしくは反応性、アミノ酸配列、翻訳後修飾、試料の起源、またはそれらの任意の組合せ）を集合的に表す複数の伸長記録タグを生成する複数サイクルのプロセスを示す。この図では、例示のために過ぎないが、分析物は、ポリペプチドであり、各サイクルは、結合性物質をＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合させること、コーディングタグ情報を記録タグに移行させることにより結合事象を記録すること、その後そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。図９Ａは、分析物に結合されている結合性物質に利用可能な、固体支持上の複数の記録タグ（例えば、ユニバーサルフォワードプライミング配列およびＵＭＩを含む）を示す。個々の記録タグは、伸長反応をプライムして、コーディングタグ情報を記録タグへと移行するために使用することができる、結合性物質のコーディングタグ内の共通スペーサー配列に相補的な共通スペーサー配列（Ｓｐ）を有する。例えば、複数の記録タグは、支持体上の分析物と共局在化することができ、記録タグの一部は、他のものよりも分析物により近くてもよい。一態様では、支持体上の分析物密度に対する記録タグの密度は、各分析物が、統計的に、その分析物に結合されている結合性物質に利用可能な複数の記録タグ（例えば、少なくとも約２個、約５個、約１０個、約２０個、約５０個、約１００個、約２００個、約５００個、約１０００個、約２０００個、約５０００個、またはそれよりも多くの）を有することになるように制御することができる。このモードは、試料中の豊富さが低いタンパク質またはポリペプチドの解析に特に有用であってもよい。図９Ａは、異なる記録タグが、サイクル１〜３の各々で伸長される（例えば、結合性物質のまたは各結合／反応サイクルで別々に付加されるサイクル特異的バーコードを使用して、結合／反応を「計時」することができる）ことを示すが、伸長記録タグは、その後の結合サイクルの任意の１つまたは複数でさらに伸長されてもよく、得られる伸長記録タグのプールは、１回のみ、２回、３回、またはそれよりも多くの回数伸長されている記録タグの混合物であってもよいことが起想される。図９Ｂは、各連続サイクルの結合に使用されるサイクル特異的ＮＴＡＡ結合性物質の様々なプールを示し、各プールは、サイクル特異的スペーサー配列などのサイクル特異的配列を有する。あるいは、サイクル特異的配列は、結合性物質とは別の試薬に提供されてもよい。
図１０Ａ〜１０Ｃは、結合性物質に付着しているコーディングタグの情報を、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着している単一の分析物（例えば、ポリペプチドなどの巨大分子）の部位に共局在化されている複数の記録タグのうちの記録タグへと移行させ、それにより分析物を集合的に表す複数の伸長記録タグを生成する複数のサイクルを含む例示的なモードを示す。この図では、例示のために過ぎないが、分析物は、ポリペプチドであり、プロセスの各ラウンドは、ＮＴＡＡと結合させること、結合事象を記録すること、その後そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。図１０Ａは、例えば１ビーズ当たり単一分子の分析物の、固体支持体上の複数の記録タグ（例えば、ユニバーサルフォワードプライミング配列およびＵＭＩを含む）を示す。個々の記録タグは、異なる「サイクル特異的」配列（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、．．．Ｃｎ）を有する異なるスペーサー配列を３’末端に有する。例えば、各ビーズ上の記録タグは、同じコンパートメントバーコードおよび／またはＵＭＩ配列を共有する。第１のサイクルの結合（サイクル１）では、複数のＮＴＡＡ結合性物質を分析物と接触させる。サイクル１で使用される結合性物質は、記録タグのサイクル１ Ｃ１スペーサー配列に相補的な共通５’スペーサー配列（Ｃ’１）を有する。また、サイクル１で使用される結合性物質は、サイクル２スペーサーＣ２に相補的な３’スペーサー配列（Ｃ’２）を有する。結合サイクル１中、第１のＮＴＡＡ結合性物質は、分析物の遊離Ｎ末端に結合し、第１のコーディングタグの情報が、相補的Ｃ’１スペーサー配列にハイブリダイズされたＣ１配列から、プライマー伸長により、同種記録タグに移行される。ＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させた後、結合サイクル２は、サイクル１結合性物質の３’スペーサー配列と同一であるサイクル２ ５’スペーサー配列（Ｃ’２）および共通のサイクル３ ３’スペーサー配列（Ｃ’３）を有する複数のＮＴＡＡ結合性物質を、分析物と接触させる。第２のＮＴＡＡ結合性物質は、分析物のＮＴＡＡと結合し、第２のコーディングタグの情報が、プライマー伸長により、相補的なＣ２およびＣ’２スペーサー配列から同種記録タグへと移行される。これらのサイクルを、最大「ｎ」結合サイクル繰り返し、最後の伸長記録タグを、ユニバーサルリバースプライミング配列でキャッピングし、単一の分析物と共局在化されている複数の伸長記録タグを生成し、各伸長記録タグは、１結合サイクルに由来するコーディングタグ情報を有する。各連続結合サイクルで使用される各セットの結合性物質は、コーディングタグにサイクル特異的スペーサー配列を有するため、結合サイクル情報を、得られる伸長記録タグの結合性物質情報と関連付けることができる。図１０Ｂは、結合の各連続サイクルに使用されるサイクル特異的結合性物質の様々なプールを示し、各プールは、サイクル特異的スペーサー配列を有する。図１０Ｃは、サイクル特異的スペーサー配列を使用し、伸長記録タグのＰＣＲアセンブリに基づいて、伸長記録タグ（例えば、分析物の部位に共局在化されている）のコレクションを逐次的に組み立て、それにより巨大分子などの分析物の順序付けられた配列を提供することができる方法を示す。好ましいモードでは、鎖状体形成前に、増幅により各伸長記録タグの複数のコピーを生成する。
図１１Ａ〜１１Ｂは、記録タグからコーディングタグまたはジタグ構築物への情報移行を示す。結合情報を記録するための２つの方法（Ａ）および（Ｂ）が示されている。結合性物質は、本明細書に記載の任意のタイプの結合性物質であってもよく、抗ホスホチロシン結合性物質が示されているが、それは例示のために過ぎない。伸長コーディングタグまたはジタグ構築の場合、結合情報をコーディングタグから記録タグへと移行させるのではなく、情報を、記録タグからコーディングタグへと移行させて、伸長コーディングタグを生成するか（図１１Ａ）、または情報を、記録タグおよびコーディングタグの両方から第３のジタグ形成構築物へと移行させるか（図１１Ｂ）のいずれかである。ジタグおよび伸長コーディングタグは、記録タグ（バーコード、必要に応じたＵＭＩ配列、および必要に応じたコンパートメントタグ（ＣＴ）配列（図示せず））およびコーディングタグの情報を含む。ジタグおよび伸長コーディングタグを、記録タグから溶出させ、収集し、必要に応じて増幅し、次世代シーケンサーで読み取ることができる。
図１２Ａ〜１２Ｄは、ＰＮＡコンビナトリアルバーコード／ＵＭＩ記録タグの設計、および結合事象のジタグ検出を示す。図１２Ａには、化学的ライゲーションによる、４つの基本ＰＮＡワード配列（Ａ、Ａ’−Ｂ、Ｂ’−Ｃ、およびＣ’）のコンビナトリアルＰＮＡバーコード／ＵＭＩの構築が示されている。ＤＮＡアームのハイブリダイズは、ＰＮＡバーコード／ＵＭＩのコンビナトリアルアセンブリの無スペーサーコンビナトリアル鋳型を創出するために含まれている。化学的ライゲーションは、アニーリングされたＰＮＡ「ワード」を縫い合わせるために使用される。図１２Ｂは、記録タグのＰＮＡ情報をＤＮＡ中間体へと移行させるための方法を示す。ＤＮＡ中間体は、情報をコーディングタグへと移行させることが可能である。すなわち、相補的ＤＮＡワード配列を、ＰＮＡにアニーリングさせ、化学的にライゲーションする（必要に応じて、ＰＮＡ鋳型を使用するリガーゼが発見された場合は、酵素的にライゲーションする）。図１２Ｃでは、ＤＮＡ中間体は、スペーサー配列Ｓｐを介して、コーディングタグと相互作用するように設計されている。鎖置換プライマー伸長ステップは、ライゲーションされたＤＮＡを置換し、記録タグ情報をＤＮＡ中間体からコーディングタグへと移行させ、伸長コーディングタグを生成する。ターミネーターヌクレオチドを、ＤＮＡ中間体の末端に組み込んで、プライマー伸長によるコーディングタグ情報のＤＮＡ中間体への移行を防止してもよい。図１２Ｄ：あるいは、情報を、コーディングタグからＤＮＡ中間体へと移行させて、ジタグ構築物を生成してもよい。ターミネーターヌクレオチドを、コーディングタグの末端に組み込んで、ＤＮＡ中間体からコーディングタグへの記録タグ情報の移行を防止してもよい。
図１３Ａ〜１３Ｅは、コンパートメントバーコート付きビーズへのプロテオーム分配、その後のエマルジョン融合ＰＣＲでのジタグアセンブリによる、ポリペプチド配列組成を表わすエレメントのライブラリーの生成を示す。その後、ポリペプチドのアミノ酸の内容は、Ｎ末端配列決定法により、またはその代わりに、アミノ酸特異的化学的標識もしくはコーディングタグが付随されている結合性物質を付着（共有結合または非共有結合）させることにより特徴付けることができる。コーディングタグは、ユニバーサルプライミング配列、ならびにアミノ酸を識別するためのエンコーダー配列、コンパートメントタグ、およびアミノ酸ＵＭＩを含む。情報移行の後、ジタグを、記録タグＵＭＩにより元の分子にマッピングし戻す。図１３Ａでは、プロテオームを、バーコード付きビーズを有する液滴にコンパートメント化する。付随する記録タグ（コンパートメントバーコード情報を含む）を有するペプチドを、ビーズ表面に付着させる。液滴エマルジョンを破壊して、ペプチドが分配されているバーコード付きビーズを放出させる。図１３Ｂでは、ペプチドの特定のアミノ酸残基を、部位特異的標識部分にコンジュゲートされているＤＮＡコーディングタグで化学的に標識する。ＤＮＡコーディングタグは、アミノ酸バーコード情報および必要に応じてアミノ酸ＵＭＩを含む。図１３Ｃ：標識ペプチド−記録タグ複合体を、ビーズから放出させる。図１３Ｄ：標識ペプチド−記録タグ複合体を、１コンパートメント当たり平均で１つ未満のペプチド−記録タグ複合体が存在するように、ナノエマルジョンまたはマイクロエマルジョンへと乳化する。図１３Ｅ：エマルジョン融合ＰＣＲは、記録タグ情報（例えば、コンパートメントバーコード）を、アミノ酸残基に付着しているＤＮＡコーディングタグのすべてに移行させる。
図１４は、乳化されたペプチド記録タグ−コーディングタグ複合体からの伸長コーディングタグの生成を示す。図１３Ｃのペプチド複合体を、１液滴当たり平均で単一のペプチド複合体となるように、ＰＣＲ試薬と共に液滴内へと共乳化する。３プライマー融合ＰＣＲ（ｔｈｒｅｅ−ｐｒｉｍｅｒ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）手法を使用して、ペプチドに付随されている記録タグを増幅し、増幅した記録タグを、複数の結合性物質コーディングタグまたは共有結合で標識されたアミノ酸のコーディングタグと融合し、プライマー伸長によりコーディングタグを伸長させて、ペプチドＵＭＩおよびコンパートメントタグ情報を、記録タグからコーディングタグへと移行させ、得られた伸長コーディングタグを増幅する。１液滴当たり複数の伸長コーディングタグ種が存在し、存在する各アミノ酸エンコーダー配列−ＵＭＩコーディングタグ毎に種が異なる。このようにして、ペプチド内のアミノ酸の同一性および計数を両方とも決定することができる。Ｕ１ユニバーサルプライマーおよびＳｐプライマーは、Ｕ２ｔｒユニバーサルプライマーよりも高い融解Ｔｍを有するように設計される。これにより、２段階ＰＣＲが可能になり、２段階ＰＣＲでは、最初の少数回のサイクルをより高いアニーリング温度で実施して記録タグを増幅し、その後、ＰＣＲ中に記録タグおよびコーディングタグが互いにプライミングして伸長コーディングタグが産生されるように、より低いＴｍの段階へと進み、Ｕ１およびＵ２ｔｒユニバーサルプライマーを使用して、得られた伸長コーディングタグ産物の増幅をプライミングする。ある特定の実施形態では、Ｕ２ｔｒプライマーからの時期尚早ポリメラーゼ伸長は、光解離性３’ブロッキング基を使用することにより防止することができる（Young et al., 2008, Chem. Commun. (Camb) 4:462-464）。記録タグを増幅する第１のラウンドのＰＣＲ、およびコーディングタグＳｐｔｒが、記録タグの増幅されたＳｐ’配列のコーディングタグの伸長をプライミングする第２のラウンドの融合ＰＣＲステップの後、Ｕ２ｔｒの３’ブロッキング基を除去し、Ｕ１およびＵ２ｔｒプライマーを有する伸長コーディングタグを増幅するために、より高い温度でのＰＣＲを開始させる。
図１５は、タンパク質のマッピング性およびフェージングの増強を容易にするプロテオーム分配およびバーコード付与の使用を示す。ポリペプチド配列決定では、典型的には、タンパク質を消化してペプチドにする。このプロセスでは、親タンパク質分子に由来する個々のポリペプチド間の関係性に関する情報、および親タンパク質分子に対するそれらの関係性が失われる。この情報を再構築するために、個々のペプチド配列を、それらが由来する可能性のあるタンパク質配列のコレクションにマッピングし戻す。そのようなセット内に一意の一致を見出すタスクは、短鎖および／または部分ペプチド配列では、コレクションのサイズおよび複雑性（例えば、プロテオーム配列複雑性）が増加すると共により困難となる。バーコード付き（例えば、コンパートメントタグ付き）コンパートメントまたは区分へとプロテオームを分配し、その後タンパク質をペプチドへと消化し、コンパートメントタグをペプチドに接合することにより、ペプチド配列をマッピングする必要のある「タンパク質」空間が低減され、複雑なタンパク質試料の場合のタスクが大幅に単純化される。ペプチドへと消化する前に、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を有するタンパク質を標識することにより、ペプチドを元のタンパク質分子にマッピングし戻すことが容易になり、同じタンパク質分子に由来する翻訳後修飾（ＰＴＭ）変異体間のフェージング情報の注釈、および個々のプロテオフォームの識別が可能になる。図１５Ａは、コンパートメントまたは分配バーコードを含む記録タグでタンパク質を標識し、その後記録タグ標識ペプチドへと断片化することを含む、プロテオーム分配の例を示す。図１５Ｂ：部分ペプチド配列情報または組成情報のみの場合でさえ、このマッピングは、高度に縮重性である。しかしながら、同じタンパク質に由来する複数のペプチドからの情報と結び付けられた部分ペプチド配列または組成情報は、元のタンパク質分子の一意の識別を可能にする。
図１６は、コンパートメントタグ付きビーズ配列設計の例示的なモードを示す。コンパートメントタグは、個々のコンパートメントを識別するためのＸ５〜２０のバーコード、およびコンパートメントタグが接合されているペプチドを識別するためのＮ５〜１０の一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含み、ＸおよびＮは、縮重した核酸塩基または核酸塩基ワードを表わす。コンパートメントタグは、一本鎖であってもよく（上段に図示）、または二本鎖であってもよい（下段に図示）。必要に応じて、コンパートメントタグは、目的のペプチドと接合するためのタンパク質リガーゼ（例えば、ブテラーゼＩ（ｂｕｔｅｌａｓｅ Ｉ））の認識配列を有するペプチド配列を含むキメラ分子であってもよい（左側に図示）。あるいは、目的のペプチドとのカップリングのための化学的部分が、コンパートメントタグに含まれていてもよい（例えば、右側の図に示されるようなアジド）。
図１７Ａ〜１７Ｂは、（Ａ）複数のペプチドを表す複数の伸長記録タグおよび（Ｂ）標準的ハイブリッド捕捉技法による標的ペプチド濃縮の例示的な方法を示す。例えば、ハイブリッド捕捉濃縮では、ペプチドのライブラリーを表わす伸長記録タグのライブラリーから、１つまたは複数の目的のペプチド（「標的ペプチド」）を表わす伸長記録タグとハイブリダイズする１つまたは複数のビオチン化「ベイト」オリゴヌクレオチドを使用してもよい。ベイトオリゴヌクレオチド：標的伸長記録タグハイブリダイゼーション対を、ハイブリダイゼーション後にビオチンタグにより溶液からプルダウンして、１つまたは複数の目的のペプチドを表わす伸長記録タグの濃縮画分を生成する。伸長記録タグの分離（「プルダウン」）は、例えば、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して達成することができる。ビオチン部分を、ビーズのストレプトアビジンと結合させ、磁石を使用してビーズを局在化させ、溶液を除去または交換することにより分離を達成する。望ましくないかまたは過剰に豊富なペプチドを表わす伸長記録タグに競合的にハイブリダイズする非ビオチン化競合物質濃縮オリゴヌクレオチドを、必要に応じて、ハイブリッド捕捉アッセイのハイブリダイゼーションステップに含めて、濃縮された標的ペプチドの量をモジュレートしてもよい。非ビオチン化競合オリゴヌクレオチドは、標的ペプチドとのハイブリダイゼーションを競合するが、ハイブリダイゼーション二本鎖は、ビオチン部分が存在しないため捕捉ステップ中に捕捉されない。したがって、競合オリゴヌクレオチドのビオチン化「ベイト」オリゴヌクレオチドに対する比を調整することにより、濃縮された伸長記録タグ画分を、広いダイナミックレンジにわたってモジュレートすることができる。このステップは、試料内のタンパク質存在量のダイナミックレンジ問題に対処するために重要になるであろう。
図１８Ａ〜１８Ｂは、単一細胞およびバルクプロテオームを個々の液滴内に分配するための例示的な方法を示し、各液滴は、ペプチドをそれらの元のタンパク質複合体と、または単一細胞に由来するタンパク質と相関させるために、複数のコンパートメントタグが付着しているビーズを含む。コンパートメントタグは、バーコードを含む。液滴形成後の液滴構成成分の操作：（Ａ）単一細胞を個々の液滴内に分配し、その後細胞溶解して細胞プロテオームを放出させ、タンパク質分解により細胞プロテオームをペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する；（Ｂ）バルクプロテオームを、複数の液滴内に分配し、個々の液滴は、タンパク質複合体を含み、その後タンパク質分解によりタンパク質複合体をペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する。熱不安定性メタロ−プロテアーゼを使用し、光ケージ化２価カチオンを光放出させてプロテアーゼを活性化した後、封入されているタンパク質をペプチドへと消化することができる。プロテアーゼは、十分なタンパク質分解後に加熱不活化してもよく、または２価カチオンをキレートしてもよい。液滴は、ペプチドのＮ−またはＣ−末端アミノ酸のいずれかにライゲートすることが可能な核酸バーコード（記録タグとは別の）を含む、ハイブリダイズされたまたは放出可能なコンパートメントタグを含む。
図１９Ａ〜１９Ｂは、単一細胞およびバルクプロテオームを個々の液滴内に分配するための例示的な方法を示し、各液滴は、ペプチドをそれらの元のタンパク質またはタンパク質複合体と、またはタンパク質を元の単一細胞と相関させるために、コンパートメントタグが付着している複数の二機能性記録タグを有するビーズを含む。液滴形成後の液滴構成成分の操作：（Ａ）単一細胞を個々の液滴内に分配し、その後細胞溶解して細胞プロテオームを放出させ、タンパク質分解により細胞プロテオームをペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する；（Ｂ）バルクプロテオームを、複数の液滴内に分配し、個々の液滴は、タンパク質複合体を含み、その後タンパク質分解によりタンパク質複合体をペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する。熱不安定性メタロ−プロテアーゼを使用し、光ケージ化２価カチオン（例えば、Ｚｎ２＋）を光放出させた後、封入されているタンパク質をペプチドへと消化することができる。プロテアーゼは、十分なタンパク質分解後に加熱不活化してもよく、または２価カチオンをキレートしてもよい。液滴は、ペプチドのＮ−またはＣ−末端アミノ酸のいずれかにライゲートすることが可能な核酸バーコード（記録タグとは別の）を含む、ハイブリダイズされたまたは放出可能なコンパートメントタグを含む。
図２０Ａ〜２０Ｌは、ペプチドに付着したコンパートメントバーコード付き記録タグの生成を示す。コンパートメントバーコード付与技術（例えば、マイクロ流体液滴中のバーコード付きビーズなど）を使用して、コンパートメント特異的バーコードを、特定のコンパートメント内に封入されている分子内容物に移行させることができる。（Ａ）特定の実施形態では、タンパク質分子を変性させ、リシン残基（Ｋ）のε−アミン基を、活性化されたユニバーサルＤＮＡタグ分子（５’末端にＮＨＳ部分を有することが示されているユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）を含むが、任意の他のバイオコンジュゲーション部分も用いることができる）と化学的にコンジュゲートさせる。ユニバーサルＤＮＡタグをポリペプチドにコンジュゲーションした後、過剰なユニバーサルＤＮＡタグを除去する。（Ｂ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合された核酸分子とハイブリダイズさせ、個々のビーズに結合された核酸分子は、コンパートメントタグ（バーコード）配列の一意の集団を含む。コンパートメント化は、液滴などの異なる物理的コンパートメント内（破線楕円により示されている）に試料を分離することにより生じ得る。あるいは、コンパートメント化は、例えば、ポリペプチドのユニバーサルＤＮＡタグを、ビーズのコンパートメントＤＮＡタグにアニーリングさせることによって、標識ポリペプチドをビーズ表面に固定化することにより、追加の物理的分離を必要とせずに、直接的に達成することができる。単一のポリペプチド分子は、単一のビーズとのみ相互作用する（例えば、単一のポリペプチドは、複数のビーズにまたがっていない）。しかしながら、複数のポリペプチドが、同じビーズと相互作用する場合がある。コンパートメントバーコード配列（ＢＣ）に加えて、ビーズに結合された核酸分子は、共通Ｓｐ（スペーサー）配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、およびポリペプチドＤＮＡタグＵ１’に相補的な配列で構成されていてもよい。（Ｃ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合されたコンパートメントタグとアニーリングさせた後、付着リンカーを切断することよりコンパートメントタグをビーズから放出する。（Ｄ）アニーリングしたＵ１ ＤＮＡタグプライマーを、ビーズに由来するコンパートメントタグ核酸分子を鋳型として使用する、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長により伸長させる。プライマー伸長ステップは、（Ｃ）に示されているようにコンパートメントタグをビーズから放出させた後で、または必要に応じてコンパートメントタグが依然としてビーズに付着している間（図示せず）に実施してもよい。これにより、ビーズのコンパートメントタグに由来するバーコード配列が、ポリペプチドのＵ１ ＤＮＡタグ配列に効果的に書き込まれる。この新しい配列が、記録タグを構成する。プライマー伸長後、プロテアーゼ、例えば、Ｌｙｓ−Ｃ（リシン残基のＣ末端側を切断する）、Ｇｌｕ−Ｃ（グルタミン酸残基のＣ末端側を、および程度はより低いがグルタミン酸残基を切断する）、またはプロテイナーゼＫなどのランダムプロテアーゼを使用して、ポリペプチドをペプチド断片へと切断する。（Ｅ）各ペプチド断片は、本明細書で開示されているように下流でペプチド配列決定するために、そのＣ末端リシンを、記録タグを構成する伸長ＤＮＡタグ配列で標識する。（Ｆ）記録タグ付きペプチドを、歪みアルキン標識ＤＢＣＯを介してアジドビーズにカップリングする。また、アジドビーズは、必要に応じて、ＤＢＣＯ−アジド固定化の効率を促進するために、記録タグに相補的な捕捉配列を含む。なお、元のビーズからペプチドを除去し、新しい固体支持体（例えば、ビーズ）に再固定化することにより、ペプチド間の最適な分子間離間が可能になり、本明細書で開示されているペプチド配列決定法が容易になることが留意されるべきである。
図２０Ａ〜２０Ｌは、ペプチドに付着したコンパートメントバーコード付き記録タグの生成を示す。コンパートメントバーコード付与技術（例えば、マイクロ流体液滴中のバーコード付きビーズなど）を使用して、コンパートメント特異的バーコードを、特定のコンパートメント内に封入されている分子内容物に移行させることができる。（Ａ）特定の実施形態では、タンパク質分子を変性させ、リシン残基（Ｋ）のε−アミン基を、活性化されたユニバーサルＤＮＡタグ分子（５’末端にＮＨＳ部分を有することが示されているユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）を含むが、任意の他のバイオコンジュゲーション部分も用いることができる）と化学的にコンジュゲートさせる。ユニバーサルＤＮＡタグをポリペプチドにコンジュゲーションした後、過剰なユニバーサルＤＮＡタグを除去する。（Ｂ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合された核酸分子とハイブリダイズさせ、個々のビーズに結合された核酸分子は、コンパートメントタグ（バーコード）配列の一意の集団を含む。コンパートメント化は、液滴などの異なる物理的コンパートメント内（破線楕円により示されている）に試料を分離することにより生じ得る。あるいは、コンパートメント化は、例えば、ポリペプチドのユニバーサルＤＮＡタグを、ビーズのコンパートメントＤＮＡタグにアニーリングさせることによって、標識ポリペプチドをビーズ表面に固定化することにより、追加の物理的分離を必要とせずに、直接的に達成することができる。単一のポリペプチド分子は、単一のビーズとのみ相互作用する（例えば、単一のポリペプチドは、複数のビーズにまたがっていない）。しかしながら、複数のポリペプチドが、同じビーズと相互作用する場合がある。コンパートメントバーコード配列（ＢＣ）に加えて、ビーズに結合された核酸分子は、共通Ｓｐ（スペーサー）配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、およびポリペプチドＤＮＡタグＵ１’に相補的な配列で構成されていてもよい。（Ｃ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合されたコンパートメントタグとアニーリングさせた後、付着リンカーを切断することよりコンパートメントタグをビーズから放出する。（Ｄ）アニーリングしたＵ１ ＤＮＡタグプライマーを、ビーズに由来するコンパートメントタグ核酸分子を鋳型として使用する、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長により伸長させる。プライマー伸長ステップは、（Ｃ）に示されているようにコンパートメントタグをビーズから放出させた後で、または必要に応じてコンパートメントタグが依然としてビーズに付着している間（図示せず）に実施してもよい。これにより、ビーズのコンパートメントタグに由来するバーコード配列が、ポリペプチドのＵ１ ＤＮＡタグ配列に効果的に書き込まれる。この新しい配列が、記録タグを構成する。プライマー伸長後、プロテアーゼ、例えば、Ｌｙｓ−Ｃ（リシン残基のＣ末端側を切断する）、Ｇｌｕ−Ｃ（グルタミン酸残基のＣ末端側を、および程度はより低いがグルタミン酸残基を切断する）、またはプロテイナーゼＫなどのランダムプロテアーゼを使用して、ポリペプチドをペプチド断片へと切断する。（Ｅ）各ペプチド断片は、本明細書で開示されているように下流でペプチド配列決定するために、そのＣ末端リシンを、記録タグを構成する伸長ＤＮＡタグ配列で標識する。（Ｆ）記録タグ付きペプチドを、歪みアルキン標識ＤＢＣＯを介してアジドビーズにカップリングする。また、アジドビーズは、必要に応じて、ＤＢＣＯ−アジド固定化の効率を促進するために、記録タグに相補的な捕捉配列を含む。なお、元のビーズからペプチドを除去し、新しい固体支持体（例えば、ビーズ）に再固定化することにより、ペプチド間の最適な分子間離間が可能になり、本明細書で開示されているペプチド配列決定法が容易になることが留意されるべきである。
図２０Ｇ〜２０Ｌは、アルキンで予め標識したポリペプチド（図２Ｂに記載のような）へのＤＮＡタグのクリック化学的コンジュゲーションを使用すること以外は、図２０Ａ〜２０Ｆに示されているものと同様の概念を示す。アジドおよびｍＴｅｔ化学は、直交性であり、ＤＮＡタグへのクリックコンジュゲーション、および配列決定基材へのクリックｉＥＤＤＡコンジュゲーション（ｍＴｅｔおよびＴＣＯ）を可能にする。 図２０Ｇ〜２０Ｌは、アルキンで予め標識したポリペプチド（図２Ｂに記載のような）へのＤＮＡタグのクリック化学的コンジュゲーションを使用すること以外は、図２０Ａ〜２０Ｆに示されているものと同様の概念を示す。アジドおよびｍＴｅｔ化学は、直交性であり、ＤＮＡタグへのクリックコンジュゲーション、および配列決定基材へのクリックｉＥＤＤＡコンジュゲーション（ｍＴｅｔおよびＴＣＯ）を可能にする。
図２１は、流動フォーカスＴ字路を使用して、単一細胞を、コンパートメントタグ付き（例えば、バーコード）ビーズにコンパートメント化するための例示的な方法を示す。２つの水流を用いると、液滴形成時に、細胞溶解およびプロテアーゼ活性化（Ｚｎ２＋混合）を容易に開始することができる。
図２２Ａ〜２２Ｂは、例示的なタグ化詳細を示す。（Ａ）コンパートメントタグ（ＤＮＡ−ペプチドキメラ）を、ブテラーゼＩによるペプチドライゲーションを使用して、ペプチドに付着させる。（Ｂ）ペプチド配列決定の開始前に、コンパートメントタグ情報を、付随する記録タグへと移行させる。必要に応じて、アスパラギン酸残基のＮ末端でペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼＡｓｐＮを使用して、記録タグへの情報移行後、コンパートメントタグを切断することができる。
図２３Ａ〜２３Ｃは、組織切片の空間的プロテオミクスに基づく解析のためのアレイに基づくバーコードを示す。（Ａ）空間的にコードされたＤＮＡバーコードのアレイ（ＢＣｉｊと表記されているバーコードを特徴とする）を、組織切片（例えば、ＦＦＰＥまたは凍結）と組み合わせる。一実施形態では、組織切片は、固定および透過処理されている。好ましい実施形態では、アレイ特徴サイズは、細胞サイズ（ヒト細胞の場合、約１０μｍ）よりも小さい。（Ｂ）アレイにマウントした組織切片を試薬で処理して架橋を元に戻す（例えば、シトラコン酸無水物を用いた抗原回復プロトコール（Namimatsu, Ghazizadeh et al. 2005）、その後その中のタンパク質を、タンパク質分子をすべてＤＮＡ記録タグで効果的に標識する部位反応性ＤＮＡ標識で標識する（例えば、抗原回復後に遊離されたリシンの標識）。標識および洗浄後、アレイに結合したＤＮＡバーコード配列を切断し、マウントした組織切片への拡散を可能にし、その中にあるタンパク質に付着したＤＮＡ記録タグとハイブリダイズさせる。（Ｃ）ここで、アレイにマウントした組織を、ポリメラーゼ伸長に供して、ハイブリダイズされたバーコードの情報を、タンパク質を標識しているＤＮＡ記録タグへと移行させる。バーコード情報の移行後、アレイにマウントした組織を、スライドからこすり落とし、必要に応じてプロテアーゼにより消化し、タンパク質またはペプチドを溶液内に抽出する。
図２４Ａ〜２４Ｂは、ビーズに固定化されており、コーディングタグに付着した結合性物質によりアッセイされる２つの異なる例示的なＤＮＡ標的分析物（ＡＢおよびＣＤ）を示す。このモデル系は、結合された物質から近位記録タグへのコーディングタグ移行の単一分子挙動を例示する役目を果たす。好ましい実施形態では、コーディングタグは、プライマー伸長により伸長記録タグに組み込まれる。図２４Ａは、ＡＢ巨大分子が、Ａ特異的結合性物質（「Ａ’」、ＡＢ巨大分子の「Ａ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグへと移行され、Ｂ特異的結合性物質（「Ｂ’」、ＡＢ巨大分子の「Ｂ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグへと移行されることを示す。コーディングタグＡおよびＢは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析には長さが異なる必要はない。Ａ’およびＢ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにてＡ’またはＢ’結合性物質のいずれが添加されるかに応じて、伸長記録タグは、形態ＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、およびＢＢのコーディングタグ情報を含むことができる。したがって、伸長記録タグは、結合物質の同一性だけでなく、結合事象の順序に関する情報も含む。同様に、図２４Ｂは、ＣＤ巨大分子が、Ｃ特異的結合性物質（「Ｃ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｃ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグへと移行され、Ｄ特異的結合性物質（「Ｄ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｄ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によりに記録タグへと移行されることを示す。コーディングタグＣおよびＤは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析には長さが異なる必要はない。Ｃ’およびＤ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにてＣ’またはＤ’結合性物質のいずれが添加されるかに応じて、伸長記録タグは、形態ＣＣ、ＣＤ、ＤＣ、およびＤＤのコーディングタグ情報を含むことができる。コーディングタグは、必要に応じてＵＭＩを含んでいてもよい。コーディングタグにＵＭＩが含まれることにより、結合事象に関する追加情報を記録することが可能になり、それにより、結合事象を個々の結合性物質のレベルで区別することが可能になる。これは、個々の結合性物質が、１つよりも多くの結合事象に参加することができる場合（例えば、その結合親和性が、１つよりも多くの事象に参加するのに十分な頻度で解離および再結合することができるような程度である場合）、有用であり得る。また、エラー訂正に有用であり得る。例えば、いくつかの状況下では、コーディングタグは、同じ結合サイクルで２回またはそれよりも多くの頻度で、情報を記録タグに移行させる場合がある。ＵＭＩを使用すれば、これらが、すべて単一結合事象に関連する繰り返し情報移行事象である可能性が高いことが明らかになるであろう。 図２４Ａ〜２４Ｂは、ビーズに固定化されており、コーディングタグに付着した結合性物質によりアッセイされる２つの異なる例示的なＤＮＡ標的分析物（ＡＢおよびＣＤ）を示す。このモデル系は、結合された物質から近位記録タグへのコーディングタグ移行の単一分子挙動を例示する役目を果たす。好ましい実施形態では、コーディングタグは、プライマー伸長により伸長記録タグに組み込まれる。図２４Ａは、ＡＢ巨大分子が、Ａ特異的結合性物質（「Ａ’」、ＡＢ巨大分子の「Ａ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグへと移行され、Ｂ特異的結合性物質（「Ｂ’」、ＡＢ巨大分子の「Ｂ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグへと移行されることを示す。コーディングタグＡおよびＢは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析には長さが異なる必要はない。Ａ’およびＢ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにてＡ’またはＢ’結合性物質のいずれが添加されるかに応じて、伸長記録タグは、形態ＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、およびＢＢのコーディングタグ情報を含むことができる。したがって、伸長記録タグは、結合物質の同一性だけでなく、結合事象の順序に関する情報も含む。同様に、図２４Ｂは、ＣＤ巨大分子が、Ｃ特異的結合性物質（「Ｃ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｃ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグへと移行され、Ｄ特異的結合性物質（「Ｄ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｄ」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によりに記録タグへと移行されることを示す。コーディングタグＣおよびＤは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析には長さが異なる必要はない。Ｃ’およびＤ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにてＣ’またはＤ’結合性物質のいずれが添加されるかに応じて、伸長記録タグは、形態ＣＣ、ＣＤ、ＤＣ、およびＤＤのコーディングタグ情報を含むことができる。コーディングタグは、必要に応じてＵＭＩを含んでいてもよい。コーディングタグにＵＭＩが含まれることにより、結合事象に関する追加情報を記録することが可能になり、それにより、結合事象を個々の結合性物質のレベルで区別することが可能になる。これは、個々の結合性物質が、１つよりも多くの結合事象に参加することができる場合（例えば、その結合親和性が、１つよりも多くの事象に参加するのに十分な頻度で解離および再結合することができるような程度である場合）、有用であり得る。また、エラー訂正に有用であり得る。例えば、いくつかの状況下では、コーディングタグは、同じ結合サイクルで２回またはそれよりも多くの頻度で、情報を記録タグに移行させる場合がある。ＵＭＩを使用すれば、これらが、すべて単一結合事象に関連する繰り返し情報移行事象である可能性が高いことが明らかになるであろう。
図２５は、ビーズに固定化されており、コーディングタグに付着した結合性物質によりアッセイされる例示的なＤＮＡ標的巨大分子（ＡＢ）を示す。Ａ特異的結合性物質（「Ａ’」、ＡＢ巨大分子のＡ成分に相補的なオリゴヌクレオチド）は、ＡＢ巨大分子と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が、ライゲーションにより記録タグへと移行される。Ｂ特異的結合性物質（「Ｂ’」、ＡＢ巨大分子のＢ成分に相補的なオリゴヌクレオチド）は、ＡＢ巨大分子と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が、ライゲーションにより記録タグへと移行される。コーディングタグＡおよびＢは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析には長さが異なる必要はない。
図２６Ａ〜２６Ｂは、プライマー伸長による結合／コーディングタグ移行の例示的なＤＮＡ−ペプチド分析物（巨大分子など）を示す。図２６Ａは、ビーズに固定化されている例示的なオリゴヌクレオチド−ペプチド標的巨大分子（「Ａ」オリゴヌクレオチド−ｃＭｙｃペプチド）を示す。ｃＭｙｃ−特異的結合性物質（例えば、抗体）は、巨大分子のｃＭｙｃペプチド部分と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が記録タグに移行される。ｃＭｙｃコーディングタグの情報の記録タグへの移行は、ゲル電気泳動法により解析することができる。図２６Ｂは、ビーズに固定化されている例示的なオリゴヌクレオチド−ペプチド標的巨大分子（「Ｃ」オリゴヌクレオチド−赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチド）を示す。ＨＡ−特異的結合性物質（例えば、抗体）は、巨大分子のＨＡペプチド部分と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が記録タグに移行される。コーディングタグの情報の記録タグへの移行は、ゲル電気泳動法により解析することができる。ｃＭｙｃ抗体−コーディングタグおよびＨＡ抗体−コーディングタグの結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２の結合サイクルが実施されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２の結合サイクルにてｃＭｙｃ抗体−コーディングタグまたはＨＡ抗体−コーディングタグのいずれを添加するかに応じて、伸長記録タグは、形態ｃＭｙｃ−ＨＡ、ＨＡ−ｃＭｙｃ、ｃＭｙｃ−ｃＭｙｃ、およびＨＡ−ＨＡのコーディングタグ情報を含むことができる。また、図示されていないが、追加の結合性物質を導入して、巨大分子のＡおよびＣオリゴヌクレオチド成分の検出を可能にすることができる。したがって、異なるタイプの骨格を含むハイブリッド巨大分子は、情報を記録タグへと移行させ、結合事象の順序ならびに結合性物質の同一性に関する情報を含む伸長記録タグを読み出すことにより解析することができる。
図２７Ａ〜２７Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐａｃｋａｇｅｓ／３．３／ｂｉｏｃ／ｍａｎｕａｌｓ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ／ｍａｎ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ．ｐｄｆ）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったか、またはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを濾過することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）細孔を通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。予測電流は、各１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップ５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ Ｒ９ナノポア電流レベル参照テーブル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｔｓ／ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ／ｔｒｅｅ／ｍａｓｔｅｒ／ｅｔｃ／ｒ９−ｍｏｄｅｌｓで利用可能なｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することにより算出した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々に一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用した、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。その後、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ Ｒ９．４リードは、７．２の品質スコアを有する（リード品質は不良）。しかしながら、バーコード配列は、リード品質が低い場合でさえ（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）、ｌａｌｉｇｎを使用して容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’記号と表記されているフォワード方向またはリバース方向のいずれでもアラインすることができる。 図２７Ａ〜２７Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐａｃｋａｇｅｓ／３．３／ｂｉｏｃ／ｍａｎｕａｌｓ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ／ｍａｎ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ．ｐｄｆ）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったか、またはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを濾過することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）細孔を通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。予測電流は、各１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップ５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ Ｒ９ナノポア電流レベル参照テーブル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｔｓ／ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ／ｔｒｅｅ／ｍａｓｔｅｒ／ｅｔｃ／ｒ９−ｍｏｄｅｌｓで利用可能なｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することにより算出した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々に一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用した、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。その後、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ Ｒ９．４リードは、７．２の品質スコアを有する（リード品質は不良）。しかしながら、バーコード配列は、リード品質が低い場合でさえ（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）、ｌａｌｉｇｎを使用して容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’記号と表記されているフォワード方向またはリバース方向のいずれでもアラインすることができる。 図２７Ａ〜２７Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐａｃｋａｇｅｓ／３．３／ｂｉｏｃ／ｍａｎｕａｌｓ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ／ｍａｎ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ．ｐｄｆ）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったか、またはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを濾過することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）細孔を通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。予測電流は、各１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップ５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ Ｒ９ナノポア電流レベル参照テーブル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｔｓ／ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ／ｔｒｅｅ／ｍａｓｔｅｒ／ｅｔｃ／ｒ９−ｍｏｄｅｌｓで利用可能なｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することにより算出した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々に一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用した、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。その後、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ Ｒ９．４リードは、７．２の品質スコアを有する（リード品質は不良）。しかしながら、バーコード配列は、リード品質が低い場合でさえ（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）、ｌａｌｉｇｎを使用して容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’記号と表記されているフォワード方向またはリバース方向のいずれでもアラインすることができる。 図２７Ａ〜２７Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐａｃｋａｇｅｓ／３．３／ｂｉｏｃ／ｍａｎｕａｌｓ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ／ｍａｎ／ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ．ｐｄｆ）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったか、またはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを濾過することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）細孔を通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。予測電流は、各１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップ５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ Ｒ９ナノポア電流レベル参照テーブル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｔｓ／ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ／ｔｒｅｅ／ｍａｓｔｅｒ／ｅｔｃ／ｒ９−ｍｏｄｅｌｓで利用可能なｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することにより算出した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々に一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用した、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。その後、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ Ｒ９．４リードは、７．２の品質スコアを有する（リード品質は不良）。しかしながら、バーコード配列は、リード品質が低い場合でさえ（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）、ｌａｌｉｇｎを使用して容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’記号と表記されているフォワード方向またはリバース方向のいずれでもアラインすることができる。
図２８Ａ〜２８Ｄは、記録タグによるタンパク質の分析物特異的標識の例を示す。（Ａ）その天然コンフォメーションをとっている目的のタンパク質分析物を標的とする結合性物質は、ＤＮＡ記録タグの相補的分析物特異的バーコード（ＢＣＡ）にハイブリダイズする分析物特異的バーコード（ＢＣＡ’）を含む。あるいは、切断可能なリンカーを介してＤＮＡ記録タグを結合性物質に付着させることができ、ＤＮＡ記録タグを、タンパク質に直接「クリック」させ、その後結合性物質から切断する（切断可能なリンカーにより）。ＤＮＡ記録タグは、反応性カップリング部分（目的のタンパク質にカップリングするためのクリック化学試薬（例えば、アジド、ｍＴｅｔなど）、および他の機能性成分（例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、試料バーコード（ＢＣＳ）、分析物特異的バーコード（ＢＣＡ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ））を含む。また、試料バーコード（ＢＣＳ）を使用して、異なる試料に由来するタンパク質を標識および区別することができる。また、ＤＮＡ記録タグは、その後の基材表面へのカップリングのための直交性カップリング部分（例えば、ｍＴｅｔ）を含んでいてもよい。目的のタンパク質に記録タグをクリック化学カップリングする場合、タンパク質を、ＤＮＡ記録タグのクリック化学カップリング部分と同種のクリック化学カップリング部分で予め標識する（例えば、タンパク質のアルキン部分は、ＤＮＡ記録タグのアジド部分と同種である）。クリック化学カップリング用のカップリング部分でＤＮＡ記録タグを標識するための試薬の例としては、リシン標識用のアルキン−ＮＨＳ試薬、光親和性標識用のアルキン−ベンゾフェノン試薬などが挙げられる。（Ｂ）結合性物質が近位標的タンパク質と結合した後、記録タグの反応性カップリング部分（例えば、アジド）は、近位タンパク質の同種クリック化学カップリング部分（３本線記号として示されている）に共有結合で付着する。（Ｃ）標的タンパク質分析物を記録タグで標識した後、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））を使用してウラシル（Ｕ）を消化することにより、付着している結合性物質を除去する。（Ｄ）ＤＮＡ記録タグで標識した標的タンパク質分析物を、クリック化学（アルキン−アジド結合対、メチルテトラジン（ｍＴＥＴ）−ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）結合対など）などの好適なバイオコンジュゲート化学反応を使用して基材表面に固定化する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質−記録タグ標識アッセイ全体を、結合性物質のプールおよび記録タグのプールを使用して、多数の異なる標的タンパク質分析物を含む単一チューブ中で実施する。試料バーコード（ＢＣＳ）を含む記録タグで試料内のタンパク質分析物を標的標識した後、複数のタンパク質分析物試料を、（Ｄ）の固定化ステップ前にプールしてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、数百個の試料にわたって最大数千個のタンパク質分析物を、単一チューブ次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）で標識および固定化することができ、高価な親和性試薬（例えば、抗体）が大幅に節約される。
図２９Ａ〜２０Ｄは、ＤＮＡ記録タグをポリペプチドにコンジュゲーションするための例を示す。（Ａ）変性ポリペプチドを、アルキン−ＮＨＳエステル（アセチレン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル）試薬またはアルキン−ベンゾフェノンなどの二機能性クリック化学試薬で標識して、アルキン標識（３本線記号）ポリペプチドを生成する。また、アルキンは、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）などを含むシクロオクチンなどの歪みアルキンであってもよい。（Ｂ）アルキン標識ポリペプチドに化学的にカップリングされるＤＮＡ記録タグ設計の例が示されている。記録タグは、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード（ＢＣ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ）を含む。記録タグを、基材表面にカップリングするためのｍＴｅｔ部分、および標識ポリペプチドのアルキン部分とカップリングするためのアジド部分で標識する。（Ｃ）変性アルキン標識タンパク質またはポリペプチドを、アルキンおよびアジド部分を介して記録タグで標識する。必要に応じて、記録タグ標識ポリペプチドを、コンパートメントバーコードで、例えば、コンパートメントビーズに付着した相補的配列とアニーリングさせ、プライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも呼ばれる）させることにより、または図２０Ｈ〜２０Ｊに示されているように、さらに標識することができる。（Ｄ）記録タグ標識ポリペプチドをプロテアーゼ消化することにより、記録タグ標識ペプチドの集団が創出される。一部の実施形態では、一部のペプチドは、いかなる記録タグにも標識されていないであろう。他の実施形態では、一部のペプチドには、１つまたは複数の記録タグが付着していてもよい。（Ｅ）記録タグ標識ペプチドを、ＴＣＯ基で機能化された基材表面とペプチドに付着した記録タグのｍＴｅｔ部分との間の逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）クリック化学反応を使用して、基材表面に固定化する。ある特定の実施形態では、図示されている異なる段階間で、クリーンアップステップを用いてもよい。直交性クリック化学（例えば、アジド−アルキンおよびｍＴｅｔ−ＴＣＯ）を使用することにより、記録タグによるポリペプチドのクリック化学標識、および記録タグ標識ペプチドの基材表面へのクリック化学固定化が両方とも可能になる（その全体が参照により組み込まれる、McKay et al., 2014, Chem. Biol. 21:1075-1101を参照されたい）。
図３０Ａ〜３０Ｅは、ポリペプチドの初期ＤＮＡ標識後に、試料バーコードを記録タグに書き込むための例示的なプロセスを示す。（Ａ）変性ポリペプチドを、アルキン−ＮＨＳ試薬またはアルキン−ベンゾフェノンなどの二機能性クリック化学試薬で標識して、アルキン標識ポリペプチドを生成する。（Ｂ）ポリペプチドをアルキン（またはその代わりにクリック化学部分）で標識した後、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）を含み、アジド部分およびｍＴｅｔ部分で標識されているＤＮＡタグを、アジド−アルキン相互作用によりポリペプチドにカップリングする。他のクリック化学相互作用を用いてもよいことが理解される。（Ｃ）試料バーコード情報（ＢＣＳ’）および他の記録タグ機能性成分（例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１’）、スペーサー配列（Ｓｐ’））を含む記録タグＤＮＡ構築物は、相補的ユニバーサルプライミング配列を介してＤＮＡタグ標識ポリペプチドとアニーリングする（Ｐ１−Ｐ１’）。記録タグ情報は、ポリメラーゼ伸長によりＤＮＡタグに移行される。（Ｄ）記録タグ標識ポリペプチドをプロテアーゼ消化することにより、記録タグ標識ペプチドの集団が創出される。（Ｅ）記録タグ標識ペプチドを、ＴＣＯ基で機能化された表面とペプチドに付着した記録タグのｍＴｅｔ部分との間の逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）クリック化学反応を使用して、基材表面に固定化する。ある特定の実施形態では、図示されている異なる段階間で、クリーンアップステップを用いてもよい。直交性クリック化学（例えば、アジド−アルキンおよびｍＴｅｔ−ＴＣＯ）を使用することにより、記録タグによるポリペプチドのクリック化学標識、および記録タグ標識ペプチドの基材表面へのクリック化学固定化が両方とも可能になる（その全体が参照により組み込まれる、McKay et al., 2014, Chem. Biol. 21:1075-1101を参照されたい）。
図３１Ａ〜３１Ｄは、ポリペプチドにバーコードを付与するためのビーズコンパートメント化の例を示す。（Ａ）ポリペプチドを、ヘテロ二機能性クリック化学試薬による標準的バイオコンジュゲーションまたは光親和性標識技法を使用して、溶液中で標識する。考え得る標識部位としては、リシン残基のε−アミン（例えば、図示されているようなＮＨＳ−アルキンと）またはペプチドの炭素骨格（例えば、ベンゾフェノン−アルキンと）が挙げられる。（Ｂ）ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）を含むアジド標識ＤＮＡタグを、標識ポリペプチドのアルキン部分にカップリングする。（Ｃ）ＤＮＡタグ標識ポリペプチドを、ＤＮＡ記録タグ標識ビーズに、相補的ＤＮＡ配列（Ｐ１およびＰ１’）を介してアニーリングさせる。ビーズのＤＮＡ記録タグは、スペーサー配列（Ｓｐ’）、コンパートメントバーコード配列（ＢＣＰ’）、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）、およびユニバーサル配列（Ｐ１’）を含む。ＤＮＡ記録タグ情報は、ポリメラーゼ伸長により（あるいは、ライゲーションを用いてもよい）、ポリペプチドのＤＮＡタグに移行される。情報移行後、得られたポリペプチドは、コンパートメントバーコードを含むいくつかの機能性エレメントを含有する複数の記録タグを含む。（Ｄ）記録タグ標識ポリペプチドをプロテアーゼ消化することにより、記録タグ標識ペプチドの集団が創出される。記録タグ標識ペプチドをビーズから解離させ、（Ｅ）配列決定基材に再固定化する（例えば、図示されているようなｍＴｅｔ部分とＴＣＯ部分との間のｉＥＤＤＡクリック化学を使用して）。
図３２Ａ〜３２Ｈは、次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）のワークフローの例を示す。タンパク質試料を、いくつかの機能性単位、例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード配列（ＢＣ）、必要に応じたＵＭＩ配列、およびスペーサー配列（Ｓｐ）（結合性物質コーディングタグとの情報移行を可能にする）で構成されているＤＮＡ記録タグで標識する。（Ａ）標識タンパク質を、基材（例えば、ビーズ、多孔性ビーズ、または多孔性マトリックス）に固定化する（受動的にまたは共有結合で）。（Ｂ）基材をタンパク質でブロッキングし、必要に応じて、分析物記録タグ配列の非特異的相互作用を最小限に抑えるために、スペーサー配列に相補的な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を添加する。（Ｃ）分析物特異的抗体（付随するコーディングタグを有する）を、基質に結合されたタンパク質と共にインキュベートする。コーディングタグは、その後のウラシル特異的切断のためのウラシル塩基を含んでいてもよい。（Ｄ）抗体結合後、該当する場合は、過剰な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を洗い流す。コーディングタグは、相補的スペーサー配列を介して記録タグと一時的にアニーリングし、コーディングタグ情報は、プライマー伸長反応で記録タグへと移行され、伸長記録タグが生成される。固定化されたタンパク質が変性されている場合、結合されている抗体およびアニーリングされているコーディングタグを、０．１Ｎ ＮａＯＨなどのアルカリ洗浄条件下で除去することができる。固定化されたタンパク質が、天然コンフォメーションをとっている場合、より穏やかな条件で、結合されている抗体およびコーディングタグを除去する必要がある場合がある。より穏やかな抗体除去条件の例は、パネルＥ〜Ｈに概説されている。（Ｅ）コーディングタグから記録タグへの情報移行後、コーディングタグを、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））酵素ミックスを使用して、そのウラシル部位にニックを入れる（切断する）。（Ｆ）結合されている抗体を、高塩濃度および低／高ｐＨ洗浄を使用して、タンパク質から除去する。抗体に付着したままの切断型ＤＮＡコーディングタグは、短鎖であり、同様に迅速に溶出する。より長鎖のＤＮＡコーディングタグ断片は、記録タグにアニーリングしたままであってもよく、またはアニーリングしたままでなくてもよい。（Ｇ）第２の結合サイクルが、ステップ（Ｂ）〜（Ｄ）と同様に開始し、第２のプライマー伸長ステップでは、プライマー伸長により、コーディングタグ情報が第２の抗体から伸長記録タグへと移行される。（Ｈ）２つの結合サイクルの結果は、記録タグに付着した第１の抗体および第２の抗体からの結合情報の鎖状物である。 図３２Ａ〜３２Ｈは、次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）のワークフローの例を示す。タンパク質試料を、いくつかの機能性単位、例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード配列（ＢＣ）、必要に応じたＵＭＩ配列、およびスペーサー配列（Ｓｐ）（結合性物質コーディングタグとの情報移行を可能にする）で構成されているＤＮＡ記録タグで標識する。（Ａ）標識タンパク質を、基材（例えば、ビーズ、多孔性ビーズ、または多孔性マトリックス）に固定化する（受動的にまたは共有結合で）。（Ｂ）基材をタンパク質でブロッキングし、必要に応じて、分析物記録タグ配列の非特異的相互作用を最小限に抑えるために、スペーサー配列に相補的な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を添加する。（Ｃ）分析物特異的抗体（付随するコーディングタグを有する）を、基質に結合されたタンパク質と共にインキュベートする。コーディングタグは、その後のウラシル特異的切断のためのウラシル塩基を含んでいてもよい。（Ｄ）抗体結合後、該当する場合は、過剰な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を洗い流す。コーディングタグは、相補的スペーサー配列を介して記録タグと一時的にアニーリングし、コーディングタグ情報は、プライマー伸長反応で記録タグへと移行され、伸長記録タグが生成される。固定化されたタンパク質が変性されている場合、結合されている抗体およびアニーリングされているコーディングタグを、０．１Ｎ ＮａＯＨなどのアルカリ洗浄条件下で除去することができる。固定化されたタンパク質が、天然コンフォメーションをとっている場合、より穏やかな条件で、結合されている抗体およびコーディングタグを除去する必要がある場合がある。より穏やかな抗体除去条件の例は、パネルＥ〜Ｈに概説されている。（Ｅ）コーディングタグから記録タグへの情報移行後、コーディングタグを、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））酵素ミックスを使用して、そのウラシル部位にニックを入れる（切断する）。（Ｆ）結合されている抗体を、高塩濃度および低／高ｐＨ洗浄を使用して、タンパク質から除去する。抗体に付着したままの切断型ＤＮＡコーディングタグは、短鎖であり、同様に迅速に溶出する。より長鎖のＤＮＡコーディングタグ断片は、記録タグにアニーリングしたままであってもよく、またはアニーリングしたままでなくてもよい。（Ｇ）第２の結合サイクルが、ステップ（Ｂ）〜（Ｄ）と同様に開始し、第２のプライマー伸長ステップでは、プライマー伸長により、コーディングタグ情報が第２の抗体から伸長記録タグへと移行される。（Ｈ）２つの結合サイクルの結果は、記録タグに付着した第１の抗体および第２の抗体からの結合情報の鎖状物である。
図３３Ａ〜３３Ｄは、複数の結合性物質および酵素媒介性連続情報移行を使用した１段階次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）の例を示す。２つの同種結合性物質（例えば、抗体）が同時に結合されている固定化タンパク質分子を用いたＮＧＰＡアッセイ。複数の同種抗体結合事象の後、プライマー伸長およびＤＮＡニッキングの組合せステップを使用して、結合されている抗体のコーディングタグから記録タグへと情報を移行させる。コーディングタグのキャレット記号（＾）は、二本鎖ＤＮＡニッキングエンドヌクレアーゼ部位を表わす。図３３Ａでは、タンパク質のエピトープ１（Ｅｐｉ＃１）に結合されている抗体のコーディングタグは、相補的スペーサー配列のハイブリダイゼーション後のプライマー伸長ステップにて、コーディングタグ情報（例えば、エンコーダー配列）を記録タグへと移行させる。図３３Ｂでは、伸長記録タグとコーディングタグとの間に二本鎖ＤＮＡが形成されたら、３７℃で活性であるＮｔ．ＢｓｍＡＩなどの、二本鎖ＤＮＡ基質の一方のＤＮＡの鎖のみを切断するニッキングエンドヌクレアーゼを使用して、コーディングタグを切断する。ニッキングステップ後、切断型コーディングタグ結合性物質および伸長記録タグで形成された二本鎖は、熱力学的に不安定になり、解離する。より長鎖のコーディングタグ断片は、記録タグにアニーリングしたままであってもよく、またはアニーリングしたままでなくてもよい。図３３Ｃでは、これにより、タンパク質のエピトープ＃２（Ｅｐｉ＃２）に結合されている抗体のコーディングタグが、相補的スペーサー配列を介して伸長記録タグにアニーリングし、プライマー伸長によりＥｐｉ＃２抗体のコーディングタグから伸長記録タグへと情報を移行させることにより、伸長記録タグをさらに伸長させることが可能になる。図３３Ｄでは、この場合も、伸長記録タグとＥｐｉ＃２抗体のコーディングタグとの間に二本鎖ＤＮＡが形成された後、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩなどのニッキングエンドヌクレアーゼによりコーディングタグにニックを入れる。ある特定の実施形態では、プライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも呼ばれる）中は非鎖置換ポリメラーゼの使用が好ましい。非鎖置換ポリメラーゼは、単一塩基よりも多くが記録タグにアニーリングしたままである切断されたコーディングタグ残部の伸長を防止する。図３３Ａ〜３３Ｄのプロセスは、近位の結合されている結合性物質のコーディングタグがすべて、ハイブリダイゼーション、伸長記録タグへの情報移行、およびニッキングステップにより「消費」されるまで自発的に繰り返すことができる。コーディングタグは、所与の分析物（例えば、同種タンパク質）に特異的なすべての結合性物質（例えば、抗体）と同一であるエンコーダー配列を含んでいてもよく、エピトープ特異的なエンコーダー配列を含んでいてもよく、または異なる分子事象を区別するための一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでいてもよい。
図３４Ａ〜３４Ｃは、基材表面の反応性部分のタイトレーションを使用した記録タグ−ペプチド固定化の密度制御の例を示す。図３４Ａでは、基材表面のペプチド密度は、基材の表面の機能性カップリング部分の密度を制御することによりタイトレーションすることができる。これは、活性カップリング分子の「ダミー」カップリング分子に対する適切な比を用いて、基質の表面を誘導体化することにより達成することができる。図示されている例では、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＴＣＯ試薬（活性カップリング分子）を、ＮＨＳ−ｍＰＥＧ（ダミー分子）を規定されている比で組み合わせて、アミン表面をＴＣＯで誘導体化する。機能化ＰＥＧは、３００から４０，０００を超える種々の分子量のものが入手可能である。図３４Ｂでは、二機能性５’アミンＤＮＡ記録タグ（ｍＴｅｔは他方の機能的部分である）を、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１（ＳＭＣＣ）二機能性架橋剤を使用して、ペプチドのＮ末端Ｃｙｓ残基にカップリングする。記録タグの内部ｍＴｅｔ−ｄＴ基を、ｍテトラジン−アジドを使用して、アジド−ｄＴ基から創出する。図３４Ｃでは、記録タグ標識ペプチドを、ｍＴｅｔとＴＣＯとのｉＥＤＤＡクリック化学反応を使用して、図３４Ａの活性化基材表面に固定化する。ｍＴｅｔ−ＴＣＯ ｉＥＤＤＡカップリング反応は、非常に迅速であり、効率的であり、安定的である（ｍＴｅｔ−ＴＣＯは、Ｔｅｔ−ＴＣＯよりも安定的である）。
図３５Ａ〜３５Ｃは、次世代タンパク質シーケンシング（ＮＧＰＳ）結合サイクル特異的コーディングタグの例を示す。（Ａ）サイクル特異的Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合性物質コーディングタグを用いたＮＧＰＳアッセイの設計。ＮＴＡＡ結合性物質（例えば、Ｎ末端ＤＮＰ標識チロシンに特異的な抗体）は、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード（ＢＣ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ）を含む記録タグに付随されているペプチドのＤＮＰ標識ＮＴＡＡに結合する。結合性物質がペプチドの同種ＮＴＡＡに結合すると、ＮＴＡＡ結合性物質に付随されているコーディングタグは、記録タグに接近し、相補的スペーサー配列を介して記録タグにアニーリングする。コーディングタグ情報は、プライマー伸長により記録タグに移行される。コーディングタグがどの結合サイクルを表わすのかを記録するために、コーディングタグは、サイクル特異的バーコードを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、分析物に結合する結合性物質のコーディングタグは、一意の結合サイクル特異的バーコードと組み合わされている、サイクル数に依存しない同じエンコーダーバーコードを有する。他の実施形態では、分析物に対する結合性物質のコーディングタグは、分析物−結合サイクルの組合せ情報についての一意のエンコーダーバーコードを含む。いずれの手法でも、共通スペーサー配列を、各結合サイクルでの結合性物質のコーディングタグに使用することができる。（Ｂ）この例では、各結合サイクルの結合性物質は、結合サイクルを識別するための短い結合サイクル特異的バーコードを有し、これにより、結合性物質を識別するエンコーダーバーコードと共に、特定の結合性物質結合サイクルの組合せを識別する一意の組合せバーコードが提供される。（Ｃ）結合サイクルの完了後、伸長記録タグを、キャッピングサイクルステップを使用して増幅可能なライブラリーに変換することができ、キャッピングサイクルステップでは、例えば、ユニバーサルプライミング配列Ｐ２およびスペーサー配列Ｓｐ’に連結されたユニバーサルプライミング配列Ｐ１’を含むキャップが、まず相補的Ｐ１およびＰ１’配列を介して伸長記録タグとアニーリングして、キャップが伸長記録タグと接近する。伸長記録タグおよびキャップの相補的ＳｐおよびＳｐ’配列がアニーリングし、プライマー伸長により、第２のユニバーサルプライマー配列（Ｐ２）が伸長記録タグに付加される。
図３６Ａ〜３６Ｅは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するためのＤＮＡに基づくモデル系の例を示す。例示的な結合および分子内書き込みを、オリゴヌクレオチドモデル系により実証した。コーディングタグの標的指向性物質Ａ’およびＢ’を、記録タグの標的結合領域ＡおよびＢとハイブリダイズするように設計した。２つの記録タグｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（Ａ標的）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（Ｂ標的）を等濃度でプールすることにより、記録タグ（ＲＴ）ミックスを調製した。記録タグは、５’末端がビオチン化されており、一意の標的結合領域、ユニバーサルフォワードプライマー配列、一意のＤＮＡバーコード、および８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）を含む。コーディングタグは、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）に隣接されている一意のエンコーダーバーコード塩基を含み、８塩基共通スペーサー配列の１つは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＡまたはＢ標的物質と共有結合で連結されている。図３６Ａでは、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド（ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２）を、ビオチン化ダミーＴ１０オリゴヌクレオチドと共に、ストレプトアビジンビーズに固定化した。ＡまたはＢ捕捉配列（それぞれ同種結合性物質Ａ’およびＢ’により認識される）および結合標的を識別するための対応するバーコード（ｒｔＡ＿ＢＣおよびｒｔＢ＿ＢＣ）を有する記録タグを設計した。このモデル系のバーコードはすべて、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）のセットから選択した。一部の場合では、ゲル解析を容易にするために、１５ｍｅｒバーコードを組み合わせて、より長いバーコードを構成した。特に、ｒｔＡ＿ＢＣ＝ＢＣ＿１＋ＢＣ＿２；ｒｔＢ＿ＢＣ＝ＢＣ＿３。また、記録タグのＡおよびＢ配列と同種の結合性物質の２つのコーディングタグ、つまりＣＴ＿Ａ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５＋ＢＣ＿６）を合成した。必要に応じて、コーディングタグを、ビーズに固定化された記録タグにアニーリングさせる前に、コーディングタグ配列の部分に相補的なブロッキングオリゴ（ＤｕｐＣＴ＿Ａ’ＢＣおよびＤｕｐＣＴ＿ＡＢ’ＢＣ）（一本鎖Ｓｐ’配列が後に残る）を、コーディングタグに予めアニーリングさせた。鎖置換ポリメラーゼは、ポリメラーゼ伸長中にブロッキングオリゴを除去する。バーコード凡例（挿入図）には、記録タグおよびコーディングタグの機能的バーコードへの１５ｍｅｒバーコードの帰属が示されている。図３６Ｂでは、記録タグバーコード設計およびコーディングタグエンコーダーバーコード設計は、記録タグとコーディングタグとの「分子内」対「分子間」相互作用の容易なゲル解析を提供する。この設計では、望ましくない「分子間」相互作用（Ａ記録タグとＢ’コーディングタグとの、およびＢ記録タグとＡ’コーディングタグとの）は、所望の「分子内」（Ａ記録タグとＡ’コーディングタグとの；Ｂ記録タグとＢ’コーディングタグとの）相互作用産物よりも１５塩基だけ長いかまたは短いかのいずれかであるゲル産物を生成する。プライマー伸長ステップでは、Ａ’およびＢ’コーディングタグバーコード（ｃｔＡ’＿ＢＣ、ｃｔＢ’＿ＢＣ）が、リバース相補体バーコード（ｃｔＡ＿ＢＣおよびｃｔＢ＿ＢＣ）に変更される。図３６Ｃでは、プライマー伸長アッセイは、コーディングタグから記録タグへと情報が移行されたこと、およびアダプター配列が、プライマー伸長により、ＰＣＲ解析のためのアニーリングされたＥｎｄＣａｐオリゴに付加されたことを実証した。図３６Ｄは、ダミーＴ２０オリゴを使用して記録タグの表面密度をタイトレーションすることによる「分子内」情報移行の最適化を示す。ビオチン化記録タグオリゴを、１：０から、１：１０、１：１００００までの全域にわたる種々の比で、ビオチン化ダミーＴ２０オリゴと混合した。低減された記録タグ密度（１：１０３および１：１０４）では、「分子内」相互作用が、「分子間」相互作用よりも優勢である。図３６Ｅでは、ＤＮＡモデル系の単純な伸長として、Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド−ストレプトアビジン結合対を含む単純なタンパク質結合系が示されているが（ＫＤ約４ｎＭ）（Perbandt et al., 2007, Proteins 67:1147-1153）、任意の数のペプチド−結合性物質モデル系を用いることができる。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド配列は、（ｆＭ）ＤＶＥＡＷＬＧＡＲＶＰＬＶＥＴ（配列番号１３１）（ｆＭ＝ホルミル−Ｍｅｔ）である。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチドは、短い可撓性リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）およびＤＮＡ記録タグにカップリングするためのシステイン残基をさらに含む。他の例示的なペプチドタグ−同種結合性物質対としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）−カルモジュリン（ＫＤ約２ｐＭ）（Mukherjeeet al., 2015, J. Mol. Biol. 427: 2707-2725）、アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）ペプチド−ＵＳ７／Ｌｃｎ２アンチカリン（０．２ｎＭ）（Rauthet al., 2016, Biochem. J. 473: 1563-1578）、ＰＡタグ／ＮＺ−１抗体（ＫＤ約４００ｐＭ）、ＦＬＡＧ−Ｍ２ Ａｂ（２８ｎＭ）、ＨＡ−４Ｂ２ Ａｂ（１．６ｎＭ）、およびＭｙｃ−９Ｅ１０ Ａｂ（２．２ｎＭ）（Fujiiet al., 2014, Protein Expr. Purif. 95:240-247）が挙げられる。プライマー伸長による結合性物質のコーディングタグから記録タグへの分子内情報移行の試験としては、相補的ＤＮＡ配列「Ａ」に結合するオリゴヌクレオチド「結合性物質」を、試験および開発に使用することができる。このハイブリダイゼーション事象は、本質的にｆＭよりも大きな親和性を示す。Ｎａｎｏ−ｔａｇ１５ペプチドエピトープの試験結合性物質としては、ストレプトアビジンを使用してもよい。ペプチドタグ−結合性物質相互作用は高親和性であるが、酸性での洗浄および／または高塩濃度での洗浄により容易に妨害することができる（Perbandtet al.,上記）。 図３６Ａ〜３６Ｅは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するためのＤＮＡに基づくモデル系の例を示す。例示的な結合および分子内書き込みを、オリゴヌクレオチドモデル系により実証した。コーディングタグの標的指向性物質Ａ’およびＢ’を、記録タグの標的結合領域ＡおよびＢとハイブリダイズするように設計した。２つの記録タグｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（Ａ標的）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（Ｂ標的）を等濃度でプールすることにより、記録タグ（ＲＴ）ミックスを調製した。記録タグは、５’末端がビオチン化されており、一意の標的結合領域、ユニバーサルフォワードプライマー配列、一意のＤＮＡバーコード、および８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）を含む。コーディングタグは、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）に隣接されている一意のエンコーダーバーコード塩基を含み、８塩基共通スペーサー配列の１つは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＡまたはＢ標的物質と共有結合で連結されている。図３６Ａでは、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド（ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２）を、ビオチン化ダミーＴ１０オリゴヌクレオチドと共に、ストレプトアビジンビーズに固定化した。ＡまたはＢ捕捉配列（それぞれ同種結合性物質Ａ’およびＢ’により認識される）および結合標的を識別するための対応するバーコード（ｒｔＡ＿ＢＣおよびｒｔＢ＿ＢＣ）を有する記録タグを設計した。このモデル系のバーコードはすべて、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）のセットから選択した。一部の場合では、ゲル解析を容易にするために、１５ｍｅｒバーコードを組み合わせて、より長いバーコードを構成した。特に、ｒｔＡ＿ＢＣ＝ＢＣ＿１＋ＢＣ＿２；ｒｔＢ＿ＢＣ＝ＢＣ＿３。また、記録タグのＡおよびＢ配列と同種の結合性物質の２つのコーディングタグ、つまりＣＴ＿Ａ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５＋ＢＣ＿６）を合成した。必要に応じて、コーディングタグを、ビーズに固定化された記録タグにアニーリングさせる前に、コーディングタグ配列の部分に相補的なブロッキングオリゴ（ＤｕｐＣＴ＿Ａ’ＢＣおよびＤｕｐＣＴ＿ＡＢ’ＢＣ）（一本鎖Ｓｐ’配列が後に残る）を、コーディングタグに予めアニーリングさせた。鎖置換ポリメラーゼは、ポリメラーゼ伸長中にブロッキングオリゴを除去する。バーコード凡例（挿入図）には、記録タグおよびコーディングタグの機能的バーコードへの１５ｍｅｒバーコードの帰属が示されている。図３６Ｂでは、記録タグバーコード設計およびコーディングタグエンコーダーバーコード設計は、記録タグとコーディングタグとの「分子内」対「分子間」相互作用の容易なゲル解析を提供する。この設計では、望ましくない「分子間」相互作用（Ａ記録タグとＢ’コーディングタグとの、およびＢ記録タグとＡ’コーディングタグとの）は、所望の「分子内」（Ａ記録タグとＡ’コーディングタグとの；Ｂ記録タグとＢ’コーディングタグとの）相互作用産物よりも１５塩基だけ長いかまたは短いかのいずれかであるゲル産物を生成する。プライマー伸長ステップでは、Ａ’およびＢ’コーディングタグバーコード（ｃｔＡ’＿ＢＣ、ｃｔＢ’＿ＢＣ）が、リバース相補体バーコード（ｃｔＡ＿ＢＣおよびｃｔＢ＿ＢＣ）に変更される。図３６Ｃでは、プライマー伸長アッセイは、コーディングタグから記録タグへと情報が移行されたこと、およびアダプター配列が、プライマー伸長により、ＰＣＲ解析のためのアニーリングされたＥｎｄＣａｐオリゴに付加されたことを実証した。図３６Ｄは、ダミーＴ２０オリゴを使用して記録タグの表面密度をタイトレーションすることによる「分子内」情報移行の最適化を示す。ビオチン化記録タグオリゴを、１：０から、１：１０、１：１００００までの全域にわたる種々の比で、ビオチン化ダミーＴ２０オリゴと混合した。低減された記録タグ密度（１：１０３および１：１０４）では、「分子内」相互作用が、「分子間」相互作用よりも優勢である。図３６Ｅでは、ＤＮＡモデル系の単純な伸長として、Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド−ストレプトアビジン結合対を含む単純なタンパク質結合系が示されているが（ＫＤ約４ｎＭ）（Perbandt et al., 2007, Proteins 67:1147-1153）、任意の数のペプチド−結合性物質モデル系を用いることができる。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド配列は、（ｆＭ）ＤＶＥＡＷＬＧＡＲＶＰＬＶＥＴ（配列番号１３１）（ｆＭ＝ホルミル−Ｍｅｔ）である。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチドは、短い可撓性リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）およびＤＮＡ記録タグにカップリングするためのシステイン残基をさらに含む。他の例示的なペプチドタグ−同種結合性物質対としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）−カルモジュリン（ＫＤ約２ｐＭ）（Mukherjeeet al., 2015, J. Mol. Biol. 427: 2707-2725）、アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）ペプチド−ＵＳ７／Ｌｃｎ２アンチカリン（０．２ｎＭ）（Rauthet al., 2016, Biochem. J. 473: 1563-1578）、ＰＡタグ／ＮＺ−１抗体（ＫＤ約４００ｐＭ）、ＦＬＡＧ−Ｍ２ Ａｂ（２８ｎＭ）、ＨＡ−４Ｂ２ Ａｂ（１．６ｎＭ）、およびＭｙｃ−９Ｅ１０ Ａｂ（２．２ｎＭ）（Fujiiet al., 2014, Protein Expr. Purif. 95:240-247）が挙げられる。プライマー伸長による結合性物質のコーディングタグから記録タグへの分子内情報移行の試験としては、相補的ＤＮＡ配列「Ａ」に結合するオリゴヌクレオチド「結合性物質」を、試験および開発に使用することができる。このハイブリダイゼーション事象は、本質的にｆＭよりも大きな親和性を示す。Ｎａｎｏ−ｔａｇ１５ペプチドエピトープの試験結合性物質としては、ストレプトアビジンを使用してもよい。ペプチドタグ−結合性物質相互作用は高親和性であるが、酸性での洗浄および／または高塩濃度での洗浄により容易に妨害することができる（Perbandtet al.,上記）。 図３６Ａ〜３６Ｅは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するためのＤＮＡに基づくモデル系の例を示す。例示的な結合および分子内書き込みを、オリゴヌクレオチドモデル系により実証した。コーディングタグの標的指向性物質Ａ’およびＢ’を、記録タグの標的結合領域ＡおよびＢとハイブリダイズするように設計した。２つの記録タグｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（Ａ標的）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（Ｂ標的）を等濃度でプールすることにより、記録タグ（ＲＴ）ミックスを調製した。記録タグは、５’末端がビオチン化されており、一意の標的結合領域、ユニバーサルフォワードプライマー配列、一意のＤＮＡバーコード、および８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）を含む。コーディングタグは、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）に隣接されている一意のエンコーダーバーコード塩基を含み、８塩基共通スペーサー配列の１つは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＡまたはＢ標的物質と共有結合で連結されている。図３６Ａでは、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド（ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２）を、ビオチン化ダミーＴ１０オリゴヌクレオチドと共に、ストレプトアビジンビーズに固定化した。ＡまたはＢ捕捉配列（それぞれ同種結合性物質Ａ’およびＢ’により認識される）および結合標的を識別するための対応するバーコード（ｒｔＡ＿ＢＣおよびｒｔＢ＿ＢＣ）を有する記録タグを設計した。このモデル系のバーコードはすべて、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）のセットから選択した。一部の場合では、ゲル解析を容易にするために、１５ｍｅｒバーコードを組み合わせて、より長いバーコードを構成した。特に、ｒｔＡ＿ＢＣ＝ＢＣ＿１＋ＢＣ＿２；ｒｔＢ＿ＢＣ＝ＢＣ＿３。また、記録タグのＡおよびＢ配列と同種の結合性物質の２つのコーディングタグ、つまりＣＴ＿Ａ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５＋ＢＣ＿６）を合成した。必要に応じて、コーディングタグを、ビーズに固定化された記録タグにアニーリングさせる前に、コーディングタグ配列の部分に相補的なブロッキングオリゴ（ＤｕｐＣＴ＿Ａ’ＢＣおよびＤｕｐＣＴ＿ＡＢ’ＢＣ）（一本鎖Ｓｐ’配列が後に残る）を、コーディングタグに予めアニーリングさせた。鎖置換ポリメラーゼは、ポリメラーゼ伸長中にブロッキングオリゴを除去する。バーコード凡例（挿入図）には、記録タグおよびコーディングタグの機能的バーコードへの１５ｍｅｒバーコードの帰属が示されている。図３６Ｂでは、記録タグバーコード設計およびコーディングタグエンコーダーバーコード設計は、記録タグとコーディングタグとの「分子内」対「分子間」相互作用の容易なゲル解析を提供する。この設計では、望ましくない「分子間」相互作用（Ａ記録タグとＢ’コーディングタグとの、およびＢ記録タグとＡ’コーディングタグとの）は、所望の「分子内」（Ａ記録タグとＡ’コーディングタグとの；Ｂ記録タグとＢ’コーディングタグとの）相互作用産物よりも１５塩基だけ長いかまたは短いかのいずれかであるゲル産物を生成する。プライマー伸長ステップでは、Ａ’およびＢ’コーディングタグバーコード（ｃｔＡ’＿ＢＣ、ｃｔＢ’＿ＢＣ）が、リバース相補体バーコード（ｃｔＡ＿ＢＣおよびｃｔＢ＿ＢＣ）に変更される。図３６Ｃでは、プライマー伸長アッセイは、コーディングタグから記録タグへと情報が移行されたこと、およびアダプター配列が、プライマー伸長により、ＰＣＲ解析のためのアニーリングされたＥｎｄＣａｐオリゴに付加されたことを実証した。図３６Ｄは、ダミーＴ２０オリゴを使用して記録タグの表面密度をタイトレーションすることによる「分子内」情報移行の最適化を示す。ビオチン化記録タグオリゴを、１：０から、１：１０、１：１００００までの全域にわたる種々の比で、ビオチン化ダミーＴ２０オリゴと混合した。低減された記録タグ密度（１：１０３および１：１０４）では、「分子内」相互作用が、「分子間」相互作用よりも優勢である。図３６Ｅでは、ＤＮＡモデル系の単純な伸長として、Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド−ストレプトアビジン結合対を含む単純なタンパク質結合系が示されているが（ＫＤ約４ｎＭ）（Perbandt et al., 2007, Proteins 67:1147-1153）、任意の数のペプチド−結合性物質モデル系を用いることができる。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド配列は、（ｆＭ）ＤＶＥＡＷＬＧＡＲＶＰＬＶＥＴ（配列番号１３１）（ｆＭ＝ホルミル−Ｍｅｔ）である。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチドは、短い可撓性リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）およびＤＮＡ記録タグにカップリングするためのシステイン残基をさらに含む。他の例示的なペプチドタグ−同種結合性物質対としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）−カルモジュリン（ＫＤ約２ｐＭ）（Mukherjeeet al., 2015, J. Mol. Biol. 427: 2707-2725）、アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）ペプチド−ＵＳ７／Ｌｃｎ２アンチカリン（０．２ｎＭ）（Rauthet al., 2016, Biochem. J. 473: 1563-1578）、ＰＡタグ／ＮＺ−１抗体（ＫＤ約４００ｐＭ）、ＦＬＡＧ−Ｍ２ Ａｂ（２８ｎＭ）、ＨＡ−４Ｂ２ Ａｂ（１．６ｎＭ）、およびＭｙｃ−９Ｅ１０ Ａｂ（２．２ｎＭ）（Fujiiet al., 2014, Protein Expr. Purif. 95:240-247）が挙げられる。プライマー伸長による結合性物質のコーディングタグから記録タグへの分子内情報移行の試験としては、相補的ＤＮＡ配列「Ａ」に結合するオリゴヌクレオチド「結合性物質」を、試験および開発に使用することができる。このハイブリダイゼーション事象は、本質的にｆＭよりも大きな親和性を示す。Ｎａｎｏ−ｔａｇ１５ペプチドエピトープの試験結合性物質としては、ストレプトアビジンを使用してもよい。ペプチドタグ−結合性物質相互作用は高親和性であるが、酸性での洗浄および／または高塩濃度での洗浄により容易に妨害することができる（Perbandtet al.,上記）。
図３７Ａ〜３７Ｂは、ポリペプチドのＵＭＩ標識ＮまたはＣ末端からＤＮＡタグ標識体へと情報を移行させるための、ナノ−またはマイクロ−エマルジョンＰＣＲの使用の例を示す。図３７Ａでは、ポリペプチドのＮ−またはＣ−末端を、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む核酸分子で標識する。ＵＭＩは、その後のＰＣＲをプライミングするために使用される配列により隣接されていてもよい。その後、ポリペプチドの内部部位を、ＵＭＩを隣接するプライミング配列に相補的な配列を含む別々のＤＮＡタグで「本体標識」する。図３７Ｂでは、得られた標識ポリペプチドを乳化し、エマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）（あるいは、エマルジョンｉｎ ｖｉｔｒｏ転写−ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＶＴ−ＲＴ−ＰＣＲ）反応または他の好適な増幅反応を実施することができる）を実施して、Ｎ−またはＣ−末端ＵＭＩを増幅する。マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョンは、平均液滴直径が５０〜１０００ｎｍで、１液滴当たり平均で１つ未満のポリペプチドが存在するように形成される。ＰＣＲ前およびＰＣＲ後の液滴内容物の概略が、それぞれ左パネルおよび右パネルに示されている。ＵＭＩアンプリコンを、内部ポリペプチド本体ＤＮＡと相補的プライミング配列を介してハイブリダイズさせ、ＵＭＩ情報を、プライマー伸長によりアンプリコンから内部ポリペプチド本体ＤＮＡタグへと移行させる。
図３８は、単一細胞プロテオミクスの例を示す。細胞を、ポリマー形成性サブユニット（例えば、アクリルアミド）を含む液滴に封入し、溶解する。ポリマー形成性サブユニットを重合させ（例えば、ポリアクリルアミド）、タンパク質を、ポリマーマトリックスに架橋する。エマルジョン液滴を破壊し、透過性ポリマーマトリックスに付着した単一細胞タンパク質ライセートを含む重合ゲルビーズを放出させる。タンパク質は、天然コンフォメーションで、または溶解および封入緩衝液中に尿素などの変性剤を含めることによる変性状態でのいずれかでポリマーマトリックスに架橋される。コンパートメントバーコードおよび他の記録タグ成分（例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、スペーサー配列（Ｓｐ）、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ））を含む記録タグを、バーコード付きビーズとの乳化またはコンビナトリアルインデックス化を含む、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載のいくつかの方法を使用してタンパク質に付着させる。また、単一細胞タンパク質を含む重合ゲルビーズを、記録タグ付加後にプロテイナーゼ消化にかけて、ペプチド配列決定に好適な記録タグ標識ペプチドを生成することができる。ある特定の実施形態では、ポリマーマトリックスは、ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤に曝されると破壊されるジスルフィド架橋ポリマーなどの適切な添加剤に溶解するように設計することができる。
図３９Ａ〜３９Ｅは、二機能性Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）修飾因子およびキメラ切断試薬を使用したアミノ酸切断反応の増強の例を示す。（Ａ）および（Ｂ）固相基材に付着しているペプチドを、ビオチン−フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）などの二機能性ＮＴＡＡ修飾因子で修飾する。（Ｃ）低親和性エドマナーゼ（＞μＭ Ｋｄ）を、ストレプトアビジン−エドマナーゼキメラタンパク質を使用して、ビオチン−ＰＩＴＣ標識ＮＴＡＡに動員する。（Ｄ）エドマナーゼ切断の効率は、ビオチン−ストレプトアビジン（strepavidin）相互作用の結果として有効局所濃度が増加するため、大幅に向上する。（Ｅ）切断されたビオチン−ＰＩＴＣ標識ＮＴＡＡおよび付随するストレプトアビジン−エドマナーゼキメラタンパク質は、切断後に遠方に拡散する。いくつかの他のバイオコンジュゲーション動員戦略も用いることができる。アジド修飾ＰＩＴＣは、市販の（４−アジドフェニルイソチオシアネート、Ｓｉｇｍａ）であり、アルキン−ビオチンとのクリック化学反応によるビオチン−ＰＩＴＣなどの、ＰＩＴＣの他のバイオコンジュゲートへのアジド−ＰＩＴＣのいくつかの単純な変換を可能にする。
図４０Ａ〜４０Ｉは、タンパク質ライセート（ゲルビーズに封入されていてもよい）に由来するＣ末端記録タグ標識ペプチドの生成の例を示す。（Ａ）変性ポリペプチドを酸無水物と反応させて、リシン残基を標識する。一実施形態では、アルキン（ｍＴｅｔ）置換シトラコン酸無水物＋プロピオン酸無水物のミックスを使用して、リシンをｍＴｅｔで標識する（縞模様の長方形として示されている）。（Ｂ）その結果は、一部のリシンがプロピオン基（ポリペプチド鎖にある正方形として示されている）でブロッキングされたアルキン（ｍＴｅｔ）標識ポリペプチドである。アルキン（ｍＴｅｔ）部分は、クリック化学に基づくＤＮＡ標識に有用である。（Ｃ）ＤＮＡタグ（黒抜き長方形として示されている）を、アジドまたはｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）標識を使用して、それぞれアルキンまたはｍＴｅｔ部分にクリック化学により付着させる。（Ｄ）バーコードならびにスペーサー（Ｓｐ）配列およびユニバーサルプライミング配列などの機能的エレメントを、図３１に示されているようなプライマー伸長ステップを使用してＤＮＡタグに追加して、記録タグ標識ポリペプチドを産生する。バーコードは、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間位置バーコードなど、またはそれらの任意の組合せであってもよい。（Ｅ）得られた記録タグ標識ポリペプチドを、プロテアーゼでまたは化学的に記録タグ標識ペプチドに断片化する。（Ｆ）例示のために、２つの記録タグで標識されているペプチド断片が示されている。（Ｇ）記録タグのユニバーサルプライミング配列に相補的なユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡタグを、ペプチドのＣ末端にライゲーションさせる。また、Ｃ末端ＤＮＡタグは、ペプチドを表面にコンジュゲートするための部分を含む。（Ｈ）Ｃ末端ＤＮＡタグの相補的ユニバーサルプライミング配列および確率論的に選択された記録タグがアニーリングする。分子内プライマー伸長反応を使用して、記録タグからＣ末端ＤＮＡタグへと情報を移行させる。（Ｉ）ペプチドの内部記録タグを、無水マレイン酸を介してリシン残基にカップリングする。このカップリングは酸性ｐＨで可逆的である。内部記録タグを、酸性ｐＨにてペプチドのリシン残基から切断し、Ｃ末端記録タグはそのまま残る。必要に応じて、新しく露出したリシン残基を、プロピオン無水物などの非加水分解性無水物でブロッキングしてもよい。 図４０Ａ〜４０Ｉは、タンパク質ライセート（ゲルビーズに封入されていてもよい）に由来するＣ末端記録タグ標識ペプチドの生成の例を示す。（Ａ）変性ポリペプチドを酸無水物と反応させて、リシン残基を標識する。一実施形態では、アルキン（ｍＴｅｔ）置換シトラコン酸無水物＋プロピオン酸無水物のミックスを使用して、リシンをｍＴｅｔで標識する（縞模様の長方形として示されている）。（Ｂ）その結果は、一部のリシンがプロピオン基（ポリペプチド鎖にある正方形として示されている）でブロッキングされたアルキン（ｍＴｅｔ）標識ポリペプチドである。アルキン（ｍＴｅｔ）部分は、クリック化学に基づくＤＮＡ標識に有用である。（Ｃ）ＤＮＡタグ（黒抜き長方形として示されている）を、アジドまたはｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）標識を使用して、それぞれアルキンまたはｍＴｅｔ部分にクリック化学により付着させる。（Ｄ）バーコードならびにスペーサー（Ｓｐ）配列およびユニバーサルプライミング配列などの機能的エレメントを、図３１に示されているようなプライマー伸長ステップを使用してＤＮＡタグに追加して、記録タグ標識ポリペプチドを産生する。バーコードは、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間位置バーコードなど、またはそれらの任意の組合せであってもよい。（Ｅ）得られた記録タグ標識ポリペプチドを、プロテアーゼでまたは化学的に記録タグ標識ペプチドに断片化する。（Ｆ）例示のために、２つの記録タグで標識されているペプチド断片が示されている。（Ｇ）記録タグのユニバーサルプライミング配列に相補的なユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡタグを、ペプチドのＣ末端にライゲーションさせる。また、Ｃ末端ＤＮＡタグは、ペプチドを表面にコンジュゲートするための部分を含む。（Ｈ）Ｃ末端ＤＮＡタグの相補的ユニバーサルプライミング配列および確率論的に選択された記録タグがアニーリングする。分子内プライマー伸長反応を使用して、記録タグからＣ末端ＤＮＡタグへと情報を移行させる。（Ｉ）ペプチドの内部記録タグを、無水マレイン酸を介してリシン残基にカップリングする。このカップリングは酸性ｐＨで可逆的である。内部記録タグを、酸性ｐＨにてペプチドのリシン残基から切断し、Ｃ末端記録タグはそのまま残る。必要に応じて、新しく露出したリシン残基を、プロピオン無水物などの非加水分解性無水物でブロッキングしてもよい。
図４１は、ＮＧＰＳアッセイの実施形態の例示的なワークフローを示す。
図４２Ａ〜４２Ｄは、ＮＧＰＳシーケンシングアッセイの例示的なステップを示す。記録タグで標識した表面に結合されているペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）アセチル化またはアミジン化ステップは、ＮＴＡＡ結合性物質が、アセチル化ＮＴＡＡに結合するように遺伝子操作されているか、または天然ＮＴＡＡに結合するように遺伝子操作されているかに応じて、ＮＴＡＡ結合性物質による結合の前に生じてもよく、または結合の後で生じてもよい。第１の場合、（Ａ）まず、ペプチドのＮＴＡＡを、無水酢酸を使用して化学的手段により、またはＮ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）を用いて酵素的にアセチル化する。（Ｂ）ＮＴＡＡは、遺伝子操作されたアンチカリン、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）、ＣｌｐＳなどのＮＴＡＡ結合性物質により認識される。ＤＮＡコーディングタグは、結合性物質に付着しており、特定のＮＴＡＡ結合性物質を識別するバーコードエンコーダー配列を含む。（Ｃ）アセチル化ＮＴＡＡがＮＴＡＡ結合性物質と結合した後に、ＤＮＡコーディングタグは、相補的配列を介して記録タグと一時的にアニーリングし、コーディングタグ情報が、ポリメラーゼ伸長により記録タグへと移行される。代替的な実施形態では、記録タグ情報は、ポリメラーゼ伸長によりコーディングタグへと移行される。（Ｄ）アセチル化ＮＴＡＡは、アセチル化ペプチドの末端アセチル化アミノ酸の加水分解を触媒する遺伝子操作されたアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）によりペプチドから切断される。アセチル化ＮＴＡＡの切断後、このサイクルは、新たに露出したＮＴＡＡのアセチル化から開始して自発的に繰り返される。Ｎ末端アセチル化が、ＮＴＡＡ修飾／切断の例示的なモードとして使用されているが、その代わりに、グアニル部分などの他のＮ末端部分を、それに応じて切断化学を変更して置換してもよい。グアニジン化を用いる場合、グアニル化ＮＴＡＡは、０．５〜２％ＮａＯＨ溶液を使用して、穏やかな条件下で切断することができる（その全体が参照により組み込まれる、Hamada, 2016を参照されたい）。ＡＰＨは、ブロッキングされたペプチドのＮα−アセチル化アミノ酸の除去を触媒することができるセリンペプチダーゼであり、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）ファミリー（クランＳＣ、ファミリーＳ９）に属する。ＡＰＨは、真核生物細胞、細菌細胞、および古細菌細胞のＮ−末端アセチル化タンパク質の重要な制御因子である。
図４３Ａ〜４３Ｂは、例示的な記録タグ−コーディングタグ設計特徴を示す。（Ａ）例示的な記録タグ付随タンパク質（またはペプチド）および付随するコーディングタグを有する結合されている結合性物質（例えば、アンチカリン）の構造。プライマー伸長反応での確率論的な非鋳型３’末端アデノシン（Ａ）付加を受け入れるために、コーディングタグのスペーサー（Ｓｐ’）とバーコード（ＢＣ’）配列との間にチミジン（Ｔ）塩基が挿入されている。（Ｂ）ＤＮＡコーディングタグは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇタンパク質−ペプチド相互作用により結合性物質（例えば、アンチカリン）に付着している。
図４４Ａ〜４４Ｅは、記録タグへの切断性物質のハイブリダイゼーションを使用したＮＴＡＡ切断反応の増強の例を示す。図４４Ａ〜４４Ｂでは、固相基材（例えば、ビーズ）に付着している記録タグ標識ペプチドのＮＴＡＡを、例えば、ＰＩＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル修飾因子、グアニジン化などで修飾または標識する（Ｍｏｄ）。図４４Ｃでは、切断酵素（例えば、アシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）、アミノペプチダーゼ（ＡＰ）、エドマナーゼなど）を、記録タグのユニバーサルプライミング配列に相補的なユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡタグに付着させる。切断酵素は、切断酵素のＤＮＡタグおよび記録タグに対する相補的ユニバーサルプライミング配列のハイブリダイゼーションにより、修飾ＮＴＡＡに動員される。図４４Ｄでは、このハイブリダイゼーションステップにより、ＮＴＡＡに対する切断酵素の有効親和性が大幅に向上される。図４４Ｅでは、切断されたＮＴＡＡは、遠方に拡散し、付随する切断酵素は、ハイブリダイズされたＤＮＡタグを剥離することにより除去することができる。
図４５は、ペプチドリガーゼ＋プロテアーゼ＋ジアミノペプチダーゼを使用した例示的なサイクル分解ペプチド配列決定を示す。ブテラーゼＩにより、ＴＥＶ−ブテラーゼＩペプチド基質（ＴＥＮＬＹＦＱＮＨＶ、配列番号１３２）が、クエリペプチドのＮＴＡＡにライゲーションされる。ブテラーゼは、ペプチド基質のＣ末端にＮＨＶモチーフを必要とする。ライゲーション後、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを使用して、グルタミン（Ｑ）残基の後でキメラペプチド基質を切断して、クエリペプチドのＮ末端にアスパラギン（Ｎ）残基が付着したキメラペプチドが得られる。２つのアミノ酸残基をＮ末端から切断するジアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）またはジペプチジルペプチダーゼにより、Ｎ付加されたクエリペプチドが２つのアミノ酸だけ短くなり、クエリペプチドのアスパラギン残基（Ｎ）および元のＮＴＡＡが効果的に除去される。新たに露出したＮＴＡＡを、本明細書で提供されているような結合性物質を使用して読み取り、その後、サイクル全体を「ｎ」回繰り返して、「ｎ」個のアミノ酸を配列決定する。ストレプトアビジン−ＤＡＰ金属酵素キメラタンパク質を使用することにより、およびビオチン部分をＮ末端アスパラギン残基に係留することにより、ＤＡＰ処理能力の制御を可能にすることができる。
図４６Ａ〜４６Ｃは、一本鎖ＤＮＡコーディングタグを一本鎖ＤＮＡ記録タグとライゲーションさせることによる例示的な「無スペーサー」コーディングタグ移行を示す。コーディングタグを記録タグにライゲーションさせることにより一本鎖ＤＮＡコーディングタグを直接移行させて、伸長記録タグを生成する。（Ａ）一本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概要。記録タグのＢ ＤＮＡ標的を検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質Ｂ’を設計した。ｓｓＤＮＡ記録タグ、ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇは、５’リン酸化および３’ビオチン化されており、６塩基ＤＮＡバーコードＢＣａ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、および標的ＤＮＡ Ｂ配列で構成される。コーディングタグ、ＣＴ＿Ｂ’ｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇは、ユニバーサルリバースプライマー配列、ウラシル塩基、および一意の６塩基エンコーダーバーコードＢＣｂを含む。コーディングタグは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＢ’ＤＮＡ配列に共有結合で連結されている。コーディングタグに付着しているＢ’配列が、記録タグに付着しているＢ配列とハイブリダイゼーションすることにより、記録タグ５’リン酸基とコーディングタグの３’ヒドロキシル基とが固体表面上で近接近し、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩなどのリガーゼでの一本鎖ＤＮＡライゲーションによる情報移行がもたらされる。（Ｂ）一本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。一本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへの結合情報移行を実証した。４７塩基記録タグと４９塩基コーディングタグとのライゲーション産物のサイズは、９６塩基である。同種ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下ではライゲーション産物バンドが観察されたが、非同種ｓａＲＴ＿Ａｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下では産物バンドが観察されなかったことを考慮すると、特異性が実証される。（Ｃ）コーディングタグの複数サイクル情報移行。第１のサイクルライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素で処理して、情報移行の第２のサイクルで使用するための遊離５’リン酸化末端を生成する。 図４６Ａ〜４６Ｃは、一本鎖ＤＮＡコーディングタグを一本鎖ＤＮＡ記録タグとライゲーションさせることによる例示的な「無スペーサー」コーディングタグ移行を示す。コーディングタグを記録タグにライゲーションさせることにより一本鎖ＤＮＡコーディングタグを直接移行させて、伸長記録タグを生成する。（Ａ）一本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概要。記録タグのＢ ＤＮＡ標的を検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質Ｂ’を設計した。ｓｓＤＮＡ記録タグ、ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇは、５’リン酸化および３’ビオチン化されており、６塩基ＤＮＡバーコードＢＣａ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、および標的ＤＮＡ Ｂ配列で構成される。コーディングタグ、ＣＴ＿Ｂ’ｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇは、ユニバーサルリバースプライマー配列、ウラシル塩基、および一意の６塩基エンコーダーバーコードＢＣｂを含む。コーディングタグは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＢ’ＤＮＡ配列に共有結合で連結されている。コーディングタグに付着しているＢ’配列が、記録タグに付着しているＢ配列とハイブリダイゼーションすることにより、記録タグ５’リン酸基とコーディングタグの３’ヒドロキシル基とが固体表面上で近接近し、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩなどのリガーゼでの一本鎖ＤＮＡライゲーションによる情報移行がもたらされる。（Ｂ）一本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。一本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへの結合情報移行を実証した。４７塩基記録タグと４９塩基コーディングタグとのライゲーション産物のサイズは、９６塩基である。同種ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下ではライゲーション産物バンドが観察されたが、非同種ｓａＲＴ＿Ａｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下では産物バンドが観察されなかったことを考慮すると、特異性が実証される。（Ｃ）コーディングタグの複数サイクル情報移行。第１のサイクルライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素で処理して、情報移行の第２のサイクルで使用するための遊離５’リン酸化末端を生成する。
図４７Ａ〜４７Ｂは、二本鎖ＤＮＡコーディングタグを二本鎖ＤＮＡ記録タグとライゲーションさせることによる例示的なコーディングタグ移行を示す。二本鎖ＤＮＡライゲーションによるコーディングタグの複数の情報移行を、ＤＮＡに基づくモデル系によって実証した。（Ａ）二本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概要。記録タグの標的結合性物質Ａを検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質Ａ’配列を調製した。記録タグおよびコーディングタグは両方とも、４塩基突出を有する２つの鎖で構成されている。コーディングタグの標的指向性物質Ａ’が、固体表面上に固定化されている記録タグの標的結合性物質Ａにハイブリダイズすると、両タグの近傍突出末端がハイブリダイズして、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼでの二本鎖ＤＮＡライゲーションによる情報移行がもたらされる。（Ｂ）二本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。二本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへのＡ／Ａ’結合情報移行を実証した。二重鎖コーディングタグを有する７６塩基記録タグおよび５４塩基記録タグのライゲーション産物のサイズは、それぞれ１１６塩基および１１１塩基である。第１のサイクルライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）で消化し、第２のサイクルアッセイで使用した。第２のサイクルライゲーション産物バンドは、１５０塩基付近で観察された。 図４７Ａ〜４７Ｂは、二本鎖ＤＮＡコーディングタグを二本鎖ＤＮＡ記録タグとライゲーションさせることによる例示的なコーディングタグ移行を示す。二本鎖ＤＮＡライゲーションによるコーディングタグの複数の情報移行を、ＤＮＡに基づくモデル系によって実証した。（Ａ）二本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概要。記録タグの標的結合性物質Ａを検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質Ａ’配列を調製した。記録タグおよびコーディングタグは両方とも、４塩基突出を有する２つの鎖で構成されている。コーディングタグの標的指向性物質Ａ’が、固体表面上に固定化されている記録タグの標的結合性物質Ａにハイブリダイズすると、両タグの近傍突出末端がハイブリダイズして、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼでの二本鎖ＤＮＡライゲーションによる情報移行がもたらされる。（Ｂ）二本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。二本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへのＡ／Ａ’結合情報移行を実証した。二重鎖コーディングタグを有する７６塩基記録タグおよび５４塩基記録タグのライゲーション産物のサイズは、それぞれ１１６塩基および１１１塩基である。第１のサイクルライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）で消化し、第２のサイクルアッセイで使用した。第２のサイクルライゲーション産物バンドは、１５０塩基付近で観察された。
図４８Ａ〜４８Ｅは、複数のサイクルによるコーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するための、例示的なペプチドに基づくモデル系およびＤＮＡ基づくモデル系を示す。複数の情報移行を、連続ペプチドおよびＤＮＡモデル系によって実証した。（Ａ）ペプチドに基づくモデル系の第１のサイクルの概要。第１のサイクル情報移行における記録タグのＰＡ−ペプチドタグを検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質抗ＰＡ抗体を調製した。加えて、Ｎａｎｏｔａｇペプチドまたはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを使用して、ペプチド−記録タグ複合体陰性対照も生成した。Ａ配列標的物質、ポリ−ｄＴ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、一意のＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２、ならびに８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）を含む記録タグａｍＲＴ＿Ａｂｃは、５’末端のアミン基および内部アルキン基を介してそれぞれペプチドおよび固体支持体に共有結合で付着されている。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）により隣接された一意のエンコーダーバーコードＢＣ５’を含むコーディングタグａｍＣＴ＿ｂｃ５は、５’末端および３’末端がそれぞれ抗体およびＣ３リンカーに共有結合で連結されている。抗ＰＡ抗体がＰＡ−タグペプチド−記録タグ（ＲＴ）複合体に結合すると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が行われる。（Ｂ）ＤＮＡに基づくモデルアッセイの第２のサイクルの概要。記録タグのＡ配列標的物質を検出するための、コーディングタグに連結された標的指向性物質Ａ’配列を調製した。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）、一意のエンコーダーバーコードＢＣ１３’、ユニバーサルリバースプライマー配列を含むコーディングタグＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３。Ａ’配列がＡ配列にハイブリダイズすると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が行われる。（Ｃ）ＰＣＲ解析のための記録タグ増幅。Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２のプライマーセットを使用した１８サイクルのＰＣＲで、固定化された記録タグを増幅した。記録タグ密度依存性ＰＣＲ産物が、５６ｂｐ付近で観察された。（Ｄ）第１のサイクル伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ５のプライマーセットを使用した２１サイクルのＰＣＲで、第１のサイクル伸長記録タグを増幅した。ＰＡ−ペプチドＲＴ複合体の場合、複合体の様々な密度タイトレーションにわたって、第１のサイクル伸長産物に由来するＰＣＲ産物の強いバンドが、８０ｂｐ付近で観察された。ＮａｎｏおよびＡβペプチド複合体でも同様に、最も高い複合体密度でわずかなバックグラウンドバンドが観察された。これは、明らかに非特異的結合によるものである。（Ｅ）第２のサイクル伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。Ｐ１＿Ｆ２およびＰ２＿Ｒ１のプライマーセットを使用した２１サイクルのＰＣＲで、第２のサイクル伸長記録タグを増幅した。ペプチド固定化ビーズすべてで、元の記録タグの第２のサイクル伸長産物（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）にのみに対応する、ＰＣＲ産物の比較的強いバンドが１１７塩基対で観察された。ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用した場合にのみ、第１のサイクル伸長記録タグの第２のサイクル伸長産物（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に対応するバンドが、９３塩基対で観察された。 図４８Ａ〜４８Ｅは、複数のサイクルによるコーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するための、例示的なペプチドに基づくモデル系およびＤＮＡ基づくモデル系を示す。複数の情報移行を、連続ペプチドおよびＤＮＡモデル系によって実証した。（Ａ）ペプチドに基づくモデル系の第１のサイクルの概要。第１のサイクル情報移行における記録タグのＰＡ−ペプチドタグを検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質抗ＰＡ抗体を調製した。加えて、Ｎａｎｏｔａｇペプチドまたはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを使用して、ペプチド−記録タグ複合体陰性対照も生成した。Ａ配列標的物質、ポリ−ｄＴ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、一意のＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２、ならびに８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）を含む記録タグａｍＲＴ＿Ａｂｃは、５’末端のアミン基および内部アルキン基を介してそれぞれペプチドおよび固体支持体に共有結合で付着されている。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）により隣接された一意のエンコーダーバーコードＢＣ５’を含むコーディングタグａｍＣＴ＿ｂｃ５は、５’末端および３’末端がそれぞれ抗体およびＣ３リンカーに共有結合で連結されている。抗ＰＡ抗体がＰＡ−タグペプチド−記録タグ（ＲＴ）複合体に結合すると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が行われる。（Ｂ）ＤＮＡに基づくモデルアッセイの第２のサイクルの概要。記録タグのＡ配列標的物質を検出するための、コーディングタグに連結された標的指向性物質Ａ’配列を調製した。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）、一意のエンコーダーバーコードＢＣ１３’、ユニバーサルリバースプライマー配列を含むコーディングタグＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３。Ａ’配列がＡ配列にハイブリダイズすると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が行われる。（Ｃ）ＰＣＲ解析のための記録タグ増幅。Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２のプライマーセットを使用した１８サイクルのＰＣＲで、固定化された記録タグを増幅した。記録タグ密度依存性ＰＣＲ産物が、５６ｂｐ付近で観察された。（Ｄ）第１のサイクル伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ５のプライマーセットを使用した２１サイクルのＰＣＲで、第１のサイクル伸長記録タグを増幅した。ＰＡ−ペプチドＲＴ複合体の場合、複合体の様々な密度タイトレーションにわたって、第１のサイクル伸長産物に由来するＰＣＲ産物の強いバンドが、８０ｂｐ付近で観察された。ＮａｎｏおよびＡβペプチド複合体でも同様に、最も高い複合体密度でわずかなバックグラウンドバンドが観察された。これは、明らかに非特異的結合によるものである。（Ｅ）第２のサイクル伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。Ｐ１＿Ｆ２およびＰ２＿Ｒ１のプライマーセットを使用した２１サイクルのＰＣＲで、第２のサイクル伸長記録タグを増幅した。ペプチド固定化ビーズすべてで、元の記録タグの第２のサイクル伸長産物（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）にのみに対応する、ＰＣＲ産物の比較的強いバンドが１１７塩基対で観察された。ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用した場合にのみ、第１のサイクル伸長記録タグの第２のサイクル伸長産物（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に対応するバンドが、９３塩基対で観察された。 図４８Ａ〜４８Ｅは、複数のサイクルによるコーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するための、例示的なペプチドに基づくモデル系およびＤＮＡ基づくモデル系を示す。複数の情報移行を、連続ペプチドおよびＤＮＡモデル系によって実証した。（Ａ）ペプチドに基づくモデル系の第１のサイクルの概要。第１のサイクル情報移行における記録タグのＰＡ−ペプチドタグを検出するための、コーディングタグにコンジュゲートされた標的指向性物質抗ＰＡ抗体を調製した。加えて、Ｎａｎｏｔａｇペプチドまたはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを使用して、ペプチド−記録タグ複合体陰性対照も生成した。Ａ配列標的物質、ポリ−ｄＴ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、一意のＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２、ならびに８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）を含む記録タグａｍＲＴ＿Ａｂｃは、５’末端のアミン基および内部アルキン基を介してそれぞれペプチドおよび固体支持体に共有結合で付着されている。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）により隣接された一意のエンコーダーバーコードＢＣ５’を含むコーディングタグａｍＣＴ＿ｂｃ５は、５’末端および３’末端がそれぞれ抗体およびＣ３リンカーに共有結合で連結されている。抗ＰＡ抗体がＰＡ−タグペプチド−記録タグ（ＲＴ）複合体に結合すると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が行われる。（Ｂ）ＤＮＡに基づくモデルアッセイの第２のサイクルの概要。記録タグのＡ配列標的物質を検出するための、コーディングタグに連結された標的指向性物質Ａ’配列を調製した。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）、一意のエンコーダーバーコードＢＣ１３’、ユニバーサルリバースプライマー配列を含むコーディングタグＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３。Ａ’配列がＡ配列にハイブリダイズすると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が行われる。（Ｃ）ＰＣＲ解析のための記録タグ増幅。Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２のプライマーセットを使用した１８サイクルのＰＣＲで、固定化された記録タグを増幅した。記録タグ密度依存性ＰＣＲ産物が、５６ｂｐ付近で観察された。（Ｄ）第１のサイクル伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ５のプライマーセットを使用した２１サイクルのＰＣＲで、第１のサイクル伸長記録タグを増幅した。ＰＡ−ペプチドＲＴ複合体の場合、複合体の様々な密度タイトレーションにわたって、第１のサイクル伸長産物に由来するＰＣＲ産物の強いバンドが、８０ｂｐ付近で観察された。ＮａｎｏおよびＡβペプチド複合体でも同様に、最も高い複合体密度でわずかなバックグラウンドバンドが観察された。これは、明らかに非特異的結合によるものである。（Ｅ）第２のサイクル伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。Ｐ１＿Ｆ２およびＰ２＿Ｒ１のプライマーセットを使用した２１サイクルのＰＣＲで、第２のサイクル伸長記録タグを増幅した。ペプチド固定化ビーズすべてで、元の記録タグの第２のサイクル伸長産物（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）にのみに対応する、ＰＣＲ産物の比較的強いバンドが１１７塩基対で観察された。ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用した場合にのみ、第１のサイクル伸長記録タグの第２のサイクル伸長産物（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に対応するバンドが、９３塩基対で観察された。
図４９Ａ〜４９Ｂは、ｐ５３タンパク質配列決定を例として使用して、プロテオフォームの重要性、および例えば単一分子手法を使用して得られるものなどの配列決定リードのロバストなマッピング性を示す。図４９Ａの左パネルは、インタクトなプロテオフォームを消化して断片にし、断片の各々は、１つもしくは複数のメチル化アミノ酸、１つもしくは複数のリン酸化アミノ酸を含んでいてもよく、または翻訳後修飾を含んでいなくともよいことを示す。翻訳後修飾情報は、配列決定リードと一緒に解析することができる。右パネルは、タンパク質における種々の翻訳後修飾を示す。図４９Ｂは、分配を使用したマッピングリード、例えばリード「ＣＰＸＱＸＷＸＤＸＴ」（配列番号１７０、Ｘ＝任意のアミノ酸）は、ヒトプロテオーム全体をブラストした後、ｐ５３に（ＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴ配列に、配列番号１６９）一意的にマッピングし戻されることを示す。配列決定リードは長い必要はなく、例えば、約１０〜１５個アミノ酸の配列が、プロテオーム内のタンパク質を識別するための十分な情報をもたらすことができる。配列決定リードはオーバーラップしてもよく、オーバーラップ配列の配列情報の冗長性を使用して、ポリペプチド配列全体を推定および／または検証することができる。 図４９Ａ〜４９Ｂは、ｐ５３タンパク質配列決定を例として使用して、プロテオフォームの重要性、および例えば単一分子手法を使用して得られるものなどの配列決定リードのロバストなマッピング性を示す。図４９Ａの左パネルは、インタクトなプロテオフォームを消化して断片にし、断片の各々は、１つもしくは複数のメチル化アミノ酸、１つもしくは複数のリン酸化アミノ酸を含んでいてもよく、または翻訳後修飾を含んでいなくともよいことを示す。翻訳後修飾情報は、配列決定リードと一緒に解析することができる。右パネルは、タンパク質における種々の翻訳後修飾を示す。図４９Ｂは、分配を使用したマッピングリード、例えばリード「ＣＰＸＱＸＷＸＤＸＴ」（配列番号１７０、Ｘ＝任意のアミノ酸）は、ヒトプロテオーム全体をブラストした後、ｐ５３に（ＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴ配列に、配列番号１６９）一意的にマッピングし戻されることを示す。配列決定リードは長い必要はなく、例えば、約１０〜１５個アミノ酸の配列が、プロテオーム内のタンパク質を識別するための十分な情報をもたらすことができる。配列決定リードはオーバーラップしてもよく、オーバーラップ配列の配列情報の冗長性を使用して、ポリペプチド配列全体を推定および／または検証することができる。
図５０Ａ〜５０Ｃは、ｍＲＮＡディスプレイを使用した、ＤＮＡ記録タグによるタンパク質またはペプチドの標識を示す。
図５１Ａ〜５１Ｅは、分配バーコード標識ペプチドに結合するＮ末端ジペプチドによる単一サイクルタンパク質識別を示す。
図５２Ａ〜５２Ｅは、ペプチド固定化分配バーコード付きビーズに対するＮ末端ジペプチド結合物質による単一サイクルタンパク質識別を示す。
図５３Ａ〜５３Ｂは、様々な細菌種にわたるＣｌｐＳホモログ／変異体、および本開示で使用するための例示的なＣｌｐＳタンパク質、例えば、寄託番号４ＹＪＭ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに由来するＣｌｐＳ２：ＭＳＤＳＰＶＤＬＫＰＫＰＫＶＫＰＫＬＥＲＰＫＬＹＫＶＭＬＬＮＤＤＹＴＰＲＥＦＶＴＶＶＬＫＡＶＦＲＭＳＥＤＴＧＲＲＶＭＭＴＡＨＲＦＧＳＡＶＶＶＶＣＥＲＤＩＡＥＴＫＡＫＥＡＴＤＬＧＫＥＡＧＦＰＬＭＦＴＴＥＰＥＥ（配列番号１９８）；寄託番号２Ｗ９Ｒ、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＣｌｐＳ：ＭＧＫＴＮＤＷＬＤＦＤＱＬＡＥＥＫＶＲＤＡＬＫＰＰＳＭＹＫＶＩＬＶＮＤＤＹＴＰＭＥＦＶＩＤＶＬＱＫＦＦＳＹＤＶＥＲＡＴＱＬＭＬＡＶＨＹＱＧＫＡＩＣＧＶＦＴＡＥＶＡＥＴＫＶＡＭＶＮＫＹＡＲＥＮＥＨＰＬＬＣＴＬＥＫＡＧＡ（配列番号１９９）；および寄託番号３ＤＮＪ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓに由来するＣｌｐＳ：ＴＱＫＰＳＬＹＲＶＬＩＬＮＤＤＹＴＰＭＥＦＶＶＹＶＬＥＲＦＦＮＫＳＲＥＤＡＴＲＩＭＬＨＶＨＱＮＧＶＧＶＣＧＶＹＴＹＥＶＡＥＴＫＶＡＱＶＩＤＳＡＲＲＨＱＨＰＬＱＣＴＭＥＫＤ（配列番号２００）を示す。図５３Ａは、９９％同一性にクラスター化された６１２個の異なる細菌種に由来するＣｌｐＳアミノ酸配列の階層的クラスタリングの樹状図（dendogram）を示す。図５３Ｂは、図５３Ａの３つの種に由来するＣｌｐＳ間のアミノ酸配列同一性の表である。Ａ．ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓ ＣｌｐＳ２は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｌｐＳと３５％未満の配列同一性を有し、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ＣｌｐＳと４０％未満の配列同一性を有する。
図５４は、実施例３１に記載のような、ＯＢＯＣビーズ上のリガンドおよび付随するコーディングタグによる例示的なリガンド結合アッセイを示す。図５４Ａでは、ＤＮＡコード付きＯＢＯＣビーズのライブラリーが構築される。各ビーズは、小分子リガンドおよび付随するＤＮＡにコードされるライブラリーバーコード（ＤＥＬ ＢＣ）の単一集団を有する（MacConnell, A. B., et al. (2015) ACS Comb Sci 17(9): 518-534）。図５４Ｂは、結合されたタンパク質記録タグとＯＢＯＣビーズ上のコーディングタグとの結合および結合情報の書込みの単一サイクルを示す。ビーズ上のコーディングタグはすべて、ビーズ上に共に存在する小分子タイプを識別する同じＤＥＬ ＢＣ配列を含む（１ビーズ当たり多数の同一小分子）。付随する記録タグを有するタンパク質を導入し、ビーズ上のリガンドに結合させる。情報は、結合と同時にまたは結合の後のいずれかで、コーディングタグと記録タグとの間を移行する。この情報移行は、ポリメラーゼ伸長、ｓｓＤＮＡライゲーション、またはｄｓＤＮＡライゲーションによって化学的にまたは酵素的に実施することができる。コーディングタグは、ビーズに直接付着されていてもよく、または二機能性リンカーを介してリガンドに付着されていてもよい。図５４Ｃは、ポリメラーゼ伸長による記録タグからコーディングタグへの情報移行を示す。図５４Ｄは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を示す。
図５５Ａ〜５５Ｃは、巨大分子を結合性物質に結合させ、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されている単一の結合性物質の部位に共局在化されている複数のコーディングタグのうちの個々のコーディングタグの情報を、巨大分子に付着されている記録タグへと移行させ、それにより所与の巨大分子の時間的な結合履歴を表す、コーディングタグを含む伸長記録タグを産生する複数サイクルのプロセスを示す。この図では、例示のために過ぎないが、巨大分子は、ペプチドであり、各ラウンドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を結合性物質に結合させること、コーディングタグ情報を記録タグに移行させることにより結合事象を記録すること、サイクル特異的タグ情報を記録タグに移行させることにより結合事象順序を記録し、その後そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。
図５６Ａ〜５６Ｃは、巨大分子を結合性物質に結合させ、巨大分子に付着されている記録タグの情報を、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されている単一の結合性物質の部位に共局在化されている複数のコーディングタグのうちの個々のコーディングタグに移行させ、それにより結合性物質を集合的に表す複数の伸長コーディングタグを生成する複数サイクルのプロセスを示す。この図では、例示のために過ぎないが、結合性物質は、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合性物質であり、各ラウンドは、ペプチドのＮＴＡＡを結合性物質に結合させること、記録タグ情報をコーディングタグに移行させることにより結合事象を記録すること、サイクル特異的タグ情報をコーディングタグに移行させることにより結合事象順序を記録し、その後そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。
図５７Ａ〜５７Ｂは、３回のサイクル結合／エンコーディングおよびＮＧＳ読み出しを示す。（Ａ）３回連続のエンコーディングステップが示されている。記録タグ（ＤＮＡ ＲＴ）にコンジュゲートされており、磁気ビーズ上に固定化されているペプチドが示されている。ペプチドはＰＡエピトープを含む。３つの異なるサイクル特異的バーコード（ＢＣ４、ＢＣ５、ＢＣ１３）で標識された抗ＰＡ抗体を使用して、アッセイの３回連続サイクルを実施し、各バーコードを異なるサイクル（それぞれ、第１、第２、および第３のサイクル）で使用した。各サイクルは、それぞれのサイクルバーコードで伸長されている記録タグをもたらす。（Ｂ）各サイクル後の伸長記録タグのＰＣＲ産物の解析を示すアガロースゲル。レーン１＝サイズ標準物質、レーン２〜４は、それぞれ、第１、第２、および第３のサイクル産物に対応する。ゲルは、明らかに高収率エンコーディングを示す。ＰＣＲでは、ＫＯＤポリメラーゼを使用し、２４サイクルの増幅を行った。（Ｃ）ゲル解析に加えて、最後の「３サイクル」産物（ゲルの３番目のレーン）をＮＧＳシーケンシングで解析した。ゲルの最大バンドに対応する主要産物（産物の７８％よりも多い）は、３つのバーコードすべてを有するライブラリーエレメントで構成されていた。単一および二重バーコード産物も、より低いパーセント（２つのＢＣは２０．７％、および１つのＢＣは１．１％）で観察された。
図５８Ａ〜５８Ｂは、プライマー伸長エンコーディングアッセイにおけるブロックキングオリゴヌクレオチドの使用を示す。いくつかのタイプのブロッキングオリゴヌクレオチドを、プライマー伸長に基づくエンコーディングアッセイで試験した。（Ａ）ＤＮＡ「結合物質」モデル系の設計、およびエンコーディングアッセイの成分をブロックキングするために使用される３つのタイプのブロッキングオリゴヌクレオチド：ＲＴブロッカー、ＣＴブロッカー、およびＳｐ’ブロッカーを示す。各サイクルのコーディングタグバーコードは、サイクル特異的であり、サイクル間で直交性（非相互作用性）であるように設計した。（Ｂ）エンコーディングおよびＰＣＲ増幅の３回のサイクル後のエンコーディング結果のゲル解析。図示されている例では、各サイクルで入って来るコーディングタグと同種のＣＴブロッカー（＊印のレーン）は、矢印で表記されている上方バンドにより示されるように最も高いエンコーディング効率をもたらした。
図５９Ａ〜５９Ｂは、ＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅライブラリー増幅中の鋳型スイッチングの最小化を示す。（Ａ）好熱性ポリメラーゼを、ＰＣＲ中に鋳型スイッチングを起こす傾向についてスクリーニングした。共有されたバーコード（ＢＣ３、ＢＣ４、ＢＣ５、およびＢＣ１３）およびスペーサー（Ｓｐ）配列を含む、長さが異なる２つの合成疑似鋳型（ＴＳ＿Ｃｔｒｌ１およびＴＳ＿Ｃｔｒｌ４）が示されている。ＰＣＲによる共増幅の後、２つの元の鋳型のバンドに加えて、ＰＡＧＥによるバンドが存在することは、鋳型スイッチングが起こったことを示す。（Ｂ）ＰＣＲ産物をＰＡＧＥで解析した。鋳型スイッチングは、ＰＣＲ条件およびポリメラーゼタイプの関数だった。Ｔａｑポリメラーゼ（レーン２〜５；レーン１＝サイズマーカー）は、特に６０℃でのアニーリングで、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−（レーン６〜９）よりも非常に低い鋳型スイッチングを示した。
図６０は、単一サイクルＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイを示す。２つの異なるビーズタイプ（一方はアミノＡ末端ペプチド（ＡＦＡペプチド）を有し、他方はアミノＦ末端ペプチド（ＦＡペプチド）を有する）をアッセイに使用した。ＡＦＡペプチドビーズおよびＦＡペプチドビーズを、ＮＴＦ／ＮＴＥ化学の１サイクル、ならびに遺伝子操作されたフェニルアラニン（Ｆ）結合物質を用いたプレ化学エンコーディングステップおよびポスト化学エンコーディングステップで構成されるエンコーディングの２サイクルからなる完全サイクルＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイに使用した。Ｆ−結合物質については、異なるバーコードを、プレ化学エンコーディングアッセイ対ポスト化学エンコーディングアッセイに使用した。エンコーディング（プレおよびポスト）の２サイクル後、伸長記録タグをＰＣＲおよびＮＧＳライブラリー調製に供し、その後Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でＮＧＳシーケンシング読み出しを行った。「プレ」および「ポスト」バーコード付きコーディングタグを含むＡＦＡ記録タグおよびＦＡ記録タグの正規化された数のリードが示されている。Ｆ−結合物質と共にインキュベートしたＦＡペプチドでは、ポスト化学サイクルタグと比較して、より高い「プレ化学」コーディングタグリード数が観察された。これはＦ残基の除去が成功したことを示す。逆に、Ｆ−結合物質と共にインキュベートしたＡＦＡペプチドでは、ポスト化学サイクルタグと比較して、より低いプレ化学サイクルタグのリード数が観察された。これは、Ａ残基の除去が成功したことを示す。
図６１Ａ〜６１Ｂは、ペプチドキメラ表面密度の関数としての分子間掛け合い応答を示す。異なる表面キメラ密度で同じビーズ上に固定化された４つのｐｌｅｘペプチド−記録タグキメラ（ＡＡペプチド、ＡＦペプチド、ＦＡペプチド、および無ペプチド）でのＦ−結合物質アッセイ掛け合い応答測定。（Ａ）ＰＡ抗体結合／エンコーディングによって評価された４つのキメラタイプにわたるキメラ固定化の均一性。各キメラ（配列決定または記録タグで測定）は、総キメラのおよそ２０〜３０％に相当した。（Ｂ）４つのキメラタイプにわたる、Ｆ−結合物質との結合およびエンコーディングの単一サイクルのエンコーディング効率。１：１０，０００および１：１００，０００のキメラ表面希釈では、ＦＡペプチドの分子内エンコーディング効率は、オフターゲットペプチドキメラ（ＡＦ、ＡＡ、および無ペプチド）の分子間エンコーディングよりも非常に高い。
図６２Ａ〜６２Ｂは、ｓｓＤＮＡリガーゼを使用した、塩基が保護されたＤＮＡによるＤＮＡエンコーディングを示す。（Ａ）ｓｓＤＮＡライゲーションアッセイのための、塩基が保護された記録タグ（ＲＴ）およびコーディングタグ（ＣＴ）の設計。用いた塩基保護基は、オリゴヌクレオチド合成に使用された標準的ホスホラミダイト保護基：Ｂｚ−ｄＡ、ｉｂｕ−ｄＧ、Ａｃ−ｄＣだった。これらの保護基は、合成後、適所に残ったままだった。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを使用して、ＲＴオリゴの５’リン酸化末端を、ＣＴオリゴの３’ＯＨにライゲーションさせた。（Ｂ）ｓｓＤＮＡリガーゼライゲーション反応成分および産物のＰＡＧＥゲル解析。レーン１＝ＲＴ全長オリゴ；レーン２＝５’Ｕを含むＲＴ全長からリン酸化ＲＴ配列を生成するためのＵＳＥＲ酵素処理後；レーン３＝ＣＴオリゴを、ビーズ上に固定化されたＲＴオリゴにアニーリングさせた後；レーン４＝ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを使用してＢ−Ｂ’相互作用によりＣＴの３’末端をＲＴの５’末端にライゲーションさせた後。「塩基が保護された」ＤＮＡのライゲーションは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを使用してレーン５に見られるようなより高い分子量のライゲーション産物の形成により示されるように、比較的効率的である。
図６３Ａ〜６３Ｅは、ＤＮＡビーズとのハイブリダイゼーションおよびライゲーションを使用した、ＤＮＡタグ付きペプチドの固定化を示す。（Ａ）ＤＮＡヘアピンの５’突出を使用してＤＮＡ−ペプチドキメラを捕捉するＤＮＡヘアピンビーズの設計。（Ｂ）ＤＮＡ−ペプチドキメラを、ビーズ上のヘアピンにハイブリダイズさせる。（Ｃ）ＤＮＡリガーゼを使用して、ペプチドのリン酸化ＤＮＡタグの５’末端を、共有結合でヘアピンに接合する。ペプチドのＤＮＡタグは、ペプチドが内部ヌクレオチドと化学的にコンジュゲートするように設計されている。ペプチドのＤＮＡタグは、コーディングタグに由来する情報を移行させることができる遊離３’末端を有する記録タグを構成する。（Ｄ）ＤＮＡタグ付きペプチドのビーズに対する固定化の効率を評価するためのｑＰＣＲプライマーの設計。（Ｅ）ヘアピン（突出）およびＤＮＡタグ付きペプチド固定化（キメラおよびライゲーション産物）を評価するための、３つの異なるプライマーセットを使用したｑＰＣＲ定量化。より低Ｃｑ値は、増幅産物の存在量がより高いことを示す。
本明細書において具体的に定義されていない用語には、本開示および文脈を踏まえて当業者によって与えられる意味が与えられるべきである。しかし、本明細書で使用される場合、それに反する指定がなければ、用語は示されている意味を有する。
本出願において参照される特許文書、科学論文およびデータベースを含めた刊行物は全て、各個々の刊行物が個別に参照により組み込まれたものと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願および他の刊行物に記載の定義に反するまたは他の点で相反する場合、本明細書に記載の定義が参照により本明細書に組み込まれる定義よりも優先される。
本明細書で使用される節の表題は、単に構成目的のものであり、記載の主題を限定するものとは解釈されない。
Ｉ．緒言および概要
ポリペプチド（例えば、タンパク質）の高度に並行な高分子特徴付けおよび認識は、いくつかの理由で困難である。親和性に基づくアッセイの使用は、多くの場合、いくつかの重要な難題に起因して難しい。１つの重要な難題は、親和性作用物質の集合の読み取りを同類の巨大分子の集合に多重化することである。別の難題は、親和性作用物質とオフターゲットの巨大分子との交差反応性を最小化することである。第３の難題は、効率的なハイスループットな読み取りプラットフォームを開発することである。この問題の例は、試料中のタンパク質の大多数または全てを識別および定量化することが１つの目標であるプロテオミクスにおいて生じる。さらに、タンパク質の種々の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を単一分子レベルで特徴付けることが望ましい。現在、これは、ハイスループットなやり方で実現することが大変な課題である。
タンパク質またはポリペプチド分析物の分子認識および特徴付けは、一般には、イムノアッセイを使用して実施される。ＥＬＩＳＡ、マルチプレックスＥＬＩＳＡ（例えば、スポッテッド抗体アレイ（ｓｐｏｔｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ）、液体粒子ＥＬＩＳＡアレイ）、デジタルＥＬＩＳＡ（例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ）、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、および多くの他のものを含めた、多くの異なるイムノアッセイ形式が存在する。これらの異なるイムノアッセイプラットフォームは全て、高親和性および高度に特異的な（または選択的な）抗体（結合性物質）の開発、試料レベルおよび分析物レベルのどちらにおいても多重化能力が限られていること、感度およびダイナミックレンジが限られていること、ならびに交差反応性およびバックグラウンドシグナルを含めた、同様の難題に直面する。ペプチド配列決定（エドマン分解または質量分析）による直接タンパク質特徴付けなどの、結合性物質にとらわれない手法により有用な代替的手法がもたらされる。しかし、これらの手法はいずれも、非常に並行またはハイスループットなものではない。
エドマン分解に基づくペプチド配列決定は、１９５０年にＰｅｈｒ Ｅｄｍａｎによって最初に提唱されたものであり、言い換えると、ペプチドのＮ末端アミノ酸の、一連の化学修飾による段階的分解および下流のＨＰＬＣ分析（後に質量分析に置き換えられた）である。第１のステップにおいて、Ｎ末端アミノ酸を穏やかな塩基性条件下（ＮＭＰ／メタノール／Ｈ２Ｏ）でフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を用いて修飾して、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）誘導体を形成させる。第２のステップでは、ＰＴＣで修飾されたアミノ基を酸（無水トリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）で処理して、切断された環状ＡＴＺ（２−アニリノ−５（４）−チアゾリノン（thiozolinone）修飾アミノ酸を創出し、新しいＮ末端をペプチド上に残す。切断された環状ＡＴＺアミノ酸をフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体に変換し、逆相ＨＰＬＣによって分析する。このプロセスを、ペプチド配列を構成するアミノ酸の全てまたは部分的な数がＮ末端から除去され識別されるまで反復的に継続する。一般に、エドマン分解ペプチド配列決定法という技術は、時間がかかり、１日当たりほんの数ペプチドとスループットが限られている。
ここ１０〜１５年で、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用したペプチド解析が大きくエドマン分解に取って代わっている。ＭＳ器械使用（Riley et al., 2016、Cell Syst 2: 142-143）における最近の進歩にもかかわらず、ＭＳにはなお、計器費用が高いこと、洗練された使用者が求められること、数量化能力が不十分であること、およびプロテオームのダイナミックレンジ全体にわたって測定を行う能力が限られていることを含めたいくつかの欠点がある。例えば、タンパク質は異なる効率レベルでイオン化するので、試料間の絶対的な定量化およびさらには相対的な定量化も困難である。質量タグの実装が相対的な定量化の改善に役立っているが、プロテオームの標識が必要になる。試料中のタンパク質の濃度が非常に大きな範囲にわたって（血漿に関しては１０桁にわたって）変動し得るダイナミックレンジがさらなる複雑化の要因である。一般には、ＭＳではより豊富な種のみが分析され、豊富さが低いタンパク質の特徴付けは困難になる。最後に、試料スループットは、一般には、実行当たり数千ペプチドに限られ、データ非依存性解析（ＤＩＡ）に関して、このスループットは真のボトムアップ式のハイスループットなプロテオーム解析には不十分である。さらに、各試料について記録された何千もの複雑なＭＳスペクトルをデコンボリューションするために著しいコンピュータ処理の必要性がある。
したがって、タンパク質配列決定および／または解析に適用される巨大分子配列決定および／または解析に関する改善された技法、ならびに、それを実現するための製品、方法およびキットが当技術分野において依然として必要とされている。高度に並行化された、正確な、感度の高い、かつハイスループットなプロテオミクス技術が必要とされている。本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかになろう。この目的のために、ある特定のバックグラウンド情報、手順、化合物および／または組成物がより詳細に記載されている種々の参考文献が本明細書に記載され、これらはそれぞれが、これにより全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、一部において、タンパク質およびペプチドの特徴付けおよび配列決定に直接適用される、高度に並行な、ハイスループットなデジタル巨大分子特徴付けおよび定量化の方法を提供する（例えば、図１Ｂ、図２Ａを参照されたい）。本明細書に記載の方法では、識別情報を核酸分子または配列決定可能なポリマーの形態で有するコーディングタグを含む結合性物質を使用し、ここで、結合性物質は、目的の巨大分子と相互作用するものである。多数の連続的な結合サイクルを実施し、各サイクルは、例えばプールされた試料を表すものである、固体支持体に固定化した複数の巨大分子を複数の結合性物質に曝露させることを含む。各結合サイクル中、巨大分子に結合する各結合性物質の同一性、および必要に応じて結合サイクル数を、結合性物質コーディングタグから巨大分子と共局在する記録タグに情報を移行させることによって記録する。代替の実施形態では、付随する巨大分子に関する識別情報を含む記録タグからの情報を、結合した結合性物質のコーディングタグ（例えば、伸長コーディングタグを形成するため）または第３の「ジタグ」構築物に移行させることができる。多数サイクルの結合事象により、巨大分子と共局在する記録タグに関する歴史的な結合情報が構築され、それにより、多数のコーディングタグを含む伸長記録タグが、所与の巨大分子についての時間的な結合履歴を表す共直線的な順序で生じる。さらに、サイクル特異的コーディングタグを使用して各サイクルからの情報を追跡することができ、したがって、あるサイクルが何らかの理由でスキップされた場合に、伸長記録タグがその後のサイクルで情報を収集し続け、情報が欠如したサイクルを識別することができる。
あるいは、コーディングタグから記録タグに情報を書き込むまたは移行させる代わりに、付随する巨大分子に関する識別情報を含む記録タグから、伸長コーディングタを形成するコーディングタググまたは第３のジタグ構築物に情報を移行させることができる。得られた伸長コーディングタグまたはジタグを、その後の配列解析のために各結合サイクル後に収集することができる。バーコード（例えば、分配タグ、コンパートメントタグ、試料タグ、画分タグ、ＵＭＩ、またはこれらの任意の組合せ）を含む記録タグ上の識別情報を使用して、伸長コーディングタグまたはジタグ配列読み取りを元の巨大分子にマッピングし戻すことができる。このように、巨大分子の結合履歴の核酸コードライブラリー表示を生成する。この核酸コードライブラリーを、非常にハイスループットな次世代デジタルシーケンシング法を使用して増幅させ、解析し、実行当たり数百万〜数十億の分子を解析することができる。結合情報に関する核酸コードライブラリーの創出は、ハイブリダイゼーションを使用するＤＮＡに基づく技法による濃縮、サブトラクション、および正規化が可能になるという点で、別のように有用である。これらのＤＮＡに基づく方法は、容易におよび迅速に大規模化可能かつカスタマイズ可能であり、タンパク質ライブラリーなどの他の型の巨大分子ライブラリーの直接操作のために利用可能なものよりも費用効果が大きい。したがって、結合情報に関する核酸コードライブラリーを配列決定前に１つまたは複数の技法によって処理して、配列の表示を濃縮および／またはサブトラクションおよび／または正規化することができる。これにより、最大の目的の情報が、個々のメンバーの豊富さが多数の桁にわたって最初に変動し得る非常に大きなライブラリーから、はるかに効率的に、迅速に、かつ大きな費用効果で抽出される。重要なことに、ライブラリー表示を操作するためのこれらの核酸に基づく技法は、より慣習的な方法と直交性のものであり、それらと組み合わせて使用することができる。例えば、アルブミンなどの、一般的な、非常に豊富なタンパク質を、望ましくないタンパク質の全てではないが大多数を除去することができるタンパク質に基づく方法を使用してサブトラクションすることができる。その後、伸長記録タグライブラリーのアルブミン特異的メンバーもサブトラクションし、したがって、より徹底的な全体的サブトラクションを実現することができる。
一態様では、本開示は、ＤＮＡ記録タグで標識されたペプチドの大きな集団（例えば、数百万〜数十億）からの配列決定を可能にする、エドマン様分解手法を使用した、ペプチド配列決定のための高度に並行化された手法を提供する。これらの記録タグで標識されたペプチドは、タンパク質試料のタンパク質分解による消化または限定された加水分解に由来するものであり、記録タグで標識されたペプチドは、配列決定基板（例えば、多孔質ビーズ）に、基板上の適切な分子間間隔でランダムに固定化される。ＮＴＡＡ切断反応を触媒するまたは動員する、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、スルホニル ニトロフェノール（ＳＮＰ）、ダンシル、７−メトキシクマリン、アセチル、またはグアニジニルなどの小さな化学的部分を用いたペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）残基の修飾により、エドマン様分解プロセスの周期的制御が可能になる。修飾用化学的部分により、同類のＮＴＡＡ結合性物質に対する結合親和性の増強をもたらすこともできる。各固定化されたペプチドの修飾されたＮＴＡＡを、コーディングタグを含む同類のＮＴＡＡ結合性物質の結合、および、コーディングタグ情報（例えば、結合性物質に関する識別情報をもたらすエンコーダー配列）のコーディングタグからペプチドの記録タグへの移行（例えば、プライマー伸長またはライゲーション）によって識別する。その後、修飾されたＮＴＡＡを化学的方法または酵素的手段によって除去する。ある特定の実施形態では、修飾されたＮＴＡＡの除去を触媒させるために酵素（例えば、エドマナーゼ）を工学的に操作する。他の実施形態では、アミノペプチダーゼまたはアシルペプチドヒドロラーゼなどの天然に存在するエキソペプチダーゼを、適切な化学修飾の存在下でのみ末端アミノ酸を切断するように工学的に操作することができる。
ＩＩ．定義
以下の説明では、種々の実施形態の詳細な理解をもたらすために、ある特定の具体的詳細を記載する。しかし、これらの詳細を伴わずに本化合物を作製および使用できることが当業者には理解されよう。他の場合では、実施形態の説明が不必要に不明瞭になるのを回避するために、周知の構造は詳細に示されていないまたは記載されていない。文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書およびそれが従う特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、制限のない、包括的な意味で、すなわち、「含むが、これだけに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきである。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連する用語）は、他のある特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載の任意の組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｔｅｒ）、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、方法、またはプロセスなどのある実施形態が、記載されている特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ものであり得ることを排除するものではない。本明細書で提示される表題は単に便宜上のものであり、特許請求された実施形態の範囲または意味であるとは解釈されない。
本明細書全体を通して、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、当該実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して各所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で組み合わせて１つまたは複数の実施形態にすることができる。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「１つのペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つもしくは複数のペプチド、またはペプチドの混合物を含む。また、特に明記されていないまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的であり、「または（ｏｒ）」と「および（ａｎｄ）」の両方を包含するものと理解される。
本明細書で使用される場合、「巨大分子」という用語は、より小さなサブユニットで構成される大きな分子を包含する。巨大分子の例としては、これだけに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、大環状分子が挙げられる。巨大分子は、共有結合により連結した２つまたはそれよりも多くの型の巨大分子の組合せで構成されるキメラ巨大分子（例えば、核酸と連結したペプチド）も含む。巨大分子は、２つまたはそれよりも多くの巨大分子の非共有結合性の複合体で構成される「巨大分子集合体」も含み得る。巨大分子集合体は、同じ型の巨大分子で構成されるもの（例えば、タンパク質−タンパク質）であってもよく、２つまたはそれよりも多くの異なる型の巨大分子で構成されるもの（例えば、タンパク質−ＤＮＡ）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチドおよびタンパク質を包含し、ペプチド結合によって接合した２つまたはそれよりも多くのアミノ酸の鎖を含む分子を指す。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドは、２〜５０個のアミノ酸を含み、例えば、２０〜３０個よりも多くのアミノ酸を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、二次、三次、またはより高次の構造を含まない。一部の実施形態では、タンパク質は、３０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含み、例えば、５０個よりも多くのアミノ酸を有する。一部の実施形態では、一次構造に加えて、タンパク質は、二次、三次、またはより高次の構造を含む。ポリペプチドのアミノ酸は、最も典型的にはＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、修飾されたアミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、またはこれらの任意の組合せであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよく、合成的に作製されたものであってもよく、組換えによって発現させたものであってもよい。ポリペプチドは、アミノ酸の鎖を修飾する追加的な基、例えば、翻訳後修飾によって付加された官能基も含んでよい。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、また、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾も包含する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、ペプチドの単量体サブユニットとして機能する、アミン基、カルボン酸基、および各アミノ酸に特異的な側鎖を含む有機化合物を指す。アミノ酸は、２０種の標準の天然に存在するまたは正規のアミノ酸ならびに非標準アミノ酸を含む。標準の天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であってもＤ−アミノ酸であってもよい。非標準アミノ酸は、天然に存在するまたは化学的に合成された修飾されたアミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、非標準タンパク質新生性アミノ酸、または非タンパク質新生性アミノ酸であり得る。非標準アミノ酸の例としては、これだけに限定されないが、セレノシステイン、ピロリジン、およびＮ−ホルミルメチオニン、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」という用語は、リボソームによるペプチドの翻訳が完了した後に当該ペプチド上で生じる修飾を指す。翻訳後修飾は、共有結合性修飾または酵素的修飾であり得る。翻訳後修飾の例としては、これだけに限定されないが、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、エリミニル化、フラビン付着、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ハイプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質付加、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、プロピオニル化、レチニリデンシッフ塩基形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、セレン化、サクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられる。翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の修飾を含む。末端アミノ基の修飾としては、これだけに限定されないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端カルボキシ基の修飾としては、これだけに限定されないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾（例えば、低級アルキルはＣ１〜Ｃ４アルキルである）が挙げられる。翻訳後修飾は、例えば、これだけに限定されないが、アミノ末端とカルボキシ末端の間にあるアミノ酸、上記のものなどの修飾も含む。翻訳後修飾という用語は、１つまたは複数の検出可能な標識を含むペプチド修飾も含み得る。
本明細書で使用される場合、「結合性物質」という用語は、分析物、例えば、巨大分子または巨大分子の成分もしくは特徴に結合する、結び付く、それと合体する、それを認識する、またはそれと組み合わさる核酸分子、ペプチドまたはペプチドの模倣物、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、または小分子を指す。結合性物質は、分析物、例えば、巨大分子または巨大分子の成分もしくは特徴と共有結合性の結び付きまたは非共有結合性の結び付きを形成し得る。結合性物質はまた、核酸分子−ペプチドキメラ結合性物質または炭水化物−ペプチドキメラ結合性物質などの、２つまたはそれよりも多くの型の分子で構成されるキメラ結合性物質であってもよい。結合性物質は、天然に存在する分子であってもよく、合成的に作製された分子であってもよく、組換えによって発現させた分子であってもよい。結合性物質は、巨大分子の単一の単量体もしくはサブユニット（例えば、ペプチドの単一のアミノ酸）に結合し得る、または巨大分子の複数の連結したサブユニット（例えば、より長いペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質分子のジ−ペプチド、トリ−ペプチド、もしくはより高次のペプチド）に結合し得る。結合性物質は、直鎖状分子または三次元構造（コンフォメーションとも称される）を有する分子に結合し得る。例えば、抗体結合性物質は、直鎖ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に結合し得る、または、コンフォメーションペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に結合し得る。結合性物質は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質分子のＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または介在するペプチドに結合し得る。結合性物質は、ペプチド分子のＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、または介在するアミノ酸に結合し得る。例えば、結合性物質は、化学修飾されたまたは標識されたアミノ酸に、修飾されていないまたは標識されていないアミノ酸よりも優先して結合し得る。例えば、結合性物質は、アセチル部分、グアニル部分、ダンシル部分、ＰＴＣ部分、ＤＮＰ部分、ＳＮＰ部分などで修飾されたアミノ酸に、前記部分を保有しないアミノ酸よりも優先して結合し得る。結合性物質は、ポリペプチド分子の翻訳後修飾に結合し得る。結合性物質は、巨大分子などの分析物の成分または特徴への選択的結合を示し得る（例えば、結合性物質は、２０種の可能性のある天然のアミノ酸残基の１種に選択的に結合し得、他の１９種の天然のアミノ酸残基には非常に低い親和性で結合するまたは全く結合しない）。結合性物質は、結合性物質が巨大分子などの分析物の複数の成分または特徴に結合することが可能な場合、より低い選択的結合を示し得る（例えば、結合性物質は、２つまたはそれよりも多くの異なるアミノ酸残基に同様の親和性で結合し得る）。結合性物質は、コーディングタグを含み、これは、リンカーによって結合性物質に接合されていてよい。
一部の実施形態では、「小分子」という用語は、複数の反復単位で構成されているポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、または合成ポリマーではない、分子量が約２ｋＤａ未満の有機金属化合物を含めた有機化合物を指す。
一部の実施形態では、「ペプチド模倣物」という用語は、ペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様鎖を含む。一部の実施形態では、ペプチド模倣物は、既存のペプチド（例えば、環状ペプチドなど）を修飾することから、またはペプトイドおよびβ−ペプチドなどの、ペプチドを模倣する同様の系を設計することによるのいずれかによって生じさせることができる。一部の実施形態では、変更された化学構造は、安定性または生物学的活性などの分子の性質が有利に調整されるように設計されている。これには、既存のペプチドからの薬物様化合物の開発における役割があり得る。一部の実施形態では、これらの修飾は、天然には生じないペプチドへの変化（例えば、骨格の変更および非天然アミノ酸の組み入れ）を伴う。ペプチド模倣物は、それらの前駆体ペプチドとの類似性に基づいて、４つのクラス（Ａ〜Ｄ）に群分けすることができ、Ａが最も高い類似性を特徴とし、Ｄが最も低い類似性を特徴とする。クラスＡおよびＢはペプチド様足場を含む、クラスＣおよびＤは小分子を含む。
一部の実施形態では、「ペプトイド」という用語は、側鎖がペプチド骨格のα炭素（アミノ酸における場合）ではなく窒素原子に付属しているペプチド模倣物のクラスであるポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、「β−ペプチド」という用語は、β−アラニン（天然に存在するβアミノ酸であり、アミノ基がα炭素ではなくβ炭素に結合している）などのβアミノ酸を含む。β−ペプチドは、より大きな生物活性分子の成分として使用されるが、一般に、天然には出現しないことだけがよく知られている。
一部の実施形態では、「作用物質」および「試薬」という用語は、互換的に使用される。例えば、結合性物質は作用物質と称されるが、そのコーディングタグは、情報を移行させるために、記録タグ上のスペーサー配列または反応性末端と反応する反応性部分、例えば、スペーサー配列または反応性末端を有し得る。反応は、ライゲーションおよび／またはアニーリング、その後のプライマー伸長を含み得る。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの分子を接合するために使用されるヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、または非ヌクレオチド化学的部分の１つまたは複数を指す。リンカーは、結合性物質とコーディングタグ、記録タグと巨大分子（例えば、ペプチド）、巨大分子と固体支持体、記録タグと固体支持体などを接合させるために使用することができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、２つの分子を酵素反応または化学反応（例えば、クリックケミストリー）によって接合させる。
本明細書で使用される場合、「プロテオミクス」という用語は、プロテオーム、例えば、細胞（複数可）、組織（複数可）、および体液（複数可）内のプロテオーム、ならびに対応する細胞内および組織内のプロテオームの空間的分布の分析（例えば、定量的分析）を指す。さらに、プロテオミクス試験は、生物学および定義された生物学的または化学的刺激に応じて継続的に時間変化するプロテオームの動的状態を含む。
本明細書で使用される場合、「プロテオーム」という用語は、ある特定の時間に、任意の生物体の標的、例えば、ゲノム、細胞、組織、または生物体によって発現されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの全セット（そのコンジュゲートまたは複合体を含む）を含み得る。一態様では、プロテオームは、所与の細胞型または生物体において、所与の時間に規程された条件下で発現されるタンパク質のセットである。プロテオミクスは、プロテオームに関する試験である。例えば、「細胞プロテオーム」は、ホルモン刺激への曝露などの特定の環境条件のセットの下で特定の細胞型において見出されるタンパク質の集合を含み得る。生物体の完全なプロテオームは、種々の細胞プロテオームの全てからのタンパク質の完全なセットを含み得る。プロテオームは、ある特定の細胞内生物系におけるタンパク質の集合も含み得る。例えば、ウイルスにおけるタンパク質の全てをウイルスプロテオームと称することができる。本明細書で使用される場合、「プロテオーム」という用語は、これだけに限定されないが、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／またはニトロシル化）によって規程されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（または脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含めたプロテオームのサブセットを含む。
本明細書で使用される場合、「非同類結合性物質」という用語は、特定の結合サイクル反応において調査される巨大分子の特徴、成分、またはサブユニットに、対応する巨大分子の特徴、成分、またはサブユニットに高親和性で結合する「同類結合性物質」と比較して、結合することができないまたは低親和性で結合する結合性物質を指す。例えば、ペプチド分子のチロシン残基を結合反応において調査する場合、非同類結合性物質は、チロシン残基に低親和性で結合するまたは全く結合しないものであり、したがって、非同類結合性物質では、コーディングタグ情報を同類結合性物質から記録タグに移行させるために適した条件下でコーディングタグ情報が記録タグに効率的に移行されない。あるいは、ペプチド分子のチロシン残基を結合反応において調査する場合、非同類結合性物質は、チロシン残基に低親和性で結合するまたは全く結合しないものであり、したがって、伸長記録タグではなく伸長コーディングタグを伴う実施形態に適した条件下で、記録タグ情報がコーディングタグに効率的に移行されない。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、結合物質、例えば、抗体、ＣｌｐＳタンパク質、またはアンチカリンの、ポリペプチド抗原などの標的に優先的に結合するような特異性を指す。結合パートナー、例えば、タンパク質、核酸、抗体または他の親和性捕捉剤などについて言及する場合、「特異的結合」は、指定のアッセイ条件下での選択的ハイブリダイゼーションを確実にするための２つまたはそれよりも多くの結合パートナーとの高親和性および／または相補性での結合反応を含み得る。一般には、特異的結合は、バックグラウンドシグナルの少なくとも３倍の標準偏差になる。したがって、指定の条件下で、結合パートナーは、その特定の標的分子に結合し、試料中に存在する他の分子には顕著な量では結合しない。他の潜在的な干渉物質の存在下で結合物質または抗体によって特定の標的が認識されることが、そのような結合の１つの特性である。例えば、標的に特異的であるまたは特異的に結合する結合物質、抗体または抗体断片は、標的に、他の非標的物質への結合よりも高い親和性で結合する。例えば、標的に特異的であるまたは特異的に結合する結合物質、抗体または抗体断片は、有意なパーセンテージの非標的物質、例えば、試験試料中に存在する非標的物質への結合を回避する。一部の実施形態では、本開示の結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質の約９０％よりも多くの結合を回避するが、より高いパーセンテージが明白に企図されており、好ましい。例えば、本開示の結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質の約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および約９９％またはそれよりも多くの結合を回避する。他の実施形態では、本開示の結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、もしくは７０％よりも多く、または約７５％よりも多く、または約８０％よりも多く、または約８５％よりも多くの結合を回避する。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドバリアント、変異体、ホモログ、または改変バージョンは、参照ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドと、核酸またはアミノ酸配列同一性、例えば、約１０％の配列同一性、約１５％の配列同一性、約２０％の配列同一性、約２５％の配列同一性、約３０％の配列同一性、約３５％の配列同一性、約４０％の配列同一性、約４５％の配列同一性、約５０％の配列同一性、約５５％の配列同一性、約６０％の配列同一性、約６５％の配列同一性、約７０％の配列同一性、約７５％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性、または約１００％の配列同一性を共有するタンパク質またはポリペプチドを含む。
参照ポリヌクレオチド配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、最大のパーセント配列同一性を実現するために必要であればギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリヌクレオチド配列内の核酸残基と同一である、候補配列内の核酸残基のパーセンテージと定義される。参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、最大のパーセント配列同一性を実現するために必要であればギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性および／またはパーセント核酸配列を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内である種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含めた配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定することができる。
例えば、本明細書に開示されているＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドは、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＣｌｐＳ２（例えば、配列番号１９８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｌｐＳ（例えば、配列番号１９９）、および／またはＣ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ＣｌｐＳ（例えば、配列番号２００）などの参照ＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドと配列同一性を、約１０％の配列同一性、約１５％の配列同一性、約２０％の配列同一性、約２５％の配列同一性、約３０％の配列同一性、約３５％の配列同一性、約４０％の配列同一性、約４５％の配列同一性、約５０％の配列同一性、約５５％の配列同一性、約６０％の配列同一性、約６５％の配列同一性、約７０％の配列同一性、約７５％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性、または約１００％の配列同一性で共有するバリアント、変異体、ホモログ、または改変バージョンを含む。
遊離のアミノ基を有する、ペプチド鎖の一方の末端の末端アミノ酸は、本明細書では、「Ｎ末端アミノ酸」（ＮＴＡＡ）と称される。遊離のカルボキシル基を有する、鎖の他方の末端の末端アミノ酸は、本明細書では、「Ｃ末端アミノ酸」（ＣＴＡＡ）と称される。ペプチドを構成するアミノ酸には、順番に番号を付すことができ、ペプチドは「ｎ」アミノ酸長になる。本明細書で使用される場合、ＮＴＡＡは、ｎ番目のアミノ酸と考えられる（本明細書では「ｎ番目のＮＴＡＡ」とも称される）。この命名法を使用すると、Ｎ末端からＣ末端までのペプチドの長さを下方に次のアミノ酸は（ｎ−１）番目のアミノ酸、次いで（ｎ−２）番目のアミノ酸などである。ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、またはその両方を化学的部分で修飾または標識することができる。
本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）、結合性物質、結合サイクルからの結合性物質のセット、試料巨大分子、試料のセット、コンパートメント（例えば、液滴、ビーズ、または分離された位置）内の巨大分子、コンパートメントのセット内の巨大分子、巨大分子の画分、巨大分子画分のセット、空間的領域もしくは空間的領域のセット、巨大分子のライブラリー、または結合性物質のライブラリーについての一意の識別子タグまたは起源情報をもたらす約２〜約３０塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基）の核酸分子を指す。バーコードは、人工的な配列であっても天然に存在する配列であってもよい。ある特定の実施形態では、バーコードの集団内の各バーコードは異なるものである。他の実施形態では、バーコードの集団内のバーコードの一部が異なる、例えば、バーコードの集団内のバーコードの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が異なる。バーコードの集団は、ランダムに生成することもでき、非ランダムに生成することもできる。ある特定の実施形態では、バーコードの集団は、エラー訂正バーコードである。バーコードは、多重化された配列決定データをコンピュータによりデコンボリューションし、個々の巨大分子、試料、ライブラリーなどに由来する配列読み取りを識別するために使用することができる。バーコードはまた、マッピングを増強するための小さなコンパートメント中に分布させた巨大分子の集合のデコンボリューションのために使用することもできる。例えば、ペプチドをプロテオームにマッピングし戻すのではなく、ペプチドをその起源であるタンパク質分子またはタンパク質複合体にマッピングし戻す。
「試料バーコード」は、「試料タグ」とも称され、巨大分子がいずれの試料に由来するかを識別するものである。
「空間バーコード」は、巨大分子が２Ｄまたは３Ｄ組織切片のいずれの領域に由来するかを識別するものである。空間バーコードは、組織切片に関する分子病理学のために使用することができる。空間バーコードにより、組織切片（複数可）由来の複数の試料またはライブラリーのマルチプレックス配列決定が可能になる。
本明細書で使用される場合、「コーディングタグ」という用語は、それに付随する結合性物質に関する識別情報を含む、任意の適切な長さのポリヌクレオチド、例えば、２および１００ならびにその間のあらゆる整数を含めて約２塩基〜約１００塩基の核酸分子を指す。「コーディングタグ」は、「配列決定可能なポリマー」で作られたものであってもよい（例えば、それぞれ、その全体が参照により組み込まれるNiu et al., 2013、Nat. Chem. 5: 282-292；Roy et al., 2015, Nat.Commun. 6: 7237； Lutz, 2015, Macromolecules 48: 4759-4767を参照されたい）。コーディングタグは、必要に応じて片側に１つのスペーサーが隣接するまたは両側にスペーサーが隣接するエンコーダー配列（例えば、バーコード識別子）を含んでよい。コーディングタグはまた、必要に応じたＵＭＩおよび／または必要に応じた結合サイクル特異的バーコードで構成されていてもよい。コーディングタグは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖コーディングタグは、平滑末端、突出末端、またはその両方を含んでよい。コーディングタグとは、結合性物質、結合性物質に直接付着したコーディングタグとハイブリダイズした相補配列（例えば、二本鎖コーディングタグに関して）、または伸長記録タグに存在するコーディングタグ情報に直接付着したコーディングタグを指し得る。ある特定の実施形態では、コーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサーまたはバーコード、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含んでよい。
本明細書で使用される場合、「エンコーダー配列」または「エンコーダーバーコード」という用語は、それに付随する結合性物質に関する識別情報をもたらす、約２塩基〜約３０塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基）の長さの核酸分子を指す。エンコーダー配列は、それに付随する結合性物質を一意的に識別することができるものである。ある特定の実施形態では、エンコーダー配列により、それに付随する結合性物質および結合性物質が使用される結合サイクルに関する識別情報がもたらされる。他の実施形態では、エンコーダー配列をコーディングタグ内の別の結合サイクル特異的バーコードと組み合わせる。あるいは、エンコーダー配列により、それに付随する結合性物質を２種またはそれよりも多くの異なる結合性物質のセットのメンバーに属するものと識別することができる。一部の実施形態では、解析のためにはこの識別のレベルで十分である。例えば、アミノ酸に結合する結合性物質を伴う一部の実施形態では、ペプチドの特定の位置におけるアミノ酸残基を決定的に識別するのではなく、ペプチドがその位置において２つの可能性のあるアミノ酸の１つを含むことを知ることで十分であり得る。別の例では、タンパク質標的の１種よりも多くのエピトープを認識し、様々な特異性を有する抗体の混合物を含むポリクローナル抗体に共通のエンコーダー配列を使用する。他の実施形態では、エンコーダー配列により可能性のある結合性物質のセットが識別される場合、逐次的な脱コーディング手法を使用して、各結合性物質の一意の識別をもたらすことができる。これは、繰り返される結合のサイクルにおいて所与の結合性物質に対するエンコーダー配列を変動させることによって実現される（Gunderson et al., 2004, Genome Res. 14: 870-7を参照されたい）。各結合サイクルからのコーディングタグ情報を部分的に識別することにより、他のサイクルからのコーディング情報と組み合わせると、結合性物質についての一意の識別子がもたらされ、例えば、個々のコーディングタグ（またはエンコーダー配列）ではなく、コーディングタグの特定の組合せにより、結合性物質に関する一意的識別情報がもたらされる。例えば、結合性物質のライブラリー内のエンコーダー配列は同じまたは同様の数の塩基を有する。
本明細書で使用される場合、「結合サイクル特異的タグ」、「結合サイクル特異的バーコード」、または「結合サイクル特異的配列」という用語は、特定の結合サイクル内で使用される結合性物質のライブラリーを識別するために使用される一意の配列を指す。結合サイクル特異的タグは、約２塩基〜約８塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、または８塩基）の長さを含み得る。結合サイクル特異的タグは、結合性物質のコーディングタグ内に、スペーサー配列の一部として、エンコーダー配列の一部として、ＵＭＩの一部として、またコーディングタグ内の別の成分として組み入れることができる。
本明細書で使用される場合、「スペーサー」（Ｓｐ）という用語は、記録タグまたはコーディングタグの末端に存在する約０塩基〜約２０塩基（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０塩基）の長さの核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、スペーサー配列は、一方の末端または両方の末端におけるコーディングタグのエンコーダー配列に隣接する。結合性物質の巨大分子への結合後、それらに付随するコーディングタグおよび記録タグ上の相補的なスペーサー配列間のアニーリングにより、それぞれ、結合情報の、プライマー伸長反応またはライゲーションによる記録タグ、コーディングタグ、またはジタグ構築物への移行が可能になる。Ｓｐ’は、Ｓｐに相補的なスペーサー配列を指す。例えば、結合性物質のライブラリー内のスペーサー配列は、同じ数の塩基を有する。共通する（共有されるまたは同一の）スペーサーを結合性物質のライブラリーにおいて使用することができる。スペーサー配列は、特定の結合サイクルにおいて使用される結合性物質を追跡するために、「サイクル特異的」配列を有してよい。スペーサー配列（Ｓｐ）は、結合サイクル全てにわたって一定のものであってもよく、特定のクラスの巨大分子に特異的なものであってもよく、結合サイクル数に特異的なものであってもよい。巨大分子クラス特異的スペーサーにより、完了した結合／伸長サイクルからの同類結合性物質の伸長記録タグに存在するコーディングタグ情報が、その後の結合サイクルにおいて同じクラスの巨大分子を認識する別の結合性物質のコーディングタグとクラス特異的スペーサーを介してアニーリングすることが可能になる。正確な同類の対の逐次的な結合によってのみ、相互作用するスペーサーエレメントおよび有効なプライマー伸長がもたらされる。スペーサー配列は、記録タグ内の相補的なスペーサー配列とアニーリングしてプライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも称される）反応を開始させる、またはライゲーション反応のための「副子」をもたらす、または「粘着末端」ライゲーション反応を媒介するために十分な数の塩基を含み得る。スペーサー配列は、コーディングタグ内のエンコーダー配列よりも少ない数の塩基を含み得る。
本明細書で使用される場合、「記録タグ」という用語は、それにコーディングタグの識別情報を移行することができる、またはそこから記録タグに付随する巨大分子に関する識別情報（例えば、ＵＭＩ情報）をコーディングタグに移行することができる部分、例えば、化学的カップリング部分、核酸分子、または配列決定可能なポリマー分子を指す（例えば、それぞれ、その全体が参照により組み込まれるNiu et al., 2013、Nat. Chem. 5: 282-292；Roy et al., 2015、Nat. Commun.6: 7237； Lutz, 2015, Macromolecules 48: 4759-4767を参照されたい）。識別情報は、分子が由来する試料、画分、分配、空間的位置、相互作用、近隣の分子（複数可）、サイクル数などに関する情報などの、分子を特徴付ける任意の情報を含み得る。さらに、ＵＭＩ情報の存在も識別情報に分類することができる。ある特定の実施形態では、結合性物質がポリペプチドに結合した後、結合性物質がポリペプチドに結合している間に、結合性物質と連結しているコーディングタグからの情報をポリペプチドに付随する記録タグに移行させることができる。他の実施形態では、結合性物質がポリペプチドに結合した後、結合性物質がポリペプチドに結合している間に、ポリペプチドに付随する記録タグからの情報を結合性物質と連結しているコーディングタグに移行させることができる。記録タグは、ポリペプチドに直接連結していてもよく、ポリペプチドに多機能性リンカーを介して連結していてもよく、固体支持体において近傍にある（または共局在する）ことによってポリペプチドに付随していてもよい。記録タグは、連結がコーディングタグ情報を記録タグに移行させるまたはその逆のために使用される方法に適合するものである限りは、５’末端または３’末端に連結していてもよく、内部の部位に連結していてもよい。記録タグは、他の機能的成分、例えば、ユニバーサルプライミング部位、一意の分子識別子、バーコード（例えば、試料バーコード、画分バーコード、空間バーコード、コンパートメントタグなど）、コーディングタグのスペーサー配列と相補的なスペーサー配列、またはこれらの任意の組合せをさらに含んでよい。コーディングタグ情報を記録タグに移行させるためにポリメラーゼ伸長を使用する実施形態では、記録タグのスペーサー配列は、記録タグの３’末端にあることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「プライマー伸長」という用語は、「ポリメラーゼ伸長」とも称され、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって触媒される反応であって、相補鎖とアニーリングする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー、スペーサー配列）を、相補鎖を鋳型として使用してポリメラーゼによって伸長させる反応を指す。
本明細書で使用される場合、「一意の分子識別子」または「ＵＭＩ」という用語は、ＵＭＩが連結された各巨大分子（例えば、ペプチド）または結合性物質についての一意の識別子タグをもたらす、約３〜約４０塩基（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０塩基の長さの核酸分子を指す。巨大分子ＵＭＩは、複数の伸長記録タグからの配列決定データをコンピュータによりデコンボリューションして個々の巨大分子を起源とする伸長記録タグを識別するために使用することができる。結合性物質ＵＭＩは、特定の巨大分子に結合する個々の結合性物質それぞれを識別するために使用することができる。例えば、ＵＭＩを使用して、特定のペプチド分子に存在する単一のアミノ酸に特異的な結合性物質についての個々の結合事象の数を識別することができる。結合性物質または巨大分子に関してＵＭＩおよびバーコードの両方に言及される場合、バーコードは、個々の結合性物質または巨大分子についてのＵＭＩ以外の識別情報（例えば、試料バーコード、コンパートメントバーコード、結合サイクルバーコード）を指すことが理解される。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」または「ユニバーサルプライミング配列」という用語は、ライブラリー増幅のためおよび／または配列決定反応のために使用することができる核酸分子を指す。ユニバーサルプライミング部位としては、これだけに限定されないが、ＰＣＲ増幅のためのプライミング部位（プライマー配列）、一部の次世代シーケンシングプラットフォームにおいてブリッジ増幅を可能にする、フローセル表面上の相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングするフローセルアダプター配列、配列決定プライミング部位、またはこれらの組合せを挙げることができる。ユニバーサルプライミング部位は、次世代デジタルシーケンシングと併せて一般に使用されるものを含めた他の型の増幅のために使用することができる。例えば、伸長記録タグ分子を環状化し、ローリングサークル増幅にユニバーサルプライミング部位を使用して、配列決定鋳型として使用することができるＤＮＡナノボールを形成することができる（Drmanac et al., 2009、Science 327: 78-81）。あるいは、記録タグ分子を環状化し、ユニバーサルプライミング部位からのポリメラーゼ伸長によって直接配列決定することができる（Korlachet al., 2008、Proc. Natl. Acad. Sci. 105: 1176-1181）。「フォワード」という用語は、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」に関連して使用される場合、「５’」または「センス」と称される場合もある。「リバース」という用語は、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」に関連して使用される場合、「３’」または「アンチセンス」と称される場合もある。
本明細書で使用される場合、「伸長記録タグ」という用語は、結合性物質が分析物、例えば、巨大分子に結合した後に少なくとも１つの結合性物質のコーディングタグ（またはその相補配列）の情報が移行された記録タグを指す。コーディングタグの情報は、記録タグに直接移行させることもでき（例えば、ライゲーション）、間接的に移行させることもできる（例えば、プライマー伸長）。コーディングタグの情報は、記録タグに酵素的に移行させることもでき、化学的に移行させることもできる。伸長記録タグは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００またはそれよりも多くのコーディングタグの結合性物質情報を含み得る。伸長記録タグの塩基配列は、それらのコーディングタグによって識別される結合性物質の結合の時間的および逐次的順序を反映する場合もあり、コーディングタグによって識別される結合性物質の結合の部分的な逐次的順序を反映する場合もあり、コーディングタグによって識別される結合性物質の結合のいかなる順序も反映しない場合もある。ある特定の実施形態では、伸長記録タグ中に存在するコーディングタグ情報は、解析される巨大分子配列を少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性で表す。解析される巨大分子配列が伸長記録タグによって１００％の同一性で表されないある特定の実施形態では、エラーは、結合性物質によるオフターゲットの結合、または「飛ばされた」結合サイクル（例えば、結合サイクル中に結合性物質が巨大分子に結合できないことが原因で、プライマー伸長反応の失敗が原因で）、またはその両方に起因する可能性がある。
本明細書で使用される場合、「伸長コーディングタグ」という用語は、コーディングタグが接合している結合性物質の、記録タグが付随している巨大分子への結合後に少なくとも１つの記録タグ（またはその相補配列）の情報が移行されたコーディングタグを指す。記録タグの情報は、コーディングタグに直接移行させることもでき（例えば、ライゲーション）、間接的に移行させることもできる（例えば、プライマー伸長）。記録タグの情報は、酵素的に移行させることもでき、化学的に移行させることもできる。ある特定の実施形態では、伸長コーディングタグは、１つの結合事象を反映する１つの記録タグの情報を含む。本明細書で使用される場合、「ジタグ」または「ジタグ構築物」または「ジタグ分子」という用語は、コーディングタグが接合している結合性物質の、記録タグが付随している巨大分子への結合後に少なくとも１つの記録タグ（またはその相補配列）の情報および少なくとも１つのコーディングタグ（またはその相補配列）が移行された核酸分子を指す（例えば、図１１Ｂを参照されたい）。記録タグの情報およびコーディングタグは、ジタグに間接的に移行させることができる（例えば、プライマー伸長）。記録タグの情報は、酵素的に移行させることもでき、化学的に移行させることもできる。ある特定の実施形態では、ジタグは、記録タグのＵＭＩ、記録タグのコンパートメントタグ、記録タグのユニバーサルプライミング部位、コーディングタグのＵＭＩ、コーディングタグのエンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコード、コーディングタグのユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」、「固体表面」、または「固体基板」または「基板」という用語は、巨大分子（例えば、ペプチド）を、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用またはこれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手段によって直接または間接的に結び付けることができる、多孔質材料および非多孔質材料を含めた任意の固体材料を指す。固体支持体は、２次元（例えば、平面）であってもよく、３次元（例えば、ゲルマトリックスまたはビーズ）であってもよい。固体支持体は、これだけに限定されないが、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、フローセル、信号変換電子機器を含むバイオチップ、チャネル、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ポリマーマトリックス、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含めた任意の支持体表面であってよい。固体支持体用の材料としては、これだけに限定されないが、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸（polyactic acid）、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、デキストラン、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。固体支持体は、薄膜、膜、ビン、ディッシュ、繊維、織られた繊維、チューブなどの成形ポリマー、粒子、ビーズ、マイクロスフェア、微小粒子、またはこれらの任意の組合せをさらに含む。例えば、固体表面がビーズである場合、ビーズは、これだけに限定されないが、セラミックビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、メチルスチレンビーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズを含み得る。ビーズは、球状であっても不規則な形状であってもよい。ビーズのサイズは、ナノメートル、例えば、１００ｎｍから、ミリメートル、例えば、１ｍｍまでにわたり得る。ある特定の実施形態では、ビーズのサイズは、約０．２ミクロンから約２００ミクロンまで、または約０．５ミクロンから約５ミクロンまでにわたる。一部の実施形態では、ビーズは、直径約１μｍ、約１．５μｍ、約２μｍ、約２．５μｍ、約２．８μｍ、約３μｍ、約３．５μｍ、約４μｍ、約４．５μｍ、約５μｍ、約５．５μｍ、約６μｍ、約６．５μｍ、約７μｍ、約７．５μｍ、約８μｍ、約８．５μｍ、約９μｍ、約９．５μｍ、約１０μｍ、約１０．５μｍ、約１５μｍ、または約２０μｍであり得る。ある特定の実施形態では、「ビーズ（ａ ｂｅａｄ）」固体支持体とは、個々のビーズを指す場合もあり、複数のビーズを指す場合もある。本明細書で使用される場合、「基板」という用語は、機械的機能性であるか、生物学的機能性であるか、光学的機能性であるか、化学的機能性であるかまたは他の機能性であるかにかかわらず、機能性がもたらされるように材料を配置することができる機械的な支持体を含む。基板は、パターンを有さないものであってもパターンを有するものであってもよく、分配されていても分配されていなくてもよい。基板上の分子は、特徴的に配置されていてもよく、基板表面に均一に配置されていてもよい。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、３’−５’リン酸ジエステル結合で連結されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有する一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチド類似体を指す。核酸分子としては、これだけに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチド類似体は、天然のポリヌクレオチドにおいて見出される標準のリン酸ジエステル連結以外の骨格、および必要に応じて、修飾された糖部分またはリボースもしくはデオキシリボース以外の部分を有し得る。ポリヌクレオチド類似体は、標準のポリヌクレオチド塩基とワトソン・クリック塩基対合によって水素結合することが可能な塩基を含有し、類似体骨格は、当該塩基を、そのような水素結合がオリゴヌクレオチド類似体分子と標準のポリヌクレオチド内の塩基との間で配列特異的に可能になるように提示する。ポリヌクレオチド類似体の例としては、これだけに限定されないが、異種核酸（ｘｅｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＸＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、γＰＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルリボシル置換ポリヌクレオチド、ホスホロチオエートポリヌクレオチド、およびボロノホスフェートポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチド類似体は、例えば、７−デアザプリン類似体、８−ハロプリン類似体、５−ハロピリミジン類似体、または、ヒポキサンチン、ニトロアゾール、イソカルボスチリル類似体、アゾールカルボキサミド、および芳香族トリアゾール類似体を含めた、任意の塩基と対合することができるユニバーサル塩基類似体、または、親和性結合のためのビオチン部分などの追加的な機能性を有する塩基類似体を含めたプリンまたはピリミジン類似体を有し得る。
本明細書で使用される場合、「核酸配列決定」とは、核酸分子内または核酸分子の試料中のヌクレオチドの順序を決定することを意味する。
本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」は、数百万〜数十億の分子を並行して配列決定することを可能にするハイスループットな配列決定法を指す。次世代シーケンシング法の例としては、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、およびパイロシーケンシングが挙げられる。プライマーを固体基板および核酸分子に対する相補配列に付着させることにより、核酸分子を固体基板にプライマーを介してハイブリダイズさせることができ、次いで、固体基板上の別個の領域においてポリメラーゼを使用することによって多数のコピーを生成させて、増幅させることができる（これらの群分けは、時にはポリメラーゼコロニーまたはポロニーと称される）。したがって、配列決定プロセス中、特定の位置にあるヌクレオチドについて多数回配列決定することができる（例えば、数百回または数千回）−このカバレッジの深さは、「ディープシーケンシング」と称される。ハイスループットな核酸配列決定技術の例としては、Ｓｅｒｖｉｃｅ（Science 311: 1544-1546、2006）によって概説されている通り、並行のビーズアレイ、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、並行マイクロチップ、および単一分子アレイなどの形式を含めた、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＢＧＩ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、およびＲｏｃｈｅにより提供されるプラットフォームが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「単一分子シーケンシング」または「第３世代シーケンシング」とは、単一分子シーケンシング装置からの読み取りがＤＮＡの単一分子の配列決定によって生成される次世代シーケンシング法を指す。段階的な手法で配列決定するために増幅に依拠して多くのＤＮＡ分子を並行してクローニングする次世代シーケンシング法とは異なり、単一分子シーケンシングでは、ＤＮＡの単一分子を調査し、増幅または同期化の必要はない。単一分子シーケンシングは、各塩基の組み入れ後に配列決定反応を休止する必要のある（「ｗａｓｈ−ａｎｄ−ｓｃａｎ」サイクル）方法、および読み取りステップ間の停止を必要としない方法を含む。単一分子シーケンシング方法の例としては、単一分子リアルタイムシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアに基づく配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、ＤＩ（ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ナノポアシーケンシング、および先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングが挙げられる。
本明細書で使用される場合、分析物、例えば、巨大分子の「解析」とは、分析物または巨大分子の成分の全部または一部を数量化すること、特徴付けること、区別すること、またはこれらの組合せを意味する。例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の解析は、ペプチドのアミノ酸配列（連続したまたは連続していない）の全部または一部を決定することを含む。巨大分子の解析は、巨大分子の成分の部分的な識別も含む。例えば、巨大分子タンパク質配列内のアミノ酸の部分的な識別により、タンパク質のアミノ酸を、可能性のあるアミノ酸のサブセットに属するものと識別することができる。解析は、一般にはｎ番目のＮＴＡＡの解析で開始され、次いで、ペプチドの次のアミノ酸（すなわち、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３など）に進行する。これは、ｎ番目のＮＴＡＡが切断され、それにより、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸がＮ末端アミノ酸（本明細書では、「（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ」と称される）に変わることによって実現される。ペプチドの解析は、ペプチド上の翻訳後修飾の存在および頻度を決定することも含み得、これは、ペプチド上の翻訳後修飾の逐次的順序に関する情報を含む場合もあり、含まない場合もある。ペプチドの解析は、ペプチドにおけるエピトープの存在および頻度を決定することも含み得、これは、ペプチド内のエピトープの逐次的順序または位置に関する情報を含む場合もあり、含まない場合もある。ペプチドの解析は、異なる型の解析を組み合わせること、例えば、エピトープ情報、アミノ酸配列情報、翻訳後修飾情報、またはこれらの任意の組合せを得ることを含み得る。
本明細書で使用される場合、「コンパートメント」という用語は、巨大分子のサブセットを巨大分子の試料から分離または隔離する物理的な領域または容積を指す。例えば、コンパートメントにより、個々の細胞を他の細胞から分離すること、または試料のプロテオームのサブセットを試料の残りのプロテオームから分離することができる。コンパートメントは、水性コンパートメント（例えば、マイクロ流体液滴）、固体コンパートメント（例えば、プレート上のピコタイターウェルまたはマイクロタイターウェル、チューブ、バイアル、ゲルビーズ）、または表面上の分離された領域であってよい。コンパートメントは、巨大分子を固定化することができる１つまたは複数のビーズを含んでよい。
本明細書で使用される場合、「コンパートメントタグ」または「コンパートメントバーコード」という用語は、１つまたは複数のコンパートメント（例えば、マイクロ流体液滴）内の、構成物（例えば、単一の細胞のプロテオーム）に関する識別情報を含む、約４塩基〜約１００塩基（４塩基、１００塩基、およびその間の任意の整数を含む）の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。コンパートメントバーコードにより、複数（例えば、数百万〜数十億）のコンパートメントから同じ物理的コンパートメントまたはコンパートメントの群に分離された試料中の巨大分子のサブセット、例えば、タンパク質試料のサブセットが識別される。したがって、コンパートメントタグを使用して、同じコンパートメントタグを有する１つまたは複数のコンパートメントに由来する構成物と、異なるコンパートメントタグを有する別のコンパートメント内の構成物を、これらの構成物が一緒にプールされた後であっても区別することができる。各コンパートメント内または２つもしくはそれよりも多くのコンパートメントの群内のタンパク質および／またはペプチドを一意のコンパートメントタグで標識することにより、個々のコンパートメントまたはコンパートメントの群内の同じタンパク質、タンパク質複合体、または細胞に由来するペプチドを識別することができる。コンパートメントタグは、必要に応じて片側または両側にスペーサー配列が隣接するバーコード、および必要に応じたユニバーサルプライマーを含む。スペーサー配列は、記録タグのスペーサー配列に相補的なものであってよく、それにより、コンパートメントタグ情報の記録タグへの移行が可能になる。コンパートメントタグは、特に、コンパートメントタグが、本明細書に記載の下流のペプチド解析方法に使用される記録タグを含む実施形態に関しては、ユニバーサルプライミング部位、一意の分子識別子（それに付着したペプチドに関する識別情報をもたらす）、またはその両方も含んでよい。コンパートメントタグは、ペプチドとのカップリングのための機能的部分（例えば、アルデヒド、ＮＨＳ、ｍＴｅｔ、アルキンなど）を含んでよい。あるいは、コンパートメントタグは、コンパートメントタグと目的のペプチドのライゲーションを可能にするためのタンパク質リガーゼの認識配列を含むペプチドを含んでよい。コンパートメントは、単一のコンパートメントタグ、必要に応じたＵＭＩ配列を保存する複数の同一のコンパートメントタグ、または２つもしくはそれよりも多くの異なるコンパートメントタグを含んでよい。ある特定の実施形態では、各コンパートメントは、一意のコンパートメントタグを含む（１対１のマッピング）。他の実施形態では、より大きなコンパートメントの集団からの多数のコンパートメントは、同じコンパートメントタグを含む（多対１のマッピング）。コンパートメントタグは、コンパートメント内の固体支持体（例えば、ビーズ）に接合していてもよく、コンパートメント自体の表面（例えば、ピコタイターウェルの表面）に接合していてもよい。あるいは、コンパートメントタグは、コンパートメント内の溶液中に遊離していてよい。
本明細書で使用される場合、「分配」という用語は、試料内の巨大分子の集団に由来する巨大分子の亜集団への一意のバーコードのランダムな割り当てを指す。ある特定の実施形態では、分配は、巨大分子をコンパートメントに区分することによって実現することができる。分配は、単一のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよく、コンパートメントの集団に由来する多数のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよい。
本明細書で使用される場合、「分配タグ」または「分配バーコード」とは、分配に関する識別情報を含む、約４塩基〜約１００塩基（４塩基、１００塩基、およびその間の任意の整数を含む）の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、巨大分子に関する分配タグは、巨大分子を同じバーコードで標識されたコンパートメント（複数可）に分配することにより生じる同一のコンパートメントタグを指す。
本明細書で使用される場合、「画分」という用語は、サイズ、疎水性、等電点、親和性などによる分画などの物理的または化学的分離方法を使用して残りの試料または細胞小器官から選別された試料内の巨大分子のサブセット（例えば、タンパク質）を指す。分離方法としては、ＨＰＬＣ分離、ゲル分離、アフィニティー分離、細胞分画、細胞小器官分画、組織分画などが挙げられる。流体の流れ、磁性、電流、質量、密度などの物理特性も分離のために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「画分バーコード」という用語は、画分内の巨大分子に関する識別情報を含む、約４塩基〜約１００塩基（４塩基、１００塩基、およびその間の任意の整数を含む）の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、本明細書の「多重化」または「多重アッセイ」という用語は、それぞれが少なくとも１つの異なる検出特性、例えば、蛍光特性（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（ピークの高さの半値全幅）、または蛍光の寿命）または一意の核酸もしくはタンパク質配列特性を有する１つよりも多くの捕捉プローブコンジュゲートを使用することによって多数の標的、例えば、多数の核酸配列の存在および／または量を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の解析方法を含み得る。
ＩＩＩ．巨大分子を含む分析物を解析するための方法およびキット
Ａ．概要
本明細書に記載の方法およびキットは、分析物、例えば、巨大分子を解析するための高度に並行化された手法を提供する。高度に多重化された分析物巨大分子結合アッセイは、次世代シーケンシングによる読み取りのために核酸分子ライブラリーに変換される。本明細書において提示されるキットおよびキット成分は、タンパク質またはペプチド配列決定に特に有用である。
好ましい実施形態では、タンパク質試料を、バーコード（例えば、試料バーコード、コンパートメントバーコード）および必要に応じた一意の分子識別子を含む少なくとも１つの核酸記録タグを用いて単一分子レベルで標識する。タンパク質試料にタンパク質分解による消化を行って、記録タグで標識されたペプチドの集団（例えば、数百万〜数十億）を生成する。これらの記録タグで標識されたペプチドをプールし、固体支持体（例えば、多孔質ビーズ）上にランダムに固定化する。プールされ、固定化され、記録タグで標識されたペプチドを、多数の連続的な結合サイクルに供し、各結合サイクルは、付随する結合性物質を識別するエンコーダー配列を含むコーディングタグで標識された複数の結合性物質（例えば、天然に存在するアミノ酸２０種全てに対する結合性物質）への曝露を含む。各結合サイクル中、結合性物質のペプチドへの結合に関する情報を、結合性物質のコーディングタグ情報を記録タグに移行させること（または記録タグ情報をコーディングタグに移行させることもしくは記録タグ情報およびコーディングタグ情報の両方を別のジタグ構築物に移行させること）によって捕捉する。結合サイクルが完了したら、アッセイされたペプチドの結合履歴を表す伸長記録タグ（または伸長コーディングタグまたはジタグ構築物）のライブラリーを生成し、これを、非常にハイスループットな次世代デジタルシーケンシング法を使用して解析することができる。記録タグに核酸バーコードを使用することにより、例えば、ペプチド配列の起源である試料、細胞、プロテオームのサブセット、またはタンパク質を識別するために、大量のペプチド配列決定データをデコンボリューションすることが可能になる。
一態様では、巨大分子を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した巨大分子および付随するまたは共局在する記録タグを用意するステップと；（ｂ）巨大分子を、巨大分子に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、一次伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）巨大分子を、巨大分子に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）第２のコーディングタグの情報を一次伸長記録タグに移行させて、二次伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）二次伸長タグを解析するステップと（例えば、図２Ａ〜Ｄを参照されたい）を含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が本明細書において提示される。
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質と第２の結合性物質を、別々の結合サイクル反応で巨大分子と接触させる。他の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に、例えば、第１の結合性物質、第２の結合性物質、および必要に応じて追加的な結合性物質を含む単一の結合サイクル反応などで実施する。好ましい実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）は、それぞれ、巨大分子を複数の結合性物質と接触させることを含む。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質であって、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップと；（ｚ）第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析するステップとをさらに含む。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
第３の（またはより高次の）結合性物質を第１の結合性物質および第２の結合性物質とは別の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。一実施形態では、ｎ回目の結合サイクルにおいてｎ番目の結合性物質を分析物（例えば、巨大分子）と接触させ、さらなる伸長記録タグ（ｎ番目の伸長記録タグ）を形成するためにｎ番目のコーディングタグ（ｎ番目の結合性物質のもの）から（ｎ−１）回目の結合サイクルにおいて形成された伸長記録タグに情報を移行させ、ここで、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または約５０、約１００、約１５０、約２００、またはそれよりも大きな整数である。同様に、（ｎ＋１）回目の結合サイクルにおいて（ｎ＋１）番目の結合性物質を分析物と接触させるなどである。
あるいは、第３の（またはより高次の）結合性物質を、第１の結合性物質、および第２の結合性物質と一緒に単一の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。この場合、結合サイクル特異的コーディングタグなどの結合サイクル特異的配列を使用することができる。例えば、コーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサー配列を含んでよく、したがって、ｎ番目のコーディングタグから（ｎ−１）番目の伸長記録タグに情報が移行してｎ番目の伸長記録タグが形成されて初めて、（ｎ＋１）番目の結合性物質（分析物にすでに結合していてもよく結合していなくてもよい）により（ｎ＋１）番目の結合タグの情報がｎ番目の伸長記録タグに移行することができるようになる。
第２の態様では、（ａ）固体支持体に接合した巨大分子、付随する第１の記録タグおよび付随する第２の記録タグを用意するステップと；（ｂ）巨大分子を、巨大分子に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を第１の記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）巨大分子を、巨大分子に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）第２のコーディングタグの情報を第２の記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）第１の伸長記録タグおよび第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が本明細書において提示される。
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質を、別々の結合サイクル反応で巨大分子と接触させる。他の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に、例えば、第１の結合性物質、第２の結合性物質、および必要に応じて追加的な結合性物質を含む単一の結合サイクル反応などで実施する。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、固体支持体に接合した付随する第３の（またはより高次の）記録タグを用意するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質であって、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第３の（またはより高次の）記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップと、（ｚ）第１の伸長記録タグ、第２の伸長記録タグおよび第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析するステップとをさらに含む。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
第３の（またはより高次の）結合性物質を第１の結合性物質および第２の結合性物質とは別の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。あるいは、第３の（またはより高次の）結合性物質を、第１の結合性物質、および第２の結合性物質と一緒に単一の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。
キットのある特定の実施形態では、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および任意のより高次のコーディングタグはそれぞれ、結合サイクル特異的配列を有する。
第３の態様では、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学的部分で修飾して、修飾されたＮＴＡＡを生成するステップと；（ｃ）ペプチドを、修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｄ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；（ｅ）伸長記録タグを解析するステップと（例えば、図３を参照されたい）を含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が本明細書において提示される。
ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）が、ペプチドを、第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質であって、ステップ（ｂ）の修飾されたＮＴＡＡ以外の修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能である第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドの第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。他の実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドの第１の結合性物質との接触と同時に、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質）を含む単一の結合サイクル反応などで行う。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、化学的部分をＮＴＡＡに化学反応または酵素反応を介して付加する。
ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡを修飾するために使用される化学的部分は、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）部分；スルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分、ダンシル部分；７−メトキシクマリン部分；チオアシル部分；チオアセチル部分；アセチル部分；グアニジニル部分；またはチオベンジル部分である。
化学的部分は、化学薬剤を使用してＮＴＡＡに付加することができる。ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡをＰＴＣ部分で修飾するための化学薬剤は、フェニルイソチオシアネートまたはその誘導体である；ＮＴＡＡをＤＮＰ部分で修飾するための化学薬剤は、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）または１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＦＢ）などのハロゲン化アリールである；ＮＴＡＡをスルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分で修飾するための化学薬剤は、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）である；ＮＴＡＡをダンシル基で修飾するための化学薬剤は、ダンシルクロリドなどのスルホニルクロリドである；ＮＴＡＡを７−メトキシクマリン部分で修飾するための化学薬剤は、７−メトキシクマリン酢酸（ＭＣＡ）である；ＮＴＡＡをチオアシル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアシル化試薬である；ＮＴＡＡをチオアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアセチル化試薬である；ＮＴＡＡをアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、アセチル化試薬（例えば、無水酢酸）である；ＮＴＡＡをグアニジニル（アミジニル）部分で修飾するための化学薬剤は、グアニジニル化試薬である、またはＮＴＡＡをチオベンジル部分で修飾するための化学薬剤は、チオベンジル化試薬である。これらの化学的部分および化学薬剤のいずれかを本明細書に開示されているキットの成分として提供することができる。
第４の態様では、本開示は、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学的部分で修飾して、修飾されたＮＴＡＡを生成するステップと；（ｃ）ペプチドを、修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｄ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｅ）修飾されたＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；（ｆ）ペプチドの新しいＮＴＡＡを化学的部分で修飾して、新しく修飾されたＮＴＡＡを生成するステップと；（ｇ）ペプチドを、新しく修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｈ）第２のコーディングタグの情報を第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｉ）第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分を提供する。
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｃ）および（ｇ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｈ）と（ｉ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能である第３の（またはより高次の）結合性物質であって、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップと；（ｚ）第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析するステップとをさらに含む。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、化学的部分をＮＴＡＡに化学反応または酵素反応を介して付加する。
ある特定の実施形態では、化学的部分は、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）部分；スルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分、ダンシル部分；７−メトキシクマリン部分；チオアシル部分；チオアセチル部分；アセチル部分；グアニル部分；またはチオベンジル部分である。
化学的部分は、化学薬剤を使用してＮＴＡＡに付加することができる。ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡをＰＴＣ部分で修飾するための化学薬剤は、フェニルイソチオシアネートまたはその誘導体である；ＮＴＡＡをＤＮＰ部分で修飾するための化学薬剤は、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）または１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＦＢ）などのハロゲン化アリールである；ＮＴＡＡをスルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分で修飾するための化学薬剤は、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）である；ＮＴＡＡをダンシル基で修飾するための化学薬剤は、ダンシルクロリドなどのスルホニルクロリドである；ＮＴＡＡを７−メトキシクマリン部分で修飾するための化学的試薬は、７−メトキシクマリン酢酸（ＭＣＡ）である；ＮＴＡＡをチオアシル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアシル化試薬である；ＮＴＡＡをチオアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアセチル化試薬である；ＮＴＡＡをアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、アセチル化剤（例えば、無水酢酸）である；ＮＴＡＡをグアニル部分で修飾するための化学薬剤は、グアニジニル化試薬である、またはＮＴＡＡをチオベンジル部分で修飾するための化学薬剤は、チオベンジル化試薬である。これらの化学的部分および化学薬剤のいずれかを本明細書に開示されているキットの成分として提供することができる。
第５の態様では、ポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）ペプチドを、ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）が、ペプチドを、第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップであって、第２の（またはより高次の）結合性物質が、ペプチドのＮＴＡＡ以外のＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドの第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。他の実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触をペプチドの第１の結合性物質との接触と同時に、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質を含む単一の結合サイクル反応などで行う。
第６の態様では、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）ペプチドを、ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）ＮＴＡＡを除去して、ペプチドの新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；（ｅ）ペプチドを、新しいＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｆ）第２のコーディングタグの情報を第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｇ）第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）と（ｇ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質であって、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｇ）において第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析する。これらのステップを実施するためのキット成分が提供される。
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｅ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、方法は、複数の巨大分子を並行して解析することを含む。好ましい実施形態では、方法は、複数のペプチドを並行して解析することを含む。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子（またはペプチド）を結合性物質と接触させるステップは、巨大分子（またはペプチド）を複数の結合性物質と接触させることを含む。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであってよい。さらなる実施形態では、ペプチドは、生体試料に由来するタンパク質またはポリペプチドを断片化することによって得ることができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子は、炭水化物、脂質、核酸、もしくは大環状分子であるまたはそれを含んでよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、ＤＮＡ分子、修飾塩基を有するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子（Dragulescu-Andrasi et al., 2006、J. Am. Chem. Soc. 128: 10258-10267）、ＧＮＡ分子、またはこれらの任意の組合せであってよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位を含んでよい。さらなる実施形態では、ユニバーサルプライミング部位は、増幅、ライゲーション、配列決定、またはこれらの組合せのためのプライミング部位を含む。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、一意の分子識別子、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、画分バーコード、スペーサー配列、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、エンコーダー配列、結合サイクル特異的配列、スペーサー配列、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグ内の結合サイクル特異的配列は、結合サイクル特異的スペーサー配列であってよい。
ある特定の実施形態では、結合サイクル特異的配列は、エンコーダー配列とは別のバーコードとしてコードされる。他の実施形態では、エンコーダー配列および結合サイクル特異的配列は、結合性物質に対しておよび各結合サイクルに対して一意である単一のバーコードに記載される。
ある特定の実施形態では、スペーサー配列は、多数の結合サイクルからの結合性物質の間で共有される共通の結合サイクル配列を含む。他の実施形態では、スペーサー配列は、同じ結合サイクルからの結合性物質の間で共有される一意の結合サイクル配列を含む。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、バーコードを含んでよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子および付随する記録タグ（複数可）は、固体支持体に共有結合により接合していてよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、固体支持体は、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、拡張可能なゲルビーズもしくはマトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアであってよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、固体支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズであってよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の巨大分子および付随する記録タグを固体支持体に接合することができる。さらなる実施形態では、固体支持体上で複数の分析物（例えば、巨大分子）の間に平均距離＞５０ｎｍ、＞１００ｎｍ、または＞２００ｎｍの間隔をあける。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質は、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。さらなる実施形態では、結合性物質は、改変もしくはバリアントアミノペプチダーゼ、改変もしくはバリアントアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変もしくはバリアントアンチカリン、または改変もしくはバリアントＣｌｐＳである。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質は、巨大分子に選択的に結合することが可能なものであってよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、ＤＮＡ分子、修飾塩基を有するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＧＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せであってよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質とコーディングタグは、リンカーによって接合されていてよい。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質とコーディングタグは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるZakeri、et al., 2012、Proc Natl Acad Sci U S A 109(12): E690-697；Veggianiet al., 2016、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113: 1202-1207）によって接合されていてよい。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ相互作用は、自発性イソペプチド結合の形成によってそれ自体をしっかりとロックするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のタンパク質ドメインに基づく不可逆的なタンパク質−ペプチド相互作用である。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質とコーディングタグは、ＳｐｙＬｉｇａｓｅ、例えば、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅによって接合されていてよい（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅによりＳｐｙＴａｇとＫＴａｇが接合され、したがって２つの部分が接合される）。ＳｐｙＬｉｇａｓｅは、不可逆的なペプチド−ペプチド相互作用を形成するために２つのペプチドタグを互いとライゲーションするタンパク質ドメインである。その全体が参照によって組み込まれるFierer et al., (2014), "SpyLigase peptide-peptide ligationpolymerizes affibodies to enhance magnetic cancer cell capture," PNAS 111(13): E1176-E1181。
ソルターゼを使用して結合性物質とコーディングタグを接合することもできる。例えば、ソルターゼにより、ＬＰＸＴＧ Ｔａｇ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）をＧＧＧなどのポリＧ部分に選択的に接合させることができる。例えばＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏからの、またはＵＳ９，２６７，１２７ Ｂ２に開示されているソルターゼＡ５を使用することができる。別の例では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｓｏｒｔａｓｅ Ａのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むソルターゼを使用することができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグの情報の記録タグへの移行は、ＤＮＡリガーゼ、例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼなどのリガーゼによって媒介される。一態様では、ライゲーションされる２つの一本鎖ポリヌクレオチドの一方の５’末端をブロッキングして、５’末端におけるライゲーションを防止する。前述の実施形態のいずれかでは、ｓｓＤＮＡリガーゼは、バクテリオファージＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標））もしくはそのバリアント、ホモログ、変異体、もしくは改変バージョンなどのＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、またはＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１もしくはそのバリアント、ホモログ、変異体、もしくは改変バージョンなどの古細菌ＲＮＡリガーゼであってよい。他の態様では、ｓｓＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型ＫＱ、またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｋ２２７ＱなどのＲＮＡリガーゼである。一態様では、ＰＥＧ ４０００などの密集剤を使用することによってライゲーション反応を最適化することができる。ライゲーションされるＤＮＡ末端を相補的ＤＮＡ配列上で互いに隣接してアニーリングする場合には、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼも使用することができる。
あるいは、コーディングタグの情報の記録タグへの移行は、ＤＮＡポリメラーゼまたは化学的ライゲーションによって媒介される。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグを解析するステップは、核酸配列決定を含んでよい。さらなる実施形態では、核酸配列決定は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである。他の実施形態では、核酸配列決定は、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、ナノギャップトンネリングシーケンシング、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグを解析前に増幅させることができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の順序により、結合性物質による巨大分子への結合の順序、したがって、結合性物質によって検出される分析物の配列に関する情報を提供することができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグに含有される特定のコーディングタグ情報（例えば、エンコーダー配列）の頻度により、特定の結合性物質による巨大分子への結合の頻度、したがって、結合性物質によって検出される巨大分子内の分析物の頻度に関する情報を提供することができる。
本明細書に開示されている実施形態のいずれかでは、多数の巨大分子（例えば、タンパク質）試料であって、各試料内の巨大分子の集団が試料特異的バーコードを含む記録タグで標識されている試料をプールすることができる。そのような巨大分子試料のプールを単一の反応チューブ内での結合サイクルに供することができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の巨大分子を表す複数の伸長記録タグを並行して解析することができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の巨大分子を表す複数の伸長記録タグを多重化アッセイで解析することができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の伸長記録タグに対して、解析前に標的濃縮アッセイを行うことができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の伸長記録タグに対して、解析前にサブトラクションアッセイを行うことができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の伸長記録タグに対して、非常に豊富な種を減少させるために解析前に正規化アッセイを行うことができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、ＮＴＡＡを、改変アミノペプチダーゼ、改変アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素、穏やかなエドマン分解、エドマナーゼ酵素、または無水ＴＦＡによって除去することができる。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、少なくとも１つの結合性物質は、末端アミノ酸残基に結合し得る。ある特定の実施形態では、末端アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸である。
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、少なくとも１つの結合性物質は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合し得る。
上述の実施形態の特徴を以下の節でさらに詳細に提示する。
Ｂ．例示的なキットおよび方法
一態様では、（ａ）分析物に直接または間接的に付随するように構成されている記録タグと；（ｂ）（ｉ）分析物に結合することが可能な結合性部分に関する識別情報を含み、結合性部分に直接もしくは間接的に付随して結合性物質を形成するように構成されているコーディングタグ、ならびに／または（ｉｉ）記録タグおよびコーディングタグが、結合性物質と分析物との間の結合時に記録タグおよびコーディングタグとの間の情報の移行を可能にするように構成されている、標識と；必要に応じて（ｃ）結合性部分とを含むキットが本明細書に開示される。
一実施形態では、記録タグおよび／または分析物は、支持体に直接または間接的に固定化されるように構成されている。さらなる実施形態では、記録タグは、支持体に固定化され、それにより、記録タグに付随する分析物が固定化されるように構成されている。別の実施形態では、分析物は、支持体に固定化され、それにより、分析物に付随する記録タグが固定化されるように構成されている。さらに別の実施形態では、記録タグと分析物のそれぞれは、支持体に固定化されるように構成されている。さらに別の実施形態では、記録タグと分析物は、両方が支持体に固定化された時に共局在するように構成されている。一部の実施形態では、記録タグと分析物に結合した結合性物質のコーディングタグとの間の情報の移行のための（ｉ）分析物と（ｉｉ）記録タグとの間の距離は、約１０−６ｎｍ未満、約１０−６ｎｍ、約１０−５ｎｍ、約１０−４ｎｍ、約０．００１ｎｍ、約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約５ｎｍ、または約５ｎｍよりも大きい、または上記の範囲の間の任意の値のものである。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉ）支持体に直接または間接的に固定化され、かつ（ｉｉ）記録タグおよび／または分析物に直接または間接的に付随するように構成されている固定化リンカーをさらに含んでよい。一実施形態では、固定化リンカーは、記録タグおよび分析物に付随するように構成されている。
前述の実施形態のいずれかでは、固定化リンカーは、支持体に直接固定化され、それにより、固定化リンカーに付随する記録タグおよび／または分析物が固定化されるように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、支持体をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、結合性物質と分析物との間の結合時にコーディングタグと記録タグとの間で情報を移行させるための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。一実施形態では、１つまたは複数の試薬は、コーディングタグから記録タグに情報を移行し、それにより、伸長記録タグを生成するように構成されている。別の実施形態では、１つまたは複数の試薬は、記録タグからコーディングタグに情報を移行し、それにより、伸長コーディングタグを生成するように構成されている。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の試薬は、コーディングタグからの情報と記録タグからの情報とを含むジタグ構築物を生成するように構成されている。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、記録タグの少なくとも２つを含んでよい。前述の実施形態のいずれかでは、キットは、それに付随する結合性部分に関する識別情報をそれぞれが含むコーディングタグの少なくとも２つを含んでよい。特定の実施形態では、各分析物は、その分析物に結合した結合性物質が利用可能な複数の記録タグ（例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれよりも多く）を有する。特定の実施形態では、キットは、複数の記録タグ、例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれよりも多くの記録タグを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、結合性物質の少なくとも２つを含んでよい。一実施形態では、キットは、（ｉ）第１の結合性物質と分析物との間の結合時に第１の結合性物質の第１のコーディングタグから記録タグに情報を移行させて、一次伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質と分析物との間の結合時に第２の結合性物質の第２のコーディングタグから一次伸長記録タグに情報を移行させて、二次伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含み、（ｉ）の１つもしくは複数の試薬および（ｉｉ）の１つもしくは複数の試薬は同じであっても異なってもよい。特定の実施形態では、各分析物は、分析物に関する記録タグが利用可能な複数の、例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれよりも多くの結合性物質および／またはコーディングタグを有し、複数の結合性物質は、逐次的にまたは並行して付加させることができる。特定の実施形態では、キットは、複数の、例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれよりも多くの結合性物質および／またはコーディングタグを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから二次伸長記録タグに情報を移行させて、三次（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。一実施形態では、キットは、（ｉ）第１の結合性物質と分析物との間の結合時に第１の結合性物質の第１のコーディングタグから第１の記録タグに情報を移行させて、第１の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、（ｉｉ）第２の結合性物質と分析物との間の結合時に第２の結合性物質の第２のコーディングタグから第２の記録タグに情報を移行させて、第２の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）の１つまたは複数の試薬は同じであっても異なってもよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグは、分析物に直接または間接的に付随するように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグは、支持体に固定化されるように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグは、例えば、第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との間の結合時に第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）コーディングタグと第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）記録タグとの間の情報の移行が可能になるように、それぞれ分析物と共局在するように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および／または第３の（またはより高次の）コーディングタグのそれぞれは、結合サイクル特異的スペーサー配列Ｃｎ、および／またはコーディングタグ特異的スペーサー配列Ｃｎなどの結合サイクル特異的バーコードを含んでよく、ｎは整数であり、Ｃｎはｎ番目の結合性物質とポリペプチドとの間の結合を示す。あるいは、結合サイクルタグＣｎは外因的に付加されてよい、例えば、結合サイクルタグＣｎはコーディングタグ（複数可）に対して外因性であってよい。
前述の実施形態のいずれかでは、分析物は、ポリペプチドを含んでよい。一実施形態では、キットの結合性部分は、ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、官能化試薬の１つまたは複数をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸を（例えば、化学的切断または酵素的切断によって）除去するため、または官能化Ｎ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸（複数可）を除去するための排除試薬をさらに含んでよく、必要に応じて、排除試薬は、カルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；穏やかなエドマン分解試薬；エドマナーゼ酵素；無水ＴＦＡ、塩基；またはこれらの任意の組合せを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸は、（ｉ）Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）；（ｉｉ）Ｎ末端ジペプチド配列；（ｉｉｉ）Ｎ末端トリペプチド配列；（ｉｖ）内部アミノ酸；（ｖ）内部ジペプチド配列；（ｖｉ）内部トリペプチド配列；（ｖｉｉ）Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）；（ｖｉｉｉ）Ｃ末端ジペプチド配列；または（ｉｘ）Ｃ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せを含んでよく、必要に応じて、（ｉ）〜（ｉｘ）内のアミノ酸残基の任意の１つまたは複数は修飾または官能化されている。
別の態様では、少なくとも（ａ）（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）または官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分および（ｉｉ）第１の結合性部分に関する識別情報を含む第１のコーディングタグを含む第１の結合性物質、必要に応じて（ｂ）ポリペプチドに直接または間接的に付随するように構成されている記録タグ、ならびに、さらに必要に応じて（ｃ）ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾して第１の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能な官能化試薬を含むキットであって、記録タグおよび第１の結合性物質が、第１の結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第１のコーディングタグと記録タグとの間の情報の移行が可能になるように構成されている、キットが本明細書に開示される。一実施形態では、キットは、第１のコーディングタグから記録タグに情報を移行させ、それにより、一次伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む。
前述の実施形態のいずれかでは、官能化試薬は、化学薬剤、酵素、および／または生物学的薬剤、例えば、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、第１の官能化ＮＴＡＡを（例えば、化学的切断または酵素的切断によって）除去して、すぐ隣のアミノ酸残基を第２のＮＴＡＡとして露出させるための排除試薬をさらに含んでよい。一実施形態では、第２のＮＴＡＡは、同じまたは異なる官能化試薬によって官能化して第１の官能化ＮＴＡＡと同じであっても異なってもよい第２の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能である。別の実施形態では、キットは、（ｄ）（ｉ）第２の官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第２の（またはより高次の）結合性部分および（ｉｉ）第２の（またはより高次の）結合性部分に関する識別情報を含む第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質をさらに含み、第１のコーディングタグおよび第２の（またはより高次の）コーディングタグは同じであっても異なってもよい。さらに別の実施形態では、第１の官能化ＮＴＡＡおよび第２の官能化ＮＴＡＡは、互いに独立して、官能化Ｎ末端アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで選択される。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、第２の（またはより高次の）コーディングタグから一次伸長記録タグに情報を移行させ、それにより、二次（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
さらなる態様では、少なくとも（ａ）それぞれが（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）もしくは官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な結合性部分および（ｉｉ）結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含む、１つもしくは複数の結合性物質、ならびに／または（ｂ）ポリペプチドに直接もしくは間接的に付随するように構成されている１つもしくは複数の記録タグ、ならびに必要に応じて（ｃ）ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾して第１の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能な官能化試薬を含むキットであって、１つまたは複数の記録タグおよび１つまたは複数の結合性物質が、各結合性物質とポリペプチドとの間の結合時にコーディングタグと記録タグとの間の情報の移行が可能になるように構成されているキットが本明細書に開示される。一実施形態では、キットは、第１の官能化ＮＴＡＡを（例えば、化学的切断または酵素的切断によって）除去して、すぐ隣のアミノ酸残基を第２のＮＴＡＡとして露出させるための排除試薬をさらに含む。別の実施形態では、第２のＮＴＡＡは、同じまたは異なる官能化試薬によって官能化して第１の官能化ＮＴＡＡと同じであっても異なってもよい第２の官能化ＮＴＡＡを生成することが可能である。さらに別の実施形態では、第１の官能化ＮＴＡＡおよび第２の官能化ＮＴＡＡは、互いに独立して、官能化Ｎ末端アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで選択される。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉ）第１の結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第１の結合性物質の第１のコーディングタグから第１の記録タグに情報を移行させて、第１の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第２の結合性物質の第２のコーディングタグから第２の記録タグに情報を移行させて、第２の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含んでよく、（ｉ）の１つもしくは複数の試薬および（ｉｉ）の１つもしくは複数の試薬は同じであっても異なってもよい。一態様では、キットは、（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む。
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグは、ポリペプチドに直接または間接的に付随するように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグは、支持体に固定化されるように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグは、例えば、第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）結合性物質とポリペプチドとの間の結合時に第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）コーディングタグと第１の、第２の、または第３の（またはより高次の）記録タグとの間の情報の移行が可能になるように、それぞれポリペプチドと共局在するように構成されていてよい。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体上の第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグの間の距離は、約１０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きいものであってよく、各記録タグおよびその対応する分析物は、両方が支持体に固定化された時に共局在するように構成されている、または各記録タグとその対応する分析物との間の距離は、約１０−６ｎｍ未満、約１０−６ｎｍ、約１０−５ｎｍ、約１０−４ｎｍ、約０．００１ｎｍ、約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約５ｎｍ、または約５ｎｍよりも大きい、または上記の範囲の間の任意の値のものである。
前述の実施形態のいずれかでは、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および／または第３の（またはより高次の）コーディングタグのそれぞれは、結合サイクル特異的スペーサー配列Ｃｎ、および／またはコーディングタグ特異的スペーサー配列Ｃｎなどの結合サイクル特異的バーコードを含んでよく、ｎは整数であり、Ｃｎはｎ番目の結合性物質とポリペプチドとの間の結合を示す。あるいは、結合サイクルタグＣｎは外因的に付加されてよい、例えば、結合サイクルタグＣｎはコーディングタグ（複数可）に対して外因性であってよい。
前述の実施形態のいずれかでは、分析物またはポリペプチドは、タンパク質またはポリペプチド鎖またはその断片、脂質、炭水化物、または大環状分子、またはその組合せもしくは複合体を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、分析物またはポリペプチドは、巨大分子またはその複合体、例えば、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、１つもしくは複数の保護された塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含んでよく、例えば、ユニバーサルプライミング部位は、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ｄｓＤＮＡニッキングエンドヌクレアーゼ部位）などのバーコードおよび／またはヌクレアーゼ部位を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、その３’末端および／またはその５’末端にスペーサーを含み、例えば、記録タグは、その３’末端にスペーサーを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、エンドヌクレアーゼ部位、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位、制限酵素消化部位、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位、またはこれらの組合せなどの１つまたは複数のヌクレアーゼ部位を含んでよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ部位を、コーディングタグ内、例えば、スペーサー配列内またはスペーサー配列とエンコーダー配列との間にもたらすことができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ部位を、記録タグ内、例えば、ユニバーサルプライマー配列と支持体との間にもたらすことができる（例えば、記録タグを支持体から切り離すために）。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体を含んでよく、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む支持体を含んでよい。一実施形態では、支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、支持体を含んでよく、かつ／または複数の分析物（例えば、ポリペプチド）を逐次的な反応、並行した反応で、または逐次的な反応と並行した反応の組合せで解析するために使用することができる。一実施形態では、支持体上で、分析物の間に、約１０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、ポリペプチドもしくはその断片、タンパク質もしくはポリペプチド鎖もしくはその断片、またはタンパク質複合体もしくはそのサブユニット、例えば、抗体またはその抗原結合性断片を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素もしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アンチカリンもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＣｌｐＳもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質もしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノ酸（複数可）を結合する改変小分子、すなわち、バンコマイシンもしくはそのバリアント、変異体、もしくは改変分子；またはこれらの任意の組合せを含んでよい、あるいは各結合性物質において、結合性部分が小分子を含み、コーディングタグが小分子を識別するポリヌクレオチドを含み、それにより、複数の結合性物質は、ＤＮＡにコードされる小分子ライブラリーなどのコードされる小分子ライブラリーを形成する。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）を含んでよく、コーディングタグは、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーを識別するポリヌクレオチドを含み、それにより、複数の結合性物質が、コードされる小分子ライブラリー、ペプチドおよび／またはペプチドの模倣物ライブラリー、ペプチド模倣物ライブラリー（例えば、ペプトイドライブラリー、β−ペプチドライブラリー、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物ライブラリー）、多糖ライブラリー、またはＤＮＡにコードされる小分子ライブラリー、ＤＮＡにコードされるペプチドおよび／もしくはペプチドの模倣物ライブラリー、ＤＮＡにコードされるペプチド模倣物ライブラリー（例えば、ＤＮＡにコードされるペプトイドライブラリー、ＤＮＡにコードされるβ−ペプチドライブラリー、またはＤＮＡにコードされるＤ−ペプチドのペプチド模倣物ライブラリー）、ＤＮＡにコードされる多糖ライブラリー、もしくはＤＮＡにコードされるアプタマーライブラリーなどのアプタマーライブラリーを形成する。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、分析物またはポリペプチドに選択的かつ／または特異的に結合し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、１つもしくは複数の保護された塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、バーコード配列、例えば、エンコーダー配列、例えば、結合性部分を識別するものを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。一実施形態では、各結合サイクル後に結合サイクル特異的配列が記録タグに付加される。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分とコーディングタグをリンカーまたは結合対によって接合することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分とコーディングタグをＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅによりＳｐｙＴａｇとＫＴａｇが接合され、したがって２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ソルターゼ、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、またはこれらの任意の組合せによって接合することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、鋳型反応または非鋳型反応においてコーディングタグと記録タグとの間で情報を移行させるための試薬をさらに含んでよく、必要に応じて、試薬は、（ｉ）化学的ライゲーション試薬または生物学的ライゲーション試薬、例えば、一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸をライゲーションするための、ＤＮＡリガーゼもしくはＲＮＡリガーゼなどのリガーゼ、または（ｉｉ）一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸のプライマー伸長のための試薬であり、必要に応じて、キットは、少なくとも２つのリガーゼまたはそのバリアント（例えば、少なくとも２つのＤＮＡリガーゼ、または少なくとも２つのＲＮＡリガーゼ、または少なくとも１つのＤＮＡリガーゼおよび少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ）を含むライゲーション試薬をさらに含み、少なくとも２つのリガーゼまたはそのバリアントは、アデニル化リガーゼおよび構成的にアデニル化されていないリガーゼを含む、または必要に応じて、キットは、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡ／ＲＮＡデアデニラーゼを含むライゲーション試薬をさらに含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コーディングタグと記録タグとの間で情報を移行させるための、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などのポリメラーゼをさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、核酸配列解析のための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。一実施形態では、核酸配列解析は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージング、またはこれらの任意の組合せを含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、核酸増幅のため、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグを増幅させるための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよく、必要に応じて、核酸増幅は、指数関数的な増幅反応（例えば、鋳型スイッチングを低減または排除するためのエマルジョンＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））および／または線形増幅反応（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、または等温キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ）による等温増幅）を含む。例えば、全てがあらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。Uemori et al., (2007), "Investigation of the molecularmechanism of ICAN、a novel gene amplification method," J Biochem 142 (2):283-292； Mukai et al., (2007), "Highly efficient isothermal DNAamplification system using three elements of 5'-DNA-RNA-3' chimeric primers,RNaseH and strand-displacing DNA polymerase," J Biochem 142 (2): 273-281；Ma et al., (2013), "Isothermal amplification method for next-generationsequencing," Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35): 14320-14323を参照されたい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コーディングタグ情報を記録タグに移行させて伸長記録タグを形成するための１つまたは複数の試薬を含んでよく、伸長記録タグ上のコーディングタグ情報の順序および／または頻度により、結合性物質が分析物またはポリペプチドに結合する順序および／または頻度が示される。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、標的濃縮のため、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグの濃縮のための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、サブトラクションのため、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグのサブトラクションのための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、例えば、１つまたは複数の分析物またはポリペプチドなどの非常に豊富な種を減少させるための正規化のための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットの少なくとも１つの結合性物質は、末端アミノ酸残基、末端２アミノ酸残基、または末端３アミノ酸残基に結合し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、キットの少なくとも１つの結合性物質は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、試料中の複数の分析物またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含んでよく、各コンパートメントは、必要に応じて支持体（例えば、固体支持体）に接合した複数のコンパートメントタグを含み、複数のコンパートメントタグは、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる。一実施形態では、キットは、複数の分析物またはポリペプチド（例えば、複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチド）を複数のポリペプチド断片に断片化するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含む。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、複数のポリペプチド断片を複数のコンパートメントのそれぞれ内のコンパートメントタグとアニーリングまたは接合し、それにより、複数のコンパートメントタグ付きポリペプチド断片を生成するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、複数のコンパートメントは、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、複数のコンパートメントのそれぞれは、平均して単一の細胞を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、試料中の複数の分析物またはポリペプチドを標識するための１つまたは複数のユニバーサルＤＮＡタグをさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、試料中の複数の分析物またはポリペプチドを１つまたは複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、プライマー伸長またはライゲーションのための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどのビーズを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、一本鎖または二本鎖核酸分子を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、バーコード、および必要に応じてＵＭＩを含んでよい。前述の実施形態のいずれかでは、支持体はビーズであってよく、コンパートメントタグはバーコードを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、支持体はビーズを含んでよく、複数のコンパートメントタグが接合したビーズは、スプリット・アンド・プール合成、個々の合成、または固定化、またはこれらの任意の組合せによって形成することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、スプリット・アンド・プール合成、個々の合成、または固定化のための１つまたは複数の試薬、またはこれらの任意の組合せをさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、記録タグ内の成分であってよく、記録タグは、必要に応じて、スペーサー、バーコード配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、複数の分析物またはポリペプチド（例えば、タンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチド）の内部アミノ酸、ペプチド骨格、またはＮ末端アミノ酸と反応することが可能な機能的部分をさらに含んでよい。一実施形態では、機能的部分は、アルデヒド、アジド／アルキン、マレイミド／チオール、エポキシ／求核試薬、逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）基、クリック試薬、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、タンパク質リガーゼ認識配列などのペプチドをさらに含んでよく、必要に応じて、タンパク質リガーゼは、ブテラーゼＩまたはそのホモログであってよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、複数の分析物またはポリペプチドを断片化するための化学的または生物学的試薬、例えば、酵素、例えば、プロテアーゼ（例えば、メタロプロテアーゼ）をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コンパートメントタグを支持体から遊離させるための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を形成するための１つまたは複数の試薬をさらに含んでよい。一実施形態では、記録タグの３’末端をブロッキングしてポリメラーゼによる記録タグの伸長を防止する。前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、エンコーダー配列、ＵＭＩ、ユニバーサルプライミング部位、その３’末端のスペーサー、結合サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、ジタグ構築物は、ギャップ充填、プライマー伸長、またはこれらの組合せによって生成することができる。
前述の実施形態のいずれかでは、ジタグ分子は、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するコンパートメントタグ、記録タグに由来する一意の分子識別子、記録タグに由来する必要に応じたスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する一意の分子識別子、コーディングタグに由来する必要に応じたスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変タンパク質；あるいははアミノ酸（複数可）を結合する改変小分子、すなわち、バンコマイシンまたはそのバリアント、変異体、もしくは改変分子；あるいは抗体またはその結合性断片；あるいはこれらの任意の組合せを含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、分析物またはポリペプチドの単一のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基）、ジペプチド（例えば、Ｎ末端ジペプチド、Ｃ末端ジペプチド、または内部ジペプチド）、トリペプチド（例えば、Ｎ末端トリペプチド、Ｃ末端トリペプチド、または内部トリペプチド）、または翻訳後修飾に結合し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、Ｎ末端ポリペプチド、Ｃ末端ポリペプチド、または内部ポリペプチドに結合し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグおよび／または記録タグは、１つまたは複数のエラー訂正コード、１つまたは複数のエンコーダー配列、１つまたは複数のバーコード、１つまたは複数のＵＭＩ、１つまたは複数のコンパートメントタグ、１つまたは複数のサイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。一部の実施形態では、エラー訂正コードは、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される。
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグおよび／または記録タグは、サイクル標識を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コーディングタグおよび／または記録タグに依存しないサイクル標識をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｃ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｄ）核酸で標識されたポリペプチド（例えば、ＤＮＡで標識されたタンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｅ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｆ）核酸配列決定のための試薬をさらに含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｃ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｄ）ポリペプチド（例えば、タンパク質）を、固定化された記録タグを含む支持体に固定化するための試薬；（ｅ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｆ）核酸配列決定のための試薬を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）変性試薬；（ｃ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｄ）ユニバーサルＤＮＡプライマー配列；（ｅ）ポリペプチドをユニバーサルＤＮＡプライマー配列で標識するための試薬；（ｆ）標識されたポリペプチドをプライマーによってアニーリングするためのバーコードが付されたビーズ；（ｇ）ビーズから標識されたポリペプチドにバーコードを書き込むためのポリメラーゼ伸長のための試薬；（ｈ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｉ）核酸で標識されたポリペプチド（例えば、ＤＮＡで標識されたタンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｊ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｋ）核酸配列決定のための試薬を含んでよい。
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）架橋試薬；（ｂ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｃ）システインのアルキル化もしくはリシンのブロッキングによってなどでアミノ酸の側鎖をブロッキングするための試薬；（ｄ）ユニバーサルＤＮＡプライマー配列；（ｅ）ポリペプチドをユニバーサルＤＮＡプライマー配列で標識するための試薬；（ｆ）標識されたポリペプチドをプライマーによってアニーリングするためのバーコードが付されたビーズ；（ｇ）ビーズから標識されたポリペプチドにバーコードを書き込むためのポリメラーゼ伸長のための試薬；（ｈ）トリプシン、ＬｙｓＮ、もしくはＬｙｓＣなどのプロテアーゼ；（ｉ）核酸で標識されたポリペプチド（例えば、ＤＮＡで標識されたタンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｊ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｋ）核酸配列決定のための試薬を含んでよい。
キットの前述の実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の成分は、溶液中または支持体、例えば固体支持体上に提供することができる。
キット成分は、以下の例示的な方法において開示および／または使用される任意の分子、分子複合体またはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的または生物学的）、作用物質、構造（例えば、支持体、表面、粒子、またはビーズ）、反応中間体、反応産物、結合複合体、または任意の他の製造品も含んでよい。本キットを、任意の適切な分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するために使用することができる。一部の実施形態では、本キットを、高度に並行な、ハイスループットなデジタル解析（例えば、巨大分子解析）、特にポリペプチド解析のために使用することができる。一部の実施形態では、本キットを、分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するための以下の例示的な方法において使用することができる。
第１の例は、分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した分析物および付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）分析物を、分析物に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、一次伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）分析物を、分析物に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）第２のコーディングタグの情報を一次伸長記録タグに移行させて、二次伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）二次伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
第２の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、第１の例に記載の方法である。
第３の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に実施する、第１の例に記載の方法である。
第４の例は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を、分析物に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質であって、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｆ）において第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析する、第１の例に記載の方法である。
第５の例は、分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した分析物、付随する第１の記録タグおよび付随する第２の記録タグを用意するステップと；（ｂ）分析物を、分析物に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を第１の記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）分析物を、分析物に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）第２のコーディングタグの情報を第２の記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）第１の伸長記録タグおよび第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
第６の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、第５の例に記載の方法である。
第７の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に実施する、第５の例に記載の方法である。
第８の例は、ステップ（ａ）が、固体支持体に接合した付随する第３の（またより高次の）記録タグを用意するステップをさらに含む、第５の例に記載の方法である。
第９の例は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を、分析物に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質であって、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第３の（またはより高次の）記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｆ）において第１の伸長記録タグ、第２の伸長記録タグおよび第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析する、第８の例に記載の方法である。
第１０の例は、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および任意のより高次のコーディングタグが、結合サイクル特異的スペーサー配列を含む、第５から第９までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第１１の例は、ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；
（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学薬剤で修飾するステップと；
（ｃ）前記ペプチドを、修飾された前記ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；
（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；
（ｅ）前記伸長記録タグを解析するステップと
を含む方法である。
第１２の例は、ステップ（ｃ）が、前記ペプチドを、前記第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、ステップ（ｂ）の前記修飾されたＮＴＡＡ以外の修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む、例１１に記載の方法である。
第１３の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、第１２の例に記載の方法である。
第１４の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、第１２の例に記載の方法である。
第１５の例は、前記化学薬剤が、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ）（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬である、例１１から１４までのいずれか１つに記載の方法である。
第１６の例は、ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；
（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学薬剤で修飾して、修飾されたＮＴＡＡを得るステップと；
（ｃ）前記ペプチドを、前記修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；
（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；
（ｅ）前記修飾されたＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；
（ｆ）前記ペプチドの前記新しいＮＴＡＡを化学薬剤で修飾して、新しく修飾されたＮＴＡＡを得るステップと；
（ｇ）前記ペプチドを、前記新しく修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；
（ｈ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；
（ｉ）前記第２の伸長記録タグを解析するステップと
を含む方法である。
第１７の例は、ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；
（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；
（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；
（ｄ）前記伸長記録タグを解析するステップと
を含む方法である。
第１８の例では、ステップ（ｂ）が、前記ペプチドを、前記第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、前記ペプチドの前記ＮＴＡＡ以外のＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む、第１７の例に記載の方法である。
第１９の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、第１８の例に記載の方法である。
第２０の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、第１８の例に記載の方法である。
第２１の例は、ペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）ペプチドを、ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、第１の結合性物質が、第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１のコーディングタグの情報を記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）ＮＴＡＡを除去して、ペプチドの新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；（ｅ）ペプチドを、新しいＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、第２の結合性物質が、第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｆ）第２のコーディングタグの情報を第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｇ）第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
第２２の例は、分析物が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、第１から第１０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第２３の例は、分析物が、ペプチドである、第１から第１０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第２４の例は、ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することによって得られる、第１１から第２３までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第２５の例は、分析物が、脂質、炭水化物、または大環状分子である、第１から第１０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第２６の例は、記録タグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、第１から第２５までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第２７の例は、記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、第１から第２６までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第２８の例は、ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、第２７の例に記載の方法である。
第２９の例は、記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、第１から第２８までの例に記載の方法である。
第３０の例は、記録タグが、バーコードを含む、第１から第２９までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第３１の例は、記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、第１から第３０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第３２の例は、分析物および付随する記録タグを、固体支持体に共有結合により接合させる、第１から第３１までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第３３の例は、固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、第１から第３２までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第３４の例は、固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、第３３の例に記載の方法である。
第３５の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物の分子または異なる分析物の分子）および付随する記録タグを固体支持体に接合させる、第１から第３４までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第３６の例は、固体支持体上の複数の分析物（例えば、同じ分析物の分子または異なる分析物の分子）の間に平均距離＞５０ｎｍの間隔をあける、第３５の例に記載の方法である。
第３７の例は、結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、第１から第３６までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第３８の例は、結合性物質が、改変アミノペプチダーゼ、改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変アンチカリン、または改変ＣｌｐＳである、第３７の例に記載の方法である。
第３９の例は、結合性物質が、分析物に選択的に結合することが可能である、第１から第３８までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４０の例は、コーディングタグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、第１から第３９までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４１の例は、コーディングタグが、エンコーダー配列を含む、第１から第４０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４２の例は、コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第１から第４１までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４３の例は、結合性物質とコーディングタグが、リンカーによって接合されている、第１から第４２までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４４の例は、結合性物質とコーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅによりＳｐｙＴａｇとＫＴａｇが接合され、したがって２つの部分が接合される）、ソルターゼ、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対によって接合されている、第１から第４２までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４５の例は、コーディングタグの情報の記録タグへの移行が、ＤＮＡリガーゼによって媒介される、第１から第４４までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４６の例は、コーディングタグの情報の記録タグへの移行が、ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される、第１から第４４までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４７の例は、コーディングタグの情報の記録タグへの移行が、化学的ライゲーションによって媒介される、第１から第４４までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４８の例は、伸長記録タグを解析するステップが、核酸配列決定法を含む、第１から第４７までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第４９の例は、核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、第４８の例に記載の方法である。
第５０の例は、核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、第４８の例に記載の方法である。
第５１の例は、伸長記録タグを解析前に増幅する、第１から第５０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５２の例は、伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の順序により、結合性物質による分析物への結合の順序に関する情報が提供される、第１から第５１までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５３の例は、伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の頻度により、結合性物質による分析物への結合の頻度に関する情報が提供される、第１から第５２までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５４の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物の分子または異なる分析物の分子）を表す複数の伸長記録タグを並行して解析する、第１から第５３までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５５の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物の分子または異なる分析物の分子）を表す複数の伸長記録タグを多重化アッセイで解析する、第５４の例に記載の方法である。
第５６の例は、複数の伸長記録タグが、解析前に標的濃縮アッセイを受ける、第１から第５５までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５７の例は、複数の伸長記録タグが、解析前にサブトラクションアッセイを受ける、第１から第５６までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５８の例は、複数の伸長記録タグが、非常に豊富な種を減少させるために解析前に正規化アッセイを受ける、第１から第５７までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第５９の例は、ＮＴＡＡを、改変アミノペプチダーゼ、改変アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素、穏やかなエドマン分解、エドマナーゼ酵素、または無水ＴＦＡによって除去する、第１から第５８までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第６０の例は、少なくとも１つの結合性物質が末端アミノ酸残基に結合する、第１から第５９までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第６１の例は、少なくとも１つの結合性物質が翻訳後修飾されたアミノ酸に結合する、第１から第６０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第６２の例は、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のペプチドを解析するための方法であって、（ａ）試料中の複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、必要に応じて固体支持体に接合した複数のコンパートメントタグを含み、複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｂ）複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチドを複数のペプチドに断片化するステップと；（ｃ）複数のペプチドと複数のコンパートメントタグを、複数のペプチドと複数のコンパートメント内の複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で接触させ、それにより、複数のコンパートメントタグ付きペプチドを生成するステップと；（ｄ）コンパートメントタグ付きペプチドを複数のコンパートメントから収集するステップと；（ｅ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを、第１から第２１までの例および第２６から第６１までの例のいずれか１つに記載の方法に従って解析するステップとを含む方法である。
第６３の例は、コンパートメントがマイクロ流体液滴である、第６２の例に記載の方法である。
第６４の例は、コンパートメントがマイクロウェルである、第６２の例に記載の方法である。
第６５の例は、コンパートメントが表面上の分離された領域である、第６２の例に記載の方法である。
第６６の例は、各コンパートメントが、平均して単一の細胞を含む、第６２から第６５までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第６７の例は、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のペプチドを解析するための方法であって、（ａ）複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するステップと；（ｂ）試料中の複数の標識されたタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、複数のコンパートメントタグを含み、複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｃ）複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドと複数のコンパートメントタグを、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドと複数のコンパートメント内の複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で接触させ、それにより、複数のコンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを生成するステップと；（ｄ）コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントから収集するステップと；（ｅ）必要に応じて、コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドをコンパートメントタグ付きペプチドに断片化するステップと；（ｆ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを、第１〜第２１までの例および第２６から第６１までの例のいずれか１つに記載の方法に従って解析するステップとを含む方法である。
第６８の例は、コンパートメントタグ情報を、ペプチドに付随する記録タグにプライマー伸長またはライゲーションによって移行させる、第６２から第６７までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第６９の例は、固体支持体がビーズを含む、第６２から第６８までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第７０の例は、ビーズが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、第６９の例に記載の方法である。
第７１の例は、コンパートメントタグが、一本鎖または二本鎖核酸分子を含む、第６２から第７０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第７２の例は、コンパートメントタグが、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含む、第６２から第７１までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第７３の例は、固体支持体がビーズであり、コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、複数のコンパートメントタグが接合したビーズを、スプリット・アンド・プール合成によって形成する、第７２の例に記載の方法である。
第７４の例は、固体支持体がビーズであり、コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、複数のコンパートメントタグが接合したビーズを、個々の合成または固定化によって形成する、第７２の例に記載の方法である。
第７５の例は、コンパートメントタグが記録タグ内の成分であり、記録タグが必要に応じてスペーサー、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第６２から第７４までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第７６の例は、コンパートメントタグが、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドの内部アミノ酸またはＮ末端アミノ酸と反応することが可能な機能的部分をさらに含む、第６２から第７５までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第７７の例は、機能的部分がＮＨＳ基である、第７６の例に記載の方法である。
第７８の例は、機能的部分がアルデヒド基である、第７６の例に記載の方法である。
第７９の例は、複数のコンパートメントタグが、コンパートメントタグをコンパートメントに印刷、スポッティング、インク噴射すること、またはこれらの組合せによって形成されたものである、第６２から第７８までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第８０の例は、コンパートメントタグが、ペプチドをさらに含む、第６２から第７９までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第８１の例は、コンパートメントタグペプチドが、タンパク質リガーゼ認識配列を含む、第８０の例に記載の方法である。
第８２の例は、タンパク質リガーゼが、ブテラーゼＩまたはそのホモログである、第８１の例に記載の方法である。
第８３の例は、複数のポリペプチドをプロテアーゼで断片化する、第６２から第８２までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第８４の例は、プロテアーゼがメタロプロテアーゼである、第８３の例に記載の方法である。
第８５の例は、メタロプロテアーゼの活性が金属カチオンの光活性化放出によってモジュレートされる、第８４の例に記載の方法である。
第８６の例は、複数のポリペプチドを複数のコンパートメントに分配する前に１つまたは複数の豊富なタンパク質を試料からサブトラクションすることをさらに含む、第６２から第８５までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第８７の例は、複数のペプチドとコンパートメントタグを接合する前にコンパートメントタグを固体支持体から遊離させることをさらに含む、第６２から第８６までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第８８の例は、ステップ（ｄ）の後に、コンパートメントタグ付きペプチドを固体支持体に記録タグを伴って接合させることをさらに含む、第６２の例に記載の方法である。
第８９の例は、コンパートメントタグ付きペプチド上のコンパートメントタグの情報を付随する記録タグに移行させることをさらに含む、第８８の例に記載の方法である。
第９０の例は、ステップ（ｅ）の前にコンパートメントタグをコンパートメントタグ付きペプチドから除去することをさらに含む、第８９の例に記載の方法である。
第９１の例は、解析されるペプチドが由来する単一の細胞の同一性を解析されるペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、第６２から第９０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第９２の例は、解析されるペプチドが由来するタンパク質またはタンパク質複合体の同一性を解析されるペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、第６２から第９０までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第９３の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物の分子または異なる分析物の分子）を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した複数の分析物および付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）複数の分析物を、複数の分析物に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）（ｉ）分析物に付随する記録タグの情報を分析物に結合した結合性物質のコーディングタグに移行させて、伸長コーディングタグを生成するステップ；または（ｉｉ）分析物に付随する記録タグおよび分析物に結合した結合性物質のコーディングタグの情報をジタグ構築物に移行させるステップと；（ｄ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を収集するステップと；（ｅ）必要に応じてステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回の結合サイクルにわたって繰り返すステップと；（ｆ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析するステップとを含む方法である。
第９４の例は、分析物がタンパク質である、第９３の例に記載の方法である。
第９５の例は、分析物がペプチドである、第９３の例に記載の方法である。
第９６の例は、ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することによって得られる、第９５の例に記載の方法である。
第９７の例は、記録タグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、第９３から第９６までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第９８の例は、記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、第９３から第９７までの例のいずれか１つに記載の方法である。
第９９の例は、記録タグが、コンパートメントタグを含む、例９３から９８までのいずれか１つに記載の方法である。
第１００の例は、記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例９３から９９までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０１の例は、記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、例９３から１００までのいずれか１つに記載の方法。
第１０２の例は、記録タグの３’末端をブロッキングしてポリメラーゼによる記録タグの伸長を防止し、分析物に付随する記録タグおよび分析物に結合している結合性物質のコーディングタグの情報をジタグ構築物に移行させる、例９３から１０１までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０３の例は、コーディングタグが、エンコーダー配列を含む、例９３から１０２までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０４の例は、コーディングタグが、ＵＭＩを含む、例９３から１０３までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０５の例は、コーディングタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例９３から１０４までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０６の例は、コーディングタグが、その３’末端にスペーサーを含む、例９３から１０５までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０７の例は、コーディングタグが、結合サイクル特異的配列を含む、例９３から１０６までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０８の例は、結合性物質とコーディングタグが、リンカーによって接合されている、例９３から１０７までのいずれか１つに記載の方法である。
第１０９の例は、記録タグの情報のコーディングタグへの移行が、プライマー伸長によってもたらされる、例９３から１０８までのいずれか１つに記載の方法である。
第１１０の例は、記録タグの情報のコーディングタグへの移行が、ライゲーションによってもたらされる、例９３から１０８までのいずれか１つに記載の方法である。
第１１１の例は、ジタグ構築物が、ギャップ充填、プライマー伸長、またはその両方によって生成される、例９３から１０８までのいずれか１つに記載の方法である。
第１１２の例は、ジタグ分子が、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するコンパートメントタグ、記録タグに由来する一意の分子識別子、記録タグに由来する必要に応じたスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する一意の分子識別子、コーディングタグに由来する必要に応じたスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含む、例９３から９７まで、１０７、１０８、および１１１のいずれか１つに記載の方法である。
第１１３の例は、分析物および付随する記録タグを、固体支持体に共有結合により接合させる、例９３から１１２までのいずれか１つに記載の方法である。
第１１４の例は、固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、例１１３に記載の方法である。
第１１５の例は、固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、例１１４に記載の方法である。
第１１６の例は、結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、例９３から１１５までのいずれか１つに記載の方法である。
第１１７の例は、結合性物質が、改変アミノペプチダーゼ、改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変アンチカリン、または抗体もしくはその結合性断片である、例１１６に記載の方法である。
第１１８の例は、結合性物質が、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドまたはペプチドの翻訳後修飾に結合する、例９５〜１１７のいずれか１つに記載の方法である。
第１１９の例は、結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、例１１８に記載の方法である。
第１２０の例は、結合性物質が、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する、例１１８に記載の方法である。
第１２１の例は、結合性物質がＮ末端アミノ酸残基に結合し、Ｎ末端アミノ酸残基が各結合サイクル後に切断される、例１１９に記載の方法である。
第１２２の例は、結合性物質がＣ末端アミノ酸残基に結合し、Ｃ末端アミノ酸残基が各結合サイクル後に切断される、例１１９に記載の方法である。
例１２３．Ｎ末端アミノ酸残基がエドマン分解によって切断される、例１２１に記載の方法。
例１２４．結合性物質が、アミノ酸または翻訳後修飾の部位特異的な共有結合性標識である、例９３に記載の方法。
例１２５．ステップ（ｂ）の後に、分析物および付随する結合性物質を含む複合体を固体支持体から解離させ、液滴またはマイクロ流体液滴のエマルジョン中に分配する、例９３から１２４までのいずれか１つに記載の方法。
例１２６．各マイクロ流体液滴が、平均して、分析物および結合性物質を含む複合体を１つ含む、例１２５に記載の方法。
例１２７．伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を生成する前に記録タグを増幅する、例１２５または１２６に記載の方法。
例１２８．エマルジョン融合ＰＣＲを使用して、記録タグ情報をコーディングタグに移行させる、またはジタグ構築物の集団を創出する、例１２５から１２７までのいずれか１つに記載の方法。
例１２９．伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析前に増幅させる、例９３から１２８までのいずれか１つに記載の方法。
例１３０．伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析するステップが、核酸配列決定法を含む、例９３から１２９までのいずれか１つに記載の方法。
例１３１．核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、例１３０に記載の方法。
例１３２．核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、例１３０に記載の方法。
例１３３．分析物の部分的組成を、一意のコンパートメントタグおよび必要に応じてＵＭＩを使用する複数の伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の解析によって決定する、例１３０に記載の方法。
例１３４．解析ステップを、塩基当たりのエラー率が＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％である配列決定法を用いて実施する、例１から１３３までのいずれか１つに記載の方法。
例１３５．コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別成分が、エラー訂正コードを含む、例１から１３４までのいずれか１つに記載の方法。
例１３６．識別成分が、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、例１３５に記載の方法。
例１３７．エラー訂正コードが、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される、例１３５または１３６に記載の方法。
例１３８．コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別成分が、一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを生成することが可能であり、解析ステップが、識別成分を識別するために一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを検出することを含む、例１から１３４までのいずれか１つに記載の方法。
例１３９． 識別成分が、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、例１３８に記載の方法。
例１４０．複数の分析物（例えば、同じ分析物の分子または異なる分析物の分子）を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した複数の分析物および付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）複数の分析物を、同類の分析物に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１の結合性物質の第１のコーディングタグの情報を第１の分析物に付随する第１の記録タグに移行させて、一次伸長記録タグを生成するステップであって、第１の結合性物質が第１の分析物に結合する、ステップと；（ｄ）複数の分析物を、同類の分析物に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップと；（ｅ）第２の結合性物質の第２のコーディングタグの情報を一次伸長記録タグに移行させて、二次伸長記録タグを生成するステップであって、第２の結合性物質が第１の分析物に結合する、ステップと；（ｆ）必要に応じて、ステップ（ｄ）〜（ｅ）を「ｎ」回の結合サイクルにわたって繰り返すステップであって、第１の分析物に結合する各結合性物質の各コーディングタグの情報を前の結合サイクルで生成した伸長記録タグに移行させて、第１の分析物を表すｎ次伸長記録タグを生成する、ステップと；（ｇ）ｎ次伸長記録タグを解析するステップとを含む方法。
例１４１．複数の分析物を表す複数のｎ次伸長記録タグを生成し、解析する、例１４０に記載の方法。
例１４２．分析物が、タンパク質である、例１４０または１４１に記載の方法。
例１４３．分析物が、ペプチドである、例１４２に記載の方法。
例１４４．ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することによって得られる、例１４３に記載の方法。
例１４５．複数の分析物が、多数のプールされた試料由来の分析物（例えば、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体などの巨大分子）を含む、例１４０から１４４までのいずれか１つに記載の方法。
例１４６．記録タグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、例１４０から１４５までのいずれか１つに記載の方法。
例１４７．記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、例１４０から１４６までのいずれか１つに記載の方法。
例１４８．記録タグが、コンパートメントタグを含む、例１４０から１４７までに記載の方法。
例１４９．記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例１４０から１４８までのいずれか１つに記載の方法。
例１５０．記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、例１４０から１４９までのいずれか１つに記載の方法。
例１５１．コーディングタグが、エンコーダー配列を含む、例１４０から１５０までのいずれか１つに記載の方法。
例１５２．コーディングタグが、ＵＭＩを含む、例１４０から１５１までのいずれか１つに記載の方法。
例１５３．コーディングタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例１４０から１５２までのいずれか１つに記載の方法。
例１５４．コーディングタグが、その３’末端にスペーサーを含む、例１４０から１５３までのいずれか１つに記載の方法。
例１５５．コーディングタグが、結合サイクル特異的配列を含む、例１４０から１５４までのいずれか１つに記載の方法。
例１５６．コーディングタグが、一意の分子識別子を含む、例１４０から１５５までのいずれか１つに記載の方法。
例１５７．結合性物質とコーディングタグが、リンカーによって接合されている、例１４０から１５６までのいずれか１つに記載の方法。
例１５８．記録タグの情報のコーディングタグへの移行が、プライマー伸長によって媒介される、例１４０から１５７までのいずれか１つに記載の方法。
例１５９．記録タグの情報のコーディングタグへの移行が、ライゲーションによって媒介される、例１４０から１５８までのいずれか１つに記載の方法。
例１６０．複数の分析物、付随する記録タグ、またはその両方が、固体支持体に共有結合により接合されている、例１４０から１５９までのいずれか１つに記載の方法。
例１６１．固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、例１４０から１６０までのいずれか１つに記載の方法。
例１６２．固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、例１６１に記載の方法。
例１６３．結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、例１４０から１６２までのいずれか１つに記載の方法。
例１６４．結合性物質が、改変アミノペプチダーゼ、改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変アンチカリン、または抗体もしくはその結合性断片である、例１６３に記載の方法。
例１６５．結合性物質が、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドまたはペプチドの翻訳後修飾に結合する、例１４２から１６４までのいずれか１つに記載の方法。
例１６６．結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、例１６５に記載の方法。
例１６７．結合性物質が、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する、例１６５に記載の方法。
例１６８．結合性物質が、修飾されたＮ末端アミノ酸残基、修飾されたＣ末端アミノ酸残基、または修飾された内部アミノ酸残基の化学標識に結合する、例１４２から１６４までのいずれか１つに記載の方法。
例１６９．結合性物質がＮ末端アミノ酸残基または修飾されたＮ末端アミノ酸残基の化学標識に結合し、Ｎ末端アミノ酸残基が各結合サイクル後に切断される、例１６６または１６８に記載の方法。
例１７０．結合性物質がＣ末端アミノ酸残基または修飾されたＣ末端アミノ酸残基の化学標識に結合し、Ｃ末端アミノ酸残基が各結合サイクル後に切断される、例１６６または１６８に記載の方法。
例１７１．Ｎ末端アミノ酸残基がエドマン分解、エドマナーゼ、改変アミノペプチダーゼ、または改変アシルペプチドヒドロラーゼによって切断される、例１６９に記載の方法。
例１７２．結合性物質が、アミノ酸または翻訳後修飾の部位特異的な共有結合性標識である、例１６３に記載の方法。
例１７３．複数のｎ次伸長記録タグを解析前に増幅させる、例１４０から１７２までのいずれか１つに記載の方法。
例１７４．ｎ次伸長記録タグの解析が、核酸配列決定法を含む、例１４０から１７３までのいずれか１つに記載の方法。
例１７５．複数の分析物を表す複数のｎ次伸長記録タグを並行して解析する、例１７４に記載の方法。
例１７６．核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、例１７４または１７５に記載の方法。
例１７７．核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、例１７４または１７５に記載の方法。
上記のキット成分、および例示的なキットおよび方法において開示および／もしくは使用されている任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的または生物学的試薬）、作用物質、構造（例えば、支持体、表面、粒子、またはビーズ）、反応中間体、反応産物、結合複合体、または任意の他の製造品のいずれかを、キットを形成するために別々にまたは任意の適切な組合せで提供することができる。キットは、必要に応じて、例えば、高度に並行な、ハイスループットなデジタル解析（例えば、巨大分子解析）、特に、ポリペプチド解析における使用のための説明書を含んでよい。
Ｃ．巨大分子
一態様では、本開示は、巨大分子の解析に関する。巨大分子は、より小さなサブユニットで構成される大きな分子である。ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、炭水化物、脂質、大環状分子、またはキメラ巨大分子である。
本明細書に開示されているキットおよび方法に従って解析される巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）は、これだけに限定されないが、細胞（初代細胞および培養細胞株の両方）、細胞溶解物または抽出物、エキソソームを含めた細胞小器官または小胞、組織および組織抽出物などの生体試料；生検材料；排泄物；事実上あらゆる生物体の体液（例えば、血液、全血、血清、血漿、尿、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門のおよび膣分泌物、汗および精液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍または任意の他の感染もしくは炎症の部位から得られる流体）または関節（正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風もしくは化膿性関節炎などの疾患の影響を受けている関節）から得られる流体）（マイクロバイオームを含有する試料を含めた哺乳動物由来試料であることが好ましく、マイクロバイオームを含有する試料を含めたヒト由来試料であることが特に好ましい）；環境試料（例えば、空気、農業、水および土壌試料）；微生物バイオフィルムおよび／また微生物群、ならびに微生物の胞子に由来する試料を含めた微生物試料；細胞外液、細胞培養物からの細胞外上清、細菌内の封入体、ミトコンドリア区画を含めた細胞区画、および細胞ペリプラズムを含めた研究試料を含めた適切な供給源または試料から得ることができる。
ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ポリペプチド、またはペプチドである。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列情報および翻訳後修飾を、次世代シーケンシング法によって解析することができる核酸コードライブラリーに変換する。ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその両方を含んでよい。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体は、標準の、天然に存在するアミノ酸、修飾されたアミノ酸（例えば、翻訳後修飾）、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。一部の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然に存在するもの、合成的に作製されたもの、または組換えによって発現させたものである。上述のペプチド実施形態のいずれかでは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体は、翻訳後修飾をさらに含んでよい。
標準の、天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。非標準アミノ酸としては、セレノシステイン、ピロリジン、およびＮ−ホルミルメチオニン、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、およびＮ−メチルアミノ酸が挙げられる。
ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、共有結合性修飾であっても酵素的修飾であってもよい。翻訳後修飾の例としては、これだけに限定されないが、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、エリミニル化、フラビン付着、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化（例えば、Ｎ結合、Ｏ結合、Ｃ結合、ホスホグリコシル化）、グリコシルホスファチジルイノシトール付加（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ハイプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質付加、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、プロピオニル化、レチニリデンシッフ塩基形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、セレン化、サクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられる。翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端、ポリペプチド、またはタンパク質の修飾を含む。末端アミノ基の修飾としては、これだけに限定されないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端カルボキシ基の修飾としては、これだけに限定されないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾（例えば、低級アルキルは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである）が挙げられる。翻訳後修飾は、例えば、これだけに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端の間にあるアミノ酸の、上記のものなどの修飾も含む。翻訳後修飾により、細胞内のタンパク質の「生物学的性質」、例えば、その活性、構造、安定性、または局在を調節することができる。リン酸化は最も一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の調節、特に細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす（Ｐｒａｂａｋａｒａｎら、２０１２年、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ、４巻：５６５〜５８３頁）。グリコシル化などの、タンパク質への糖の付加により、タンパク質のフォールディングが促進されること、安定性が改善されること、および調節機能が修飾されることが示されている。タンパク質に脂質を付着させるにより、細胞膜へのターゲティングが可能になる。翻訳後修飾は、１つまたは複数の検出可能な標識を含めるための、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の修飾も含み得る。
ある特定の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を断片化することができる。例えば、生体試料などの試料に由来するタンパク質を断片化することにより、断片化されたペプチドを得ることができる。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を、プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼによる断片化を含めた当技術分野で公知の任意の手段によって断片化することができる。一部の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の断片化を、特異的なプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼを使用することによって標的化する。特異的なプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼは、特異的なコンセンサス配列に結合し、そこで切断する（例えば、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓコンセンサス配列に対して特異的なＴＥＶプロテアーゼ）。他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の断片化を、非特異的プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼを使用することにより、標的化しないまたはランダムなものにする。非特異的プロテアーゼは、コンセンサス配列ではなく特定のアミノ酸残基に結合し、そこで切断することができる（例えば、プロテイナーゼＫは、非特異的セリンプロテアーゼである）。プロテイナーゼおよびエンドペプチダーゼは当技術分野で周知であり、タンパク質またはポリペプチドを切断してより小さなペプチド断片にするために使用することができるものの例としては、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、トロンビン、第Ｘａ因子、フューリン、エンドペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、スブチリシン、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（商標）Ｉ、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｓｐＮ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣなどが挙げられる（Ｇｒａｎｖｏｇｌら、２００７年、Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ、３８９巻：９９１〜１００２頁）。ある特定の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を、プロテイナーゼＫによって、または、任意選択で、迅速な不活化を可能にするために熱不安定性型のプロテイナーゼＫによって、断片化する。プロテイナーゼＫは、尿素およびＳＤＳなどの変性試薬中で非常に安定であり、それにより、完全に変性したタンパク質を消化することが可能になる。タンパク質およびポリペプチドのペプチドへの断片化は、ＤＮＡタグまたはＤＮＡ記録タグを付着させる前に実施することもでき、その後に実施することもできる。
化学試薬を使用してタンパク質をペプチド断片に消化することもできる。化学試薬により、特定のアミノ酸残基において切断することができる（例えば、臭化シアンにより、メチオニン残基のＣ末端においてペプチド結合が加水分解される）。ポリペプチドまたはタンパク質をより小さなペプチドに断片化するための化学試薬としては、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ギ酸、ＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチルインドール］、ヨードソ安息香酸、・ＮＴＣＢ＋Ｎｉ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）などが挙げられる。
ある特定の実施形態では、酵素的切断または化学的切断の後、得られるペプチド断片は、ほぼ同じ所望の長さ、例えば、約１０アミノ酸から約７０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約６０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約５０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約４０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約３０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約７０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約６０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約５０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約４０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約３０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約７０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約６０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約５０アミノ酸まで、または約３０アミノ酸から約４０アミノ酸までである。切断反応は、タンパク質またはポリペプチド試料に、プロテイナーゼまたはエンドペプチダーゼ切断部位を含有するペプチド配列を含む短い試験ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）ペプチドをスパイクすることにより、例えばリアルタイムで、モニターすることができる。インタクトなＦＲＥＴペプチドでは、蛍光基およびクエンチャー基が切断部位を含有するペプチド配列のいずれかの末端に付着しており、クエンチャーとフルオロフォアの間の蛍光共鳴エネルギー移動により、低い蛍光が生じる。試験ペプチドがプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼによって切断されると、クエンチャーおよびフルオロフォアが分離し、それにより、蛍光の大きな増大がもたらされる。切断反応は、ある特定の蛍光強度が実現された時に停止させることができ、これにより、再現性のある切断エンドポイントを実現することが可能になる。
巨大分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）の試料に対して、固体支持体に付着させる前にタンパク質分画法を行うことができ、ここで、タンパク質またはペプチドを細胞内の位置、分子量、疎水性、もしくは等電点などの１つもしくは複数の性質、またはタンパク質濃縮法によって分離する。その代わりにまたはそれに加えて、特定のタンパク質またはペプチドを選択するため（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｗｈｉｔｅａｋｅｒら、２００７年、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３６２巻：４４〜５４頁を参照されたい）または特定の翻訳後修飾を選択するため（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｈｕａｎｇら、２０１４年、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ、１３７２巻：１〜１７頁を参照されたい）に、タンパク質濃縮法を使用することができる。あるいは、免疫グロブリンなどの特定のクラス（複数可）のタンパク質、またはＩｇＧなどの免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプを、解析のために親和性により濃縮または選択することができる。免疫グロブリン分子の場合では、親和性結合に関与する超可変配列の配列および豊富さまたは頻度を解析することが特に興味深く、これは、特に、これらが疾患の進行に応答して変動するまたは健康、免疫、および／もしくは疾患表現型と相関するからである。過度に豊富なタンパク質を、標準の免疫親和性方法を使用して試料からからサブトラクションすることもできる。豊富なタンパク質の枯渇は、タンパク質構成物の８０％よりも多くがアルブミンおよび免疫グロブリンである血漿試料に関して有用であり得る。例えばＰＲＯＴＩＡおよびＰＲＯＴ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）など、血漿試料の過度に豊富なタンパク質の枯渇のために、いくつかの市販品が入手可能である。
ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質またはポリペプチドで構成される。一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドを標準のアミンカップリング化学によってＤＮＡ記録タグで標識する（例えば、図２Ｂ、２Ｃ、２８、２９、３１、４０）を参照されたい。ε−アミノ基（例えばリシン残基の）およびＮ末端アミノ基は、反応のｐＨに応じて、アミン反応性カップリング剤で特に標識しやすい（ＭｅｎｄｏｚａおよびＶａｃｈｅｔ、２００９年）。特定の実施形態では（例えば、図２Ｂおよび図２９を参照されたい）、記録タグは、反応性部分（例えば、固体表面、多機能性リンカー、または巨大分子へのコンジュゲーションのための部分）、リンカー、ユニバーサルプライミング配列、バーコード（例えば、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、画分バーコード、またはそれらの任意の組合せ）、任意選択のＵＭＩ、およびコーディングタグへの／からの情報移行を容易にするためのスペーサー（Ｓｐ）配列で構成される。別の実施形態では、タンパク質を、まず、ユニバーサルＤＮＡタグで標識し、その後で、酵素的または化学的カップリングステップによってバーコード−Ｓｐ配列（試料、コンパートメント、スライド上の物理的位置を表すなど）をタンパク質に付着させることができる（例えば、図２０、３０、３１、４０を参照されたい）。ユニバーサルＤＮＡタグは、タンパク質またはポリペプチド巨大分子を標識するために使用され、バーコード（例えば、コンパートメントタグ、記録タグなど）の付着点として使用することができるヌクレオチドの短い配列を含む。例えば、記録タグは、その末端に、ユニバーサルＤＮＡタグと相補的な配列を含んでよい。ある特定の実施形態では、ユニバーサルＤＮＡタグは、ユニバーサルプライミング配列である。標識されたタンパク質上のユニバーサルＤＮＡタグが記録タグ（例えば、ビーズに結合させたもの）内の相補配列とハイブリダイズしたら、アニーリングされたユニバーサルＤＮＡタグをプライマー伸長によって伸長させ、それにより、ＤＮＡタグが付されたタンパク質に記録タグ情報を移行させることができる。特定の実施形態では、タンパク質を、プロテイナーゼにより消化してペプチドにする前に、ユニバーサルＤＮＡタグで標識する。次いで、消化物に由来する標識されたペプチド上のユニバーサルＤＮＡタグを、情報価値があり、有効な記録タグに変換することができる。
ある特定の実施形態では、タンパク質巨大分子を親和性捕捉試薬によって固体支持体に固定化すること（および任意選択で共有結合により架橋結合させること）ができ、ここで、記録タグは、親和性捕捉試薬に直接付随している、あるいは、タンパク質を固体支持体に記録タグと共に直接固定化することができる（例えば、図２Ｃを参照されたい）。
Ｄ．固体支持体などの支持体
本開示の巨大分子を固体支持体の表面（「基板表面」とも称される）に接合する。固体支持体は、これだけに限定されないが、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フローセル、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含めた任意の多孔質または非多孔質支持体表面であってよい。固体支持体用の材料としては、これだけに限定されないが、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。固体支持体は、薄膜、膜、ビン、ディッシュ、繊維、織られた繊維、チューブなどの成形ポリマー、粒子、ビーズ、微小粒子、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。例えば、固体表面がビーズである場合、ビーズとしては、これだけに限定されないが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズを挙げることができる。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、フローセルである。フローセルの形態は、異なる次世代シーケンシングプラットフォームの間で変動し得る。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルは、その表面に一連のオリゴヌクレオチドアンカーが結合した、顕微鏡スライドと同様の平面の光学的に透明な表面である。鋳型ＤＮＡは、末端にフローセル表面上のオリゴヌクレオチドと相補的なアダプターがライゲーションしている。アダプター付加した一本鎖ＤＮＡをフローセルに結合させ、固相「ブリッジ」ＰＣＲによって増幅した後、配列決定する。４５４フローセル（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、７５ピコリットルのウェルを約１６０万個有する光ファイバースライドである「ピコタイター」プレートを支持するものである。せん断された鋳型ＤＮＡの個々の分子をそれぞれ別々のビーズに捕捉し、各ビーズを油エマルジョン中の水性ＰＣＲ反応混合物の個々の液滴中に区画化する。鋳型をビーズ表面上でＰＣＲによってクローン的に増幅し、次いで、鋳型がローディングされたビーズを配列決定反応のためにピコタイタープレートのウェル中に、理想的には１ウェル当たり１個またはそれ未満のビーズに分布させる。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＳＯＬｉＤ（Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）計器では、４５４システムと同様に、鋳型分子をエマルジョンＰＣＲによって増幅する。増幅した鋳型を含有しないビーズを選別するステップの後、ビーズに結合した鋳型がフローセル上に蓄積する。フローセルは、ＴＷＩＳＴ（商標）ＤＮＡ合成カラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの単純なフィルターフリットであってもよい。
ある特定の実施形態では、固体支持体はビーズであり、これは、個々のビーズを指す場合もあり複数のビーズを指す場合もある。一部の実施形態では、ビーズは、下流の解析のために使用される選択された次世代シーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤまたは４５４）に適合するものである。一部の実施形態では、固体支持体は、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである。さらなる実施形態では、ビーズは、巨大分子への結合を容易にするために、結合機能性（例えば、アミン基、ビオチン標識された巨大分子、抗体との結合用のストレプトアビジンなどの親和性リガンド）でコーティングすることができる。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、固体支持体に、直接または間接的に、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用またはそれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手段によって接合させることができる（例えば、それぞれ、これによってその全体が参照により組み込まれる、Ｃｈａｎら、２００７年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２巻：ｅ１１６４頁；Ｃａｚａｌｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．、１５巻：１００５〜１００９頁；Ｓｏｅｌｌｎｅｒら、２００３年、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１２５巻：１１７９０〜１１７９１頁；Ｓｕｎら、２００６年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、１７巻、５２〜５７頁；Ｄｅｃｒｅａｕら、２００７年、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、７２巻：２７９４〜２８０２頁；Ｃａｍａｒｅｒｏら、２００４年、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１２６巻：１４７３０〜１４７３１頁；Ｇｉｒｉｓｈら、２００５年、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、１５巻：２４４７〜２４５１頁；Ｋａｌｉａら、２００７年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、１８巻：１０６４〜１０６９頁；Ｗａｔｚｋｅら、２００６年、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、４５巻：１４０８〜１４１２頁；Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙら、２００７年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１８巻：４６９〜４７６頁；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３年）を参照されたい）。例えば、ペプチドを固体支持体にライゲーション反応によって接合させることができる。あるいは、固体支持体は、直接または間接的にペプチドを固体支持体に接合することを容易にするための作用物質またはコーティングを含んでよい。タンパク質、核酸、炭水化物および小分子を含めた任意の適切な分子または材料をこの目的のために使用することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は、親和性分子である。別の例では、作用物質は、別の分子のアルキニル基と反応して固体支持体と他の分子の間の結び付きまたは結合を容易にすることができる、アジド基である。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、固体支持体に、「クリックケミストリー」と称される方法を使用して接合させることができる。この目的のために、迅速かつ実質的に不可逆的である任意の反応を使用してタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを固体支持体に付着させることができる。例示的な反応としては、トリアゾールが形成される、アジドとアルキンの銅により触媒される反応（ヒュスゲン１，３−双極子付加環化）、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）、ジエンと求ジエン体の反応（ディールス・アルダー）、歪み促進型アルキン−ニトロン付加環化、歪アルケンとアジド、テトラジンまたはテトラゾールの反応、アルケン−アジド［３＋２］付加環化、アルケン−テトラジン逆電子要請型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応（例えば、ｍ−テトラジン（ｍＴｅｔ）−ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ））、アルケン−テトラゾール光化学反応、アジド−ホスフィンのシュタウディンガーライゲーション、ならびに、求電子原子に対する求核攻撃による脱離基の置換（Ｈｏｒｉｓａｗａ ２０１４年、Ｋｎａｌｌ、Ｈｏｌｌａｕｆら、２０１４年）などの種々の置換反応が挙げられる。例示的な置換反応としては、アミンと活性化エステルの反応；アミンとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応；アミンとイソシアネートの反応；アミンとイソチオシアネートの反応などが挙げられる。
一部の実施形態では、巨大分子および固体支持体を、２つの相補的な反応性基の反応によって形成することができる官能基、例えば、前述の「クリック」反応のうちの１つの生成物である官能基によって接合する。種々の実施形態では、官能基は、アルデヒド、オキシム、ヒドラゾン、ヒドラジド、アルキン、アミン、アジド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、ニトリル、ニトロン、スルフヒドリル、ジスルフィド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、イミドエステル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンチン酸ＳＴＰエステル）、ケトン、α，β−不飽和カルボニル、アルケン、マレイミド、α−ハロイミド、エポキシド、アジリジン、テトラジン、テトラゾール、ホスフィン、ビオチンまたはチイラン官能基と、相補的な反応性基との反応によって形成することができる。例示的な反応は、アミン（例えば、第一級アミン）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイソチオシアネートの反応である。
さらに他の実施形態では、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。さらなる実施形態では、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、チオ尿素、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。他の実施形態では、官能基は、アミドまたはチオ尿素を含む。一部のより具体的な実施形態では、官能基は、トリアゾリル官能基、アミド、またはチオ尿素官能基である。
好ましい実施形態では、迅速かつ低インプット濃度で高収率がもたらされるので、ｉＥＤＤＡクリックケミストリーを巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）を固体支持体に固定化するために使用する。別の好ましい実施形態では、テトラジンではなくｍ−テトラジンをｉＥＤＤＡクリックケミストリー反応に使用し、これは、ｍ−テトラジンが改善された結合安定性を有するからである。
好ましい実施形態では、基板表面をＴＣＯで官能化し、記録タグで標識したタンパク質、ポリペプチド、ペプチドを、ＴＣＯでコーティングした基板表面に、付着したｍ−テトラジン部分を介して固定化する（例えば図３４を参照されたい）。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、そのＣ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸により、例えば、アミン基、カルボキシル基、またはスルフィドリル基を介して、固体支持体の表面に固定化することができる。アミン基へのカップリングに使用される標準の活性化された支持体としては、ＣＮＢｒで活性化された支持体、ＮＨＳで活性化された支持体、アルデヒドで活性化された支持体、アズラクトンで活性化された支持体、およびＣＤＩで活性化された支持体が挙げられる。カルボキシルカップリングに使用される標準の活性化された支持体としては、アミン支持体にカップリングするカルボジイミドで活性化されたカルボキシル部分が挙げられる。システインカップリングでは、マレイミド、ヨードアセチル、およびピリジルジスルフィドで活性化された支持体を使用することができる。ペプチドカルボキシ末端固定化の代替方式では、Ｃ末端にリシンまたはアルギニン残基を含有するペプチドに、それらを切断することなく結合する、触媒として不活性なトリプシンの誘導体であるアンヒドロトリプシンを使用する。
ある特定の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを固体支持体に、固体表面に結合させたリンカーをタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのリシン基に共有結合により付着させることによって固定化する。
固体支持体への固定化前または固定化後に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに記録タグを付着させることができる。例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、まず記録タグで標識し、次いで、カップリングのための２つの機能的部分を含む記録タグを介して固体表面に固定化することができる（例えば図２８を参照されたい）。記録タグの一方の機能的部分をタンパク質とカップリングさせ、他方の機能的部分により、記録タグで標識したタンパク質を固体支持体に固定化する。
あるいは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを記録タグで標識する前に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを固体支持体に固定化する。例えば、タンパク質をまずクリックケミストリー部分などの反応性基で誘導体化することができる。次いで、活性化されたタンパク質分子を適切な固体支持体に付着させ、次いで、相補的なクリックケミストリー部分を使用して記録タグで標識することができる。例として、アルキンおよびｍＴｅｔ部分で誘導体化したタンパク質を、アジドおよびＴＣＯで誘導体化したビーズに固定化し、アジドおよびＴＣＯで標識された記録タグに付着させることができる。
巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）を固体支持体に付着させるための本明細書において提示される方法はまた、記録タグを固体支持体に付着させるまたは記録タグを巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）に付着させるためにも使用することができることが理解される。
ある特定の実施形態では、結合性物質への非特異的吸収を最小限にするために、固体支持体の表面を不動態化（ブロッキング）する。「不動態化」された表面とは、結合性物質の非特異的結合を最小限にするために材料の外層で処理された表面を指す。表面を不動態化する方法としては、表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｐａｎら、２０１５年、Ｐｈｙｓ． Ｂｉｏｌ．、１２巻：０４５００６頁）、ポリシロキサン（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７）、星型ポリマー（例えば、星型ＰＥＧ）（Ｇｒｏｌｌら、２０１０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４７２巻：１〜１８頁）、疎水性ジクロロジメチルシラン（ＤＤＳ）＋自己組織化Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｈｕａら、２０１４年、Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１巻：１２３３〜１２３６頁）、およびダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）、ＤＬＣ＋ＰＥＧ（Ｓｔａｖｉｓら、２０１１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０８巻：９８３〜９８８頁）のようなポリマーで不動態化することを含めた、蛍光単一分子解析の文献からの標準の方法が挙げられる。共有結合性の表面修飾に加えて、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０のような界面活性物質、溶液中ポリシロキサン（Ｐｌｕｒｏｎｉｃシリーズ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ならびにＢＳＡおよびカゼインのようなタンパク質を含めたいくつもの不動態化剤を同様に使用することができる。あるいは、固体基板の表面上または容積内のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの密度を、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを固体基板に固定化する際に競合剤または「ダミー」反応性分子をスパイクすることによって調整することができる（例えば図３６Ａを参照されたい）。
ある特定の実施形態では、多数の巨大分子を同じ固体支持体上に固定化する場合、例えば、結合性物質が第１の巨大分子に結合し、そのコーディングタグ情報が第１の巨大分子に付随する記録タグではなく近隣の巨大分子に付随する記録タグに移行する交差結合または分子間事象の発生を低減するまたはそれを防止するために、巨大分子の間に適切に間隔をあけることができる。固体支持体上の巨大分子の間隔（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの間隔）を制御するために、基板表面上の機能的カップリング基（例えば、ＴＣＯ）の密度を調整することができる（例えば図３４を参照されたい）。一部の実施形態では、固体支持体（例えば、多孔質支持体）の表面上または容積内で多数の巨大分子の間に約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの距離で間隔をあける。一部の実施形態では、固体支持体の表面上で多数の巨大分子の間に少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍの平均距離で間隔をあける。一部の実施形態では、固体支持体の表面上で多数の巨大分子の間に少なくとも５０ｎｍの平均距離で間隔をあける。一部の実施形態では、固体支持体の表面上または容積内で巨大分子の間に、経験的に分子内事象に対する分子間事象の相対的な頻度が＜１：１０；＜１：１００；＜１：１，０００；または＜１：１０，０００になるように間隔をあける。適切な間隔頻度は、機能アッセイを使用して経験的に決定することができ（実施例２３を参照されたい）、希釈によっておよび／または基板表面上の部位への付着について競合する「ダミー」スペーサー分子をスパイクすることによって実現することができる。
例えば、図３４に示されている通り、ＰＥＧ−５０００（ＭＷ約５０００）を使用して、基板表面（例えば、ビーズ表面）上のペプチド間の間隙の空間をブロッキングする。さらに、ペプチドを同じくＰＥＧ−５０００分子に付着させた機能的部分とカップリングさせる。好ましい実施形態では、これは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−５０００−ＴＣＯ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ−５０００−メチルの混合物をアミン誘導体化ビーズにカップリングすることによって実現される（例えば、図３４を参照されたい）。２つのＰＥＧ間（ＴＣＯ対メチル）の化学量論比を調整して、基板表面上の機能的カップリング部分（ＴＣＯ基）の適切な密度を生じさせる；メチル−ＰＥＧはカップリングに対して不活性である。ＴＣＯ基間の有効な間隔は、表面上のＴＣＯ基の密度を測定することによって算出することができる。ある特定の実施形態では、固体表面上のカップリング部分（例えば、ＴＣＯ）間の平均間隔は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍである。ビーズをＰＥＧ５０００−ＴＣＯ／メチルで誘導体化した後、表面上の過剰なＮＨ２基を反応性無水物（例えば、無水酢酸のまたは無水コハク酸）阻害剤でクエンチする。
特定の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを基板または支持体に、（ｉ）第１の分析物に結合したコーディング物質（特に、その結合したコーディング物質内のコーディングタグ）と（ｉｉ）第２の分析物および／またはその記録タグと間の相互作用が低減する、最小限になる、または完全に排除されるような密度で固定化する。したがって、「分子間」会合に起因する偽陽性アッセイシグナルが低減され、最小限にされ、または排除され得る。
ある特定の実施形態では、基板上の分析物分子および／または記録タグの密度を各型の分析物について決定する。例えば、「分子間」相互作用を防止するために、変性ポリペプチド鎖が長いほど密度を低くすべきである。ある特定の態様では、分析物分子および／または記録タグの間の間隔を増大させること（すなわち、密度を低下させること）により、本開示のアッセイのシグナルのバックグラウンドに対する比が増大する。
一部の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを基板上に約０．０００１分子／μｍ２、０．００１分子／μｍ２、０．０１分子／μｍ２、０．１分子／μｍ２、１分子／μｍ２、約２分子／μｍ２、約３分子／μｍ２、約４分子／μｍ２、約５分子／μｍ２、約６分子／μｍ２、約７分子／μｍ２、約８分子／μｍ２、約９分子／μｍ２、または約１０分子／μｍ２の平均密度で蓄積または固定化する。他の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、基板上に約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、または約２００分子／μｍ２の平均密度で蓄積または固定化する。他の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、約１分子／ｍｍ２個、約１０分子／ｍｍ２、約５０分子／ｍｍ２、約１００分子／ｍｍ２、約１５０分子／ｍｍ２、約２００分子／ｍｍ２、約２５０分子／ｍｍ２、約３００分子／ｍｍ２、約３５０分子／ｍｍ２、４００分子／ｍｍ２、約４５０分子／ｍｍ２、約５００分子／ｍｍ２、約５５０分子／ｍｍ２、約６００分子／ｍｍ２、約６５０分子／ｍｍ２、約７００分子／ｍｍ２、約７５０分子／ｍｍ２、約８００分子／ｍｍ２、約８５０分子／ｍｍ２、約９００分子／ｍｍ２、約９５０分子／ｍｍ２、または約１０００分子／ｍｍ２の平均密度で蓄積または固定化する。さらに他の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを基板上に約１×１０３〜約０．５×１０４分子／ｍｍ２の間、約０．５×１０４〜約１×１０４分子／ｍｍ２の間、約１×１０４〜約０．５×１０５分子／ｍｍ２の間、約０．５×１０５〜約１×１０５分子／ｍｍ２の間、約１×１０５〜約０．５×１０６分子／ｍｍ２の間、または約０．５×１０６〜約１×１０６分子／ｍｍ２の間の平均密度で蓄積または固定化する。他の実施形態では、基板上に蓄積または固定化される分析物分子および／または記録タグの平均密度は、例えば、約１分子／ｃｍ２〜約５分子／ｃｍ２の間、約５〜約１０分子／ｃｍ２の間、約１０〜約５０分子／ｃｍ２の間、約５０〜約１００分子／ｃｍ２の間、約１００〜約０．５×１０３分子／ｃｍ２の間、約０．５×１０３〜約１×１０３分子／ｃｍ２の間、１×１０３〜約０．５×１０４分子／ｃｍ２の間、約０．５×１０４〜約１×１０４分子／ｃｍ２の間、約１×１０４〜約０．５×１０５分子／ｃｍ２の間、約０．５×１０５〜約１×１０５分子／ｃｍ２の間、約１×１０５〜約０．５×１０６分子／ｃｍ２の間、または約０．５×１０６〜約１×１０６分子／ｃｍ２の間であってよい。
ある特定の実施形態では、アッセイのバックグラウンドおよび／または偽陽性の結果を低減するために、溶液中の結合性物質の濃度を制御する。
一部の実施形態では、結合性物質の濃度は、約０．０００１ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１０００ｎＭである。他の実施形態では、アッセイにおいて使用される可溶性コンジュゲートの濃度は、約０．０００１ｎＭ〜約０．００１ｎＭの間、約０．００１ｎＭ〜約０．０１ｎＭの間、約０．０１ｎＭ〜約０．１ｎＭの間、約０．１ｎＭ〜約１ｎＭの間、約１ｎＭ〜約２ｎＭの間、約２ｎＭ〜約５ｎＭの間、約５ｎＭ〜約１０ｎＭの間、約１０ｎＭ〜約２０ｎＭの間、約２０ｎＭ〜約５０ｎＭの間、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭの間、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭの間、約２００ｎＭ〜約５００ｎＭの間、約５００ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、または約１０００ｎＭよりも高い。
一部の実施形態では、可溶性結合性物質分子と固定化された分析物分子および／または記録タグとの間の比は、約０．００００１：１、約０．０００１：１、約０．００１：１、約０．０１：１、約０．１：１、約１：１、約２：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約５５：１、約６０：１、約６５：１、約７０：１、約７５：１、約８０：１、約８５：１、約９０：１、約９５：１、約１００：１、約１０４：１、約１０５：１、約１０６：１、またはそれよりも大きい、または上に列挙した比の間の任意の比である。可溶性結合性物質分子と固定化された分析物分子および／または記録タグとの間のより大きな比を使用して、結合および／またはコーディングタグ／記録タグ情報の移行が完了するように駆動することができる。これは、試料中の豊富さが低いタンパク質分析物の検出および／または解析するために特に有用であり得る。
Ｅ．記録タグ
一部の実施形態では、少なくとも１つの記録タグを巨大分子に直接または間接的に付随または共局在させ、固体支持体に接合させる（例えば、図５を参照されたい）。記録タグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、γＰＮＡ、ＧＮＡ、ＢＮＡ、ＸＮＡ、ＴＮＡ、ポリヌクレオチド類似体、またはこれらの組合せを含んでよい。記録タグは、一本鎖であってもよく、部分的にまたは完全に二本鎖であってもよい。記録タグは、平滑末端を有してもよく突出末端を有してもよい。ある特定の実施形態では、結合性物質が巨大分子に結合したら、結合性物質のコーディングタグの識別情報を記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成する。その後の結合サイクルにおいて伸長記録タグに対するさらなる伸長を行うことができる。
記録タグは、固体支持体に、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用、またはそれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手段によって直接または間接的に（例えば、リンカーを介して）接合させることができる。例えば、記録タグを固体支持体にライゲーション反応によって接合させることができる。あるいは、固体支持体は、記録タグを固体支持体に直接または間接的に接合させることを容易にするための作用物質またはコーティングを含んでよい。核酸分子を固体支持体（例えば、ビーズ）に固定化するための戦略は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９００，４８１号；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（２００４年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７３巻：５９７〜６０５頁）；Ｌｕｎｄら、１９８８年（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻：１０８６１〜１０８８０頁）；およびＳｔｅｉｎｂｅｒｇら（２００４年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７３巻：５９７〜６０５頁）に記載されている。
ある特定の実施形態では、巨大分子（例えば、ペプチド）と付随する記録タグの共局在は、巨大分子および記録タグを、固体支持体表面に直接付着させた二機能性リンカーとコンジュゲートすることによって実現される。Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（２００４年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、７３巻：５９７〜６０５頁）。さらなる実施形態では、三機能性部分を使用して固体支持体（例えば、ビーズ）を誘導体化し、得られた二機能性部分を巨大分子および記録タグの両方とカップリングさせる。
巨大分子および固体支持体の付着に関して記載されているものなどの方法および試薬（例えば、クリックケミストリー試薬および光親和性標識試薬）を記録タグの付着にも使用することができる。
特定の実施形態では、単一の記録タグを巨大分子（例えば、ペプチド）に、例えば脱ブロッキングしたＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸に付着させることによって付着させる。別の実施形態では、多数の記録タグを巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）に、例えばリシン残基またはペプチド骨格に付着させる。一部の実施形態では、多数の記録タグで標識した巨大分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）を、それぞれが平均して１つの記録タグで標識された、より小さなペプチドに断片化または消化する。
ある特定の実施形態では、記録タグは、任意選択の、ＵＭＩが付随する各巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）についての一意の識別子タグをもたらす一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む。ＵＭＩは、約３〜約４０塩基、約３〜約３０塩基、約３〜約２０塩基、または約３〜約１０塩基、または約３〜約８塩基であってよい。一部の実施形態では、ＵＭＩは、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、または４０塩基の長さである。ＵＭＩを使用して、複数の伸長記録タグからの配列決定データをデコンボリューションして個々の巨大分子からの配列読み取りを識別することができる。一部の実施形態では、巨大分子のライブラリー内で、各巨大分子に単一の記録タグを付随させ、各記録タグが一意のＵＭＩを含む。他の実施形態では、記録タグの多数のコピーを単一の巨大分子に付随させ、記録タグの各コピーは同じＵＭＩを含む。一部の実施形態では、ＵＭＩは、結合性物質のコーディングタグ内のスペーサーまたはエンコーダー配列と、これらの成分を配列解析中に区別することを容易にするために、異なる塩基配列を有する。
ある特定の実施形態では、記録タグは、例えば、存在する場合、ＵＭＩ以外のバーコードを含む。バーコードは、約３〜約３０塩基、約３〜約２５塩基、約３〜約２０塩基、約３〜約１０塩基、約３〜約１０塩基、約３〜約８塩基の長さの核酸分子である。一部の実施形態では、バーコードは、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、または３０塩基の長さである。一実施形態では、バーコードにより、複数の試料またはライブラリーのマルチプレックス配列決定が可能になる。バーコードを使用して、分配、画分、コンパートメント、試料、空間的位置、または巨大分子（例えば、ペプチド）が由来するライブラリーを識別することができる。バーコードを使用して、多重化された配列データをデコンボリューションし、個々の試料またはライブラリーからの配列読み取りを識別する。例えば、バーコードが付されたビーズは、試料のエマルジョンおよび分配を伴う方法に、例えば、プロテオームを分配するために、有用である。
バーコードは、例えば液滴、マイクロウェル、固体支持体上の物理的領域などのコンパートメントに一意のバーコードが割り当てられたコンパートメントタグを表し得る。コンパートメントと特異的なバーコードの結び付きは、例えば、単一のバーコードが付されたビーズをコンパートメントに封入することによって、例えば、バーコードが付された液滴をコンパートメントに直接混合させるまたは添加することによって、バーコード試薬をコンパートメントに直接プリントまたは注射することによってなどの任意の数のやり方で実現することができる。コンパートメント内のバーコード試薬を使用して、コンパートメント特異的バーコードをコンパートメント内の巨大分子またはその断片に付加する。コンパートメント内へのタンパク質の分配に適用すると、バーコードを使用して、解析されるペプチドをコンパートメント内のそれらの起源であるタンパク質分子にマッピングし戻すことができる。これにより、タンパク質識別が著しく容易になる。コンパートメントバーコードを使用してタンパク質複合体を識別することもできる。
他の実施形態では、コンパートメントの集団のサブセットを表す多数のコンパートメントにそのサブセットを表す一意のバーコードを割り当てることができる。
あるいは、バーコードは、試料識別バーコードであってよい。試料バーコードは、単一反応容器中のまたは単一の固体基板または固体基板の集合（例えば、平面スライド、単一のチューブまたは容器などに含有されるビーズの集団）に固定化された試料のセットの多重化解析に有用である。多くの異なる試料由来の巨大分子を、試料特異的バーコードを有する記録タグで標識することができ、次いで、全ての試料を、固体支持体への固定化、周期的結合、および記録タグ解析の前に一緒にプールすることができる。あるいは、ＤＮＡによりコードされるライブラリー作成後まで試料を別々に保持し、ＤＮＡによりコードされるライブラリーのＰＣＲ増幅中に試料バーコードを付着させ、次いで、配列決定前に混合することができる。この手法は、豊富さのクラスが異なる分析物（例えば、タンパク質）をアッセイする場合に有用であり得る。例えば、試料を分割し、バーコードを付し、一方の部分を豊富さが低い分析物に対する結合性物質を使用して処理し、他方の部分を豊富さがより高い分析物に対する結合性物質を使用して処理することができる。特定の実施形態では、この手法は、特定のタンパク質分析物アッセイのダイナミックレンジをタンパク質分析物の標準の発現レベルの「スイートスポット」に入るように調整するのに役立つ。
ある特定の実施形態では、多数の異なる試料に由来するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を、試料特異的バーコードを含有する記録タグで標識する。多試料バーコードが付されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を周期的結合反応前に混合することができる。このように、デジタル逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）に対する高度に多重化された代替物が有効に創出される（Ｇｕｏ、Ｌｉｕら、２０１２年、Ａｓｓａｄｉ、Ｌａｍｅｒｚら、２０１３年、Ａｋｂａｎｉ、Ｂｅｃｋｅｒら、２０１４年、ＣｒｅｉｇｈｔｏｎおよびＨｕａｎｇ、２０１５年）。デジタルＲＰＰＡ様アッセイの創出には、翻訳研究、バイオマーカー検証、薬物発見、臨床、および高精度の医療における多数の適用がある。
ある特定の実施形態では、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位、例えば、フォワードまたは５’ユニバーサルプライミング部位を含む。ユニバーサルプライミング部位は、ライブラリー増幅反応をプライミングするためおよび／または配列決定のために使用することができる核酸配列である。ユニバーサルプライミング部位としては、これだけに限定されないが、ＰＣＲ増幅のためのプライミング部位、フローセル表面上の相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングするフローセルアダプター配列（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング）、配列決定プライミング部位、またはこれらの組合せを挙げることができる。ユニバーサルプライミング部位は、約１０塩基〜約６０塩基であってよい。一部の実施形態では、ユニバーサルプライミング部位は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’−配列番号１３３）またはＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７プライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’−配列番号１３４）を含む。
ある特定の実施形態では、記録タグは、その末端、例えば３’末端にスペーサーを含む。本明細書で使用される場合、記録タグに関してスペーサー配列への言及は、その同類結合性物質に付随するスペーサー配列、またはその同類結合性物質に付随するスペーサー配列と相補的なスペーサー配列と同一のスペーサー配列を含む。記録タグ上の末端、例えば３’スペーサーにより、第１の結合サイクル中に同類結合性物質の識別情報をそのコーディングタグから記録タグに移行させることが可能になる（例えば、プライマー伸長または粘着末端ライゲーションのための相補的なスペーサー配列のアニーリングによって）。
一実施形態では、スペーサー配列は、約１〜２０塩基の長さ、約２〜１２塩基の長さ、または５〜１０塩基の長さである。スペーサーの長さは、コーディングタグ情報を記録タグに移行させるためのプライマー伸長反応の温度および反応条件などの因子に依存し得る。
好ましい実施形態では、記録タグ内のスペーサー配列を、記録タグ内の他の領域に対して最小の相補性を有するように設計する；同様に、コーディングタグ内のスペーサー配列はコーディングタグ内の他の領域に対して最小の相補性を有するべきである。言い換えれば、記録タグおよびコーディングタグのスペーサー配列は、記録タグまたはコーディングタグ内に存在する一意の分子識別子、バーコード（例えば、コンパートメント、分配、試料、空間的位置）、ユニバーサルプライマー配列、エンコーダー配列、サイクル特異的配列などの成分に対して最小の配列相補性を有するべきである。
結合性物質スペーサーについて記載されている通り、一部の実施形態では、巨大分子のライブラリーに付随する記録タグは、共通のスペーサー配列を共有する。他の実施形態では、巨大分子のライブラリーに付随する記録タグは、それらの同類結合性物質の結合サイクル特異的スペーサー配列と相補的な結合サイクル特異的スペーサー配列を有し、これは、非連鎖状伸長記録タグを使用する場合に有用であり得る（例えば図１０を参照されたい）。
伸長記録タグの収集物は、事後に連鎖状にすることができる（例えば、図１０を参照されたい）。結合サイクルが完了した後、ビーズ固体支持体であって、各ビーズが平均してビーズ当たり１つまたは１つ未満の巨大分子を有し、各巨大分子が巨大分子の部位に共局在する伸長記録タグの収集物を有するビーズ固体支持体をエマルジョン中に入れる。エマルジョンは、各液滴が平均して最大で１ビーズによって占められるように形成する。任意選択のアセンブリＰＣＲ反応をエマルジョン中で実施してビーズ上の巨大分子と共局在する伸長記録タグを増幅し、それらを別の伸長記録タグの異なるサイクル特異的配列間のプライミングによって共直線的な順序でアセンブルさせる（Ｘｉｏｎｇ、Ｐｅｎｇら、２００８年）。その後、エマルジョンを破壊し、アセンブルした伸長記録タグを配列決定する。
別の実施形態では、ＤＮＡ記録タグは、第１の結合サイクルに特異的なユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）、１つまたは複数のバーコード配列（ＢＣｓ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ１）で構成される。第１の結合サイクルでは、結合性物質はＳｐ１相補的スペーサー、エンコーダーバーコード、および任意選択のサイクルバーコード、および第２のスペーサーエレメント（Ｓｐ２）で構成されるＤＮＡコーディングタグを使用する。少なくとも２つの異なるスペーサーエレメントを使用することの有用性は、第１の結合サイクルにより潜在的に複数のＤＮＡ記録タグのうちの１つが選択され、単一のＤＮＡ記録タグが伸長し、その結果、伸長ＤＮＡ記録タグの最後に新しいＳｐ２スペーサーエレメントがもたらされることである。第２の結合サイクルおよびその後の結合サイクルでは、結合性物質は、Ｓｐ１’ではなくＳｐ２’スペーサーだけを含有する。このように、第１のサイクルからの単一の伸長記録タグのみがその後のサイクルで伸長する。別の実施形態では、第２のサイクルおよびその後のサイクルに結合性物質特異的スペーサーを使用することができる。
一部の実施形態では、記録タグは、５’から３’の方向に、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、ＵＭＩ、およびスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、記録タグは、５’から３’の方向に、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、任意選択のＵＭＩ、バーコード（例えば、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間バーコード、またはそれらの任意の組合せ）、およびスペーサー配列を含む。一部の他の実施形態では、記録タグは、５’から３’の方向に、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、バーコード（例えば、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間バーコード、またはそれらの任意の組合せ）、任意選択のＵＭＩ、およびスペーサー配列を含む。
改変ＤＮＡおよびＰＮＡからＵＭＩを生成するためにコンビナトリアル手法を使用することができる。一実施例では、ＵＭＩは、互いに直交性になるように設計された短いワード配列（４〜１５ｍｅｒ）のセットの「化学的ライゲーション」によって構築することができる（ＳｐｉｒｏｐｕｌｏｓおよびＨｅｅｍｓｔｒａ、２０１２年）。「ワード」ポリマーの化学的ライゲーションを導くためにＤＮＡ鋳型を使用する。ＤＮＡ鋳型は、単に溶液中で副成分を一緒に混合することによってコンビナトリアル鋳型構造をアセンブルすることを可能にするハイブリダイズアームを用いて構築する（例えば図１２Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態では、この設計には「スペーサー」配列は存在しない。ワードスペースのサイズは、１０ワードから１０，０００またはそれよりも多くのワードまで変動し得る。ある特定の実施形態では、ワードは、交差ハイブリダイズはしないように互いとは異なるが、それでも比較的均一なハイブリダイゼーション条件が保たれるように選択する。一実施形態では、ワードの長さは、およそ１０塩基であり、サブセット内に約１０００ワードを有する（これは、全１０ｍｅｒワードスペースのたった０．１％である、約４１０＝百万ワード）。これらのワードのセット（サブセット内に１０００）を連鎖状にして、複雑さ＝１０００ｎパワーの最終的なコンビナトリアルＵＭＩを生成することができる。連鎖状にした４つのワードに関しては、これにより、１０１２種の異なるエレメントのＵＭＩ多様性が生じる。これらのＵＭＩ配列を巨大分子（ペプチド、タンパク質など）に単一分子レベルで付加する。一実施形態では、ＵＭＩの多様性は、ＵＭＩを付着させる巨大分子の分子数を超える。このように、ＵＭＩにより、目的の巨大分子が一意的に識別される。コンビナトリアルワードＵＭＩの使用により、多数塩基長のワードを読み取るために一塩基分解能は必要ないので、エラー率が高いシーケンサー（例えば、ナノポアシーケンサー、ナノギャップトンネリングシーケンシングなど）での読み取りが容易になる。コンビナトリアルワード手法は、コンパートメントタグ、分配バーコード、空間バーコード、試料バーコード、エンコーダー配列、サイクル特異的配列、およびバーコードなどの、他の同一性に関する情報価値のある記録タグまたはコーディングタグの成分を生成するためにも使用することができる。ナノポアシーケンシングに関する方法およびエラー許容性ワード（コード）を有する情報をコードするＤＮＡは、当技術分野で公知である（例えば、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる、Ｋｉａｈら、２０１５年、Ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ （ＩＳＩＴ）；Ｇａｂｒｙｓら、２０１５年、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｌｅｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ． ＩＥＥＥ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ （ＩＳＩＴ）；Ｌａｕｒｅら、２０１６年、Ｃｏｄｉｎｇ ｉｎ ２Ｄ： Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｔｅｎｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｃｏｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂａｒｃｏｄｅｓ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１６０５２７９；Ｙａｚｄｉら、２０１５年、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｃａｌｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１巻：２３０〜２４８頁；およびＹａｚｄｉら、２０１５年、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、５巻：１４１３８頁を参照されたい）。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおける伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ構築物は、エラー訂正コードである識別成分（例えば、ＵＭＩ、エンコーダー配列、バーコード、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列など）で構成される。一部の実施形態では、エラー訂正コードは、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される。ナノポアシーケンシングに関しては、電流またはイオンフラックスプロファイルおよび非対称の塩基呼び出しエラーは使用されるナノポアの型および生化学的性質に内因するものであり、上述のエラー訂正手法を使用してよりロバストなＤＮＡコードを設計するためにこの情報を使用することができる。ロバストなＤＮＡナノポアシーケンシングバーコードの使用に対する代替として、バーコード配列の電流またはイオンフラックスシグネチャを直接使用し（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第７，０６０，５０７号）、それによりＤＮＡ塩基呼び出しを完全に回避し、バーコード配列を、Ｌａｓｚｌｏら（２０１４年、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻：８２９〜８３３頁、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている通り、予測される電流／フラックスシグネチャにマッピングし戻すことによってすぐに識別することができる。この論文において、Ｌａｓｚｌｏらは、生物学的ナノポア、ＭｓｐＡから、異なるワードのつながりをナノポアを通過させた時に生じる電流シグネチャ、ならびに、得られた電流シグネチャを配列のユニバースからの可能性のある電流シグネチャのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測にマッピングし戻すことによってＤＮＡ鎖をマッピングおよび識別する能力について記載している（２０１４年、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻：８２９〜８３３頁）。同様の概念を、ＤＮＡコードおよびナノギャップトンネル電流に基づくＤＮＡ配列決定によって生じる電気信号に適用することができる（Ｏｈｓｈｉｒｏら、２０１２年、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、２巻：５０１頁）。
したがって、ある特定の実施形態では、コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別成分は、一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを生成することが可能であり、本明細書において提示される方法のいずれかの解析ステップは、識別成分を識別するために一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを検出することを含む。一部の実施形態では、識別成分は、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組合せから選択される。
ある特定の実施形態では、試料中の巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）の全量または実質的な量（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を記録タグで標識する。巨大分子の標識は、巨大分子を固体支持体に固定化する前に行うこともでき、その後に行うこともできる。
他の実施形態では、試料中の巨大分子のサブセット（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）を記録タグで標識する。特定の実施形態では、試料由来の巨大分子のサブセットに記録タグを用いて標的化（分析物特異的）標識を行う。タンパク質の標的化記録タグ標識は、相補的な標的特異的ベイト配列、例えば記録タグ内の分析物特異的バーコードとアニーリングする短い標的特異的ＤＮＡ捕捉用プローブ、例えば分析物特異的バーコードと連結した標的タンパク質特異的結合性物質（例えば、抗体、アプタマーなど）を使用して実現することができる（例えば図２８Ａを参照されたい）。記録タグは、標的タンパク質上に存在する同類の反応性部分（例えば、クリックケミストリー標識、光親和性標識）に対する反応性部分を含む。例えば、記録タグは、アルキンで誘導体化されたタンパク質と相互作用させるためのアジド部分を含んでよい、または、記録タグは、ネイティブなタンパク質で相互作用させるためのベンゾフェノンを含んでよい、などである（例えば図２８Ａ〜Ｂを参照されたい）。標的タンパク質に標的タンパク質特異的結合性物質を結合させたら、記録タグおよび標的タンパク質をそれらの対応する反応性部分を介してカップリングさせる（例えば図２８Ｂ〜Ｃを参照されたい）。標的タンパク質を記録タグで標識した後、標的タンパク質特異的結合性物質を、標的タンパク質特異的結合性物質に連結したＤＮＡ捕捉用プローブの消化によって除去することができる。例えば、ＤＮＡ捕捉用プローブをウラシル塩基が含有されるように設計することができ、次いでこれを、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））を用いた消化の標的とし、標的タンパク質特異的結合性物質を標的タンパク質から解離させることができる。
一実施例では、標的タンパク質のセットに特異的な抗体を、相補的なベイト配列（例えば、図２８の分析物バーコードＢＣＡの）を用いて設計した記録タグとハイブリダイズするＤＮＡ捕捉用プローブ（例えば、図２８の分析物バーコードＢＣＡ）で標識することができる。タンパク質の試料特異的標識は、試料特異的バーコードを含む記録タグ上の相補的なベイト配列とハイブリダイズするＤＮＡ捕捉用プローブで標識された抗体を使用することによって実現することができる。
別の例では、標的タンパク質特異的アプタマーを試料中のタンパク質のサブセットの標的化記録タグ標識のために使用する。標的特異的アプタマーを、記録タグ内の相補的なベイト配列とアニーリングするＤＮＡ捕捉用プローブに連結する。記録タグは、対応する反応性部分を有する標的タンパク質とカップリングするための反応性化学プローブまたは光反応性化学プローブ（例えば、ベンゾフェノン（ＢＰ））を含む。アプタマーがその標的タンパク質分子に結合し、記録タグが標的タンパク質の極めて近傍になり、その結果、記録タグと標的タンパク質がカップリングする。
小分子タンパク質親和性リガンドに付着させた光反応性化学プローブを使用した光親和性（ＰＡ）タンパク質標識は以前記載されている（Ｐａｒｋ， Ｋｏｈら、２０１６年）。典型的な光反応性化学プローブとしては、以前に記載されている照射波長の下で活性化されたベンゾフェノンに基づくプローブ（反応性ジラジカル、３６５ｎｍ）、フェニルジアジリンに基づくプローブ（反応性炭素、３６５ｎｍ）、およびアジ化フェニルに基づくプローブ（反応性ニトレンフリーラジカル、２６０ｎｍ）が挙げられる（ＳｍｉｔｈおよびＣｏｌｌｉｎｓ、２０１５年）。好ましい実施形態では、タンパク質試料中の標的タンパク質を、Ｌｉらにより開示された、ベンゾフェノンで標識した記録タグ内のベイト配列を同類結合性物質（例えば、核酸アプタマー（例えば図２８を参照されたい））に付着させたＤＮＡ捕捉用プローブとハイブリダイズさせる方法（Ｌｉ、Ｌｉｕら、２０１３年）を使用して試料バーコードを含む記録タグで標識する。光親和性標識されたタンパク質標的に関しては、光親和性部分により標的タンパク質ではなく抗体が自己標識される可能性があるので、抗体よりもＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを標的タンパク質特異的結合性物質として使用することが好ましい。対照的に、光親和性標識は、核酸に対してはタンパク質よりも効率が低く、それにより、ＤＮＡ指向性化学標識または光標識についてはアプタマーがより良好なビヒクルになる。光親和性標識と同様に、Ｒｏｓｅｎら（Ｒｏｓｅｎ、Ｋｏｄａｌら、２０１４年、Ｋｏｄａｌ、Ｒｏｓｅｎら、２０１６年）記載されているものと同様に、アプタマー結合性部位の近傍にある反応性リシン（または他の部分）のＤＮＡ指向性化学標識を使用することもできる。
上述の実施形態では、標的特異的結合性物質と記録タグを連結するために、ハイブリダイゼーションに加えて他の型の連結を使用することができる（例えば図２８Ａを参照されたい）。例えば、図２８Ｂに示されている通り、２つの部分を、捕捉された標的タンパク質（または他の巨大分子）が記録タグと共有結合したら、切断され、結合性物質を放出するように設計されたリンカーを使用して共有結合により連結することができる。適切なリンカーを記録タグの様々な位置、例えば、３’末端、または記録タグの５’末端に付着させたリンカー内などに付着させることができる。
Ｆ．結合性物質およびコーディングタグ
一態様では、本明細書に記載のキットは、分析物、例えば、巨大分子に結合することが可能な結合性物質を含む。結合性物質は、巨大分子の成分または特徴に結合することが可能な任意の分子であってよい（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子など）。結合性物質は、天然に存在する分子であってもよく、合成的に作製された分子であってもよく、組換えによって発現させた分子であってもよい。結合性物質は、巨大分子の単一の単量体またはサブユニット（例えば、ペプチドの単一のアミノ酸）に結合し得る、または巨大分子の多数の連結したサブユニット（例えば、より長いペプチド分子のジペプチド、トリペプチド、またはより高次のペプチド）に結合し得る。
ある特定の実施形態では、結合性物質を、共有結合により結合するように設計することができる。共有結合は、正確な部分への結合が条件付けられるまたはそれが有利になるように設計することができる。例えば、ＮＴＡＡおよびその同類のＮＴＡＡ特異的結合性物質はそれぞれ、ＮＴＡＡ特異的結合性物質が同類のＮＴＡＡに結合したらカップリング反応が行われてこれら２つの間に共有結合性の連結が生じるように、反応性基を用いて修飾することができる。同類の反応性基を欠く他の位置への結合性物質の非特異的結合では共有結合による付着はもたらされない。結合性物質とその標的の間の共有結合により、非特異的に結合した結合性物質を除去するためによりストリンジェントな洗浄を使用することが可能になり、したがって、アッセイの特異度が増大する。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、選択的結合性物質であってよい。本明細書で使用される場合、選択的結合とは、結合性物質が、特異的なリガンド（例えば、アミノ酸またはアミノ酸のクラス）に、異なるリガンド（例えば、アミノ酸またはアミノ酸のクラス）への結合と比べて優先的に結合できることを指す。選択性は、一般に、結合性物質との複合体において１つのリガンドが別のリガンドで置換される反応についての平衡定数とされる。一般には、そのような選択性は、リガンドの空間的な幾何学的形状ならびに／またはリガンドが結合性物質に結合する様式および程度、例えば、水素結合またはファンデルワールス力（非共有結合性の相互作用）によるもしくは可逆的または非可逆的な共有結合による、結合性物質への付着などに関連付けられる。選択性は、絶対的なものとは対照的に相対的なものであってよいこと、および、リガンド濃度を含めた種々の因子が選択性に影響を及ぼし得ることも理解されるべきである。したがって、一実施例では、結合性物質は、２０種の標準のアミノ酸のうちの１種に選択的に結合する。非選択的結合の例では、結合性物質は、２０種の標準のアミノ酸のうちの２種またはそれよりも多くに結合し得る。
本明細書に開示されているキットおよび方法の実施において、結合性物質の、巨大分子の特徴または成分に選択的に結合する能力は、結合性物質のコーディングタグ情報の巨大分子に付随する記録タグへの移行、記録タグ情報のコーディングタグへの移行、またはコーディングタグ情報および記録タグ情報のジタグ分子への移行を可能にするために十分なものであればよい。したがって、選択的とは、巨大分子が暴露される他の結合性物質に対して相対的なものであればよい。結合性物質の選択性は、特定のアミノ酸に対して絶対的なものである必要はなく、非極性もしくは非極性側鎖を有するアミノ酸、または電気的に（正にもしくは負に）荷電した側鎖を有するアミノ酸、または芳香族側鎖を有するアミノ酸などのアミノ酸のクラス、または一部の特異的なクラスまたはサイズの側鎖などに選択的なものであってよいことも理解されるべきである。
特定の実施形態では、結合性物質は、目的の巨大分子に対して高い親和性および高い選択性を有する。特に、低い解離速度で高い結合親和性を有することがコーディングタグと記録タグとの間の情報の移行に効果的である。ある特定の実施形態では、結合性物質のＫｄは、約５０ｎＭもしくはそれ未満、約１０ｎＭもしくはそれ未満、約５ｎＭもしくはそれ未満、約１ｎＭもしくはそれ未満、約０．５ｎＭもしくはそれ未満、または約０．１ｎＭもしくはそれ未満である。特定の実施形態では、結合性物質を巨大分子に、結合が完了するように駆動するために、結合性物質のＫｄの＞１０×、＞１００×、または＞１０００×の濃度で添加する。抗体の単一のタンパク質分子への結合カイネティクスに関する詳細な考察は、Ｃｈａｎｇら（Chang, Rissin et al. 2012）に記載されている。
結合性物質の、ペプチドの小さなＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に対する親和性を増大させるために、ＮＴＡＡを、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）などの「免疫原性」ハプテンで修飾することができる。これは、ＤＮＰ基をＮＴＡＡのアミン基に付着させるサンガー試薬であるジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を使用して周期的な配列決定手法で実行することができる。商業的な抗ＤＮＰ抗体は、低ｎＭ範囲（約８ｎＭ、ＬＯ−ＤＮＰ−２）で親和性を有する（Ｂｉｌｇｉｃｅｒ， Ｔｈｏｍａｓら、２００９年）；そのように、ＤＮＰで（ＤＮＦＢを介して）修飾されたいくつものＮＴＡＡに対して親和性が高いＮＴＡＡ結合性物質を工学的に操作し、同時に特定のＮＴＡＡに対する良好な結合選択性を実現することが可能であるはずなのは当然である。別の例では、ＮＴＡＡを、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）を使用してスルホニルニトロフェノール（ＳＮＰ）で修飾することができる。アセチル基またはアミジニル（グアニジニル）基などの代替的なＮＴＡＡ修飾因子を用いて同様の親和性の増強を実現することもできる。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、ペプチド分子のＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、介在するアミノ酸、ジペプチド（２つのアミノ酸の配列）、トリペプチド（３つのアミノ酸の配列）、またはより高次のペプチドに結合し得る。一部の実施形態では、結合性物質のライブラリー内の各結合性物質は、特定のアミノ酸、例えば、２０種の標準の天然に存在するアミノ酸のうちの１種に選択的に結合する。標準の、天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、アミノ酸の翻訳後修飾に結合し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数の翻訳後修飾を含み、これは、同じものであっても異なるものであってもよい。ペプチドのＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、介在するアミノ酸、またはこれらの組合せを翻訳後に修飾することができる。アミノ酸に対する翻訳後修飾としては、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、エリミニル化、フラビン付着、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ハイプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質付加、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、プロピオニル化、レチニリデンシッフ塩基形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、セレン化、サクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられる（ＳｅｏおよびＬｅｅ、２００４年、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３７巻：３５〜４４頁も参照されたい）。
ある特定の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのグリコシル化の状態を検出するための結合性物質としてレクチンを使用する。レクチンは、遊離の炭水化物または糖タンパク質のグリカンエピトープを選択的に認識することができる炭水化物−結合性タンパク質である。種々のグリコシル化の状態（例えば、コア−フコース、シアル酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチル−グルコサミン）を認識するレクチンの一覧は、Ａ、ＡＡＡ、ＡＡＬ、ＡＢＡ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＣＬ、ＡＯＬ、ＡＳＡ、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣ２Ｌ−Ａ、ＢＣ２ＬＣＮ、ＢＰＡ、ＢＰＬ、Ｃａｌｓｅｐａ、ＣＧＬ２、ＣＮＬ、Ｃｏｎ、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ、ＤＳＡ、ＥＣＡ、ＥＥＬ、Ｆ１７ＡＧ、Ｇａｌ１、Ｇａｌ１−Ｓ、Ｇａｌ２、Ｇａｌ３、Ｇａｌ３Ｃ−Ｓ、Ｇａｌ７−Ｓ、Ｇａｌ９、ＧＮＡ、ＧＲＦＴ、ＧＳ−Ｉ、ＧＳ−ＩＩ、ＧＳＬ−Ｉ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＨＨＬ、ＨＩＨＡ、ＨＰＡ、Ｉ、ＩＩ、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＢＡ、ＬＣＡ、ＬＥＡ、ＬＥＬ、Ｌｅｎｔｉｌ、Ｌｏｔｕｓ、ＬＳＬ−Ｎ、ＬＴＬ、ＭＡＡ、ＭＡＨ、ＭＡＬ＿Ｉ、Ｍａｌｅｃｔｉｎ、ＭＯＡ、ＭＰＡ、ＭＰＬ、ＮＰＡ、Ｏｒｙｓａｔａ、ＰＡ−ＩＩＬ、ＰＡ−ＩＬ、ＰＡＬａ、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ、ＰＨＡ−Ｐ、ＰＨＡＥ、ＰＨＡＬ、ＰＮＡ、ＰＰＬ、ＰＳＡ、ＰＳＬ１ａ、ＰＴＬ、ＰＴＬ−Ｉ、ＰＷＭ、ＲＣＡ１２０、ＲＳ−Ｆｕｃ、ＳＡＭＢ、ＳＢＡ、ＳＪＡ、ＳＮＡ、ＳＮＡ−Ｉ、ＳＮＡ−ＩＩ、ＳＳＡ、ＳＴＬ、ＴＪＡ−Ｉ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＴｘＬＣＩ、ＵＤＡ、ＵＥＡ−Ｉ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＶＦＡ、ＶＶＡ、ＷＦＡ、ＷＧＡを含む（Ｚｈａｎｇら、２０１６年、ＭＡＢＳ、８巻：５２４〜５３５頁を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、修飾または標識されたＮＴＡＡに結合し得る。修飾または標識されたＮＴＡＡは、ＰＩＴＣ、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ、もしくは１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロリド）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬で標識されたものであってよい。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、アプタマー（例えば、ペプチドアプタマー、ＤＮＡアプタマー、またはＲＮＡアプタマー）、抗体、アンチカリン、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼアダプタータンパク質（ＣｌｐＳ）、抗体結合性断片、抗体模倣物、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、γＰＮＡ、架橋核酸（ＢＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（ＴＮＡ）、またはそのバリアント）であってよい。
本明細書で使用される場合、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）という用語は、広範な意味で使用され、インタクトな抗体分子、例えば、これだけに限定されないが、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、および免疫グロブリンＭだけでなく、少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する抗体分子の任意の免疫反応性成分（複数可）も含む。抗体は、天然に存在するものであってもよく、合成的に作製されたものであってもよく、組換えによって発現させたものであってもよい。抗体は、融合タンパク質であってよい。抗体は、抗体模倣物であってよい。抗体の例としては、これだけに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）、ミニボディ（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、架橋結合した抗体断片、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ分子、アルファボディ、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、サイクロチド、分子などが挙げられる。抗体工学またはタンパク質工学技法を使用して得られる免疫反応性産物もまた、明白に抗体という用語の意味の範囲内に入る。関連するプロトコールを含めた抗体および／またはタンパク質工学の詳細な説明は、他の場所の中でも、Ｊ． ＭａｙｎａｒｄおよびＧ． Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、２０００年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．、２巻：３３９〜７６頁；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｒ． ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ． Ｄｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（２００１年）；米国特許第５，８３１，０１２号；およびＳ． Ｐａｕｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）において見いだすことができる。
抗体と同様に、ペプチドを特異的に認識する核酸およびペプチドアプタマーは、公知の方法を使用して作製することができる。アプタマーは、標的分子に、高度に特異的な、コンフォメーション依存性様式で結合し、一般には、非常に高い親和性を有するが、より低い結合親和性を有するアプタマーも所望であれば選択することができる。アプタマーは、標的間を、メチル基またはヒドロキシル基が存在するかしないかなどの非常に小さな構造的差異に基づいて区別することが示されており、また、ある特定のアプタマーは、Ｄ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体を区別することができる。薬物、金属イオン、および有機色素、ペプチド、ビオチン、ならびに、これだけに限定されないが、ストレプトアビジン、ＶＥＧＦ、およびウイルスタンパク質を含めたタンパク質を含めた小分子標的に結合するアプタマーが得られている。アプタマーは、ビオチン化の後、フルオレセイン標識の後、ならびにガラス表面およびマイクロスフェアに付着した際に機能活性を保持することが示されている（Ｊａｙａｓｅｎａ、１９９９年、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、４５巻：１６２８〜５０頁；Ｋｕｓｓｅｒ、２０００年、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻：２７〜３９頁；Ｃｏｌａｓ、２０００年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、４巻：５４〜９頁を参照されたい）。アルギニンおよびＡＭＰに特異的に結合するアプタマーも記載されている（ＰａｔｅｌおよびＳｕｒｉ、２０００年、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７４巻：３９〜６０頁を参照されたい）。特定のアミノ酸に結合するオリゴヌクレオチドアプタマーがＧｏｌｄら（１９９５年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻：７６３〜９７頁）に開示されている。アミノ酸に結合するＲＮＡアプタマーも記載されている（ＡｍｅｓおよびＢｒｅａｋｅｒ、２０１１年、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．、８巻；８２〜８９頁；Ｍａｎｎｉｒｏｎｉら、２０００年、ＲＮＡ、６巻：５２０〜２７頁；Ｆａｍｕｌｏｋ、１９９４年、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１６巻：１６９８〜１７０６頁）。
結合性物質は、天然に存在するまたは合成的に作製されたタンパク質を、アミノ酸配列内に１つまたは複数の変異が導入されるように遺伝子工学によって修飾して、特定の巨大分子の成分または特徴（例えば、ＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、または翻訳後修飾されたアミノ酸もしくはペプチド）に結合する工学的に操作されたタンパク質を生じさせることによって作出することができる。例えば、エキソペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ）、エキソプロテアーゼ、変異エキソプロテアーゼ、変異アンチカリン、変異ＣｌｐＳ、抗体、またはｔＲＮＡ合成酵素を改変して、特定のＮＴＡＡに選択的に結合する結合性物質を創出することができる。別の例では、カルボキシペプチダーゼを改変して、特定のＣＴＡＡに選択的に結合する結合性物質を創出することができる。結合性物質はまた、修飾されたＮＴＡＡもしくは修飾されたＣＴＡＡ、例えば、翻訳後修飾（例えば、リン酸化ＮＴＡＡまたはリン酸化ＣＴＡＡ）を有するもの、または標識（例えば、ＰＴＣ、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢを使用して）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ、または１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロリドを使用して）、またはチオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、アセチル化試薬、アミジン化（グアニジニル化）試薬、もしくはチオベンジル化試薬を使用して）で修飾されたものを特異的に結合するように設計または改変し、利用することができる。タンパク質の定向進化のための戦略は、当技術分野で公知であり（例えば、Yuan et al., 2005、Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69: 373-392によって概説されている）、それらとして、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、ＣＡＤディスプレイ、エマルジョン、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ、細菌表面ディスプレイなどが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾されたＮＴＡＡに選択的に結合する結合性物質を利用することができる。例えば、ＮＴＡＡをフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と反応させてフェニルチオカルバモイル−ＮＴＡＡ誘導体を形成することができる。このように、結合性物質をフェニルチオカルバモイル部分のフェニル基ならびにＮＴＡＡのアルファ炭素Ｒ基のどちらにも選択的に結合するように適合させることができる。このように、ＰＩＴＣを使用することにより、以下に考察する通り、その後の、ＮＴＡＡのエドマン分解による切断が可能になる。別の実施形態では、ＮＴＡＡをサンガー試薬（ＤＮＦＢ）と反応させて、ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡを生成することができる（例えば図３を参照されたい）。任意選択で、ＤＮＦＢを、ＤＮＦＢが高度に可溶性である１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス［（トリフルオロメチル）スルホニル］イミド（［エミン］［Ｔｆ２Ｎ］）などのイオン性液体と共に使用する。このように、結合性物質を、ＤＮＰとＮＴＡＡのＲ基の組合せに選択的に結合するように工学的に操作することができる。ＤＮＰ部分の付加により、結合性物質とＮＴＡＡの相互作用に対するより大きな「ハンドル」がもたらされ、より高い親和性相互作用が導かれるはずである。さらに別の実施形態では、結合性物質は、ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡを認識し、それによりペプチドのアミノペプチダーゼ分解の周期的制御がもたらされるように工学的に操作されたアミノペプチダーゼであってよい。ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡが切断されたら、新しく露出したＮＴＡＡへの結合およびその切断のためにＤＮＦＢ誘導体化の別のサイクルを実施する。好ましい特定の実施形態では、アミノペプチダーゼは、単量体メタロ−プロテアーゼであり、そのようなアミノペプチダーゼは亜鉛によって活性化される（ＣａｌｃａｇｎｏおよびＫｌｅｉｎ、２０１６年）。別の例では、結合性物質は、例えば４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）を使用することによってスルホニルニトロフェノール（ＳＮＰ）で修飾されたＮＴＡＡに選択的に結合し得る。さらに別の実施形態では、結合性物質は、アセチル化されたまたはアミジン化されたＮＴＡＡに選択的に結合し得る。
ＮＴＡＡを修飾するために使用することができる他の試薬としては、トリフルオロエチルイソチオシアネート、イソチオシアン酸アリル、およびジメチルアミノアゾベンゼンイソチオシアネートが挙げられる。
結合性物質を、修飾されたＮＴＡＡに対する高い親和性、修飾されたＮＴＡＡに対する高い特異性、またはその両方のために工学的に操作することができる。一部の実施形態では、結合性物質を、ファージディスプレイを使用した有望な親和性足場の定向進化によって開発することができる。中程度〜低い親和性の結合性物質に関しては、同時結合／エンコーディングステップを使用することによって効率的な情報の移行をもたらすことができる、あるいは、エンコーディングまたは情報書き込みステップの温度を低下させて結合性物質の解離速度を遅らせることができる。一部の実施形態では、同時結合／エンコーディングステップをエンコーディングまたは情報書き込みステップの温度の低下と組み合わせることができる。
個々のまたは小さな群の標識（ビオチン化）されたＮＴＡＡに結合し、それを切断する工学的に操作されたアミノペプチダーゼ変異体が記載されている（その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０６５３２２号を参照されたい）。アミノペプチダーゼは、タンパク質またはペプチドのＮ末端からアミノ酸を切断する酵素である。天然のアミノペプチダーゼは、非常に限られた特異性を有し、一般的に、Ｎ末端アミノ酸を前進的に切断し、アミノ酸を次々に切断する（Ｋｉｓｈｏｒら、２０１５年、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４８８巻：６〜８頁）。しかし、残基特異的アミノペプチダーゼが同定されている（Ｅｒｉｑｕｅｚら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８０年、１２巻：６６７〜７１頁；Ｗｉｌｃｅら、１９９８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：３４７２〜３４７７頁；Ｌｉａｏら、２００４年、Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ．、１３巻：１８０２〜１０頁）。アミノペプチダーゼを、特定の部分（例えば、ＰＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰなど）で標識された、標準のアミノ酸を表す２０種の異なるＮＴＡＡに特異的に結合するように工学的に操作することができる。ペプチドのＮ末端の段階的分解の制御は、標識の存在下でのみ活性な（例えば、結合活性または触媒活性）、工学的に操作されたアミノペプチダーゼを使用することによって実現される。別の例では、Ｈａｖｒａｎａｋら（米国特許公開第２０１４／０２７３００４号）が、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）を特異的なＮＴＡＡ結合物質として工学的に操作することに関して記載している。ａａＲＳのアミノ酸結合ポケットは、同類のアミノ酸に結合する内因性の能力を有するが、一般に、不十分な結合親和性および特異性を示す。さらに、これらの天然のアミノ酸結合物質はＮ末端標識を認識しない。ａａＲＳ足場の定向進化を使用して、Ｎ末端標識に関してＮ末端アミノ酸を認識する、親和性がより高く、特異性がより高い結合性物質を生成することができる。
別の例では、高度に選択的な工学的に操作されたＣｌｐＳも文献に記載されている。Ｅｍｉｌｉらは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｌｐＳタンパク質のファージディスプレイによる定向進化の結果、ＮＴＡＡをアスパラギン酸、アルギニン、トリプトファン、およびロイシン残基に対して選択的に結合する能力を有する４つの異なるバリアントがもたらされることを記載している（米国特許第９，５６６，３３５号、その全体が参照により組み込まれる）。一実施形態では、結合性物質の結合性部分は、天然のＮ末端タンパク質認識および結合に関与するアダプタータンパク質の進化的に保存されたＣｌｐＳファミリーのメンバーまたはそのバリアントを含む。細菌におけるアダプタータンパク質のＣｌｐＳファミリーは、Schuenemann et al., (2009), "Structural basis of N-end rulesubstrate recognition in Escherichia coli by the ClpAP adaptor proteinClpS," EMBO Reports 10 (5)、およびRoman-Hernandez et al., (2009),"Molecular basis of substrate selection by the N-end rule adaptor proteinClpS," PNAS 106 (22): 8888-93に記載されている。Guo et al., (2002), JBC 277 (48):46753-62、およびWang et al., (2008), "The molecular basis of N-end rulerecognition," Molecular Cell 32: 406-414も参照されたい。一部の実施形態では、Ｓｃｈｕｅｎｅｍａｎｎらに同定されたＣｌｐＳ疎水性結合ポケットに対応するアミノ酸残基を、所望の選択性を有する結合性部分を生成するために修飾する。ＣｌｐＳファミリーメンバーとしては、ＣｌｐＳ１ ＲＰＡ１２０３、ＣｌｐＳ２ ｂｌｌ５１５４、ＣｌｐＳ２ ＲＰＡ３１４８、ＣｌｐＳ ＢＡＶ２０９１、ＣｌｐＳ ＢＰ２７５６、ＣｌｐＳ ＥＣＰ＿０８９６、ＣｌｐＳ ＥＣＳＥ＿０９３９、ＣｌｐＳ ＳＧ１１０１、ＣｌｐＳ ＳＣＯ２９１６、ＳＣＥ１９Ａ．１６ｃ、ＣｌｐＳ Ｓｐｕｔｗ３１８１＿１７８１、ＣｌｐＳ ＶＣ＿１１４３、ＣｌｐＳ ＷＳ０３３６、ＣｌｐＳ ＸＣＣ１９６６、ＣｌｐＳ Ｔｃｒ＿１１１１、ＣｌｐＳ ＴＤＥ＿２１２３、ＣｌｐＳ ＺＭＯ１７２５、ＣｌｐＳ１ ｂｌｌ２６３６、ＣｌｐＳ ＢＣＡＮ＿Ａ１１８８、ＣｌｐＳ ＢａｍＭＣ４０６＿２４３７、ＣｌｐＳ Ｂａｍｂ＿２５６７、ＣｌｐＳ ＢＭＡ１０２４７＿２１５７、ＣｌｐＳ ＢＭＡＳＡＶＰ１＿Ａ０５７５、ＣｌｐＳ ＢＵＲＰＳ１１０６Ａ＿０９６３、ＣｌｐＳ Ｂｃｅｐ１８０８＿２５９７、ＣｌｐＳ ＣＣＮＡ＿０２５５２、およびそれらの断片、バリアント、変異体、ホモログ、または改変バージョンが挙げられ、これらに限定されない。
一実施形態では、結合性物質の結合性部分は、Stein et al., (2016),"Structural Basis of an N-Degron Adaptor with More StringentSpecificity," Structure 204(2): 232-242.に開示されているものなどのＣｌｐＳ２タンパク質またはポリペプチドまたはその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されているＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドは、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＣｌｐＳ２（例えば、配列番号１９８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｌｐＳ（例えば、配列番号１９９）、および／またはＣ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ＣｌｐＳ（例えば、配列番号２００）などの参照ＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドと配列同一性を共有するバリアント、変異体、ホモログ、または改変バージョンを含む。一態様では、結合性物質の結合性部分は、配列番号１９８と、配列番号１９９と、および／または配列番号２００と、約１０％の配列同一性、約１５％の配列同一性、約２０％の配列同一性、約２５％の配列同一性、約３０％の配列同一性、約３５％の配列同一性、約４０％の配列同一性、約４５％の配列同一性、約５０％の配列同一性、約５５％の配列同一性、約６０％の配列同一性、約６５％の配列同一性、約７０％の配列同一性、約７５％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一実施形態では、結合性部分は、ＵＢＲボックス認識配列ファミリーのメンバー、またはＵＢＲボックス認識配列ファミリーのバリアントを含む。ＵＢＲ認識ボックスは、Tasaki et al., (2009), JBC 284 (3): 1884-95に記載されている。例えば、結合性部分は、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、またはその変異体、バリアント、もしくはホモログを含んでよい。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、結合性部分に加えて、１つまたは複数の検出可能な標識、例えば蛍光標識をさらに含む。一部の実施形態では、結合性物質は、コーディングタグなどのポリヌクレオチドを含まない。必要に応じて、結合性物質は、合成または天然の抗体を含む。一部の実施形態では、結合性物質は、アプタマーを含む。一実施形態では、結合性物質は、アダプタータンパク質のＣｌｐＳファミリーの改変メンバーなどのポリペプチド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｌｐＳ結合性ポリペプチドのバリアント、および検出可能な標識を含む。一実施形態では、検出可能な標識は、光学的に検出可能なである。一部の実施形態では、検出可能な標識は、蛍光性部分、色分けされたナノ粒子、量子ドットまたはこれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、標識は、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ（商標）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡなどの誘導体化ローダミン色素、リン光体、ポリメタジン色素、蛍光ホスホラミダイト、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ、緑色蛍光タンパク質、アクリジン、シアニン、シアニン５色素、シアニン３色素、５−（２’−アミノエチル）−アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ＢＯＤＩＰＹ、１２０ ＡＬＥＸＡまたは前述のもののいずれかの誘導体もしくは改変などのコア色素分子を包含するポリスチレン色素を含む。一実施形態では、検出可能な標識は、光退色に抵抗性である一方で、特有の容易に検出可能な波長において高い信号対雑音比で多数のシグナル（例えば、光子）を生じさせる。
特定の実施形態では、アンチカリンを、標識されたＮＴＡＡ（例えば、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル化など）に対する高い親和性および高い特異性の両方について工学的に操作する。アンチカリン足場のある特定の変形は、ベータバレル構造に起因して、単一のアミノ酸への結合に適した形状を有する。Ｎ末端アミノ酸（修飾を伴うまたは伴わない）は、この「ベータバレル」バケットに潜在的に適合し、認識され得る。工学的に操作された新規の結合活性を有する親和性が高いアンチカリンが記載されている（Ｓｋｅｒｒａ、２００８年、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５巻：２６７７〜２６８３頁によって概説されている）。例えば、フルオレセインおよびジゴキシゲニンに対して親和性が高い結合性（低ｎＭ）を有するアンチカリンが工学的に操作されている（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、２０１２年）。新しい結合機能のために代替的足場を工学的に操作することについては、Ｂａｎｔａら（２０１３年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．、１５巻：９３〜１１３頁）によっても概説されている。
所与の一価の結合性物質の機能的親和性（結合活性）を、一価の結合性物質の二価またはより高次の多量体を使用することによって少なくとも１桁分だけ増大させることができる（ＶａｕｑｕｅｌｉｎおよびＣｈａｒｌｔｏｎ、２０１３年）。結合活性とは、多数の同時に存在する非共有結合性の相互作用の蓄積された強度を指す。個々の結合相互作用は容易に解離し得る。しかし、多数の結合相互作用が同時に存在する場合、単一の結合相互作用の一過性の解離では結合性タンパク質は発散せず、結合相互作用は回復する可能性がある。結合性物質の結合活性を増大させるための代替的方法は、結合性物質に付着させるコーディングタグと巨大分子に付随させる記録タグに相補配列を含めることである。
一部の実施形態では、修飾されたＣ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）に選択的に結合する結合性物質を利用することができる。カルボキシペプチダーゼは、遊離のカルボキシル基を含有する末端アミノ酸を切断するプロテアーゼである。いくつものカルボキシペプチダーゼがアミノ酸の優先性を示し、例えば、カルボキシペプチダーゼＢは、アルギニンおよびリシンなどの塩基性アミノ酸において優先的に切断する。カルボキシペプチダーゼを改変して、特定のアミノ酸に選択的に結合する結合性物質を創出することができる。一部の実施形態では、カルボキシペプチダーゼを、修飾部分ならびにＣＴＡＡのアルファ炭素Ｒ基のどちらにも選択的に結合するように工学的に操作することができる。したがって、工学的に操作されたカルボキシペプチダーゼは、Ｃ末端標識に関連して標準のアミノ酸を表す２０種の異なるＣＴＡＡを特異的に認識し得る。ペプチドのＣ末端からの段階的分解の制御は、標識の存在下でのみ活性な（例えば、結合活性または触媒活性）工学的に操作されたカルボキシペプチダーゼを使用することによって実現される。一実施例では、ＣＴＡＡをパラ−ニトロアニリド基または７−アミノ−４−メチルクマリニル基によって修飾することができる。
本明細書に記載の方法において使用するための結合物質を生成するために工学的に操作することができる他の潜在的な足場としては、アンチカリン、アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、ＣｌｐＳ、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、Ｔ細胞受容体、ジンクフィンガータンパク質、チオレドキシン、ＧＳＴ Ａ１−１、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、アフィチン、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＨＰＳＴＩ、細胞内抗体、リポカリン、ＰＨＤ−フィンガー、Ｖ（ＮＡＲ）ＬＤＴＩ、エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｙ）、Ｉｇ（ＮＡＲ）、ノッチン、マキシボティ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ネオカルジノスタチン、ｐＶＩＩＩ、テンダミスタット、ＶＬＲ、プロテインＡ足場、ＭＴＩ−ＩＩ、エコチン、ＧＣＮ４、Ｉｍ９、クニッツドメイン、ミクロボディ、ＰＢＰ、トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）、テトラネクチン（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、ＷＷドメイン、ＣＢＭ４−２、ＤＸ−８８、ＧＦＰ、ｉＭａｂ、Ｌｄｌ受容体ドメインＡ、Ｍｉｎ−２３、ＰＤＺ−ドメイン、トリ膵臓ポリペプチド、カリブドトキシン／１０Ｆｎ３、ドメイン抗体（Ｄａｂ）、ａ２ｐ８アンキリンリピート、昆虫防御Ａペプチド、設計されたＡＲタンパク質、Ｃ型レクチンドメイン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Ｓｒｃ相同性ドメイン３（ＳＨ３）、またはＳｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）が挙げられる。
結合性物質を、より高い温度および穏やかな変性条件（例えば、尿素、グアニジンチオシアネート、イオン溶液の存在など）に耐えるように工学的に操作することができる。変性剤の使用は、結合性物質の直鎖ペプチドエピトープへの結合に干渉する可能性がある、表面に結合したペプチドの二次構造、例えば、α−ヘリックス構造、β−ヘアピン、β−鎖、および他のこのような構造などを低減するのに役立つ。一実施形態では、結合サイクル中にペプチド二次構造を低減するために１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（［ＥＭＩＭ］＋［ＡＣＥ］）などのイオン性液体を使用する（Ｌｅｓｃｈ、Ｈｅｕｅｒら、２０１５年）。
記載されている任意の結合性物質はまた、結合性物質に関する識別情報を含有するコーディングタグも含む。コーディングタグは、それが付随する結合性物質に関する一意の識別情報をもたらす約３塩基〜約１００塩基の核酸分子である。コーディングタグは、約３〜約９０塩基、約３〜約８０塩基、約３〜約７０塩基、約３〜約６０塩基、約３塩基〜約５０塩基、約３塩基〜約４０塩基、約３塩基〜約３０塩基、約３塩基〜約２０塩基、約３塩基〜約１０塩基、または約３塩基〜約８塩基を含み得る。一部の実施形態では、コーディングタグは、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、５５塩基、６０塩基、６５塩基、７０塩基、７５塩基、８０塩基、８５塩基、９０塩基、９５塩基、または１００塩基の長さである。コーディングタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド類似体、またはこれらの組合せで構成されるものであってよい。ポリヌクレオチド類似体は、ＰＮＡ、ガンマＰＮＡ、ＢＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、アルキルリボシル置換ポリヌクレオチド、ホスホロチオエートポリヌクレオチド、および７−デアザプリン類似体を含む。
コーディングタグは、付随する結合性物質に関する識別情報をもたらすエンコーダー配列を含む。エンコーダー配列は、約３塩基〜約３０塩基、約３塩基〜約２０塩基、約３塩基〜約１０塩基、または約３塩基〜約８塩基である。一部の実施形態では、エンコーダー配列は、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、または３０塩基の長さである。エンコーダー配列の長さにより、生成され得る一意のエンコーダー配列の数が決定される。コード配列が短いほど、生成される一意のコード配列の数が少なくなり、これは、少数の結合性物質を使用する場合に有用であり得る。巨大分子の集団を解析する場合にはより長いエンコーダー配列が望ましい可能性がある。例えば、５塩基のエンコーダー配列は式５’−ＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１３５）（式中、Ｎは任意の天然に存在するヌクレオチドまたは類似体であってよい）を有する。４種の天然に存在するヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧを使用すると、５塩基の長さを有する一意のエンコーダー配列の総数は１，０２４になる。一部の実施形態では、例えば、塩基が全て同一であるか、少なくとも３つの連続した塩基が同一であるか、またはその両方であるエンコーダー配列を除くことにより、一意のエンコーダー配列の総数を減らすことができる。特定の実施形態では、≧５０種の一意のエンコーダー配列のセットを結合性物質ライブラリーに使用する。
一部の実施形態では、コーディングタグまたは記録タグの識別成分、例えば、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、空間的領域バーコード、サイクル特異的配列またはそれらの任意の組合せを、Ｈａｍｍｉｎｇ距離、Ｌｅｅ距離、非対称Ｌｅｅ距離、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓ、または同様のエラー訂正方法に供する。Ｈａｍｍｉｎｇ距離は、長さが等しい２つのつながりの間の異なる位置の数を指す。Ｈａｍｍｉｎｇ距離により、１つのつながりを他のつながりに変えるために必要な置換の最小数が測定される。Ｈａｍｍｉｎｇ距離は、妥当な距離があいたエンコーダー配列を選択することによってエラーを訂正するために使用することができる。したがって、エンコーダー配列が５塩基である例では、使用できるエンコーダー配列の数は２５６種の一意のエンコーダー配列に減少する（１→４４エンコーダー配列のＨａｍｍｉｎｇ距離＝２５６種のエンコーダー配列）。別の実施形態では、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組合せを、周期的な脱コーディングプロセスによって容易に読み取られるように設計する（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１４巻：８７０〜７頁）。別の実施形態では、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、分配バーコード、空間バーコード、試料バーコード、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組合せを、一塩基分解能が必要なのではなく、多数の塩基のワード（約５〜２０塩基の長さ）を読み取る必要があるので、正確度の低いナノポアシーケンシングによって読み取られるように設計する。本開示の方法において使用することができる１５ｍｅｒのエラー訂正Ｈａｍｍｉｎｇバーコードのサブセットは配列番号１〜６５に記載されており、それらの対応する逆相補的な配列は配列番号６６〜１３０に記載されている。
一部の実施形態では、結合性物質のライブラリー内の一意の結合性物質のそれぞれが一意のエンコーダー配列を有する。例えば、２０種の一意のエンコーダー配列を２０種の標準のアミノ酸に結合する２０種の結合性物質のライブラリーに使用することができる。修飾されたアミノ酸（例えば、翻訳後修飾されたアミノ酸）を識別するために追加的なコーディングタグ配列を使用することができる。別の例では、３０種の一意のエンコーダー配列を２０種の標準のアミノ酸および１０種の翻訳後修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、メチル化アミノ酸）に結合する３０種の結合性物質のライブラリーに使用することができる。他の実施形態では、２種またはそれよりも多くの異なる結合性物質が同じエンコーダー配列を共有してよい。例えば、それぞれが異なる標準のアミノ酸に結合する２種の結合性物質が同じエンコーダー配列を共有してよい。
ある特定の実施形態では、コーディングタグは、一方の末端または両方の末端にスペーサー配列をさらに含む。スペーサー配列は、約１塩基〜約２０塩基、約１塩基〜約１０塩基、約５塩基〜約９塩基、または約４塩基〜約８塩基である。一部の実施形態では、スペーサーは、約１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基または２０塩基の長さである。一部の実施形態では、コーディングタグ内のスペーサーは、エンコーダー配列よりも短い、例えば、エンコーダー配列よりも少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６、塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、２０塩基、または２５塩基短い。他の実施形態では、コーディングタグ内のスペーサーは、エンコーダー配列と同じ長さである。ある特定の実施形態では、スペーサーは、結合性物質特異的であり、したがって、前の結合サイクルからのスペーサーは現行の結合サイクルにおいて適切な結合性物質からのスペーサーとのみ相互作用する。例は、両方の抗体が巨大分子に逐次的に結合する場合にのみ情報移行を可能にするスペーサー配列を含有する同類の抗体の対である。スペーサー配列は、プライマー伸長反応のためのプライマーアニーリング部位、またはライゲーション反応における副子もしくは粘着末端として使用することができる。コーディングタグ上の５’スペーサー（例えば図５Ａ、「＊Ｓｐ’」を参照されたい）は、Ｔｍを上昇させるために、記録タグ上の３’スペーサーに対する偽性相補的塩基を任意選択で含有してよい（Ｌｅｈｏｕｄら、２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：３４０９〜３４１９頁）。
一部の実施形態では、結合性物質の集合内のコーディングタグは、アッセイに使用される共通のスペーサー配列を共有する（例えば、多数の結合サイクル方法に使用される結合性物質のライブラリー全体がそれらのコーディングタグに共通のスペーサーを有する）。別の実施形態では、コーディングタグは、特定の結合サイクルを識別する結合サイクルタグで構成される。他の実施形態では、結合性物質のライブラリー内のコーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサー配列を有する。一部の実施形態では、コーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサー配列を１つ含む。例えば、第１の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル１」特異的スペーサー配列を含み、第２の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル２」特異的スペーサー配列を含み、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。さらなる実施形態では、第１の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル１」特異的スペーサー配列および「サイクル２」特異的スペーサー配列を含み、第２の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル２」特異的スペーサー配列および「サイクル３」特異的スペーサー配列を含み、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。この実施形態は、結合サイクルが完了した後の非連鎖状伸長記録タグのＰＣＲアセンブリに有用である（例えば図１０を参照されたい）。一部の実施形態では、スペーサー配列は、プライマー伸長反応または粘着末端ライゲーション反応を開始するために記録タグまたは伸長記録タグ内の相補的なスペーサー配列とアニーリングするのに十分な数の塩基を含む。
記録タグの集団が巨大分子に付随する場合、サイクル特異的スペーサー配列を使用してコーディングタグの情報を単一の記録タグ上に連鎖状にすることもできる。第１の結合サイクルでコーディングタグからランダムに選択された記録タグに情報を移行させ、その後の結合サイクルではサイクル依存性スペーサー配列を使用して伸長記録タグのみをプライミングすることができる。より詳細には、第１の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル１」特異的スペーサー配列および「サイクル２」特異的スペーサー配列を含み、第２の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル２」特異的スペーサー配列および「サイクル３」特異的スペーサー配列を含み、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。第１の結合サイクルからの結合性物質のコーディングタグは、相補的なサイクル１特異的スペーサー配列を介して記録タグとアニーリングすることが可能である。コーディングタグ情報が記録タグに移行したら、結合サイクル１の最後に、サイクル２特異的スペーサー配列が伸長記録タグの３’末端に位置する。第２の結合サイクルからの結合性物質のコーディングタグは、相補的なサイクル２特異的スペーサー配列を介して伸長記録タグとアニーリングすることが可能である。コーディングタグ情報が伸長記録タグに移行したら、結合サイクル２の最後に、サイクル３特異的スペーサー配列が伸長記録タグの３’末端に位置し、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。この実施形態は、多数の結合サイクルの中で特定の結合サイクルにおける結合情報の移行が前の結合サイクルを経た（伸長）記録タグ上でのみ起こるものとする。しかし、時には、結合性物質は同類の巨大分子に結合し損ねる。「追跡」ステップとして各結合サイクル後に結合サイクル特異的スペーサーを含むオリゴヌクレオチドを使用して、結合サイクルの事象が失敗したとしても結合サイクルを同期させたままにすることができる。例えば、同類結合性物質が結合サイクル１の間に巨大分子に結合し損ねた場合、結合サイクル１後に、サイクル１特異的スペーサー、サイクル２特異的スペーサーの両方、および「ヌル」エンコーダー配列を含むオリゴヌクレオチドを使用する追跡ステップを追加する。「ヌル」エンコーダー配列は、エンコーダー配列、または、例えば、「ヌル」結合サイクルを正に識別する特異的なバーコードが存在しないことであってよい。「ヌル」オリゴヌクレオチドは、記録タグとサイクル１特異的スペーサーを介してアニーリングすることが可能であり、サイクル２特異的スペーサーが記録タグに移行される。したがって、結合サイクル１事象の失敗にもかかわらず、結合サイクル２からの結合性物質が伸長記録タグとサイクル２特異的スペーサーを介してアニーリングすることが可能である。「ヌル」オリゴヌクレオチドにより、伸長記録タグ内で結合サイクル１に結合事象失敗の印が付けられる。
好ましい実施形態では、結合サイクル特異的エンコーダー配列をコーディングタグに使用する。結合サイクル特異的エンコーダー配列は、完全に一意の分析物（例えば、ＮＴＡＡ）−結合サイクルエンコーダーバーコードを使用することによって、または分析物（例えば、ＮＴＡＡ）エンコーダー配列とサイクル特異的バーコードを接合させた組合せ使用によってのいずれかで実現することができる（例えば図３５を参照されたい）。組合せ手法を使用することの有利な点は、設計する必要がある総バーコードがより少なくなることである。１０サイクルにわたって使用する２０種の分析物結合性物質のセットに対しては、２０種の分析物エンコーダー配列バーコードおよび１０種の結合サイクル特異的バーコードのみを設計する必要がある。対照的に、結合サイクルが結合性物質エンコーダー配列に直接埋め込まれる場合には、合計２００種の独立したエンコーダーバーコードを設計する必要があり得る。結合サイクル情報をエンコーダー配列に直接埋め込むことの利点は、ナノポア読み取りにエラー訂正バーコードを使用する場合にコーディングタグの全長を最小化することができることである。エラー耐性バーコードの使用により、配列決定プラットフォームおよびよりエラーが生じやすい手法を使用して高度に正確なバーコード識別が可能になるが、迅速な解析スピード、低費用、および／またはよりポータブルな器械使用などの他の利点がある。そのような例の１つは、ナノポアに基づく配列決定読み取りである。
一部の実施形態では、コーディングタグは、結合性物質の近位にある第２の（３’）スペーサー配列内の切断可能なまたはニッキング可能なＤＮＡ鎖を含む（例えば図３２を参照されたい）。例えば、３’スペーサーは、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）によってニッキングすることができる１つまたは複数のウラシル塩基を有してよい。ＵＳＥＲにより、ウラシルの位置に一ヌクレオチドギャップが生成される。別の例では、３’スペーサーは、２重鎖の一方の鎖のみを加水分解するニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列を含んでよい。例えば、３’スペーサー配列を切断またはニッキングするために使用する酵素は、一方のＤＮＡ鎖のみ（コーディングタグの３’スペーサー）に作用し、したがって、（伸長）記録タグに属する２重鎖内の他方の鎖はインタクトなまま残される。これらの実施形態は、プライマー伸長が起こった後に結合性物質を（伸長）記録タグから変性によらずに除去し、その後の結合サイクルに利用可能な一本鎖ＤＮＡスペーサー配列を伸長記録タグ上に残すことが可能になるので、タンパク質をそれらのネイティブなコンフォメーションで解析するアッセイにおいて特に有用である。
コーディングタグは、パリンドローム配列を含有するように設計することもできる。コーディングタグにパリンドローム配列を含めることにより、新生の成長している伸長記録タグが、コーディングタグ情報が移行するに従ってそれ自体でフォールディングすることが可能になる。伸長記録タグはより緻密な構造にフォールディングし、望ましくない分子間結合およびプライマー伸長事象が有効に減少する。
一部の実施形態では、コーディングタグは、同じ分析物を認識する結合性物質を用いて以前に伸長した記録タグ上でのみプライミング伸長することが可能な分析物特異的スペーサーを含む。伸長記録タグは、分析物特異的スペーサーおよびエンコーダー配列を含むコーディングタグを使用して一連の結合事象から組み立てることができる。一実施形態では、第１の結合事象では、一般的な３’スペーサープライマー配列および次の結合サイクルで使用するための５’末端の分析物特異的スペーサー配列で構成されるコーディングタグを伴う結合性物質を使用する；次いで、その後の結合サイクルでは、コードされる分析物特異的３’スペーサー配列を伴う結合性物質を使用する。この設計により、正確な一連の同類結合事象のみから創出される増幅可能なライブラリーエレメントがもたらされる。オフターゲットのおよび交差反応性結合相互作用により、増幅可能でない伸長記録タグが導かれる。一実施例では、同類結合性物質と特定の巨大分子分析物の対を２つの結合サイクルに使用して分析物を識別する。第１の同類結合性物質は、一般的な記録タグのスペーサー配列上でのプライミング伸長のための一般的なスペーサー３’配列および次の結合サイクルで使用される５’末端のコードされる分析物特異的スペーサーで構成されるコーディングタグを含有する。対応する同類結合性物質対に関しては、第２の結合性物質の３’分析物特異的スペーサーと第１の結合性物質の５’分析物特異的スペーサーを対応させる。このように、結合性物質の同類の対の正確な結合によってのみ、増幅可能な伸長記録タグがもたらされる。交差反応性結合性物質は記録タグ上でプライミング伸長することができず、増幅可能な伸長記録タグ産物は生成しない。この手法では、本明細書に開示されている方法の特異性が著しく増強される。同じ原理を、３つの結合サイクルを使用するトリプレット結合性物質セットに適用することができる。第１の結合サイクルでは、記録タグ上の一般的な３’Ｓｐ配列と結合性物質コーディングタグ上の一般的なスペーサーを相互作用させる。プライマー伸長により、分析物特異的５’スペーサーを含めたコーディングタグ情報を記録タグに移行させる。その後の結合サイクルでは、結合性物質のコーディングタグ上の分析物特異的スペーサーを使用する。
ある特定の実施形態では、コーディングタグは、コーディングタグが連結した結合性物質についての一意の分子識別子をさらに含んでよい。結合性物質についてのＵＭＩは、配列決定読み取りのために伸長コーディングタグまたはジタグ分子を利用し、エンコーダー配列と組み合わせて、結合性物質の同一性および巨大分子に対する一意の結合事象の数に関する情報をもたらす実施形態において有用であり得る。
別の実施形態では、コーディングタグは、ランダム化配列（Ｎのセット、ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔからのランダムな選択、またはワードのセットからのランダムな選択である）を含む。一連の「ｎ」回の結合サイクルおよびコーディングタグ情報の（伸長）記録タグへの移行の後、最終的な伸長記録タグ産物は、一連のこれらのランダム化配列で構成され、これは、最終的な伸長記録タグについての「複合性の」一意の分子識別子（ＵＭＩ）を集合的に形成する。例えば、各コーディングタグが（ＮＮ）配列（４＊４＝１６の可能性のある配列）を含有する場合、１０回の配列決定サイクル後に、分布した２ｍｅｒの組合せセットが１０種形成され、可能性のある伸長記録タグ産物についての複合性のＵＭＩ配列１６１０〜１０１２種という総多様性が創出される。ペプチド配列決定実験で約１０９個の分子を使用するとすれば、この多様性は、配列決定実験のための有効なＵＭＩのセットを創出するために十分すぎるほどである。多様性の増大は、単にコーディングタグ内により長いランダム化領域（ＮＮＮ、ＮＮＮＮなど）を使用することによって実現することができる。
コーディングタグは、３’スペーサー配列の３’末端に組み入れられたターミネーターヌクレオチドを含んでよい。結合性物質が巨大分子およびそれらの対応するコーディングタグに結合し、記録タグが相補的なスペーサー配列を介してアニーリングした後、情報をコーディングタグから記録タグに移行させるため、または情報を記録タグからコーディングタグに移行させるためにプライマー伸長することが可能になる。コーディングタグの３’末端にターミネーターヌクレオチドを付加することにより、記録タグ情報のコーディングタグへの移行が防止される。伸長コーディングタグの生成を伴う本明細書に記載の実施形態に関しては、例えば、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を防止するために、記録タグの３’末端にターミネーターヌクレオチドを含める場合があることが理解される。
コーディングタグは、一本鎖分子であってもよく、二本鎖分子であってもよく、部分的に二本鎖であってもよい。コーディングタグは、平滑末端、突出末端、またはその一方を含んでよい。一部の実施形態では、コーディングタグは、部分的に二本鎖であり、それにより、コーディングタグが成長している伸長記録タグの内部のエンコーダーおよびスペーサー配列にアニーリングすることが防止される。
コーディングタグは、結合性物質に、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用を含めた当技術分野で公知の任意の手段を使用して直接または間接的に接合される。一部の実施形態では、コーディングタグを結合性物質に酵素的にまたは化学的に接合することができる。一部の実施形態では、コーディングタグを結合性物質にライゲーションによって接合することができる。他の実施形態では、コーディングタグを結合性物質に親和性結合対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）を介して接合する。
一部の実施形態では、結合性物質とコーディングタグをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇ相互作用によって接合する（例えば図４３Ｂを参照されたい）。ＳｐｙＴａｇペプチドは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と自発的なイソペプチド連結によって不可逆的な共有結合を形成し、それにより、力および厳しい条件に対して抵抗性であるペプチド相互作用を創出するための遺伝子によりコードされたやり方がもたらされる（Ｚａｋｅｒｉら、２０１２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、１０９巻：Ｅ６９０〜６９７頁；Ｌｉら、２０１４年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４２６巻：３０９〜３１７頁）。結合性物質を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含む融合タンパク質として発現させることができる。一部の実施形態では、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を結合性物質のＮ末端またはＣ末端に付加する。ＳｐｙＴａｇペプチドとコーディングタグを標準のコンジュゲーション化学を使用してカップリングすることができる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３年））。
他の実施形態では、結合性物質とコーディングタグをＳｎｏｏｐＴａｇ−ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質相互作用によって接合する。ＳｎｏｏｐＴａｇペプチドは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質とイソペプチド結合を形成する（Ｖｅｇｇｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、２０１６年、１１３巻：１２０２〜１２０７頁）。結合性物質を、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含む融合タンパク質として発現させることができる。一部の実施形態では、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質を結合性物質のＮ末端またはＣ末端に付加する。ＳｎｏｏｐＴａｇペプチドとコーディングタグを標準のコンジュゲーション化学を使用してカップリングすることができる。
さらに他の実施形態では、結合性物質とコーディングタグをＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質融合タグとその化学的リガンドによって接合する。ＨａｌｏＴａｇは、合成リガンド（ＨａｌｏＴａｇリガンド）と共有結合するように設計された改変ハロアルカンデハロゲナーゼである（Ｌｏｓら、２００８年、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３巻：３７３〜３８２頁）。合成リガンドは、種々の有用な分子に付着したクロロアルカンリンカーを含む。ＨａｌｏＴａｇとクロロアルカンリンカーの間に、高度に特異的であり、生理的条件下で迅速に起こり、基本的に不可逆的である共有結合が形成される。
ある特定の実施形態では、巨大分子を非同類結合性物質とも接触させる。本明細書で使用される場合、非同類結合性物質とは、考察されている特定の巨大分子とは異なる巨大分子の特徴または成分に対して選択的である結合性物質を指す。例えば、ｎ ＮＴＡＡがフェニルアラニンであり、ペプチドを、それぞれフェニルアラニン、チロシン、およびアスパラギンに対して選択的な３種の結合性物質と接触させる場合、フェニルアラニンに対して選択的な結合性物質がｎ番目のＮＴＡＡ（すなわち、フェニルアラニン）に選択的に結合することが可能な第１の結合性物質ということになり、一方、他の２種の結合性物質はそのペプチドに対して非同類結合性物質ということになる（フェニルアラニン以外のＮＴＡＡに対して選択的であるので）。しかし、チロシン結合性物質およびアスパラギン結合性物質は、試料中の他のペプチドに対して同類結合性物質になり得る。次いで、ｎ番目のＮＴＡＡ（フェニルアラニン）をペプチドから切断し、それにより、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸を（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ（例えば、チロシン）に変換し、次いで、ペプチドを同じ３種の結合性物質と接触させると、チロシンに対して選択的な結合性物質が、（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ（すなわち、チロシン）に選択的に結合することが可能な第２の結合性物質ということになり、一方、他の２種の結合性物質は非同類結合性物質ということになる（チロシン以外のＮＴＡＡに対して選択的であるので）。
したがって、作用物質が結合性物質であるか非同類結合性物質であるかは、結合のために現在利用可能な特定の巨大分子の特徴または成分の性質に依存することが理解されるべきである。また、多数の巨大分子を多重化反応において解析する場合、１つの巨大分子に対する結合性物質は別の巨大分子に対しては非同類結合性物質であり得、逆もまた同じである。したがって、結合性物質に関する以下の説明は本明細書に記載されているあらゆる型の結合性物質（すなわち、同類結合性物質および非同類結合性物質のどちらにも）に適用可能であることが理解されるべきである。
Ｇ．コーディングタグ情報の記録タグへの周期的移行のための方法およびキット
本明細書に記載のキットおよび方法では、結合性物質が巨大分子に結合したら、その連結したコーディングタグの識別情報を巨大分子に付随する記録タグに移行させ、それにより、「伸長記録タグ」を生成する。伸長記録タグは、実施された各結合サイクルを表す、結合性物質のコーディングタグからの情報を含み得る。しかし、伸長記録タグはまた、例えば、結合性物質が巨大分子に結合し損ねたことが原因で、コーディングタグが見落とされた、損傷を受けた、または欠陥があることが原因で、プライマー伸長反応が失敗したことが原因で、「飛ばされた」結合サイクルを経る可能性もある。結合事象が起こったとしても、例えば、コーディングタグが損傷を受けたまたは欠陥があることが原因で、プライマー伸長反応にエラーが導入されたことが原因で、コーディングタグから記録タグへの情報の移行が不完全なであるまたは１００％未満の正確さになる可能性がある）。したがって、伸長記録タグは、その付随する巨大分子において起こった結合事象の１００％、または最大で９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、６５％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％を表す可能性がある。さらに、伸長記録タグ中に存在するコーディングタグ情報は、対応するコーディングタグに対して少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する可能性がある。
ある特定の実施形態では、伸長記録タグは、多数の連続的な結合事象を表す、多数のコーディングタグからの情報を含む可能性がある。これらの実施形態では、単一の連鎖状の伸長記録タグは単一の巨大分子を表す可能性がある（例えば図２Ａを参照されたい）。本明細書で言及される通り、コーディングタグ情報の記録タグへの移行は、多数の連続的な結合事象を伴う方法において起こると思われる伸長記録タグへの移行も含む。
ある特定の実施形態では、結合事象情報をコーディングタグから記録タグに周期的に移行させる（例えば図２Ａおよび２Ｃを参照されたい）。交差反応性結合事象を、配列決定後に、少なくとも２つの異なるコーディングタグを要求し、２つまたはそれよりも多くの独立した結合事象を識別し、同じ結合性物質のクラス（特定のタンパク質と同類）にマッピングすることにより、情報科学的にフィルターにかけて除去することができる。任意選択の試料バーコードまたはコンパートメントバーコードを記録タグに含めることができ、同じく任意選択のＵＭＩ配列も含めることができる。コーディングタグは、任意選択のＵＭＩ配列をエンコーダーおよびスペーサー配列と一緒に含有してもよい。ユニバーサルプライミング配列（Ｕ１およびＵ２）も増幅およびＮＧＳ配列決定のために伸長記録タグに含めることもできる（例えば図２Ａを参照されたい）。
特定の結合性物質に付随するコーディングタグ情報を記録タグに種々の方法を使用して移行させることができる。ある特定の実施形態では、コーディングタグの情報を記録タグに、プライマー伸長によって移行させる（Ｃｈａｎ、ＭｃＧｒｅｇｏｒら、２０１５年）。記録タグまたは伸長記録タグの３’末端のスペーサー配列をコーディングタグの３’末端の相補的なスペーサー配列とアニーリングさせ、ポリメラーゼ（例えば、鎖置換ポリメラーゼ）により、アニーリングしたコーディングタグを鋳型として使用して記録タグ配列を伸長させる（例えば図５〜７を参照されたい）。一部の実施形態では、コーディングタグと伸長記録タグに存在する内部のエンコーダーおよびスペーサー配列のハイブリダイゼーションを防止するために、コーディングタグエンコーダー配列および５’スペーサーと相補的なオリゴヌクレオチドをコーディングタグとプレアニーリングさせることができる。例えば、一本鎖のままのコーディングタグ上の３’末端スペーサーを記録タグ上の末端３’スペーサーと結合させる。他の実施形態では、コーディングタグと内部の部位とのアニーリングを防止するために、新生記録タグを一本鎖結合性タンパク質でコーティングすることができる。あるいは、完全に二本鎖のコーディングタグへの３’末端の侵入を容易にするために、新生記録タグをＲｅｃＡ（またはｕｖｓＸなどの関連する相同体）でコーティングすることもできる（Ｂｅｌｌら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：２７４〜２７８頁）。この形態により、二本鎖のコーディングタグが内部の記録タグエレメントと相互作用することが防止されるが、それでも、伸長記録タグのＲｅｃＡコーティングされた３’尾部による鎖の侵入は起こりやすい（Ｂｅｌｌら、２０１５年、Ｅｌｉｆｅ、４巻：ｅ０８６４６頁）。一本鎖結合性タンパク質が存在することにより、鎖置換反応が容易になり得る。
好ましい実施形態では、プライマー伸長のために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、３’−５エキソヌクレアーゼ活性が限られているまたはそれを欠く。そのようなポリメラーゼの多数の例のいくつかとして、クレノウｅｘｏ−（ＤＮＡ Ｐｏｌ １のクレノウ断片）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ−、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ（シーケナーゼ２．０）、Ｐｆｕ ｅｘｏ−、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片ｅｘｏ−、Ｂｃａ Ｐｏｌ、９°Ｎ Ｐｏｌ、およびＰｈｉ２９ Ｐｏｌ ｅｘｏ−が挙げられる。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、室温および最大４５℃までで活性である。別の実施形態では、「ウォームスタート」バージョンの好熱性ポリメラーゼを使用し、したがって、ポリメラーゼを約４０℃〜５０℃で活性化し、使用する。例示的なウォームスタートポリメラーゼは、Ｂｓｔ ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）である。
鎖置換複製に有用な添加剤としては、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２産物、ファージＴ７遺伝子２．５タンパク質、ファージＰｆ３ ＳＳＢ、複製タンパク質Ａ ＲＰＡ３２およびＲＰＡ１４サブユニット（Ｗｏｌｄ、１９９７年）などの、細菌起源、ウイルス起源、または真核生物起源のいくつもの一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質（ＳＳＢタンパク質）のいずれか；アデノウイルスＤＮＡ結合性タンパク質、単純ヘルペスタンパク質ＩＣＰ８、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、ヘルペスウイルスＵＬ２９ ＳＳＢ様タンパク質などの他のＤＮＡ結合性タンパク質；ファージＴ７ヘリカーゼ／プライマーゼ、ファージＴ４遺伝子４１ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｅｐヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ｒｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび真核生物トポイソメラーゼ（Ｃｈａｍｐｏｕｘ、２００１年）などの、ＤＮＡ複製に関与することが公知のいくつもの複製複合体タンパク質のいずれかが挙げられる。
記録タグの末端スペーサー配列により伸長自己伸長がプライミングされる場合などのミスプライミングまたは自己プライミング事象は、一本鎖結合性タンパク質（Ｔ４遺伝子３２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢなど）、ＤＭＳＯ（１〜１０％）、ホルムアミド（１〜１０％）、ＢＳＡ（１０〜１００μｇ／ｍｌ）、ＴＭＡＣｌ（１〜５ｍＭ）、硫酸アンモニウム（１０〜５０ｍＭ）、ベタイン（１〜３Ｍ）、グリセロール（５〜４０％）、またはエチレングリコール（５〜４０％）をプライマー伸長反応に含めることによって最小化することができる。
大多数のＡ型ポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き（内因的または工学的除去）、例えば、クレノウｅｘｏ−、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ−（シーケナーゼ２．０）、およびＴａｑポリメラーゼは、２重鎖増幅産物の３’平滑末端へのヌクレオチド、例えばアデノシン塩基（より低い程度でＧ塩基、配列の状況に依存する）の非鋳型付加を触媒する。Ｔａｑポリメラーゼに関しては、３’ピリミジン（Ｃ＞Ｔ）により、非鋳型アデノシン付加が最小限になり、一方、３’プリンヌクレオチド（Ｇ＞Ａ）では非鋳型アデノシン付加が有利になる。プライマー伸長のためにＴａｑポリメラーゼを使用する実施形態では、コーディングタグにおいて、結合性物質から遠位のスペーサー配列と隣接するバーコード配列（例えば、エンコーダー配列またはサイクル特異的配列）との間にチミジン塩基を置くことにより、記録タグのスペーサー配列の３’末端上の非鋳型アデノシンヌクレオチドの散在的包含に適応させる（例えば図４３Ａ）。このように、伸長記録タグ（非鋳型アデノシン塩基を有するまたは有さない）は、コーディングタグとアニーリングし、プライマー伸長を受けることが可能である。
あるいは、特にＯ−へリックス領域における１つまたは複数の点変異によって非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を著しく低下させた変異ポリメラーゼ（中温性または好熱性）を使用することにより、非鋳型塩基の付加を減少させることができる（例えば米国特許第７，５０１，２３７号を参照されたい）（Ｙａｎｇ、Ａｓｔａｔｋｅら、２００２年）。３’エキソヌクレアーゼが欠損しており、鎖置換能を有するＰｆｕ ｅｘｏ−も非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を有さない。
別の実施形態では、最適なポリメラーゼ伸長緩衝液は、４０〜１２０ｍＭの、例えばＴｒｉｓ−酢酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝剤、ｐＨ６〜９で構成される。
伸長記録タグの末端スペーサー配列と伸長記録タグの内部の領域の自己アニーリングによって開始される自己プライミング／ミスプライミング事象は、記録／伸長記録タグに偽相補的塩基を含めることによって最小化することができる（Ｌａｈｏｕｄ、Ｔｉｍｏｓｈｃｈｕｋら、２００８年）、（Ｈｏｓｈｉｋａ、Ｃｈｅｎら、２０１０年）。偽相補的塩基は、化学修飾が存在することに起因する互いとの２重鎖の形成に対する有意に低下したハイブリダイゼーション親和性を示す。しかし、多くの偽相補的修飾塩基は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と強い塩基対を形成し得る。ある特定の実施形態では、コーディングタグスペーサー配列は、多数のＡ塩基およびＴ塩基で構成され、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成を使用して市販の偽相補的塩基２−アミノアデニンおよび２−チオチミンを記録タグに組み入れる。追加的な偽相補的塩基を、プライマー伸長中に、偽相補的ヌクレオチドを反応に添加することによって伸長記録タグに組み入れることができる（Ｇａｍｐｅｒ、Ａｒａｒら、２００６年）。
溶液中のコーディングタグで標識された結合性物質と固定化されたタンパク質の記録タグとの非特異的な相互作用を最小限にするために、記録タグスペーサー配列と相補的な競合剤オリゴヌクレオチド（遮断オリゴヌクレオチドとも称される）を結合反応に添加して、非特異的な相互作用を最小限にする（例えば図３２Ａ〜Ｄを参照されたい）。遮断オリゴヌクレオチドは、比較的短いものである。プライマー伸長前に過剰な競合オリゴヌクレオチドを結合反応から洗い流し、これにより、特にわずかな温度の上昇（例えば、３０〜５０℃）に曝露させると、アニーリングした競合オリゴヌクレオチドが記録タグから有効に解離する。遮断オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を防止するために３’末端にターミネーターヌクレオチドを含んでよい。
ある特定の実施形態では、記録タグ上のスペーサー配列とコーディングタグ上の相補的なスペーサー配列のアニーリングは、プライマー伸長反応条件下（すなわち、アニーリングＴｍが反応温度と同様である）で準安定である。これにより、コーディングタグのスペーサー配列で記録タグのスペーサー配列とアニーリングした任意の遮断オリゴヌクレオチドを置き換えることが可能になる。
特定の結合性物質に付随するコーディングタグ情報は、ライゲーションによって記録タグに移行させることもできる（例えば、図６および図７を参照されたい）。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションであってもよく、粘着末端ライゲーションであってもよい。ライゲーションは、酵素的ライゲーション反応であってよい。リガーゼの例としては、これだけに限定されないが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｇａｓｅ（登録商標）が挙げられる。あるいは、ライゲーションは、化学的ライゲーション反応であってよい（例えば、図７を参照されたい）。図において、スペーサーを欠くライゲーションは、「記録ヘルパー」配列とコーディングタグ上のアームのハイブリダイゼーションを使用することによって実現される。アニーリングした相補配列を、標準の化学的ライゲーションまたは「クリックケミストリー」を使用して化学的にライゲーションする（Gunderson, Huang et al. 1998、Peng, Li et al. 2010, El-Sagheer,Cheong et al. 2011、El-Sagheer, Sanzone et al. 2011、Sharma, Kent et al. 2012、Roloffand Seitz 2013、Litovchick, Clark et al. 2014、Roloff, Ficht et al. 2014）。一態様では、「スペーサーを欠く」ライゲーションは、例えば図４６に示されている通り、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩまたはＩＩ（例えば、Ｌｕｃｉｇｅｎからのもの）などのｓｓＤＮＡリガーゼを使用して実現することもできる。「スペーサーを欠く」ライゲーションの使用は、ライブラリーエレメントの全長さを著しく低減すること、および／またはライブラリー増幅中の鋳型スイッチングを低減もしくは最小限にすることにおいて有利である。
一実施形態では、キットは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含む。ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の不在下でｓｓＤＮＡの末端とライゲーションすることが可能である。例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼおよびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼはどちらも、５’−リン酸および３’−ヒドロキシル基を有するｓｓＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーション（すなわち、環状化）触媒させるために一般に使用される熱安定性リガーゼである。相補ＤＮＡ配列上で互いに隣接してアニーリングするＤＮＡ末端をライゲーションさせるＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼとは対照的に、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ｓｓＤＮＡの末端を相補配列の不在下でライゲーションさせる。したがって、酵素は、直鎖状ｓｓＤＮＡから環状ｓｓＤＮ分子を作出するために有用である。環状ｓｓＤＮＡ分子は、ローリングサークル複製またはローリングサークル転写のための基質として使用することができる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）酵素は、ｓｓＤＮＡに対する活性に加えて、３’−ヒドロキシルリボヌクレオチドおよび５’−リン酸化リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを有する一本鎖核酸のライゲーションに関しても活性を有する。
ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼのいずれも本開示において使用することができる。２つの酵素は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩよりもアデニル化がはるかに少なく、また、最良の活性のためにＡＴＰを必要とするという点で異なる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）Ｉは、ＡＴＰの存在下でｓｓＤＮＡを再環状化させる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩは、ほぼ１００％アデニル化されており、したがって、反応緩衝剤にＡＴＰを添加する必要がない。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩは化学量論反応として働き、この酵素が酵素活性部位内のアデニル化されているオリゴの５’末端を結合し、次いで、オリゴをライゲーションさせ、停止する。反応はＡＴＰを含有しないので、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩは１：１の酵素：オリゴ構成で働く。特定の実施形態では、本明細書のキットは、バクテリオファージＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標））などのＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、またはＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１などの古細菌ＲＮＡリガーゼを含む。前述の実施形態のいずれかでは、キットは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型ＫＱ、またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｋ２２７ＱなどのＲＮＡリガーゼを含んでよい。
別の実施形態では、ＰＮＡの移行は、公開された技法を使用した化学的ライゲーションで実現することができる。ＰＮＡの構造は、５’Ｎ末端アミン基および非反応性３’Ｃ末端アミドを有するようなものである。ＰＮＡの化学的ライゲーションには、末端を化学的に活性になるように修飾することが必要である。これは、一般には、５’Ｎ末端をシステイニル部分で誘導体化し、３’Ｃ末端をチオエステル部分で誘導体化することによってなされる。そのような修飾されたＰＮＡは、標準のネイティブな化学的ライゲーション条件を使用することで容易にカップリングする（Ｒｏｌｏｆｆら、２０１３年、Ｂｉｏｏｒｇａｎ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、２１巻：３４５８〜３４６４頁）。
一部の実施形態では、コーディングタグ情報を、トポイソメラーゼを使用して移行させることができる。トポイソメラーゼを使用して、記録タグ上のトポ荷電３’リン酸とコーディングタグまたはその相補物の５’末端とライゲーションすることができる（Ｓｈｕｍａｎら、１９９４年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３２６７８〜３２６８４頁）。
本明細書に記載の通り、結合性物質は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合し得る。したがって、ペプチド巨大分子を伴うある特定の実施形態では、伸長記録タグは、アミノ酸配列および翻訳後修飾に関するコーディングタグ情報を含む。一部の実施形態では、内部の翻訳後修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、グリコシル化、サクシニル化、ユビキチン化、Ｓ−ニトロシル化、メチル化、Ｎ−アセチル化、脂質付加など）の検出は、末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡまたはＣＴＡＡ）の検出および切断の前に実現される。一実施例では、ペプチドをＰＴＭ修飾のために結合性物質と接触させ、付随するコーディングタグ情報を上記の通り記録タグに移行する（例えば図８Ａを参照されたい）。アミノ酸修飾に関するコーディングタグ情報の検出および移行が完了したら、一次アミノ酸配列に関するコーディングタグ情報の検出および移行の前に、Ｎ末端またはＣ末端分解法を使用してＰＴＭ修飾基を除去することができる。したがって、得られた伸長記録タグにより、ペプチド配列における翻訳後修飾の存在が、逐次的順序ではないが、一次アミノ酸配列情報と併せて示される（例えば図８Ｂを参照されたい）。
一部の実施形態では、内部の翻訳後修飾されたアミノ酸の検出は、一次アミノ酸配列の検出と並行して行うことができる。一実施例では、ＮＴＡＡ（またはＣＴＡＡ）を、単独でまたは結合性物質のライブラリー（例えば、２０種の標準のアミノ酸および選択された翻訳後修飾されたアミノ酸に対する結合性物質で構成されるライブラリー）の一部としての、翻訳後修飾されたアミノ酸に対して特異的な結合性物質と接触させる。末端アミノ酸切断および結合性物質（または結合性物質のライブラリー）との接触の連続的なサイクルを後に続ける。したがって、得られた伸長記録タグにより、一次アミノ酸配列に関して、翻訳後修飾の存在および順序が示される。
ある特定の実施形態では、コーディングタグ情報移行の全体的な頑強性および効率を改善するために、巨大分子ごとに記録タグのアンサンブルを使用することができる（例えば、図９を参照されたい）。単一の記録タグではなく、所与の巨大分子に付随する記録タグのアンサンブルを使用することにより、コーディングタグと記録タグのカップリング収率が潜在的に高いこと、およびライブラリーの全収率が高いことに起因して、ライブラリー構築の効率が改善される。単一の連鎖状の伸長記録タグの収率は、連鎖の段階的収率に直接依存し、一方、コーディングタグ情報を受容することが可能な多数の記録タグの使用では、指数関数的な連鎖の喪失を受けない。
そのような実施形態の例が図９および１０に示されている。図９Ａおよび図１０Ａでは、固体支持体上で単一の巨大分子に多数の記録タグが付随している（空間的共局在または単一の巨大分子の単一のビーズへの限局によって）。結合性物質を固体支持体に周期的に曝露させ、各サイクルにおいて、それらの対応するコーディングタグにより、共局在する多数の記録タグのうちの１つに情報が移行される。図９Ａに示されている例では、結合サイクル情報は、コーディングタグ上に存在するスペーサーにコードされている。各結合サイクルについて、結合性物質のセットに設計されたサイクル特異的スペーサー配列で印をつける（例えば図９Ａおよび９Ｂを参照されたい）。例えば、ＮＴＡＡ結合性物質の場合では、同じアミノ酸残基に対する結合性物質を異なるコーディングタグで標識する、またはサイクル特異的情報をスペーサー配列に含めて、両方の結合性物質の同一性およびサイクル数を示す。
図９Ａにおいて例示されている通り、第１の結合サイクル（サイクル１）において、複数のＮＴＡＡ結合性物質を巨大分子と接触させる。サイクル１で使用する結合性物質は、記録タグのスペーサー配列と相補的な共通のスペーサー配列を有する。サイクル１で使用する結合性物質は、サイクル１特異的配列を含む３’−スペーサー配列も有する。結合サイクル１の間に、第１のＮＴＡＡ結合性物質が巨大分子の遊離末端に結合し、第１のコーディングタグおよび記録タグ内の共通のスペーサー配列の相補配列がアニーリングし、第１のコーディングタグの情報が同類の記録タグに共通のスペーサー配列からのプライマー伸長を介して移行する。ＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させた後、結合サイクル２により、記録タグのスペーサー配列と相補的な共通のスペーサー配列を有する複数のＮＴＡＡ結合性物質を接触させる。サイクル２で使用する結合性物質は、サイクル２特異的配列を含む３’−スペーサー配列も有する。第２のＮＴＡＡ結合性物質が巨大分子のＮＴＡＡに結合し、第２のコーディングタグの情報が記録タグにプライマー伸長を介して移行する。これらのサイクルを最大「ｎ」回の結合サイクルまで繰り返し、単一の巨大分子と共局在する複数の伸長記録タグを生成し、ここで、各伸長記録タグは、１つの結合サイクルからのコーディングタグ情報を有する。連続的な結合サイクルのそれぞれで使用される結合性物質の各セットは、コーディングタグ内のサイクル特異的スペーサー配列を有するので、結合サイクル情報を、得られた伸長記録タグ内の結合性物質情報と関連づけることができる。
代替の実施形態では、図９Ａと同様に、固体支持体（例えば、ビーズ）上で単一の巨大分子に多数の記録タグが付随しているが、この場合、特定の結合サイクルで使用される結合性物質は、今の結合サイクルに対するサイクル特異的スペーサーおよび次の結合サイクルに対するサイクル特異的スペーサーが隣接するコーディングタグを有する（例えば図１０Ａおよび１０Ｂを参照されたい」）。この設計は、伸長記録タグの集団を単一の共直線性の伸長記録タグに変換するための最終的なアセンブリＰＣＲステップを支持するためのものである（例えば図１０Ｃを参照されたい）。単一の共直線性の伸長記録タグのライブラリーを配列決定前に濃縮、サブトラクションおよび／または正規化方法に供すことができる。第１の結合サイクル（サイクル１）では、第１の結合性物質が結合すると、サイクル１特異的スペーサー（Ｃ’１）を含むコーディングタグの情報が、末端に相補的なサイクル１特異的スペーサー（Ｃ１）を含む記録タグに移行する。第２の結合サイクル（サイクル２）では、第２の結合性物質が結合すると、サイクル２特異的スペーサー（Ｃ’２）を含むコーディングタグの情報が、末端に相補的なサイクル２特異的スペーサー（Ｃ２）を含む異なる記録タグに移行する。このプロセスを第ｎの結合サイクルまで続ける。一部の実施形態では、伸長記録タグ内の第ｎのコーディングタグにユニバーサルリバースプライミング配列を用いてキャップ形成する、例えば、ユニバーサルリバースプライミング配列を第ｎのコーディングタグ設計の一部として組み入れることもでき、ユニバーサルリバースプライミング配列を第ｎの結合サイクルの後に続く反応、例えば尾部を有するプライマーを使用した増幅反応などに添加することもできる。一部の実施形態では、各結合サイクル時に、巨大分子を、それらの対応する結合性物質に関する識別情報および結合サイクル情報を含むコーディングタグと接合した結合性物質の集合に曝露させる（例えば図９および図１０を参照されたい）。特定の実施形態では、第ｎの結合サイクルが完了した後、伸長記録タグでコーティングしたビーズ基板を油乳剤に平均して液滴当たり１ビーズ未満またはそれとほぼ同等になるように入れる。次いで、アセンブリＰＣＲを使用して、伸長記録タグをビーズから増幅し、多数の別々の記録タグを、別々の伸長記録タグ内のサイクル特異的スペーサー配列を介してプライミングすることによって共直線的な順序でアセンブルさせる（例えば図１０Ｃを参照されたい）（Ｘｉｏｎｇら、２００８年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、３２巻：５２２〜５４０頁）。あるいは、結合性物質のコーディングタグを有するサイクル特異的スペーサーを使用する代わりに、各結合サイクル中または各結合サイクル後に、サイクル特異的スペーサーを別々に伸長記録タグに付加することができる。単一の巨大分子を集合的に表すものである伸長記録タグの集団を使用することの、単一の巨大分子を表すものである単一の連鎖状の伸長記録タグに対する１つの利点は、より高濃度の記録タグにより、コーディングタグ情報の移行の効率が上昇し得ることである。さらに、結合サイクルを数回繰り返して同類結合事象の完了を確実にすることができる。さらに、伸長記録タグの表面増幅により、情報移行の重複性をもたらすことができる（例えば図４Ｂを参照されたい）。コーディングタグ情報が必ずしも移行されない場合、ほとんどの場合、それでも、コーディングタグ情報の不完全な集合を、タンパク質などの、情報含有量が非常に高い巨大分子を識別するために使用することが可能であるはずである。短いペプチドであっても、非常に多数の可能性のあるタンパク質配列を具体化し得る。例えば、１０ｍｅｒのペプチドは、２０１０種の可能性のある配列を有する。したがって、欠失および／または多義性を含有する可能性がある部分的または不完全な配列を、それでも、多くの場合、一意的にマッピングすることができる。
タンパク質のネイティブなコンフォメーションが照会される一部の実施形態では、結合性物質の近位のスペーサーエレメント内の切断可能なまたはニッキング可能なＤＮＡ鎖で構成されるコーディングタグを有する結合性物質を用いて周期的結合アッセイを実施する（例えば図３２を参照されたい）。例えば、結合性物質の近位のスペーサーは、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）によってニッキングすることができる１つまたは複数のウラシル塩基を有してよい。別の例では、結合性物質の近位のスペーサーは、２重鎖の一方の鎖のみを加水分解するニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列を含んでよい。この設計により、結合性物質を伸長記録タグから変性によらずに除去し、その後のイムノアッセイサイクルのための遊離の一本鎖ＤＮＡスペーサーエレメントを創出することが可能になる。好ましい実施形態では、プライマー伸長ステップ後の結合性物質の酵素的ＵＳＥＲ除去を可能にするために、コーディングタグにウラシル塩基を組み入れる（例えば図３２Ｅ〜Ｆを参照されたい）。ウラシルによるＵＳＥＲ切除後、結合性物質および切り詰められたコーディングタグを、タンパク質−結合性物質相互作用を破壊するための、高塩濃度（４ＭのＮａＣｌ、２５％ホルムアミド）および穏やかな熱を含めた種々の穏やかな条件下で除去することができる。記録タグとアニーリングしたままの他の切り詰められたコーディングタグＤＮＡの残り（例えば図３２Ｆを参照されたい）は、わずかに温度を上昇させると容易に解離する。
結合性物質の近位のスペーサーエレメント内の切断可能なまたはニッキング可能なＤＮＡ鎖で構成されるコーディングタグにより、多数の結合した結合性物質からコーディングタグ情報を移行させるための単一の均一なアッセイも可能になる（例えば図３３を参照されたい）。好ましい実施形態では、結合性物質の近位のコーディングタグはニッキングエンドヌクレアーゼ配列モチーフを含み、これは、ｄｓＤＮＡに関して規定された配列モチーフにおいてニッキングエンドヌクレアーゼにより認識され、ニッキングされる。多数の結合性物質の結合後、複合ポリメラーゼ伸長（鎖置換活性を欠く）＋ニッキングエンドヌクレアーゼ試薬混合物を使用して、コーディングタグの近位の記録タグまたは伸長記録タグへの反復移行を生じさせる。各移行ステップ後、得られた伸長記録タグ−コーディングタグ２重鎖をニッキングエンドヌクレアーゼによってニッキングし、それにより、結合性物質に付着した切り詰められたスペーサーを放出させ、追加的な近位の結合した結合性物質のコーディングタグとアニーリングすることが可能な伸長記録タグ３’スペーサー配列に曝露させる（例えば図３３Ｂ〜Ｄを参照されたい）。コーディングタグスペーサー配列内へのニッキングモチーフの配置は、切断されていないコーディングタグスペーサー配列と容易に交換することができる、準安定ハイブリッドが創出されるように設計する。このように、２種またはそれよりも多くの結合性物質が同じタンパク質分子に同時に結合する場合、多重に結合した結合性物質からのコーディングタグ情報の記録タグ上への連鎖による結合情報は、単一反応混合物において、いかなる周期的な試薬交換も伴わずに生じる（例えば図３３Ｃ〜Ｄを参照されたい）。この実施形態は、次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）、特に、タンパク質上の多価エピトープに対するポリクローナル抗体（またはモノクローナル抗体の混合集団）を用いるものに特に有用である。
変性したタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの解析を伴う実施形態に関しては、結合した結合性物質およびアニーリングしたコーディングタグを、プライマー伸長後に、高度変性条件（例えば、０．１〜０．２ＮのＮａＯＨ、６Ｍの尿素、２．４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネート、９５％ホルムアミドなど）を使用することによって除去することができる。
Ｈ．記録タグ情報のコーディングタグまたはジタグ構築物への周期的移行のための方法およびキット
別の態様では、結合性物質が巨大分子に結合した後にコーディングタグから記録タグに情報を書き込むのではなく、任意選択のＵＭＩ配列（例えば、特定のペプチドまたはタンパク質分子を識別する）および少なくとも１つのバーコード（例えば、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、空間的位置バーコードなど）を含む記録タグからコーディングタグに情報を移行させ、それにより、伸長コーディングタグを生成することができる（例えば図１１Ａを参照されたい）。ある特定の実施形態では、結合性物質および付随する伸長コーディングタグを、各結合サイクル後、および任意選択でエドマン分解化学ステップの前に収集する。ある特定の実施形態では、コーディングタグは、結合サイクル特異的タグを含む。周期的なエドマン分解におけるＮＴＡＡの検出などの全ての結合サイクルが完了した後、伸長コーディングタグの完全な収集物を増幅し、配列決定し、ペプチド上の情報を、ＵＭＩ（ペプチド同一性）、エンコーダー配列（ＮＴＡＡ結合性物質）、コンパートメントタグ（単一の細胞またはプロテオームのサブセット）、結合サイクル特異的配列（サイクル数）、またはそれらの任意の組合せの間の関連性から決定することができる。同じコンパートメントタグ／ＵＭＩ配列を有するライブラリーエレメントを同じ細胞、プロテオームのサブセット、分子などにマッピングし戻し、ペプチド配列を再構築することができる。この実施形態は、記録タグがエドマン分解プロセス中に過度の損傷を保持する場合に有用であり得る。
複数の巨大分子を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した複数の巨大分子および付随する記録タグを用意するステップと；（ｂ）複数の巨大分子を複数の巨大分子に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）（ｉ）巨大分子に付随する記録タグの情報を巨大分子に結合した結合性物質のコーディングタグに移行させて、伸長コーディングタグを生成するステップ（例えば図１１Ａを参照されたい）；または（ｉｉ）巨大分子に付随する記録タグおよび巨大分子に結合した結合性物質のコーディングタグの情報をジタグ構築物に移行するステップと（例えば図１１Ｂを参照されたい）；（ｄ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を収集するステップと；（ｅ）任意選択でステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回の結合サイクルにわたって繰り返すステップと；（ｆ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析するステップとを含む方法が本明細書において提示される。
ある特定の実施形態では、記録タグからコーディングタグへの情報移行は、記録タグのプライマー伸長を防止するために記録タグの３’末端を任意選択でブロッキングする（例えば、図１１Ａを参照されたい）プライマー伸長ステップを使用して実現することができる。得られた伸長コーディングタグおよび付随する結合性物質を各結合事象の後および情報移行の完了後に収集することができる。図１１Ｂに例示されている例では、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ２’）、バーコード（例えば、コンパートメントタグ「ＣＴ」）、任意選択のＵＭＩ配列、および共通のスペーサー配列（Ｓｐ１）で構成される。ある特定の実施形態では、バーコードは、個々のコンパートメントを表すコンパートメントタグであり、また、ＵＭＩを使用して、配列読み取りを照会されている特定のタンパク質またはペプチド分子にマッピングし戻すことができる。図１１Ｂの例において例示されている通り、コーディングタグは、共通のスペーサー配列（Ｓｐ２’）、結合性物質エンコーダー配列、およびユニバーサルプライミング部位（Ｕ３）で構成される。コーディングタグで標識した結合性物質の導入前に、記録タグのＵ２’ユニバーサルプライミング部位と相補的であり、ユニバーサルプライミング配列Ｕ１およびサイクル特異的タグを含むオリゴヌクレオチド（Ｕ２）を記録タグＵ２’とアニーリングさせる。さらに、アダプター配列Ｓｐ１’−Ｓｐ２を記録タグＳｐ１とアニーリングさせる。このアダプター配列は、コーディングタグ上のＳｐ２’配列とも相互作用することができ、それにより、記録タグとコーディングタグが互いと近傍になる。結合事象の前または後のいずれかにギャップ充填伸長ライゲーションアッセイを実施する。ギャップ充填を結合サイクルの前に実施する場合、結合サイクル後のプライマー伸長ステップを使用してジタグ形成を完了させる。いくつもの結合サイクルにわたってジタグを収集した後、ジタグの収集物を配列決定し、ＵＭＩ配列を介して元のペプチド分子にマッピングし戻す。有効性を最大にするために、ＵＭＩ配列の多様性はＵＭＩでタグが付された単一分子の数の多様性を超えるものでなければならないことが理解される。
ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質またはペプチドである。ペプチドは生体試料由来のタンパク質を断片化することによって得ることができる。
記録タグは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せであってよい。記録タグは、それが付随する巨大分子（例えば、ペプチド）を識別するＵＭＩを含む。ある特定の実施形態では、記録タグは、コンパートメントタグをさらに含む。記録タグは、ユニバーサルプライミング部位も含んでよく、これを下流の増幅に使用することができる。ある特定の実施形態では、記録タグは、３’末端にスペーサーを含む。スペーサーは、コーディングタグ内のスペーサーと相補的であってよい。記録タグの３’末端をブロッキングして（例えば、光不安定性３’ブロッキング基）ポリメラーゼによる記録タグの伸長を防止し、それにより、巨大分子に付随する記録タグの情報のコーディングタグへの移行または巨大分子に付随する記録タグおよびコーディングタグの情報のジタグ構築物への移行を容易にすることができる。
コーディングタグは、コーディング物質が連結した結合性物質を識別するエンコーダー配列を含む。ある特定の実施形態では、コーディングタグは、コーディングタグが連結した各結合性物質に対する一意の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。コーディングタグは、下流の増幅のために使用することができるユニバーサルプライミング部位を含んでよい。コーディングタグは、３’末端にスペーサーを含んでよい。スペーサーは、記録タグ内のスペーサーに相補的であってよく、記録タグ情報をコーディングタグに移行させるためのプライマー伸長反応を開始するために使用することができる。コーディングタグは、伸長コーディングタグまたはジタグの起源である結合サイクルを識別するための結合サイクル特異的配列も含んでよい。
記録タグの情報のコーディングタグへの移行は、プライマー伸長またはライゲーションによってもたらすことができる。記録タグおよびコーディングタグの情報のジタグ構築物への移行は、ギャップ充填反応、プライマー伸長反応、またはその両方で生じさせることができる。
ジタグ分子は、伸長記録タグのものと同様の機能的成分を含む。ジタグ分子は、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するバーコード（例えば、コンパートメントタグ）、記録タグに由来する任意選択の一意の分子識別子（ＵＭＩ）、記録タグに由来する任意選択のスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する任意選択の一意の分子識別子、結合サイクル特異的配列、コーディングタグに由来する任意選択のスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含んでよい。
ある特定の実施形態では、記録タグを、バーコードのコンビナトリアル連鎖をコードするワードを使用して生成することができる。コンビナトリアルをコードするワードの使用により、アニーリングおよび化学的ライゲーションを使用して情報をＰＮＡ記録タグからコーディングタグまたはジタグ構築物に移行させることができる方法がもたらされる（例えば、図１２Ａ〜Ｄを参照されたい）。本明細書に開示されているペプチドを解析する方法がエドマン分解による末端アミノ酸の切断を伴うある特定の実施形態では、ＰＮＡなどの、エドマン分解の厳しい条件に対して抵抗性の記録タグを使用することが望ましい可能性がある。エドマン分解プロトコールにおける１つの厳しいステップは、Ｎ末端アミノ酸を切断するための無水ＴＦＡ処理である。このステップにより、一般には、ＤＮＡが破壊される。ＰＮＡは、ＤＮＡとは対照的に、酸加水分解に対して高度に抵抗性である。ＰＮＡでの問題は、情報移行の酵素的方法がより難しくなる、すなわち、好ましい様式が化学的ライゲーションによる情報移行になることである。図１１Ｂにおいて、記録タグおよびコーディングタグ情報は酵素的ギャップ充填伸長ライゲーションステップによって書き込まれるが、これは、現在、ＰＮＡ鋳型を用いると、ＰＮＡを使用するポリメラーゼが開発されなければ、都合がよくない。化学的ライゲーションが必要であり、その産物は容易には増幅されないので、ＰＮＡ記録タグからコーディングタグへのバーコードおよびＵＭＩの書き込みには問題がある。化学的ライゲーションの方法は、文献に広範囲にわたって記載されている（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、１９９８年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、８巻：１１４２〜１１５３頁；Ｐｅｎｇら、２０１０年、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、４１９４〜４１９７頁；Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、２０１１年、Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．、９巻：２３２〜２３５頁；Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、２０１１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０８巻：１１３３８〜１１３４３頁；Ｌｉｔｏｖｃｈｉｃｋら、２０１４年、Ａｒｔｉｆ． ＤＮＡ ＰＮＡ ＸＮＡ、５巻：ｅ２７８９６頁；Ｒｏｌｏｆｆら、２０１４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１０５０巻：１３１〜１４１頁）。
コンビナトリアルＰＮＡバーコードおよびＵＭＩ配列を創出するために、ｎ−ｍｅｒのライブラリーからのＰＮＡワードのセットをコンビナトリアルにライゲーションすることができる。各ＰＮＡワードが１，０００ワードの空間に由来する場合、４つの組合せ配列により、１，０００４＝１０１２コードのコーディング空間が生じる。このように、４，０００種の異なるＤＮＡ鋳型配列の出発セットから、１０１２を超えるＰＮＡコードを生成することができる（例えば図１２Ａを参照されたい）。連鎖状のワードの数を調整すること、または基本のワードの数を調整することにより、より小さなまたはより大きなコーディング空間を生成することができる。そのように、ＰＮＡ記録タグとハイブリダイズさせたＤＮＡ配列を使用した情報移行は、ＤＮＡワードアセンブリハイブリダイゼーションおよび化学的ライゲーションを使用して完了させることができる（例えば図１２Ｂを参照されたい）。ＰＮＡ鋳型上のＤＮＡワードのアセンブリおよびＤＮＡワードの化学的ライゲーションの後、得られた中間体を使用して、情報をコーディングタグに／から移行させることができる（例えば図１２Ｃおよび図１２Ｄを参照されたい）。
ある特定の実施形態では、巨大分子および付随する記録タグは、固体支持体に共有結合により接合している。固体支持体は、ビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアであってよい。固体支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズであってよい。
ある特定の実施形態では、結合性物質は、タンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、結合性物質は、改変またはバリアントアミノペプチダーゼ、改変またはバリアントアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変またはバリアントアンチカリン、改変またはバリアントＣｌｐＳ、または改変またはバリアント抗体またはその結合性断片である。ある特定の実施形態では、結合性物質は、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、またはペプチドの翻訳後修飾に結合する。一部の実施形態では、結合性物質は、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する。一部の実施形態では、結合性物質は、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する。一部の実施形態では、結合性物質は、ペプチドの翻訳後修飾のアミノ酸の部位特異的な共有結合性標識である。
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において複数の巨大分子を複数の結合性物質と接触させた後、巨大分子および付随する結合性物質を含む複合体を固体支持体から解離させ、液滴またはマイクロ流体液滴のエマルジョン中に分配する。一部の実施形態では、各マイクロ流体液滴は、巨大分子および結合性物質を含む複合体を最大で１つ含む。
ある特定の実施形態では、伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を生成する前に前記記録タグを増幅する。巨大分子および付随する結合性物質を含む複合体を液滴またはマイクロ流体液滴に液滴当たりの複合体が最大で１つになるように分配する実施形態では、記録タグの増幅により、情報をコーディングタグまたはジタグ構築物に移行させるための鋳型として追加的な記録タグがもたらされる（例えば図１３および図１４を参照されたい）。エマルジョン融合ＰＣＲを使用して、記録タグ情報をコーディングタグに移行させるか、またはジタグ構築物の集団を創出することができる。
生成された伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析前に増幅させることができる。伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物の解析は、核酸配列決定法を含んでよい。合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシング。核酸配列決定法は、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングであってよい。
エドマン分解およびＰＩＴＣ、サンガー薬剤（ＤＮＦＢ）、ＳＮＦＢ、アセチル化試薬、アミジン化（グアニジニル化）試薬などのＮ末端アミンを化学的に標識する方法により、アデニン、グアニン、およびシトシンなどの標準の核酸またはＰＮＡ塩基の内部アミノ酸および環外アミンを修飾することもできる。ある特定の実施形態では、ペプチドのリシン残基のε−アミンを、配列決定の前に酸無水物、グアニジン化剤、または同様のブロッキング試薬でブロッキングする。ＤＮＡ塩基の環外アミンはペプチドのＮ末端第一級アミンよりもはるかに反応性が低いが、ＤＮＡ塩基の内部アミノ酸および環外アミンに対する非標的活性を低下させる、アミン反応性作用物質のＮ末端アミンに対する反応性の制御が、配列決定アッセイにとって重要である。修飾反応の選択性は、ｐＨ、溶媒（水性対有機、非プロトン性、非極性、極性非プロトン性、イオン性液体など）、塩基および触媒、共溶媒、温度、ならびに時間などの反応条件を調整することによってモジュレートすることができる。さらに、ＤＮＡ塩基の環外アミンの反応性は、ＤＮＡがｓｓＤＮＡの形態であるかｄｓＤＮＡの形態であるかによってモジュレートされる。修飾を最小限にするために、ＮＴＡＡ化学修飾の前に、記録タグを相補ＤＮＡプローブ：Ｐ１’、｛試料ＢＣｓ｝’、｛Ｓｐ−ＢＣ｝’などとハイブリダイズさせることができる。別の実施形態では、保護された環外アミンを有する核酸の使用も使用することができる（Ohkubo, Kasuya et al. 2008）。さらに別の実施形態では、ＳＮＦＢなどの「反応性が低い」アミン標識化合物により、ＤＮＡの内部アミノ酸および環外アミンに対するオフターゲットの標識が軽減される（Cartyand Hirs 1968）。ＳＮＦＢは、パラスルホニル基がパラニトロ基よりも電子求引性であり、それにより、ＤＮＦＢよりも活性が低いＳＮＦＢでのフッ素置換が導かれるという事実に起因してＤＮＦＢよりも反応性が低い。
ＮＴＡＡ α−アミン修飾を最適化し、オフターゲットのアミノ酸修飾またはＤＮＡ修飾を最小限にするためのカップリング条件およびカップリング試薬の調整は、化学および反応条件（濃度、温度、時間、ｐＨ、溶媒の型など）を慎重に選択することによって可能である。例えば、ＤＮＦＢは、二級アミンと、水中よりもアセトニトリルなどの非プロトン性溶媒中の方が容易に反応することが公知である。環外アミンが軽度に修飾されてもなお相補的なプローブが配列とハイブリダイズすることが可能になるが、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長を妨害する可能性がある。環外アミンを保護しながら、それでも水素結合を可能にすることも可能である。これは、保護された塩基がなお目的の標的とハイブリダイズすることが可能であるという最近の刊行物に記載された（Ｏｈｋｕｂｏ、Ｋａｓｕｙａら、２００８年）。一実施形態では、工学的に操作されたポリメラーゼを使用して、ＤＮＡコーディングタグ鋳型上の記録タグの伸長中に、保護された塩基を有するヌクレオチドを組み入れる。別の実施形態では、工学的に操作されたポリメラーゼを使用して、ＰＮＡ記録タグ鋳型上のコーディングタグの伸長中に記録タグＰＮＡ鋳型（ｗ／またはｗ／ｏ保護された塩基）上のヌクレオチドを組み入れる。別の実施形態では、情報を、外因性オリゴヌクレオチドをＰＮＡ記録タグとアニーリングさせることによって記録タグからコーディングタグに移行させることができる。ハイブリダイゼーションの特異性は、ｎ−ｍｅｒのワードのアセンブリに基づく設計などの配列空間が別個であるＵＭＩを選択することによって容易にすることができる（Ｇｅｒｒｙ、Ｗｉｔｏｗｓｋｉら、１９９９年）。
エドマン様Ｎ末端ペプチド分解配列決定を使用してペプチドの直鎖状アミノ酸配列を決定することができるが、代替的な実施形態を使用して、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、およびジタグを利用する方法を用いたペプチドの部分的な組成分析を実施することができる。結合性物質または化学標識を使用してペプチド上のＮ末端および内部の両方のアミノ酸またはアミノ酸修飾を識別することができる。化学薬剤により、アミノ酸（例えば、標識）を部位特異的に共有結合により修飾することができる（ＳｌｅｔｔｅｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ、２００９年、Ｂａｓｌｅ、Ｊｏｕｂｅｒｔら、２０１０年）（ＳｐｉｃｅｒおよびＤａｖｉｓ、２０１４年）。部位特異的に標識されたアミノ酸のコーディングおよびその後の識別を容易にするために、単一のアミノ酸を標的とする化学標識剤にコーディングタグを付着させることができる（例えば図１３を参照されたい）。
ペプチド組成分析にはペプチドの環状分解は必要なく、したがって、ＤＮＡを含有するタグを厳しいエドマン化学に曝露することの問題が回避される。環状結合様式では、組成情報（アミノ酸またはジペプチド／トリペプチド情報）、ＰＴＭ情報、および一次アミノ酸配列をもたらすために伸長コーディングタグまたはジタグを使用することもできる。一実施形態では、この組成情報は、本明細書に記載の伸長コーディングタグまたはジタグ手法を使用して読み取ることができる。ＵＭＩおよびコンパートメントタグ情報と組み合わせると、伸長コーディングタグまたはジタグの収集物により、ペプチドおよびそれらの起源であるコンパートメントのタンパク質（複数可）に関する組成情報がもたらされる。同じコンパートメントタグ（および表面上起源であるタンパク質分子）にマッピングし戻された伸長コーディングタグまたはジタグの収集物は、部分的な組成情報を有するペプチドをマッピングするための強力なツールである。プロテオーム全体にマッピングし戻すのではなく、コンパートメントタグ付きペプチドの集合を限られたタンパク質分子のサブセットにマッピングし戻し、これにより、マッピングの一意性が著しく増大する。
本明細書で使用される結合性物質は、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはさらに長いペプチド配列モチーフを認識し得る。Ｔｅｓｓｌｅｒ（２０１１年、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｐｈ．Ｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）は、荷電したジペプチドエピトープのサブセットに対して比較的選択的なジペプチド抗体を生成することができることを実証した（Ｔｅｓｓｌｅｒ、２０１１年）。代替のタンパク質足場（例えば、ａａＲＳ、アンチカリン、ＣｌｐＳなど）およびアプタマーへの定向進化の適用を使用して、ジペプチド／トリペプチド結合性物質のセットを増大させることができる。単一のタンパク質分子にマッピングし戻すことと併せたジペプチド／トリペプチド組成分析からの情報は、各タンパク質分子を一意的に識別し、定量化するために十分なものであり得る。最大で、合計４００種の可能性のあるジペプチドの組合せがある。しかし、最も頻度が高く、かつ最も抗原性が高い（荷電、親水性、疎水性）ジペプチドのサブセットが、結合性物質を生成するために十分なものであるはずである。この数は、４０〜１００種の異なる結合性物質のセットを構成し得る。４０種の異なる結合性物質のセットに関して、平均１０ｍｅｒのペプチドに少なくとも１種の結合性物質が結合する見込みは約８０％である。この情報を同じタンパク質分子に由来する全てのペプチドと組み合わせることにより、タンパク質分子の識別が可能になり得る。ペプチドおよびその起源であるタンパク質に関するこの情報全てを組み合わせて、より正確かつ的確なタンパク質配列特徴付けをもたらすことができる。
部分的なペプチド配列情報を使用する最近のデジタルタンパク質特徴付けアッセイが提唱された（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら、２０１５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．、１１巻：ｅ１００４０８０頁）（Ｙａｏ、Ｄｏｃｔｅｒら、２０１５年）。すなわち、当該手法では、システイン、リシン、アルギニン、チロシン、アスパラギン酸／グルタミン酸などの、標準の化学を使用して容易に標識されるアミノ酸の蛍光標識を使用する（Ｂａｓｌｅ、Ｊｏｕｂｅｒｔら、２０１０年）。部分的なペプチド配列情報を用いることの問題は、プロテオームにマッピングし戻すことが一対多数の関連であり、一意のタンパク質が識別されないことである。この一対多数のマッピング問題は、プロテオーム全体空間を、ペプチドがマッピングし戻される限られたタンパク質分子のサブセットに減少させることによって解決することができる。本質的に、単一の部分的なペプチド配列を１００種または１０００種の異なるタンパク質配列にマッピングし戻すことができるが、いくつかのペプチド（例えば、単一のタンパク質分子の消化に由来する１０ペプチド）のセットを全て、コンパートメント内のタンパク質分子のサブセットに含有される単一のタンパク質分子にマッピングし戻した場合、タンパク質分子の同一性を推定することが容易であることが公知である。例えば、同じ分子に由来する全てのペプチドに関するペプチドプロテオームマップの交差により、可能性のあるタンパク質同一性のセットが著しく制限される（例えば図１５を参照されたい）。
特に、部分的なペプチド配列または組成のマッピング可能性は、コンパートメントのタグおよびＵＭＩの革新的使用を行うことによって有意に増強される。すなわち、プロテオームを最初にバーコードが付されたコンパートメントに分配し、ここで、コンパートメントバーコードはＵＭＩ配列にも付着している。コンパートメントバーコードはコンパートメントに一意の配列であり、ＵＭＩはコンパートメント内のバーコードが付された分子それぞれに一意の配列である（例えば図１６を参照されたい）。一実施形態では、この分配は、その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０６１５１７号に開示されているものと同様の方法を使用して、ビーズに付着したＤＮＡコンパートメントバーコードとのハイブリダイゼーションによる、ＤＮＡタグで標識されたポリペプチドとビーズの表面との直接相互作用によって実現される（例えば図３１を参照されたい）。プライマー伸長ステップにより、ビーズに連結されたコンパートメントバーコードからポリペプチド上のＤＮＡタグに情報を移行させる（例えば図２０を参照されたい）。別の実施形態では、この分配は、ＵＭＩを含有する、バーコードが付されたビーズおよびタンパク質分子をエマルジョンの液滴中に共封入することによって実現される。さらに、液滴は、任意選択でタンパク質をペプチドに消化するプロテアーゼを含有する。いくつものプロテアーゼを、レポータータグが付されたポリペプチドを消化するために使用することができる（Ｓｗｉｔｚａｒ、Ｇｉｅｒａら、２０１３年）。ブテラーゼＩなどの酵素的リガーゼとプロテアーゼの共封入では、酵素をプロテアーゼ消化に対して抵抗性にするために、ペグ化などの酵素の修飾が必要になり得る（ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＯｔｚｅｎ、２００５年、Ｋａｎｇ、Ｗａｎｇら、２０１０年）。消化後、ペプチドをバーコード−ＵＭＩタグとライゲーションする。好ましい実施形態では、下流の生化学的操作を容易にするために、バーコード−ＵＭＩタグをビーズ上に保持する（例えば図１３を参照されたい）。
バーコード−ＵＭＩとペプチドのライゲーション後、エマルジョンを破壊し、ビーズを回収する。バーコードが付されたペプチドを、それらの一次アミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸組成によって特徴付けることができる。ペプチドに関するどちらの型の情報も、プロテオームのサブセットにマッピングし戻すために使用することができる。一般に、配列情報は、組成情報よりもはるかに小さいプロテオームのサブセットにマッピングし戻される。それにもかかわらず、多数のペプチド（配列または組成）からの情報を同じコンパートメントバーコードと組み合わせることにより、ペプチドの起源であるタンパク質（複数可）を一意的に識別することが可能である。このように、プロテオーム全体を特徴付け、定量化することができる。ペプチド上の一次配列情報は、ペプチド配列を表すＤＮＡにコードされるライブラリー（ＤＮＡ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＤＥＬ）の伸長記録タグ創出を伴うペプチド配列決定反応を実施することによって引き出すことができる。好ましい実施形態では、記録タグは、コンパートメントバーコードおよびＵＭＩ配列で構成される。この情報を、コーディングタグから移行された一次またはＰＴＭアミノ酸情報と共に使用して、最終的なマッピングされたペプチド情報を生成する。
ペプチド配列情報に対する代替は、コンパートメントバーコードおよびＵＭＩと連結したペプチドアミノ酸またはジペプチド／トリペプチド組成情報を生成することである。これは、ＵＭＩ−バーコードが付されたペプチドを伴うビーズを、各ペプチド上の選択されたアミノ酸（内部）をアミノ酸コード情報および別のアミノ酸ＵＭＩ（ＡＡ ＵＭＩ）を含むＤＮＡタグで部位特異的に標識するアミノ酸標識ステップに供することによって実現される（例えば図１３を参照されたい）。最も化学標識しやすいアミノ酸（ＡＡ）は、リシン、アルギニン、システイン、チロシン、トリプトファン、およびアスパラギン酸／グルタミン酸であるが、他のＡＡに対する標識スキームを同様に展開することも実行可能であり得る（ＭｅｎｄｏｚａおよびＶａｃｈｅｔ、２００９年）。所与のペプチドは、同じ型のＡＡをいくつか含有し得る。同じ型の多数のアミノ酸の存在は、付着したＡＡ ＵＭＩ標識によって区別することができる。各標識分子は、ＤＮＡタグ内に異なるＵＭＩを有し、それによりアミノ酸の計数が可能になる。化学標識に対する代替は、ＡＡを結合性物質で「標識」することである。例えば、ＡＡコード情報およびＡＡ ＵＭＩを含むコーディングタグで標識されたチロシン特異的抗体を使用して、ペプチドの全てのチロシンに印を付けることができる。この手法に伴う注意事項は、大きなかさのある抗体では立体的な障害が生じることであり、この目的のためには、より小さなｓｃＦｖ、アンチカリン、またはＣｌｐＳバリアントを使用することが理想的である。
一実施形態では、ＡＡへのタグ付け後、情報を、記録タグと、ペプチド上の結合したまたは共有結合によりカップリングした結合性物質に付随する多数のコーディングタグとの間で、液滴当たり単一のペプチドが含有されるようにペプチド複合体を区画化し、エマルジョン融合ＰＣＲを実施して、区画化されたペプチドのアミノ酸組成を特徴付ける伸長コーディングタグまたはジタグのセットを構築することによって移行させる。ジタグの配列決定後、同じバーコードを有するペプチド上の情報を単一のタンパク質分子にマッピングし戻すことができる。
特定の実施形態では、タグが付されたペプチド複合体をビーズから解離させ（例えば図１３を参照されたい）、小さなミニコンパートメント（例えば、マイクロエマルジョン）に、平均して単一の標識された／結合した結合性物質ペプチド複合体のみが所与のコンパートメント内に存在するように分配する。特定の実施形態では、この区画化は、マイクロエマルジョン液滴の生成によって実現される（Ｓｈｉｍ、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら、２０１３年、Ｓｈｅｍｂｅｋａｒ、Ｃｈａｉｐａｎら、２０１６年）。ペプチド複合体に加えて、ＰＣＲ試薬も、液滴中に３種のプライマー（Ｕ１、Ｓｐ、およびＵ２ｔｒ）と共封入することができる。液滴形成後、Ｕ１およびＳｐのみがアニーリングし、記録タグ産物が増幅するように、高いアニーリング温度でエマルジョンＰＣＲを数サイクル実施する（約５〜１０サイクル）（例えば図１３を参照されたい）。この最初の５〜１０サイクルのＰＣＲの後、アミノ酸コードタグ上のＵ２ｔｒおよびＳｐｔｒが増幅に加わるようにアニーリング温度を低下させ、さらに約１０ラウンドを実施する。３プライマーエマルジョンＰＣＲにより、ペプチドＵＭＩ−バーコードとＡＡコードタグの全てが有効に組み合わされ、それにより、ペプチドおよびそのアミノ酸組成のジタグライブラリー表示が生成する。３プライマーＰＣＲおよびタグの連鎖を実施する他のモダリティを使用することもできる。別の実施形態は、光デブロッキング、または不安定なブロッキングされた３’ヌクレオチドの３’デブロッキングを開始するための油可溶性還元体の添加によって活性化される、３’ブロッキングされたＵ２プライマーの使用である。エマルジョンＰＣＲ後、ＮＧＳ配列決定のためのライブラリーエレメントをフォーマットするための一般的なプライマーを用いて別のラウンドのＰＣＲを実施することができる。
このように、ライブラリーエレメントの異なる配列成分を計数および分類のために使用する。所与のペプチド（コンパートメントバーコード−ＵＭＩの組合せによって識別される）について、多くのライブラリーエレメントが存在し、それぞれが識別用ＡＡコードタグおよびＡＡ ＵＭＩを有する（例えば図１３を参照されたい）。ＡＡコードおよび付随するＵＭＩを使用して、所与のペプチド内の所与のアミノ酸型の存在を計数する。したがって、ペプチド（おそらくＧｌｕＣ、ＬｙｓＣ、またはＥｎｄｏ ＡｓｎＮ消化物）を、そのアミノ酸組成（例えば、Ｃｙｓが２つ、Ｌｙｓが１つ、Ａｒｇが１つ、Ｔｙｒが２つなど）によって、空間的順序は考慮せず、特徴付ける。それにもかかわらず、これにより、ペプチドをプロテオームのサブセットにマッピングするため、また、同じタンパク質分子に由来する他のペプチドと組み合わせて使用した場合には、タンパク質を一意的に識別および定量化するための、十分なシグネチャがもたらされる。
Ｉ．末端アミノ酸（ＴＡＡ）標識のための方法およびキット
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法においてペプチドを結合性物質と接触させる前に、ペプチドの末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡまたはＣＴＡＡ）を修飾または標識する。そのような修飾および／または標識のためのキットおよびキット成分が本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、ＮＴＡＡをフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と反応させて、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）−ＮＴＡＡ誘導体を生成する。エドマン分解では、一般には、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を使用してＮ末端を標識する。ＰＩＴＣは、本明細書に開示されている方法に十分に適する２つの性質を有する：（１）ＰＩＴＣはＮ末端アミン基を高い効率で標識する；および（２）得られるＰＴＣ誘導体化ＮＴＡＡは、酸処理されると自己異性化を受け、それにより当該アミノ酸が残りのペプチドから切断される。
ＮＴＡＡを標識するために使用することができる他の試薬としては、４−スルホフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート（ＰＹＩＴＣ）、２−ピペリジノエチルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ）、３−（４−モルホリノ）プロピルイソチオシアネート（ＭＰＩＴＣ）、３−（ジエチルアミノ）プロピルイソチオシアネート（ＤＥＰＴＩＣ）（Wang et al., 2009, Anal Chem 81: 1893-1900）、（１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ、または１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロリド）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、アセチル化試薬、アミジン化（グアニジニル化）試薬、２−カルボキシ−４，６−ジニトロクロロベンゼン、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、およびチオベンジル化試薬が挙げられる。ＮＴＡＡを標識するためにブロッキングする場合、例えば、Ｎ−アセチルブロッキングをアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）で除去することなど、末端をアンブロッキングするための手法がいくつも存在する（Farries,Harris et al., 1991、Eur. J. Biochem. 196: 679-685）。ペプチドのＮ末端をアンブロッキングする方法は、当技術分野で公知である（例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれるKrishnaet al., 1991、Anal. Biochem. 199: 45-50； Leone et al., 2011、Curr. Protoc.Protein Sci., Chapter 11: Unit 11.7； Fowler et al., 2001, Curr. Protoc. ProteinSci.、Chapter 11 : Unit 11.7を参照されたい）。
ダンシルクロリドは、ペプチドの遊離のアミン基と反応して、ＮＴＡＡのダンシル誘導体をもたらす。ＤＮＦＢおよびＳＮＦＢはペプチドのε−アミン基と反応して、それぞれＤＮＰ−ＮＴＡＡ、およびＳＮＰ−ＮＴＡＡを生成させる。さらに、ＤＮＦＢおよびＳＮＦＢはどちらも、リシン残基のε−アミンとも反応する。ＤＮＦＢはまた、チロシンおよびヒスチジンアミノ酸残基とも反応する。ＳＮＦＢは、ＤＮＦＢよりも良好なアミン基に対する選択性を有し、ＮＴＡＡ修飾に好ましい（Carty and Hirs 1968）。ある特定の実施形態では、ポリペプチドをプロテアーゼ消化してペプチドにする前に、リシンε−アミンを有機無水物でプレブロッキングする。
別の有用なＮＴＡＡ修飾因子はアセチル基であり、その理由は、アセチル化ＮＴＡＡを除去する公知の酵素、すなわち、Ｎ末端アセチル化アミノ酸を切断し、それによりペプチドを単一のアミノ酸だけ有効に短縮するアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）が存在するからである｛Chang, 2015 #373；Friedmann, 2013 #374｝。ＮＴＡＡは、無水酢酸を用いて化学的にアセチル化することもでき、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）を用いて酵素的にアセチル化することもできる｛Chang,2015 #373；Friedmann, 2013 #374｝。さらに別の有用なＮＴＡＡ修飾因子はアミジニル（グアニジニル）部分であり、その理由は、アミジン化ＮＴＡＡの証明された切断化学、すなわち、Ｎ末端アミジン化ペプチドを０．５〜２％ＮａＯＨと一緒に穏やかにインキュベートすることにより、Ｎ末端アミノ酸の切断がもたらされることが文献で知られているからである｛Hamada,2016 #383｝。これにより、穏やかなエドマン様化学的Ｎ末端分解ペプチド配列決定プロセスが有効にもたらされる。さらに、ある特定のアミジン化（グアニジニル化）試薬および下流のＮａＯＨ切断は、ＤＮＡエンコーディングに非常に適合性である。
ＮＴＡＡにＤＮＰ／ＳＮＰ基、アセチル基、またはアミジニル（グアニジニル）基が存在することにより、工学的に操作された結合性物質との相互作用のより良好な取り扱いがもたらされ得る。低ｎＭの親和性を有する商業的なＤＮＰ抗体がいくつも存在する。他のＮＴＡＡ標識方法としては、トリプリガーゼ（ｔｒｙｐｌｉｇａｓｅ）を用いた標識（Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒら、２０１４年、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ、５３巻：３０２４〜３０２８頁）、およびアミノアシルトランスフェラーゼを用いた標識（Ｗａｇｎｅｒら、２０１１年、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、１３３巻：１５１３９〜１５１４７頁）が挙げられる。
イソチオシアネートは、イオン性液体の存在下では、第一級アミンに対して増強された反応性を有することが示されている。イオン性液体は、有機化学反応における優れた溶媒であり（また、触媒として作用する）、チオ尿素を形成する、イソチオシアネートとアミンの反応を増強することができる。例は、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）による芳香族および脂肪族アミンの迅速かつ効率的な標識のためにイオン性液体１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウムテトラフルオロボレート［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ４］を使用することである（Le, Chen et al. 2005）。エドマン分解は、ＰＩＴＣなどのイソチオシアネートとペプチドのアミノＮ末端の反応を伴う。そのように、一実施形態では、より穏やかな標識および分解条件をもたらすことによってエドマン分解プロセスの効率を改善するためにイオン性液体を使用する。例えば、イオン性液体［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ４］中５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＰＩＴＣを２５℃で１０分間使用することは、ピリジン、エタノール、およびｄｄＨ２Ｏを含有する溶液（１：１：１ ｖｏｌ．／ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）中５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＰＩＴＣを５５℃で６０分間使用する標準のエドマンＰＩＴＣ誘導体化条件下で標識することよりも効率的である（Wang,Fang et al. 2009）。好ましい実施形態では、ポリペプチドの内部のリシン、チロシン、ヒスチジン、およびシステインアミノ酸を、ペプチドへの断片化の前にブロッキングする。このように、ペプチド配列決定反応中、ＮＴＡＡのペプチドα−アミン基のみが修飾に利用可能になるようにする。これは、特に、ＤＮＦＢ（サンガー試薬）およびダンシルクロリドを使用する場合に適切である。
ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡは、ＮＴＡＡ標識ステップの前にブロッキングされている（特にタンパク質の元のＮ末端）。その場合、例えば、Ｎ−アセチルブロッキングをアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）で除去することなど、Ｎ末端をアンブロッキングするための手法がいくつも存在する（Ｆａｒｒｉｅｓ、Ｈａｒｒｉｓら、１９９１年）。ペプチドのＮ末端をアンブロッキングする他の方法がいくつも当技術分野で公知である（例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｉｓｈｎａら、１９９１年、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９巻：４５〜５０頁；Ｌｅｏｎｅら、２０１１年、Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、第１１章：ユニット１１．７；Ｆｏｗｌｅｒら、２００１年、Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、第１１章：ユニット１１．７を参照されたい）。
ＣＴＡＡは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、２０１３年）に記載されている通り、いくつもの異なるカルボキシル反応性試薬を用いて修飾することができる。別の例では、ＣＴＡＡを混合無水物およびイソチオシアネートで修飾して、チオヒダントインを生成する（（ＬｉｕおよびＬｉａｎｇ、２００１年）および米国特許第５，０４９，５０７号）。チオヒダントインで修飾されたペプチドは、基剤中上昇した温度で切断されて、最後から２番目のＣＴＡＡが露出し、それにより、Ｃ末端に基づくペプチド分解配列決定手法を有効に生成することができる（ＬｉｕおよびＬｉａｎｇ、２００１年）。ＣＴＡＡに対して行うことができる他の修飾としては、パラ−ニトロアニリド基の付加および７−アミノ−４−メチルクマリニル基の付加が挙げられる。
Ｊ．末端アミノ酸切断のための方法およびキット
ペプチドの解析に関するある特定の実施形態では、末端アミノ酸（Ｎ末端またはＣ末端）への結合性物質の結合、およびコーディングタグ情報の記録タグへの移行、記録タグ情報のコーディングタグへの移行、記録タグ情報およびコーディングタグ情報のジタグ構築物への移行の後、末端アミノ酸をペプチドから除去または切断して、新しい末端アミノ酸を露出させる。一部の実施形態では、末端アミノ酸は、ＮＴＡＡである。他の実施形態では、末端アミノ酸は、ＣＴＡＡである。
末端アミノ酸の切断は、化学的切断および酵素的切断を含めた、任意の数の公知の技法によって実現することができる。化学的切断の例は、エドマン分解である。ペプチドのエドマン分解中、ｎ ＮＴＡＡをフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と弱アルカリ性条件下で反応させて、フェニルチオカルバモイル−ＮＴＡＡ誘導体を形成する。次に、酸性条件下で、フェニルチオカルバモイル−ＮＴＡＡ誘導体を切断し、それにより、遊離のチアゾリノン誘導体を生成し、それにより、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸をＮ末端アミノ酸（（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ）に変換する。このプロセスのステップを以下に例示する。
典型的なエドマン分解では、上記の通り、長いインキュベーション時間にわたって厳しい高温の化学的条件（例えば、無水ＴＦＡ）の発生が必要になる。これらの条件は、一般に、巨大分子の核酸エンコーディングには適合しない。
化学的エドマン分解を核酸エンコーディングに好都合の手法に変換するために、厳しい化学的ステップを穏やかな化学的分解または効率的な酵素的ステップで置き換える。一実施形態では、化学的エドマン分解を、元々記載された条件よりも穏やかな条件を使用して利用することができる。アセトニトリル中無水ＴＦＡを酢酸トリエチルアミンで置き換えること（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｂａｒｒｅｔｔ、１９８５年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２６巻：４３７５〜４３７８頁を参照されたい）を含め、エドマン分解のための穏やかな切断条件がいくつか文献に記載されている。ＮＴＡＡの切断は、エドマン分解と比較して穏やかな切断条件を使用するチオアシル化分解を使用することによって実現することもできる（米国特許第４，８６３，８７０号を参照されたい）。
別の実施形態では、無水ＴＦＡによる切断を、穏やかな条件下で切れやすいペプチド結合のカルボニル基のチオ尿素硫黄原子の求核攻撃によるＰＩＴＣ誘導体化Ｎ末端アミノ酸の除去を触媒する、工学的に操作された酵素である「エドマナーゼ（Ｅｄｍａｎａｓｅ）」で置き換えることができる（その全体が参照により組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２７３００４号を参照されたい）。エドマナーゼは、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉに由来するシステインプロテアーゼであるクルザイン（ｃｒｕｚａｉｎ）を改変することによって作出された（Ｂｏｒｇｏ、２０１４年）。Ｃ２５Ｇ変異により触媒性システイン残基が除去されたと同時に、エドマン試薬（ＰＩＴＣ）のフェニル部分との立体的な適合を創出するための３つの変異（Ｇ６５Ｓ、Ａ１３８Ｃ、Ｌ１６０Ｙ）が選択された。
ＮＴＡＡの酵素的切断は、アミノペプチダーゼによって実現することもできる。アミノペプチダーゼは、単量体酵素および多量体酵素として天然に存在し、金属またはＡＴＰ依存性であり得る。天然のアミノペプチダーゼは、非常に限られた特異性を有し、一般的に、Ｎ末端アミノ酸を前進的に切断し、それにより、アミノ酸を次々に切断する。本明細書に記載の方法に関しては、アミノペプチダーゼを、ＮＴＡＡに対して、Ｎ末端標識で修飾されている場合にのみ特異的な結合活性または触媒活性を有するように工学的に操作することができる。例えば、アミノペプチダーゼを、Ｎ末端アミノ酸がＤＮＰ／ＳＮＰ、ＰＴＣ、ダンシルクロリド、アセチル、アミジニルなどの基によって修飾されている場合にＮ末端アミノ酸のみを切断するように工学的に操作することができる。このように、アミノペプチダーゼは、一度にＮ末端から単一のアミノ酸だけ切断し、分解サイクルの制御を可能にする。一部の実施形態では、改変アミノペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性に関しては非選択的である一方で、Ｎ末端標識に関しては選択的である。他の実施形態では、改変アミノペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性とＮ末端標識の両方に関して選択的である。酵素的ＮＴＡＡ分解の修飾特異性のモデルの例は、ＢｏｒｇｏおよびＨａｖｒａｎｅｋにより例示されており、そこでは、構造−機能補助設計を通じて、メチオニンアミノペプチダーゼがロイシンアミノペプチダーゼに変換された（ＢｏｒｇｏおよびＨａｖｒａｎｅｋ、２０１４年）。ＤＮＰ／ＳＮＰで修飾されたＮＴＡＡなどの修飾されたＮＴＡＡに同様の手法をとることができ、ここで、アミノペプチダーゼを、ＤＮＰ／ＳＮＰ基が存在するＮ末端アミノ酸のみを切断するように工学的に操作する（構造−機能に基づく設計および定向進化の両方を使用する）。個々のまたは小さな群の標識した（ビオチン化した）ＮＴＡＡに結合し、それを切断する工学的に操作されたアミノペプチダーゼ変異体が記載されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０６５３２２号を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、緻密な単量体金属酵素的アミノペプチダーゼを、ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡを認識し、切断するように工学的に操作する。単量体メタロ−アミノペプチダーゼの使用には、重要な利点が２つある：１）緻密な単量体タンパク質は、ファージディスプレイを使用してディスプレイおよびスクリーニングするのがはるかに容易である；２）メタロ−アミノペプチダーゼは、適切な金属カチオンを添加または除去することによってその活性をオン／オフにすることができるという点で、独特の利点を有する。例示的なアミノペプチダーゼとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＫＫ５０６（ＳＫＡＰ）（Ｙｏｏ、Ａｈｎら、２０１０年）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＳＧＡＰ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＶＰＡＰ）、（ＳｐｕｎｇｉｎおよびＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９８９年、Ｂｅｎ−Ｍｅｉｒ、Ｓｐｕｎｇｉｎら、１９９３年）などの、アミノペプチダーゼのＭ２８ファミリーが挙げられる。これらの酵素は、室温およびｐＨ８．０で安定であり、ロバストであり、かつ活性であり、したがって、ペプチド解析に好ましい穏やかな条件に適合する。
別の実施形態では、アミノペプチダーゼを、Ｎ末端アミノ酸標識の存在下でのみ活性になるように工学的に操作することにより、周期的切断が達成される。さらに、アミノペプチダーゼを、非特異的になるように、したがって、１つの特定のアミノ酸を別のアミノ酸に対して選択的に認識するのではなく、単に標識されたＮ末端を認識するように、工学的に操作することができる。好ましい実施形態では、メタロペプチダーゼ単量体アミノペプチダーゼ（例えば、Ｖｉｂｒｏロイシンアミノペプチダーゼ）（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ、Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒら、２０１４年）を、修飾されたＮＴＡＡ（例えば、ＰＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル化された、アシル化されたなど）のみを切断するように工学的に操作する。
さらに別の実施形態では、アセチル化ＮＴＡＡを切断するように工学的に操作されたアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）を使用することによって周期的切断を達成する。ＡＰＨは、ブロッキングされたペプチドからのＮα−アセチル化アミノ酸の除去を触媒することができるセリンペプチダーゼであり、真核細胞、細菌細胞および古細菌細胞において、Ｎ末端がアセチル化されたタンパク質の重要な調節因子である。ある特定の実施形態では、ＡＰＨは、二量体であり、エキソペプチダーゼ活性のみを有する（Ｇｏｇｌｉｅｔｔｉｎｏ、Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉら、２０１２年、Ｇｏｇｌｉｅｔｔｉｎｏ、Ｒｉｃｃｉｏら、２０１４年）。工学的に操作されたＡＰＨは、内因性または野生型ＡＰＨよりも高い親和性および低い選択性を有し得る。
さらに別の実施形態では、ＮＴＡＡのアミジン化（グアニジニル化）を使用して、標識されたＮＴＡＡのＮａＯＨを使用した穏やかな切断を可能にする（Ｈａｍａｄａ、２０１６年、その全体が参照により組み込まれる）。Ｓ−メチルイソチオ尿素、３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジン、Ｓ−エチルチオウロニウムブロミド、Ｓ−エチルチオウロニウムクロリド、Ｏ−メチルイソ尿素、Ｏ−メチルイソウロニウム硫酸塩、Ｏ−メチルイソ尿素硫化水素塩、２−メチル−１−ニトロイソ尿素、アミノイミノメタンスルホン酸、シアナミド、シアノグアニド、ジシアンジアミド、３，５−ジメチル−１−グアニルピラゾール硝酸塩および３，５−ジメチルピラゾール、Ｎ，Ｎ’−ビス（オルト−クロロ−Ｃｂｚ）−Ｓ−メチルイソチオ尿素およびＮ，Ｎ’−ビス（オルト−ブロモ−Ｃｂｚ）−Ｓ−メチルイソチオ尿素を含めたいくつものアミジン化（グアニジニル化）試薬が当技術分野で公知である（Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ、２００５年、その全体が参照により組み込まれる）。
ＮＴＡＡの標識、結合、および分解ワークフローの例は以下の通りである（例えば図４１および図４２を参照されたい）：タンパク質分解による消化に由来する、記録タグで標識されたペプチドの大きな集団（例えば、５千万〜１０億）を単一分子シーケンシング基板（例えば、多孔質ビーズ）に適切な分子内間隔でランダムに固定化する。周期的に、各ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を小さな化学的部分（例えば、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル）で修飾して、ＮＴＡＡ分解プロセスの周期的制御をもたらし、同類結合性物質による結合親和性を増強する。各固定化ペプチドの修飾されたＮ末端アミノ酸（例えば、ＤＮＰ−ＮＴＡＡ、ＳＮＰ−ＮＴＡＡ、アセチル−ＮＴＡＡ）に同類のＮＴＡＡ結合性物質を結合させ、結合したＮＴＡＡ結合性物質に付随するコーディングタグからの情報を固定化されたペプチドに付随する記録タグに移行させる。ＮＴＡＡの認識、結合、およびコーディングタグ情報の記録タグへの移行の後、標識されたＮＴＡＡを、標識の存在下でのみＮＴＡＡを切断することができる工学的に操作されたアミノペプチダーゼ（例えば、ＤＮＰ−ＮＴＡＡもしくはＳＮＰ−ＮＴＡＡに対して）または工学的に操作されたＡＰＨ（例えば、アセチル−ＮＴＡＡに対して）に曝露させることによって除去する。他のＮＴＡＡ標識（例えば、ＰＩＴＣ）も、適切に工学的に操作されたアミノペプチダーゼとともに使用することもできる。特定の実施形態では、単一の工学的に操作されたアミノペプチダーゼまたはＡＰＨは、Ｎ末端アミノ酸標識を有する全ての可能性のあるＮＴＡＡ（翻訳後修飾バリアントを含む）を普遍的に切断する。別の特定の実施形態では、２種、３種、４種、またはそれよりも多くの工学的に操作されたアミノペプチダーゼまたはＡＰＨを使用して、標識されたＮＴＡＡのレパートリーを切断する。
ＤＮＰまたはＳＮＰで標識されたＮＴＡＡに対する活性を有するアミノペプチダーゼは、ベンジルペニシリンに対するメタロ−ベータ−ラクタマーゼ酵素の工学的操作におけるＰｏｎｓａｒｄらにより記載されている手法（Ｐｏｎｓａｒｄ、Ｇａｌｌｅｎｉら、２００１年、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇａｃｉｏ、Ｕｇｕｅｎら、２００３年）のような、アポ酵素（金属補助因子の不在下では不活性）に対する密接結合の選択、その後の機能的触媒の選択ステップを組み合わせるスクリーニングを使用して選択することができる。この二段階選択は、Ｚｎ２＋イオンの添加によって活性化されたメタロ−ＡＰの使用を伴う。固定化されたペプチド基板への密接結合選択の後、Ｚｎ２＋を導入し、ＤＮＰまたはＳＮＰで標識されたＮＴＡＡを加水分解することが可能な、触媒として活性なファージにより、結合したファージの上清中への放出が導かれる。ＤＮＰまたはＳＮＰで標識されたＮＴＡＡを切断するための活性なＡＰを濃縮するために、選択ラウンドを繰り返し実施する。
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、ＮＴＡＡの切断試薬のＮＴＡＡへの動員は、キメラ切断酵素およびキメラＮＴＡＡ修飾因子によって増強することができ、ここで、キメラ切断酵素およびキメラＮＴＡＡ修飾因子は、それぞれ、互いと密接結合反応することが可能な部分を含む（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）（例えば図３９を参照されたい）。例えば、ＮＴＡＡをビオチン−ＰＩＴＣで修飾し、キメラ切断酵素（ストレプトアビジン−エドマナーゼ）を修飾されたＮＴＡＡにストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって動員し、それにより切断酵素の親和性および効率を改善することができる。修飾されたＮＴＡＡが切断され、付随する切断酵素と共にペプチドから発散する。キメラエドマナーゼの例では、この手法により、親和性ＫＤがμＭからサブピコモルまで有効に増大する。記録タグと相互作用する切断剤上のＤＮＡタグを使用した係留により、同様の切断の増強も実現することができる（例えば図４４を参照されたい）。
ＮＴＡＡの切断のための代替として、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）を使用して、最後の２つのＮ末端アミノ酸をペプチドから切断することができる。ある特定の実施形態では、単一のＮＴＡＡを切断することができる（例えば図４５を参照されたい）：図４５は、ブテラーゼＩペプチド基板のＮ末端ライゲーションによりＴＥＶエンドペプチダーゼ基板をペプチドのＮ末端に付着させる、Ｎ末端分解のための手法を示す。付着後、ＴＥＶエンドペプチダーゼにより、新しくライゲーションされたペプチドが照会ペプチド（配列決定を受けているペプチド）から切断され、ＮＴＡＡに付着した単一のアスパラギン（Ｎ）が残る。Ｎ末端から２つのアミノ酸を切断するＤＡＰと一緒にインキュベートすることにより、元のＮＴＡＡの最終的な除去がもたらされる。このプロセス全体をＮ末端分解プロセスとして周期的に繰り返すことができる。
ＣＴＡＡ結合性物質に関する実施形態に関しては、ＣＴＡＡをペプチドから切断する方法も当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，０４６，０５３号には、ペプチドまたはタンパク質をアルキル酸無水物と反応させて、カルボキシ末端をオキサゾロンに変換させ、酸およびアルコールまたはエステルを用いた反応によってＣ末端アミノ酸を遊離させる方法が開示されている。ＣＴＡＡの酵素的切断はまた、カルボキシペプチダーゼによっても実現することができる。いくつかのカルボキシペプチダーゼは、アミノ酸の優先性を示し、例えば、カルボキシペプチダーゼＢは、アルギニンおよびリシンなどの塩基性アミノ酸において優先的に切断する。上記の通り、カルボキシペプチダーゼをアミノペプチダーゼと同じように改変して、Ｃ末端標識を有するＣＴＡＡに特異的に結合するカルボキシペプチダーゼを工学的に作製することもできる。このように、カルボキシペプチダーゼは、Ｃ末端から一度に単一のアミノ酸のみを切断し、分解サイクルの制御を可能にする。一部の実施形態では、改変カルボキシペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性に関しては非選択的であるが、Ｃ末端標識については選択的である。他の実施形態では、改変カルボキシペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性およびＣ末端標識の両方に関して選択的である。
Ｋ．伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを処理および解析するための方法およびキット
目的の巨大分子（複数可）を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、およびジタグライブラリーを、種々の核酸配列決定法を使用して処理および解析することができる。配列決定法の例としては、これだけに限定されないが、連鎖停止配列決定（サンガー配列決定）；合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、およびパイロシーケンシングなどの次世代シーケンシング法；および単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、ＤＩ（ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）シーケンシング、および先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングなどの第３世代シーケンシング法が挙げられる。
伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーを様々なやり方で増幅することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーに、例えば、ＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲによって指数関数的な増幅を行うことができる。エマルジョンＰＣＲにより、より均一な増幅がもたらされることが公知である（Hori, Fukano et al. 2007）。一部の実施形態では、反復のバーコードまたはスペーサー配列を有する配列の場合、ＰＣＲ鋳型スイッチングのリスクが高く、そのリスクを低減するためにエマルジョンＰＣＲまたは線形増幅を使用してもよい。例えば、米国特許第９，５９３，３７５（Ｂ２）号に開示されているようなエマルジョンＰＣＲを使用することができる。この文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
あるいは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーに、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼを使用した鋳型ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写による線形増幅を行って、ｃＤＮＡへとコピーし戻すことができる。また、一態様では、直鎖増幅は、鋳型スイッチングを低減または排除する。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、それに含有されるユニバーサルフォワードプライミング部位およびユニバーサルリバースプライミング部位に適合するプライマーを使用して増幅することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの５’末端、３’末端または両末端のいずれかに配列を付加するための尾部を有するプライマーを使用して増幅することもできる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの末端に付加することができる配列としては、多数のライブラリーを単一の配列決定の実行に多重化することを可能にするライブラリー特異的指数配列、アダプター配列、読み取りプライマー配列、または配列決定プラットフォームに適合する伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、もしくはジタグのライブラリーを作出するための任意の他の配列が挙げられる。次世代シーケンシングのための調製におけるライブラリー増幅の例は以下の通りである：ビーズ（約１０ｎｇ）約１ｍｇから溶出した伸長記録タグライブラリー、２００μＭのｄＮＴＰ、１μＭの各フォワードおよびリバース増幅プライマー、０．５μｌ（１Ｕ）のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してＰＣＲ反応体積２０μｌをセットアップし、以下のサイクル条件に供する：９８℃で３０秒、その後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル、その後、７２℃で７分、次いで、４℃で保持。
ある特定の実施形態では、増幅前、増幅中または増幅後のいずれかにおいて、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーに標的濃縮を行うことができる。標的濃縮は、配列決定前に、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーから、目的の巨大分子を表す伸長記録タグを選択的に捕捉または増幅するために使用することができる。タンパク質配列に対する標的濃縮は、費用が高く、また、標的タンパク質に対して高度に特異的な結合性物質を作製することが難しいので、困難である。抗体は、非特異的であり、何千ものタンパク質にわたる規模生産が難しいことが周知である。本開示の方法では、タンパク質コードを核酸コードに変換し、次いで、ＤＮＡライブラリーに利用可能な広範囲の標的化ＤＮＡ濃縮戦略を使用することによってこの問題を回避する。目的のペプチドを、それらの対応する伸長記録タグを濃縮することによって試料中で濃縮することができる。標的化濃縮の方法が当技術分野で公知であり、それらとして、ハイブリッド捕捉アッセイ、ＰＣＲに基づくアッセイ、例えば、ＴｒｕＳｅｑ ｃｕｓｔｏｍ Ａｍｐｌｉｃｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ｐａｄｌｏｃｋプローブ（分子反転プローブとも称される）などが挙げられる（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｍａｎｏｖａら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：１１１〜１１８頁；Ｂｏｄｉら、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｔｅｃｈ．、２０１３年、２４巻：７３〜８６頁；Ｂａｌｌｅｓｔｅｒら、２０１６年、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、３５７〜３７２頁；Ｍｅｒｔｅｓら、２０１１年、Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１０巻：３７４〜３８６頁；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５巻：２０８５〜８頁を参照されたい）。
一実施形態では、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーをハイブリッド捕捉に基づくアッセイによって濃縮する（例えば、図１７Ａおよび図１７Ｂを参照されたい）。ハイブリッド−捕捉に基づくアッセイでは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーを、アフィニティータグ（例えば、ビオチン）で標識した標的特異的オリゴヌクレオチドまたは「ベイトオリゴヌクレオチド」とハイブリダイズさせる。標的特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを、親和性リガンド（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ）を使用してそれらの親和性タグを介して「プルダウン」し、バックグラウンド（非特異的な）伸長記録タグを洗い流す（例えば、図１７を参照されたい）。次いで、濃縮された伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを正の濃縮のために得る（例えば、ビーズから溶出する）。
アレイに基づく「ｉｎ ｓｉｔｕ」オリゴヌクレオチド合成およびその後のオリゴヌクレオチドプールの増幅によって合成されたベイトオリゴヌクレオチドに関しては、所与のオリゴヌクレオチドアレイ内でユニバーサルプライマーのいくつかのセットを使用することにより、競合するベイトを工学的に操作してプールにすることができる。それぞれの型のユニバーサルプライマーについて、ビオチン化プライマーと非ビオチン化プライマーの比により、濃縮比を制御する。いくつかのプライマー型の使用により、いくつかの濃縮比を設計して最終的なオリゴヌクレオチドベイトプールにすることができる。
ベイトオリゴヌクレオチドを目的の巨大分子を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグと相補的になるように設計することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ内のスペーサー配列に対するベイトオリゴヌクレオチドの相補性の程度は、０％から１００％まで、およびその間の任意の整数にすることができる。このパラメーターは、少しの濃縮実験によって容易に最適化することができる。一部の実施形態では、コーディングタグ設計においてエンコーダー配列に対するスペーサーの長さを最小化する、または、スペーサーを、ベイト配列とのハイブリダイゼーションに利用できないように設計する。１つの手法は、補助因子の存在下で二次構造を形成するスペーサーを使用することである。そのような二次構造の例は、互いの上に積み重なった２つまたはそれよりも多くのグアニンカルテットによって形成される構造である、Ｇ−４重鎖である（Ｂｏｃｈｍａｎ、Ｐａｅｓｃｈｋｅら、２０１２年）。グアニンカルテットは、フーグスティーン水素結合によって結びついた４つのグアニン塩基によって形成される平面正方形構造である。Ｇ−４重鎖構造は、カチオン、例えば、Ｋ＋イオン対Ｌｉ＋イオンの存在下で安定化される。
使用するベイトオリゴヌクレオチドの数を最小限にするために、各タンパク質に由来する比較的一意のペプチドのセットをバイオインフォマティクスにより識別することができ、目的のペプチドの対応する伸長記録タグライブラリー表示と相補的なベイトオリゴヌクレオチドのみをハイブリッド捕捉アッセイに使用する。同じまたは異なるベイトセットを用いて逐次的なラウンドまたは濃縮を行うこともできる。
その断片（例えば、ペプチド）を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリー中の巨大分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）の全長を濃縮するために、「タイルド」ベイトオリゴヌクレオチドをタンパク質の核酸表示全体にわたって設計することができる。
別の実施形態では、プライマー伸長およびライゲーションに基づき媒介される増幅濃縮（ＡｍｐｌｉＳｅｑ、ＰＣＲ、ＴｒｕＳｅｑ ＴＳＣＡなど）を使用して、巨大分子のサブセットを表すライブラリーエレメントを選択し、モジュール画分を濃縮することができる。競合するオリゴを使用して、プライマー伸長、ライゲーション、または増幅の程度を調整することもできる。最も単純な実行では、これは、ユニバーサルプライマー尾部を含む標的特異的プライマーと５’ユニバーサルプライマー尾部を欠く競合プライマーの混合物によって実現することができる。最初のプライマー伸長の後、５’ユニバーサルプライマー配列を有するプライマーのみを増幅することができる。ユニバーサルプライマー配列を有するプライマーとユニバーサルプライマー配列を有さないプライマーの比により、増幅する標的の分率を制御する。他の実施形態では、ハイブリダイズするが伸長しないプライマーを含めることを使用して、プライマー伸長、ライゲーション、または増幅を受けるライブラリーエレメントの分率をモジュレートすることができる。
配列決定前に伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグをライブラリーから選択的に除去するために標的化濃縮法を負の選択形式で使用することもできる。したがって、ビオチン化ベイトオリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンでコーティングしたビーズを使用する上記の例において、上清を配列決定のために保持する一方で、ビーズに結合したベイト−オリゴヌクレオチド：伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグハイブリッドは解析しない。除去することができる望ましくない伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの例は、豊富な巨大分子種、例えば、タンパク質、アルブミン、免疫グロブリンなどを表すものである。
標的とハイブリダイズするがビオチン部分を欠く競合オリゴヌクレオチドベイトをハイブリッド捕捉ステップに使用して、濃縮しようとする任意の特定の遺伝子座の分率をモジュレートすることもできる。競合オリゴヌクレオチドベイトは、標的とのハイブリダイゼーションについて、濃縮中の標的プルダウンの分率を有効にモジュレートする標準のビオチン化ベイトと競合する（例えば図１７を参照されたい）。特にアルブミンなどの過度に豊富な種に関して、この競合的な抑制手法を使用することで１０桁のタンパク質発現のダイナミックレンジを何桁か圧縮することができる。したがって、所与の遺伝子座に関して、標準のハイブリッド捕捉に対する捕捉されるライブラリーエレメントの分率を１００％から０％濃縮までモジュレートすることができる。
さらに、ライブラリー正規化技法を使用して、過度に豊富な種を伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグライブラリーから除去することができる。この手法は、トリプシン、ＬｙｓＣ、ＧｌｕＣなどの部位特異的プロテアーゼ消化によって生成されたペプチドを起源とする規程された長さのライブラリーに対して最良に機能する。一実施例では、正規化は、二本鎖ライブラリーを変性させ、ライブラリーエレメントを再アニーリングさせることによって実現することができる。豊富なライブラリーエレメントは、２分子ハイブリダイゼーションカイネティクスの二次速度定数に起因して、豊富さがより低いエレメントよりも迅速に再アニーリングする（Ｂｏｃｈｍａｎ、Ｐａｅｓｃｈｋｅら、２０１２年）。ヒドロキシアパタイトカラムでのクロマトグラフィー（ＶａｎｄｅｒＮｏｏｔら、２０１２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５３巻：３７３〜３８０頁）またはライブラリーを、ｄｓＤＮＡライブラリーエレメントを破壊するタラバガニ由来の２重鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）で処理すること（Ｓｈａｇｉｎら、２００２年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２巻：１９３５〜４２頁）などの当技術分野で公知の方法を使用して、ｓｓＤＮＡライブラリーエレメントを豊富なｄｓＤＮＡライブラリーエレメントから分離することができる。
固体支持体に付着させる前の巨大分子および／または得られた伸長記録タグライブラリーの分画、濃縮、およびサブトラクション方法の任意の組合せにより、配列決定読み取りを節約し、豊富さが低い種の測定を改善することができる。
一部の実施形態では、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーをライゲーションまたは末端相補的ＰＣＲによって連鎖状にして、それぞれ多数の異なる伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを含む長いＤＮＡ分子を創出する（それぞれ、その全体が参照により組み込まれる、Ｄｕら、２００３年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３５巻：６６〜７２頁；Ｍｕｅｃｋｅら、２００８年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１６巻：８３７〜８４１頁；米国特許第５，８３４，２５２号）。この実施形態は、例えば、長鎖のＤＮＡをナノポアシーケンシングデバイスによって解析するナノポアシーケンシングである。
一部の実施形態では、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグに対して直接単一分子解析を実施する（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、２００８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０巻：１０６〜１０９頁を参照されたい）。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを、フローセル表面（任意選択でマイクロセルパターン）へのローディングに適合するフローセルまたはビーズなどの固体支持体上で直接解析することができ、ここで、フローセルまたはビーズは、単一分子シーケンサーまたは単一分子脱コーディング計器に組み込むことができる。単一分子脱コーディングに関しては、プールした蛍光標識した脱コーディングオリゴヌクレオチドの数ラウンドのハイブリダイゼーション（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１４巻：９７０〜７頁）を使用して、伸長記録タグ内のコーディングタグの同一性および順序の両方を確認することができる。コーディングタグの結合の順序をデコンボリューションするために、結合性物質を上記のサイクル特異的コーディングタグで標識することができる（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１４巻：９７０〜７頁も参照されたい）。サイクル特異的コーディングタグは、単一の巨大分子を表す単一の連鎖状の伸長記録タグ、または単一の巨大分子を表す伸長記録タグの集合のどちらに対しても機能する。
伸長レポータータグ、伸長コーディングタグ、またはジタグライブラリーの配列決定後、得られた配列をそれらのＵＭＩにより崩壊させ、次いで、それらの対応する巨大分子（例えば、ペプチド、タンパク質、タンパク質複合体）に付随させ、細胞内の巨大分子型全体（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質巨大分子についてのプロテオーム）とアラインメントすることができる。得られた配列をそれらのコンパートメントタグにより崩壊させ、特定の実施形態では、単一のタンパク質分子のみまたは非常に限られた数のタンパク質分子を含有する、それらの対応するコンパートメントのプロテオームに付随させることもできる。タンパク質の識別および数量化はどちらも、このデジタルペプチド情報から容易に引き出すことができる。
一部の実施形態では、コーディングタグ配列を特定の配列決定解析プラットフォームに対して最適化することができる。特定の実施形態では、配列決定プラットフォームは、ナノポアシーケンシングである。一部の実施形態では、配列決定プラットフォームの塩基当たりのエラー率は、＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％である。例えば、ナノポアシーケンシング装置を使用して伸長記録タグを解析する場合、バーコード配列（例えば、エンコーダー配列）を、ナノポアを通過時に最適に電気的に区別可能になるように設計することができる。本明細書に記載の方法に従ったペプチド配列決定は、ナノポアシーケンシングの一塩基正確度はまだ幾分低いが（７５％〜８５％）、「エンコーダー配列」の決定は、はるかにより正確であるはずである（＞９９％）ことを考慮すると、ナノポアシーケンシングによく適し得る。さらに、ＤＩ（ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ナノポアシーケンシングと称される技法を、システム設計を著しく単純化する分子モーターを必要とせずに、ナノポア鎖シーケンシングと共に使用することができる（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｂｕｔｌｅｒら、２０１０年）。ＤＩナノポアシーケンシングによる伸長記録タグの読み取りには、連鎖状の伸長記録タグライブラリー内のスペーサーエレメントを相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングする必要がある。本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは、得られる２重鎖の有効なＴｍを上昇させるために、ＬＮＡ、または他の改変された核酸または類似体を含んでよい。これらの２重鎖スペーサー領域で装飾された一本鎖伸長記録タグがポアを通過するに従い、２本鎖領域が狭窄域で一過性にストールし、それにより、２重鎖領域に隣接する約３塩基の電流読み取りが可能になる。特定の実施形態では、ＤＩナノポアシーケンシングのために、エンコーダー配列を、スペーサーエレメントに隣接する３塩基により最大限に電気的に区別可能なナノポアシグナルが生じるように設計する（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０１０年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０７巻：１６０６０〜５頁）。モーターフリーＤＩシーケンシングの代替として、スペーサーエレメントを、ナノポアを通過するに従い、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを一過性にストールし、それにより、隣接するエンコーダー配列の読み取りを可能にするＧ−カルテットなどの二次構造をとるように設計することができる（Ｓｈｉｍ、Ｔａｎら、２００９年、Ｚｈａｎｇ、Ｚｈａｎｇら、２０１６年）。ストールを過ぎて進んだ後、次のスペーサーにより一過性のストールが創出され、それにより、次のエンコーダー配列の読み取りが可能になる、などである。
本明細書に開示されている方法は、複数の巨大分子（例えば、ペプチド）の同時（多重化）検出、定量化および／または配列決定を含めた解析のために使用することができる。多重化とは、本明細書で使用される場合、複数の巨大分子を同じアッセイで解析することを指す。複数の巨大分子は、同じ試料に由来するものであってもよく、異なる試料に由来するものであってもよい。複数の巨大分子は、同じ対象に由来するものであってもよく、異なる対象に由来するものであってもよい。解析される複数の巨大分子は、異なる巨大分子（例えば、ペプチド）であってもよく、異なる試料に由来する同じ巨大分子（例えば、ペプチド）であってもよい。複数の巨大分子は、２またはそれよりも多くの巨大分子、５またはそれよりも多くの巨大分子、１０またはそれよりも多くの巨大分子、５０またはそれよりも多くの巨大分子、１００またはそれよりも多くの巨大分子、５００またはそれよりも多くの巨大分子、１０００またはそれよりも多くの巨大分子、５，０００またはそれよりも多くの巨大分子、１０，０００またはそれよりも多くの巨大分子、５０，０００またはそれよりも多くの巨大分子、１００，０００またはそれよりも多くの巨大分子、５００，０００またはそれよりも多くの巨大分子、または１，０００，０００またはそれよりも多くの巨大分子を含む。
試料多重化は、記録タグで標識された巨大分子試料を予めバーコーディングすることによって実現することができる。各バーコードは異なる試料を表し、試料を周期的結合アッセイまたは配列解析前にプールすることができる。このように、多くのバーコードで標識した試料を単一のチューブ内で同時に処理することができる。この手法は、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）で実施するイムノアッセイに対する有意な改善である（Ａｋｂａｎｉ、Ｂｅｃｋｅｒら、２０１４年、ＣｒｅｉｇｈｔｏｎおよびＨｕａｎｇ、２０１５年、ＮｉｓｈｉｚｕｋａおよびＭｉｌｌｓ、２０１６年）。このように、本開示は、基本的に、単純なワークフローを用いるＲＰＰＡアッセイの代わりに、多重化された高度にデジタルの試料および分析物を提供する。
Ｌ． ＮＴＡＡの認識、記録タグ伸長、およびＮＴＡＡの切断の周期的ラウンドにより巨大分子を特徴付けるための方法およびキット
ある特定の実施形態では、本開示において提示される巨大分子を解析するための本キットを使用する方法は、多数の結合サイクルを有し、ここで巨大分子を複数の結合性物質と接触させ、連続的な結合性物質の結合により、履歴的な結合情報が核酸に基づくコーディングタグの形態で少なくとも１つの巨大分子に付随する記録タグに移行する。このように、多数の結合事象に関する情報を含有する履歴的記録を核酸形式で生成する。
Ｎ末端分解に基づく手法を使用してペプチド巨大分子を解析する方法に関する実施形態では（例えば、図３、図４、図４１、および図４２を参照されたい）、第１の結合性物質をｎアミノ酸のペプチドのｎ番目のＮＴＡＡに接触させ、結合させ、第１の結合性物質のコーディングタグ情報をペプチドに付随する記録タグに移行させ、それにより、一次伸長記録タグを生成した後、ｎ番目のＮＴＡＡを本明細書に記載の通り切断する。ｎ番目のＮＴＡＡの切断により、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸がＮ末端アミノ酸に変わり、これは、本明細書では（ｎ−１）番目のＮＴＡＡと称される。本明細書に記載の通り、ｎ番目のＮＴＡＡは、必要に応じて、部分（例えば、ＰＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル、アミジニルなど）で標識することができ、これは、標識された形態のＮＴＡＡに結合するように工学的に操作された切断酵素と併せて特に有用である。ｎ番目のＮＴＡＡを標識した場合、次いで、（ｎ−１）番目のＮＴＡＡも同じ部分を用いて標識する。第２の結合性物質をペプチドと接触させ、（ｎ−１）番目のＮＴＡＡに結合させ、第２の結合性物質のコーディングタグ情報を一次伸長記録タグに移行させ、それにより、二次伸長記録タグ（例えば、ペプチドを表す連鎖状のｎ次伸長記録タグを生成するため）、または異なる記録タグ（例えば、ペプチドを集合的に表す多数の伸長記録タグを生成するため）を生成する。（ｎ−１）番目のＮＴＡＡの切断により、ペプチドの（ｎ−２）番目のアミノ酸がＮ末端アミノ酸に変わり、これは、本明細書では（ｎ−２）番目のＮＴＡＡと称される。追加的な結合、移行、切断、および必要に応じてＮＴＡＡ標識を、上記の通り、最大ｎアミノ酸まで行って、ペプチドを集合的に表す、ｎ次伸長記録タグまたはｎ個の別々の伸長記録タグを生成することができる。本明細書で使用される場合、結合性物質、コーディングタグ、または伸長記録タグに関して使用される際のｎ「次」は、結合性物質およびその付随するコーディングタグが使用されるｎ回目の結合サイクル、または伸長記録タグが創出されるｎ回目の結合サイクルを指す。
一部の実施形態では、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる結合性物質（例えば、第３の結合性物質、第４の結合性物質、第５の結合性物質など）の巨大分子への接触を同時に実施する。例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる次数の結合性物質を、例えば結合性物質のライブラリーを形成するために、一緒にプールすることができる。別の例では、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる次数の結合性物質を、一緒にプールするのではなく、巨大分子に同時に添加する。一実施形態では、結合性物質のライブラリーは、２０種の標準の天然に存在するアミノ酸に選択的に結合する少なくとも２０種の結合性物質を含む。
他の実施形態では、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる次数の結合性物質をそれぞれ別々の結合サイクルで巨大分子をと接触させ、逐次的に添加する。ある特定の実施形態では、多数の結合性物質を同時に使用することが好ましく、その理由は、並行手法により時間が節約されるから、および、結合性物質が競合状態になり、それにより、同類結合性物質が結合する部位への非同類結合性物質による非特異的結合が低減するからである。
本明細書に記載の方法によって生成される最終的な伸長記録タグの長さは、コーディングタグ（例えば、エンコーダー配列およびスペーサー）の長さ、記録タグ（例えば、一意の分子識別子、スペーサー、ユニバーサルプライミング部位、バーコード）の長さ、実施される結合サイクルの数、および各結合サイクルからのコーディングタグが同じ伸長記録タグに移行されるか多数の伸長記録タグに移行されるかを含めた多数の因子に依存する。ペプチドを表し、エドマン分解様切断方法によって作製される連鎖状の伸長記録タグの例では、コーディングタグが、両側に５塩基のスペーサーが隣接する５塩基のエンコーダー配列を有する場合、ペプチドの結合性物質履歴を示す最終的な伸長記録タグ上のコーディングタグ情報は、１０塩基×エドマン分解サイクルの数になる。２０サイクルの実行に関しては、伸長記録は、少なくとも２００塩基である（最初の記録タグ配列は含めない）。この長さは、標準の次世代シーケンシング計器に適合する。
最終的な結合サイクルおよび最終的な結合性物質のコーディングタグ情報の伸長記録タグへの移行の後、記録タグに、ユニバーサルリバースプライミング部位をライゲーション、プライマー伸長または当技術分野で公知の他の方法によって付加することによってキャップ形成することができる。一部の実施形態では、記録タグ内のユニバーサルフォワードプライミング部位は最終的な伸長記録タグに付属するユニバーサルリバースプライミング部位に適合する。一部の実施形態では、ユニバーサルリバースプライミング部位は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７プライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’−配列番号１３４）またはＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’−配列番号１３３）である。記録タグの鎖のセンスに応じてセンスまたはアンチセンスＰ７を付属させることができる。伸長記録タグライブラリーを固体支持体（例えば、ビーズ）からから直接切断または増幅し、従来の次世代シーケンシングアッセイおよびプロトコールに使用することができる。
一部の実施形態では、プライマー伸長反応を一本鎖伸長記録タグのライブラリーに対して実施して、その相補鎖をコピーする。
ＮＧＰＳペプチドシーケンシングアッセイは、いくつかの化学的ステップおよび酵素的ステップを周期的進行で含む。ＮＧＰＳシーケンシングは単一分子であるという事実により、いくつかの重要な利点がプロセスに付与される。単一分子アッセイの第１の重要な利点は、種々の周期的化学的／酵素的ステップにおける非能率に対する頑強性である。これは、コーディングタグ配列内に存在するサイクル特異的バーコードを使用することによって可能になる。
サイクル特異的コーディングタグを使用して、各サイクルからの情報を追跡する。これは単一分子シーケンシング手法であるので、配列決定プロセスの各結合／移行サイクルにおける７０％の効率でさえ、マッピング可能な配列情報を生成するために十分すぎるほどである。例として、１０塩基ペプチド配列「ＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴ」（配列番号１６９）は、我々の配列プラットフォームでは「ＣＰＸＱＸＷＸＤＸＴ」（配列番号１７０）と読み取られる可能性がある（Ｘ＝任意のアミノ酸；アミノ酸の存在はサイクル数追跡によって推定される）。この部分的なアミノ酸配列読み取りは、ＢＬＡＳＴＰを使用してそれをヒトｐ５３タンパク質に一意的にマッピングし戻すために十分すぎるほどである。そのように、我々のプロセスはいずれも完全にロバストにする必要はない。さらに、サイクル特異的バーコードを我々の分配概念と組み合わせれば、どのペプチドのセットが元のタンパク質分子にマッピングされるかが（コンパートメントバーコードによって）わかるので、１０カ所の位置のうちの数アミノ酸を識別するだけでタンパク質の絶対的な識別を実現することができる。
分画、区画化、および結合能が限定された樹脂によるタンパク質正規化
プロテオミクス解析の重要な問題の１つは、試料中のタンパク質の豊富さの大きなダイナミックレンジに取り組むことである。タンパク質は、血漿中で１０桁を超えるダイナミックレンジにわたる（「上位２０種」が枯渇した血漿でさえ）。ある特定の実施形態では、解析前に、試料からのある特定のタンパク質種（例えば、極めて豊富なタンパク質）のサブトラクションを実施する。これは、例えば、上位２０種の血漿タンパク質を枯渇させるＳｉｇｍａのＰＲＯＴ２０免疫枯渇キットなどの市販のタンパク質枯渇試薬を使用して実現することができる。さらに、ダイナミックレンジを管理可能な３〜４桁までさらに著しく低下させる手法をとることが有用であると思われる。ある特定の実施形態では、タンパク質試料のダイナミックレンジは、電気泳動および液体クロマトグラフィーを含めた標準の分画法を使用してタンパク質試料を分画するか（Zhou, Ning et al. 2012）、または、画分を、限られた能力のタンパク質結合性ビーズ／樹脂（例えば、ヒドロキシル化シリカ粒子）をローディングしたコンパートメント（例えば、液滴）に分配し（McCormick1989）、結合したタンパク質を溶出することによってモジュレートすることができる。各区画化された画分中の過剰なタンパク質を洗い流す。
電気泳動による方法の例としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、フリーフロー電気泳動、ゲル溶出分画液相封入電気泳動（ＧＥＬＦｒＥＥ）が挙げられる。液体クロマトグラフィータンパク質の分離方法の例としては、逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥ）、サイズ排除（ＳＥ）、親水性相互作用などが挙げられる。コンパートメント分配の例としては、エマルジョン、液滴、マイクロウェル、平らな基板上の物理的に分離された領域などが挙げられる。例示的なタンパク質結合性ビーズ／樹脂としては、フェノール基またはヒドロキシル基で誘導体化されたシリカナノ粒子（例えば、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ Ｒｅｓｉｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＲａｐｉｄＣｌｅａｎ（ＬａｂＴｅｃｈ製）など）が挙げられる。ビーズ／樹脂の結合能を限定することにより、所与の画分中に溶出する高度に豊富なタンパク質は部分的にビーズに結合するだけになり、過剰なタンパク質は除去される。
Ｍ． 単一の細胞のプロテオームを分配するためのまたは分子サブサンプリングするための方法およびキット
別の態様では、本開示は、バーコーディングおよび分配技法を使用して試料中のタンパク質を大規模並列解析するためのキットおよび方法を提供する。タンパク質解析の現行の手法は、タンパク質巨大分子をペプチド配列決定に適したより短いペプチド分子に断片化することを伴う。したがって、そのような手法を使用して得られる情報は、断片化ステップによって限定され、例えば、各試料中に生じる翻訳後修飾、タンパク質間相互作用、試料中に存在するタンパク質集団の組成、または特定の細胞もしくは細胞の集団に由来するなどタンパク質巨大分子の起源を含めた、タンパク質の広範な連続した情報は排除される。タンパク質分子内の翻訳後修飾に関する広範な情報（例えば、プロテオフォーム特徴付け）により、より徹底的な生物学的像がもたらされ、どのペプチドがどのタンパク質分子に属するかに関する広範な情報により、ペプチド配列の、基礎をなすタンパク質配列へのよりロバストなマッピングがもたらされる（例えば、図１５Ａを参照されたい）。これは、ペプチド配列決定技術が、わずか５種のアミノ酸型からの情報など、不完全なアミノ酸配列情報しかもたらさない場合に特に意義がある。本明細書に開示されている分配方法を使用することにより、同じタンパク質分子に由来するいくつかのペプチドからの情報と組み合わせて、タンパク質分子の同一性（例えば、プロテオフォーム）をより正確に評価することができる。コンパートメントタグを同じコンパートメント（複数可）に由来するタンパク質およびペプチドに付随させることにより、分子および細胞情報の再構成が容易になる。典型的なプロテオーム解析では、細胞を溶解し、タンパク質を短いペプチドに消化するため、どのタンパク質がどの細胞または細胞型に由来するか、およびどのペプチドがどのタンパク質またはタンパク質複合体に由来するかに関する全体的な情報が破壊される。この全体的な情報は、細胞および組織内の生物学および生化学を理解するために重要である。
分配とは、試料内の巨大分子の集団に由来する巨大分子の亜集団への一意のバーコードのランダムな割り当てを指す。分配は、巨大分子をコンパートメントに区分することによって実現することができる。分配は、単一のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよく、コンパートメントの集団に由来する多数のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよい。
複数（例えば、数百万〜数十億）のコンパートメントから同じ物理的コンパートメントまたはコンパートメントの群に、またはそれにおいて分離された巨大分子のサブセットまたはタンパク質試料のサブセットを一意のコンパートメントタグによって識別する。したがって、コンパートメントタグを使用して、同じコンパートメントタグを有する１つまたは複数のコンパートメントに由来する構成物と、異なるコンパートメントタグを有する別のコンパートメント（またはコンパートメントの群）内の構成物を、これらの構成物が一緒にプールされた後であっても区別することができる。
本開示は、複雑なプロテオーム試料（例えば、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチド）または複雑な細胞試料を複数のコンパートメントに分配することによってタンパク質解析を増強する方法であって、各コンパートメントが、個々のコンパートメント内では同じであり（任意選択のＵＭＩ配列は除いて）、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる複数のコンパートメントタグを含む、方法を提供する（例えば図１８〜２０を参照されたい）。コンパートメントは、任意選択で、複数のコンパートメントタグが接合した固体支持体（例えば、ビーズ）を含む。複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のペプチドに断片化し、次いで、それを複数のコンパートメントタグと、複数のコンパートメント内で複数のペプチドと複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で接触させ、それにより、複数のコンパートメントタグ付きペプチドを生成する。あるいは、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドに、複数のコンパートメントタグを、複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドと複数のコンパートメント内の複数のコンパートメントタグのアニーリングまたは接合を可能にするために十分な条件下で接合し、それにより、複数のコンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチドを生成する。次いで、コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントから収集し、任意選択で複数のコンパートメントタグ付きペプチドに断片化する。１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを本明細書に記載の方法のいずれかに従って解析する。
ある特定の実施形態では、コンパートメントタグ情報を、プライマー伸長（例えば、図５および図４８を参照されたい）またはライゲーション（例えば、図６、図４６、および図４７を参照されたい）により、巨大分子（例えば、ポリペプチド）などの分析物に付随する記録タグへと移行させる。
一部の実施形態では、コンパートメントタグは、コンパートメント内で溶液中に遊離している。他の実施形態では、コンパートメントタグをコンパートメントの表面（例えば、マイクロタイタープレートもしくはピコタイタープレートのウェルの底）またはビーズもしくはコンパートメント内のビーズに直接接合させる。
コンパートメントは、水性コンパートメント（例えば、マイクロ流体液滴）であっても固体コンパートメントであってもよい。固体コンパートメントとしては、例えば、ナノ粒子、マイクロスフェア、マイクロタイターウェルもしくはピコタイターウェル、またはアレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フローセル、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、もしくはニトロセルロースに基づくポリマー表面上の分離された領域が挙げられる。ある特定の実施形態では、各コンパートメントは、平均して、単一の細胞を含有する。
固体支持体は、これだけに限定されないが、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フローセル、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含めた任意の支持体表面であってよい。固体支持体用の材料としては、これだけに限定されないが、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである。
コンパートメントタグを付けたビーズを伴うコンパートメントに試料を分配する種々の方法は、Ｓｈｅｍｂｅｋａｒらにより概説されている（Ｓｈｅｍｂｅｋａｒ、Ｃｈａｉｐａｎら、２０１６年）。一実施例では、プロテオームをエマルジョンにより液滴中に分配して、タンパク質分子およびタンパク質複合体に関する全体的な情報を本明細書に開示されている方法を使用して記録することを可能にする（例えば、図１８および図１９を参照されたい）。ある特定の実施形態では、プロテオームをコンパートメント（例えば、液滴）に、コンパートメントタグを付けたビーズ、活性化可能なプロテアーゼ（直接または間接的に熱、光などによって）、およびプロテアーゼ抵抗性になるように工学的に操作された（例えば、修飾リシン、ペグ化など）ペプチドリガーゼと一緒に分配する。ある特定の実施形態では、プロテオームを変性剤で処理して、タンパク質またはポリペプチドのペプチド構成物を評価することができる。タンパク質のネイティブな状態に関する情報が望まれる場合、相互作用するタンパク質複合体を、それに由来するペプチドのその後の分析のためにコンパートメントに分配することができる。
コンパートメントタグは、任意選択で片側または両側にスペーサーまたはユニバーサルプライマー配列が隣接するバーコードを含む。プライマー配列は、記録タグの３’配列に対して相補的であってよく、それにより、プライマー伸長反応によるコンパートメントタグ情報の記録タグへの移行が可能になる（例えば図２２Ａ〜Ｂを参照されたい）。バーコードは、固体支持体もしくはコンパートメントに付着した一本鎖核酸分子または固体支持体もしくはコンパートメントとハイブリダイズしたその相補配列、または両方の鎖で構成されるものであってよい（例えば、図１６を参照されたい）。コンパートメントタグは、ペプチドとのカップリングのための、例えばスペーサーに付着した、機能的部分を含んでよい。一実施例では、機能的部分（例えば、アルデヒド）は、複数のペプチド上のＮ末端アミノ酸残基と反応することが可能である。別の例では、機能的部分は、複数のペプチド上の内部アミノ酸残基（例えば、リシンまたは「クリック」反応性部分で標識されたリシン）と反応することが可能である。別の実施形態では、機能的部分は、単に、ＤＮＡタグで標識されたタンパク質とハイブリダイズすることが可能な相補ＤＮＡ配列であってよい。あるいは、コンパートメントタグは、コンパートメントタグの目的のペプチドへのライゲーションを可能にするために、タンパク質リガーゼ（例えば、ブテラーゼＩまたはそのホモログ）の認識配列を含むペプチドをさらに含むキメラ分子であってよい（例えば図２２Ａを参照されたい）。コンパートメントタグは、より大きな核酸分子内の成分であってよく、当該核酸分子は、それに接合したペプチドに関する識別情報をもたらすための一意の分子識別子、スペーサー配列、ユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組合せを任意選択でさらに含む。このＵＭＩ配列は、一般に、コンパートメント内のコンパートメントタグの集団の間で異なる。ある特定の実施形態では、コンパートメントタグは、記録タグ内の成分であり、したがって、個々のコンパートメント情報をもたらすために使用する同じタグを、それが付着したペプチドに関する個々のペプチド情報を記録するためにも使用する。
ある特定の実施形態では、コンパートメントタグは、コンパートメントタグをコンパートメントにプリント、スポッティング、インク噴射することによって形成することができる。ある特定の実施形態では、複数のコンパートメントタグを付けたビーズであって、ビーズ当たり１つのバーコード型が存在するビーズを、Ｋｌｅｉｎら、２０１５年、Ｃｅｌｌ、１６１巻：１１８７〜１２０１頁；Ｍａｃｏｓｋｏら、２０１５年、Ｃｅｌｌ、１６１巻：１２０２〜１２１４頁；およびＦａｎら、２０１５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４７巻：１２５８３６７頁に記載されている通り、スプリット・アンド・プール（ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｐｏｏｌ）オリゴヌクレオチドライゲーションまたは合成によって形成する。コンパートメントタグを付けたビーズは、個々の合成または固定化によって形成することもできる。ある特定の実施形態では、コンパートメントタグを付けたビーズは、一方の部分が記録タグを含むコンパートメントタグを含み、他方の部分が消化されたペプチドをカップリングすることができる機能的部分を含む二機能性記録タグをさらに含む（例えば図１９および図２０を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、複数のコンパートメント内の複数のタンパク質またはポリペプチドを、プロテアーゼを用いて複数のペプチドに断片化する。プロテアーゼは、メタロプロテアーゼであってよい。ある特定の実施形態では、メタロプロテアーゼの活性が金属カチオンの光活性化放出によってモジュレートされる。使用することができるエンドペプチダーゼの例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、クロストリパン、グルタミルエンドペプチダーゼ（ＧｌｕＣ）、エンドペプチダーゼＡｒｇＣ、ペプチジル−ａｓｐメタロ−エンドペプチダーゼ（ＡｓｐＮ）、エンドペプチダーゼＬｙｓＣおよびエンドペプチダーゼＬｙｓＮが挙げられる。それらの活性化の形式は、緩衝液および二価カチオンの必要性に応じて変動する。任意選択で、タンパク質またはポリペプチドをペプチド断片に十分に消化した後、プロテアーゼを不活性化する（例えば、熱、フルオロ油またはシリコーン油可溶性阻害剤、例えば、二価カチオンキレート化剤など）。
コンパートメントタグを用いたペプチドバーコーディングのある特定の実施形態では、タンパク質分子（任意選択で、変性ポリペプチド）を、ＤＮＡタグを用いて、ＤＮＡタグをタンパク質のリシン基のε−アミン部分とのコンジュゲーションによって、またはアルキンなどの反応性クリック部分で予め標識したタンパク質／ポリペプチドに付着させるクリックケミストリーによって間接的に標識する（例えば図２Ｂおよび図２０Ａを参照されたい）。次いで、ＤＮＡタグで標識したポリペプチドを、コンパートメントタグ（例えば、液滴内に含有されるビーズに結合したＤＮＡバーコード）を含むコンパートメントに分配し（例えば図２０Ｂを参照されたい）、ここで、コンパートメントタグは、各コンパートメントを識別するバーコードを含有する。一実施形態では、ビーズに付随する単一のタンパク質／ポリペプチド分子と単一の種のＤＮＡバーコードを共封入する（例えば図２０Ｂを参照されたい）。別の実施形態では、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０６１５１７号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されているものと、ＤＮＡではなくタンパク質に適用されること以外は同様に、コンパートメントは、付着したコンパートメント（ビーズ）タグと共にビーズの表面を構成し得る。コンパートメントタグは、バーコード（ＢＣ）配列、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１’）、ＵＭＩ配列、およびスペーサー配列（Ｓｐ）を含んでよい。一実施形態では、分配と同時にまたはその後に、コンパートメントタグをビーズから切断し、ポリペプチドに付着したＤＮＡタグと、例えば、それぞれＤＮＡタグおよびコンパートメントタグ上の相補的なＵ１配列およびＵ１’配列を介してハイブリダイズさせる。ビーズへの分配に関しては、ＤＮＡタグで標識したタンパク質をビーズ表面上のコンパートメントタグと直接ハイブリダイズさせることができる（例えば図２０Ｃを参照されたい）。このハイブリダイゼーションステップ後、ＤＮＡタグとハイブリダイズしたポリペプチドをコンパートメントから抽出し（例えば、エマルジョン「分解」、またはビーズからのコンパートメントタグの切断）、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長ステップを使用して、バーコードおよびＵＭＩ情報をポリペプチド上のＤＮＡタグに書き込んでコンパートメントバーコードが付された記録タグをもたらす（例えば図２０Ｄを参照されたい）。ポリペプチドを、Ｃ末端リシンにおいてユニバーサルプライミング配列を含有する記録タグ、コンパートメントタグ、およびＵＭＩで標識されたペプチドに切断するために、ＬｙｓＣプロテアーゼ消化を使用することができる（例えば図２０Ｅを参照されたい）。一実施形態では、ＬｙｓＣプロテアーゼを、ＤＮＡタグが付されたリシン残基が許容されるように工学的に操作する。得られる記録タグで標識されたペプチドを、固体基板（例えば、ビーズ）に、記録タグが付されたペプチド間の分子間相互作用を最小限にするために適した密度で固定化する（例えば図２０Ｅおよび２０Ｆを参照されたい）。
ペプチドのコンパートメントタグへの付着（または逆もまた同じ）は、固定化されたコンパートメントタグへの直接付着であってもよく、その相補配列（二本鎖の場合）への付着であってもよい。あるいは、コンパートメントタグを固体支持体またはコンパートメントの表面から引き離し、ペプチドおよび液相コンパートメントタグをコンパートメント内に接合させることができる。一実施形態では、コンパートメントタグ（例えば、オリゴヌクレオチドの末端）上の機能的部分は、ペプチドのＮ末端のアミンにシッフ塩基を通じて直接カップリングしたアルデヒドである（例えば図１６を参照されたい）。別の実施形態では、コンパートメントタグを、タンパク質リガーゼに対するペプチドモチーフ（ｎ−Ｘ・・・ＸＸＣＧＳＨＶ−ｃ）を含む核酸−ペプチドキメラ分子として構築する。核酸−ペプチドコンパートメントタグ構築物を、消化されたペプチドと、ブテラーゼＩまたはそのホモログなどのペプチドリガーゼを使用してコンジュゲートする。ブテラーゼＩ、および他のアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）相同体を使用して、オリゴヌクレオチド−ペプチドコンパートメントタグ構築物のＣ末端と消化されたペプチドのＮ末端をライゲーションすることができる（Ｎｇｕｙｅｎ、Ｗａｎｇら、２０１４年、Ｎｇｕｙｅｎ、Ｃａｏら、２０１５年）。この反応は、速く、高度に効率的である。得られたコンパートメントタグ付きペプチドを、その後、本明細書に記載の核酸ペプチド解析のために固体支持体に固定化することができる。
ある特定の実施形態では、コンパートメントタグと複数の断片化されたペプチドを接合させる前に、固体支持体またはコンパートメントの表面に接合しているコンパートメントタグを放出させる（例えば図１８を参照されたい）。一部の実施形態では、コンパートメントタグ付きペプチドを複数のコンパートメントから収集した後、コンパートメントタグ付きペプチドを、記録タグを伴って固体支持体に接合する。次いで、コンパートメントタグ情報をコンパートメントタグ付きペプチド上のコンパートメントタグから付随する記録タグに移行させることができる（例えば、記録タグおよびコンパートメントタグ内の相補的なスペーサー配列からプライミングされるプライマー伸長反応によって）。一部の実施形態では、次いで、本明細書に記載の方法に従ったペプチド解析の前に、コンパートメントタグをコンパートメントタグ付きペプチドから除去する。さらなる実施形態では、最初に複数のタンパク質を消化するために使用した配列特異的プロテアーゼ（例えば、Ｅｎｄｏ ＡｓｐＮ）を、コンパートメントタグ情報を付随する記録タグに移行した後、ペプチドのＮ末端からのコンパートメントタグの除去にも使用する（例えば図２２Ｂを参照されたい）。
コンパートメントに基づく分配のための手法は、Ｔジャンクションおよびフローフォーカシング、撹拌または小さな穴を有する膜（例えば、エッチング飛跡膜）を通じた押出しを使用したエマルジョン生成などを使用するマイクロ流体デバイスによる液滴形成などを含む（例えば図２１を参照されたい）。区画化に伴う問題は、コンパートメントの内部の取扱いである。ある特定の実施形態では、コンパートメント内で一連の異なる生化学的ステップを行うことは、流体成分の交換が困難であるので、難しい場合がある。以前に記載されている通り、液滴内部の限られた特徴、例えば、ｐＨ、キレート化剤、還元剤などは、エマルジョンのフルオロ油に試薬を添加することによって改変することができる。しかし、水性相と有機相両方の溶解性を有する化合物の数は限られている。１つの手法は、コンパートメント内の反応を、基本的に目的の分子へのバーコードの移行に限定することである。
タンパク質／ペプチドをコンパートメントタグ（バーコード）で構成される記録タグで標識した後、タンパク質／ペプチドを、固体支持体に、結合した同類結合性物質のコーディングタグから結合したペプチドまたはタンパク質分子に付着した対応する記録タグ／タグへの情報の分子内移行を有利にするために適した密度で固定化する。分子間情報移行は、固体支持体の表面上の分子の分子間間隔を制御することによって最小化される。
ある特定の実施形態では、コンパートメントタグは、コンパートメントの集団内の各コンパートメントに対して一意である必要はない。コンパートメントの集団内のコンパートメントのサブセット（２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）は、同じコンパートメントタグを共有してよい。例えば、各コンパートメントは、試料から巨大分子の亜集団を捕捉するように作用するビーズ表面の集団で構成されてよい（ビーズ当たり多くの分子が捕捉される）。さらに、ビーズは、捕捉される巨大分子に付着させることができるコンパートメントバーコードを含む。各ビーズは、単一のコンパートメントバーコード配列のみを含むが、このコンパートメントバーコードは、コンパートメント内の他のビーズ上で複製され得る（多くのビーズが同じバーコードにマッピングされる）。物理的コンパートメントとコンパートメントバーコードの間で多対１のマッピングをなすことができ（必要ではないが）、さらに、コンパートメント内の巨大分子間で多対１のマッピングをなすことができる（必要ではないが）。分配バーコードは、試料内の巨大分子の集団から巨大分子をサブサンプリングするための一意のバーコードの割り当てと定義される。この分配バーコードは、同じバーコードで標識されたコンパートメント内の巨大分子の分配から生じる同一のコンパートメントバーコードで構成されてよい。物理的コンパートメントの使用により、元の試料が有効にサブサンプリングされて、分配バーコードの割り当てがもたらされる。例えば、１０，０００種の異なるコンパートメントバーコードで標識されたビーズのセットがもたらされる。さらに、所与のアッセイにおいて、ビーズ百万個の集団をアッセイに使用されると仮定する。平均で、コンパートメントバーコード当たり１００個のビーズが存在する（ポアソン分布）。さらに、ビーズにより巨大分子１千万個の凝集体が捕捉されると仮定する。平均で、ビーズ当たり１０個の巨大分子が存在し、コンパートメントバーコード当たりのコンパートメントは１００個であり、分配バーコード（１００個の別個の物理的コンパートメント当たり１００個のコンパートメントバーコードで構成される）当たり有効に１０００個の巨大分子が存在する。
別の実施形態では、ポリペプチドの単一分子分配および分配バーコーディングは、ポリペプチドを、Ｎ末端またはＣ末端またはその両方において、増幅可能なＤＮＡ ＵＭＩタグ（例えば、記録タグ）を用いて標識すること（化学的にまたは酵素的に）によって実現される（例えば図３７を参照されたい）。ＤＮＡタグをポリペプチドのボディ（内部アミノ酸）に非特異的な光標識または図２Ｂにおいて例示されている通りリシンなどの反応性アミノ酸への特異的な化学的付着によって付着させる。ペプチドの末端に付着させた記録タグからの情報をＤＮＡタグに酵素的エマルジョンＰＣＲ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｐｅｉｓａｊｏｖｉｃｈら、２００６年、Ｓｃｈｕｔｚｅ、Ｒｕｂｅｌｔら、２０１１年）またはエマルジョンｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／逆転写（ＩＶＴ／ＲＴ）ステップによって移行させる。好ましい実施形態では、ナノエマルジョンを使用し、その結果、平均して、５０ｎｍ〜１０００ｎｍのサイズのエマルジョン液滴当たり単一のポリペプチド未満が存在するようにする（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ、Ｓｕｎａｍｉら、２０１２年、Ｇｕｐｔａ、Ｅｒａｌら、２０１６年）。さらに、プライマー、ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋、ポリメラーゼ、およびＰＣＲ緩衝液を含めたＰＣＲの全ての成分を水性エマルジョン混合物に含める。ＩＶＴ／ＲＴを使用する場合には、記録タグを、Ｔ７／ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を用い、ポリペプチドのボディに付着したＤＮＡタグにハイブリダイズする転写物が生成されるように設計する（Ｒｙｃｋｅｌｙｎｃｋ、Ｂａｕｄｒｅｙら、２０１５年）。逆転写酵素（ＲＴ）により、ハイブリダイズしたＲＮＡ分子からＤＮＡタグに情報がコピーされる。このように、エマルジョンＰＣＲまたはＩＶＴ／ＲＴを使用して、末端記録タグからポリペプチドのボディに付着させた多数のＤＮＡタグに情報を有効に移行させることができる。
細胞内容物のビーズへのゲル化による封入は、単一の細胞を解析するために有用な手法である（ＴａｍｍｉｎｅｎおよびＶｉｒｔａ ２０１５、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｔａｍｍｉｎｅｎら、２０１６年）。単一の細胞液滴のバーコーディングにより、単一の細胞に由来する成分を全て同じ識別子で標識することが可能になる（Ｋｌｅｉｎ、Ｍａｚｕｔｉｓら、２０１５年、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｔｅｅｍｅｒｓら、２０１６年、Ｚｉｌｉｏｎｉｓ、Ｎａｉｎｙｓら、２０１７年）。コンパートメントバーコーディングは、一意のバーコードを、各液滴に、液滴接合によって（Ｒａｉｎｄａｎｃｅ）、バーコードが付されたビーズを液滴に導入することによって（１０× Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、または、その全体が参照により組み込まれる、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｔｅｅｍｅｒｓら、２０１６年）およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１３０７０４号に記載されている通り、封入およびゲル化後にスプリット・プール（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ）コンビナトリアルバーコーディングを使用して液滴の成分をコンビナトリアルバーコーディングすることによって、直接組み入れることを含めた、いくつものやり方で実現することができる。Ａｄｅｙら（Ｖｉｔａｋ、Ｔｏｒｋｅｎｃｚｙら、２０１７年）に記載されている通り、同様のコンビナトリアル標識スキームを核にも適用することができる。
上記の液滴バーコーディング手法は、ＤＮＡ解析には使用されているが、タンパク質解析には使用されていない。上記の液滴バーコーディングプラットフォームをタンパク質を用いた研究に適合させるには、いくつかの革新的なステップが必要である。まず第１は、バーコードは主にＤＮＡ配列で構成され、このＤＮＡ配列情報をタンパク質分析物に付与する必要があることである。ＤＮＡ分析物の場合では、ＤＮＡ情報をＤＮＡ分析物に移行させることは比較的簡単である。対照的に、ＤＮＡ情報をタンパク質に移行させることは、特に、下流の解析のためにタンパク質を変性させ、消化してペプチドにする場合には、より困難である。これにより、各ペプチドをコンパートメントバーコードで標識することが必要になる。問題は、細胞が液滴に封入されたら、タンパク質を変性させ、得られたポリペプチドをプロテアーゼ消化し、同時にペプチドをＤＮＡバーコードで標識するのが難しいことである。細胞をポリマー形成液滴に封入し、それらを重合（ゲル化）して、水性緩衝液にすることができる多孔質ビーズにすることにより、液滴中の細胞とは異なり、多数の異なる反応ステップを実施するためのビヒクルがもたらされる（ＴａｍｍｉｎｅｎおよびＶｉｒｔａ、２０１５年、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｔａｍｍｉｎｅｎら、２０１６年）（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｔｅｅｍｅｒｓら、２０１６年）。封入されたタンパク質がその後ゲルビーズから拡散することを防止するために、封入されたタンパク質をゲルマトリックスと架橋結合させることが好ましい。このゲルビーズ形式により、ゲル中に閉じ込められたタンパク質を化学的にまたは酵素的に変性させ、ＤＮＡタグで標識し、プロテアーゼ消化し、いくつもの他の介入に供すことが可能になる。図３８は、例示的な単一の細胞のゲルマトリックスへの封入および溶解を示す。
Ｎ． 組織および単一細胞空間的プロテオミクスの方法およびキット
バーコードの別の使用は、空間的に分布したＤＮＡバーコード配列のアレイ表面上での組織の空間的分割である。組織タンパク質を、アレイ表面に乗せた細胞組織内のタンパク質の空間的位置を反映するバーコードを含むＤＮＡ記録タグで標識すれば、Ｓｔａｈｌら（２０１６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５３巻（６２９４号）：７８〜８２頁）およびＣｒｏｓｅｔｔｏら（Ｃｏｒｓｅｔｔｏ、Ｂｉｅｎｋｏら、２０１５年）に記載されている空間的トランスクリプトームと同様に、組織スライス内のタンパク質分析物の空間的分布を配列解析後に再構築することができる。空間バーコードの付着は、アレイに結合させたバーコードをアレイから放出させ、それらを組織切片中に拡散させることによって実現することができる、あるいは、組織切片中のタンパク質をＤＮＡ記録タグで標識し、次いで、タンパク質をプロテアーゼで消化して、拡散し、アレイ上の空間バーコードとハイブリダイズする標識されたペプチドを放出させることができる。次いで、バーコード情報をペプチドに付着させた記録タグに移行させることができる（酵素的にまたは化学的に）。
組織内のタンパク質の空間的バーコーディングは、ＤＮＡ記録タグで化学的に標識された、固定／透過処理した組織スライスを、空間的にコードされたＤＮＡアレイであって、アレイ上の各特徴が空間的に識別可能なバーコードを有する、ＤＮＡアレイに置くことによって実現することができる（例えば図２３を参照されたい）。アレイバーコードをＤＮＡタグに付着させるために、組織スライスをプロテアーゼで消化し、それにより、拡散し、組織スライスに隣接する近位のアレイ特徴にハイブリダイズすることができるＤＮＡタグで標識されたペプチドを放出させることができる。アレイバーコード情報は、化学的／酵素的ライゲーションまたはポリメラーゼ伸長によってＤＮＡタグに移行させることができる。あるいは、標識されたペプチドをアレイ表面に拡散させる代わりに、アレイ上のバーコード配列を切断し、組織スライス上の近位の領域に拡散させ、その中のＤＮＡタグで標識されたタンパク質にハイブリダイズさせることができる。再度、バーコーディング情報は、化学的／酵素的ライゲーションまたはポリメラーゼ伸長によって移行させることができる。この第２の場合には、バーコード情報の移行後にプロテアーゼ消化を実施することができる。いずれの手法の結果も、記録タグで標識されたタンパク質またはペプチドの収集であり、ここで、記録タグは、元の組織内のタンパク質／ペプチドの位置に関する２−Ｄ空間的情報を有するバーコードを含む。さらに、翻訳後修飾の空間的分布を特徴付けることができる。この手法により、感度が高く、高度に多重化されたｉｎ ｓｉｔｕデジタル免疫組織化学的アッセイがもたらされ、また、現代の分子病理学の基礎が形成され、それによりはるかに正確な診断および予後判定が導かれるはずである。
別の実施形態では、細胞小器官および細胞区画内のタンパク質構成物／ＰＴＭを識別するために、細胞内に空間的バーコーディングを使用することができる（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｏｕら、２０１６年、Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．、７巻：８９９２頁、その全体が参照により組み込まれる）。近位のタンパク質に付着させることができる細胞内空間バーコードをもたらすために、いくつもの手法を使用することができる。一実施形態では、細胞または組織を構成物細胞小器官中に細胞内分画し、異なるタンパク質細胞小器官画分バーコードを付すことができる。空間的な細胞標識の他の方法は、その全体が参照により組み込まれる、Ｍａｒｘ、２０１５年、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２巻：８１５〜８１９頁による総説に記載されている；同様の手法を本明細書で使用することができる。
Ｏ． 単一サイクルアッセイ法およびキット
一態様では、本明細書には、ポリペプチドなどの分析物を解析するための単一サイクル法が提供される。解析は、定性的もしくは定量的分析物検出（例えば、試料中の存在／非存在またはレベルまたは量）、分析物識別、所望の特性（治療剤もしくは治療剤候補、例えば小分子治療剤、ペプチドもしくはペプチドの模倣物治療剤、またはアプタマー治療剤との結合など）のスクリーニング、ポリペプチド配列決定、またはこれらの任意の組合せのためであってもよい。一部の実施形態では、タンパク質／ポリペプチドを、記録タグ（ＤＮＡ記録タグなど）で標識し、「まばらな」単一分子密度で基材上に固定化し、コーディングタグ（ＤＮＡコーディングタグなど）でコードされた単一結合事象で検出する。これらの例では、まばらな単一分子分布を使用することにより、分子内複合体内での情報移行のみが可能になる。一態様では、これにより多重化が容易になる。さらに、ペプチドｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイの標準的方法（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２２５４２６号に開示されているような）と比較して、本明細書で開示されている分析物−タグ構築物では、必要に応じて、分析物の結合性部分を識別する「コード」配列と無関係なバーコードを含む機能性記録タグが使用される。
別の態様では、本明細書には、ＮＧＬＡ（次世代リガンドアッセイ）および単一サイクル標的−リガンド結合アッセイが開示される。この点に関して、候補小分子またはペプチド治療剤（またはペプチド模倣物治療剤、例えばペプトイド治療剤、β−ペプチド治療剤、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物治療剤、または多糖治療剤）のタンパク質標的を迅速にスクリーニングおよび識別する能力は、効果的な創薬パイプラインを高度に可能にする。さらに、オフターゲット結合活性を識別する能力は、治療剤毒性の理解に重要である。本明細書では、核酸（例えば、ＤＮＡ）タグでバーコード付与された１０５〜１０９個の異なる小分子タイプを含む、ＤＮＡにコードされるライブラリー（ＤＥＬ）などの高度多様性ライブラリーを、キナーゼ、ＧＰＣＲなどの、全プロテオームまたはプロテオームのサブセットに対してスクリーニングすることができる方法が開示される。一部の実施形態では、本明細書で開示された方法および／またはキットを使用して、プロテオーム×ＤＥＬライブラリーの完全結合マトリックスを創出することができる。一部の実施形態では、固定化されたタンパク質−記録タグ複合体を、支持体（例えば、ＧＰＣＲを含む膜タンパク質）に繋留されたナノディスクまたはリポディスク（ｌｉｐｏｄｉｓｃ）構造内に埋め込む。一態様では、ナノディスクまたはリポディスク内でのタンパク質の再構成は、膜タンパク質の解析に有用である。例えば、Rue et al., (2016), “Co-translational formation and pharmacologicalcharacterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with differentlipid environments," Biochim Biophys Acta 1858 (6): 1306-1316；およびFiori etal., (2017), “Polymer-encased nanodiscs with improved buffercompatibility," Sci Rep 7 (1): 7432を参照されたい。これら文献は両方とも、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、これは、２つの機能性エレメントによって達成される。第１の機能性エレメントは、全プロテオームの固定化ＤＮＡタグ付き単一タンパク質分子表示である。固定化プロテオーム表示は、個々のタンパク質を発現、精製、およびＤＮＡバーコード標識することにより創出することができ、各タンパク質は、その付随するＤＮＡバーコードによって識別される。膜タンパク質は、必要に応じてナノディスク／リポディスク内に再構成することができる。一部の実施形態では、これらのバーコード−タンパク質複合体（必要に応じてナノディスク／リポディスク）は、分子内ＤＮＡ情報移行が、分子間移行よりも非常に有利になるような分子間間隔で基材に取り付けられる。間隔の例示的な距離は、約２０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約１００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約１５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約２００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約２５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約３００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約３５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約４００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約４５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約５００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約５５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約６００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約６５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約７００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約７５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約８００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約８５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約９００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約９５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、または約１μｍと等しいかもしくはそれよりも大きくともよい。
一部の実施形態では、ＤＮＡバーコード付き小分子またはペプチド／ペプチドの模倣物ライブラリー（またはペプチド模倣物ライブラリー、例えばペプトイドライブラリー、β−ペプチドライブラリー、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物ライブラリー、または多糖ライブラリー）を提供することができ、バーコードは特定のペプチドまたは小分子エレメントを識別する。このライブラリーは、＞１０３、＞１０４、＞１０５、＞１０６、＞１０７、＞１０８、または＞１０９の複雑性を有することができる。一部の実施形態では、小分子とタンパク質標的との結合は、ＤＮＡタグ付き小分子ライブラリーを、固定化ＤＮＡタグ付きプロテオーム（またはサブプロテオーム）に導入し、結合反応が続いて起こることを可能にすることによりもたらされる。一部の実施形態では、小分子と標的タンパク質との結合は、近接効果により、小分子のコーディングタグからタンパク質の記録タグへのまたはその逆の効率的な情報移行を可能にする。一部の実施形態では、この情報移行は、ポリメラーゼ伸長、ライゲーション（酵素的または化学的）、または代替方法を使用して達成することができる。
上述の実施形態のいずれかでは、ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリー、例えば、試薬などのいくつかの化学的「構造単位」を組み合わせることによる化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学化合物のコレクションであってもよい。例えば、ポリペプチド（例えば、ムテイン）ライブラリーなどの線形コンビナトリアル化学ライブラリーは、所与の化合物長（つまり、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）のありとあらゆる様式のアミノ酸と呼ばれる１セットの化学的構造単位を組み合わせることによって形成される。多数の化学化合物が、化学的構造単位のそのようなコンビナトリアル混合により合成される（Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994)）。
コンビナトリアルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、これらだけに限定されないが、以下のものが挙げられる：ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)；Houghton et al., Nature,354:84-88 (1991)；ペプトイド（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１９７３５号）；コード付きペプチド（ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２０２４２号）；ランダムバイオ−オリゴマー（ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０００９１号）；ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Hobbset al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagihara etal., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)）、ベータ−Ｄ−グルコーススキャホールドを有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmannet al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)）、小化合物ライブラリーのアナロガス有機合成（ａｎａｌｏｇｏｕｓ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ）（Chenet al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)）、オリゴカルバルネート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｒｎａｔｅ）（Cho,et al., Science 261:1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J. Org.Chem. 59:658 (1994)）。一般に、以下のものを参照されたい：Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385(1994)、核酸ライブラリー（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｏｒｐ．を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnet al., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996)、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（例えば、Lianget al., Science 274:1520-1522 (1996)、および米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum,C&EN, January 18, page 33 (1993)；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ならびにベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号など）。
一部の実施形態では、このアッセイの最終結果は、小分子−タンパク結合マトリックスを創出することである。一部の実施形態では、これは、１０９個の多様性を有する小分子ライブラリーを、固定化ヒトプロテオーム全体（２×１０４個）と共にインキュベートした場合でさえ、かなり大きなマトリックスであり得る。マトリックスサイズは、１０９×２×１０４個であり、２×１０１３回の異なる測定となるであろう。一部の実施形態では、高親和性結合相互作用（＜低ｎＭ）は、洗浄ステップ後でさえ上記の手法で容易に記録することができるが、中〜低親和性相互作用は、失われる可能性が高いであろう。一部の実施形態では、低親和性相互作用（約μＭ）を記録するために、結合およびそれと同時に情報移行が生じる均質な反応が望ましい。一部の実施形態では、これには、重合またはライゲーションステップが、結合占有時間と比べて迅速な動力学を有する必要があることが求められる。重合時間の尺度は、秒の単位であり、μＭ濃度での結合占有時間（約１０〜１００秒）と適合する。ライゲーション時間の尺度は、同様に秒の単位であり得る（例えば、迅速化学ライゲーションの場合、例えば、Abe et al., (2008), “Rapid DNA chemical ligation for amplificationof RNA and DNA signal," Bioconjug Chem 19(1): 327-333を参照されたい）。一部の実施形態では、リガーゼまたはポリメラーゼを、特に低親和性相互作用を解析または検出するために、１つまたは複数の結合物質と共に反応ミックスに含ませてもよい。あるいは、記録タグ内の部位と相互作用するＤＮＡタグによるハイブリダイゼーションを使用して、リガーゼまたはポリメラーゼを作用物質部位に共局在化させてもよい。結合および「書き込み」（つまり、情報移行）ステップを組み合わせることにより、低親和性相互作用を「記録する」ことがより容易になる。
一実施形態では、ＤＮＡタグと、タンパク質標的またはペプチドもしくは小分子リガンド（またはペプチド模倣物リガンド、例えばペプトイドリガンド、β−ペプチドリガンド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物リガンド、または多糖リガンド）のいずれかとの付着は、バーコード付きＤＮＡタグを、個々に産生されたタンパク質標的または個々に産生された小分子／ペプチド標的に個々に付着させることにより達成することができる。別の実施形態では、ＤＮＡタグとタンパク質との付着は、リボソームまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイにより生じ、ｍＲＮＡ配列内にＤＮＡバーコードが含まれている。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイのプロセスでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応を使用してｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する。ｍＲＮＡは、リンカーを介してｍＲＮＡの３’末端に付着されたピューロマイシン分子を有するように構成されている（例えば、Liu et al., (2000), “Optimized synthesis of RNA-protein fusions forin vitro protein selection," In Methods in Enzymology, Academic Press,318:268-293を参照されたい）。チロシル−ｔＲＮＡの類似体であるピューロマイシンを、ｍＲＮＡ転写物の３’末端に係留し、リボソームが３’末端付近で翻訳を終了させる際に成長中のポリペプチド鎖に組み込み、ｍＲＮＡ−タンパク質融合体を効率的に創出して、ＲＮＡ／ＤＮＡ転写物および付随するバーコードをその対応する翻訳されたタンパク質に連結する（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２５８８７１（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１７／０１０７５６６（Ａ１）号、またはKozlovet al., (2012), PLoS One 7(6): e37441に開示されている。これら文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、下流における情報移行のためのユニバーサルプライマー部位およびスペーサー配列などのバーコード配列および付随するＤＮＡ記録タグ機能性エレメントを、ｍＲＮＡ転写物の３’末端に遺伝子操作する。また、一実施形態では、ＤＮＡバーコードおよびＤＮＡ記録タグ機能性エレメントのまさに５’に一意の制限部位も含まれる。ｍＲＮＡ−タンパク質融合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳および創出した後、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆翻訳する。外因性オリゴをアニーリングさせ、制限酵素と共にインキュベーションすることによって、バーコードの５’でｃＤＮＡを切断する。これにより、その後のアッセイの記録タグとしての役目を果たすＤＮＡタグが残る（例えば、図５０を参照されたい）。
別の態様では、本明細書には、単一サイクルによる次世代タンパク質アッセイが開示されている。一部の実施形態では、このアッセイでは、ＮＴＡＡ結合物質（例えば、Ｎ末端のモノ−、ジ−、またはトリ−アミノ酸）などのアミノ酸結合物質が使用される。
ボトムアップ質量分析法（ＭＳ）による典型的なタンパク識別では、各タンパク質から１セットのペプチド（約２０〜４０個のペプチド）を生成するために、トリプシン消化などのプロテアーゼ消化ステップが使用される。単一のペプチド種は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、タンパク質種全体の識別を提供することができる。また、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０４２５０６号には、単一分子レベルでのタンパク識別方法が開示されている。ＷＯ２０１５／０４２５０６号の試薬および方法ステップを、本開示と組み合わせてもよい。
単一分子レベルでタンパクを識別するための代替手法は、タンパク質分子を数百万〜数十億個の区分（例えば、コンパートメントバーコードを含む区分）に分配し、分配バーコードを有する試料中の分子すべてにバーコードを付けることである。一態様では、所与のコンパートメント（例えば、個々のビーズ表面）は、そのコンパートメント内の分子がすべて同じバーコードで標識されている。別の態様では、区分は、同じバーコードを共有するコンパートメントをすべて含む。例えば、１０８個のビーズに１０６個のバーコードが存在する場合、ビーズの一部は、同じバーコードを有するであろう。この例では、個々のビーズ表面は各々がコンパートメントであってもよく、同じバーコードを共有するコンパートメントは、バーコードが異なることに基づき他の区分から区別可能な区分を形成する。好ましい実施形態では、タンパク質を、まず変性およびアルキル化し、その後ポリペプチドの全体にわたって「クリック」化学ハンドルで標識する。「クリック」ハンドルを付着させた後、クリック化学を使用してユニバーサルＤＮＡプライマーを「クリック」ハンドルに付着させる。このＤＮＡプライマーは、ＤＮＡ記録タグの初期部分を形成することになる。ポリペプチドを、過剰なＤＮＡプライマーから精製する。ポリペプチドをＤＮＡプライマーで標識した後、ポリペプチドを、コンパートメントバーコード、およびポリペプチドのものと相補的なユニバーサルプライマーを有するＤＮＡバーコード付きビーズの集団に曝露させる（例えば、図５１を参照されたい）。個々のポリペプチド分子は、特定のビーズと相互作用し、ユニバーサルプライマー配列を介したハイブリダイゼーションによりビーズ上に本質的に「ジップアップ（ｚｉｐ−ｕｐ）」する。１つよりも多くの分子が、任意の所与のビーズに付随してもよいが、理想的には分子の数は最小限に維持される。ポリペプチドがビーズ上に「ジップ（ｚｉｐ）」したら、プライマー伸長またはライゲーション反応を使用して、ビーズのバーコード情報を、ポリペプチドに付着した多数のユニバーサルプライマーに移行させる。このように、ポリペプチドは、今や、プロテオームの分配の基盤を形成するバーコード付きの「コンパートメント」である。ポリペプチド分子の伸長ＤＮＡタグは、アッセイのその後のステップのための記録タグを構成する。次に、ビーズ上のポリペプチド（最初に取り外してもよい）を、プロテアーゼ消化ステップ（例えば、トリプシン消化）を使用して断片化する。消化した後、記録タグ標識ペプチドをビーズから溶出する。標識ペプチドを、単一分子密度（例えば、固定化ペプチド間の平均距離が情報移行をおおむね分子内結合事象のみに制限するようなペプチド間距離）で基材に固定化する。間隔の例示的な距離は、約２０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約１００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約１５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約２００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約２５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約３００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約３５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約４００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約４５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約５００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約５５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約６００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約６５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約７００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約７５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約８００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約８５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約９００ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、約９５０ｎｍと等しいかもしくはそれよりも大きく、または約１μｍと等しいかもしくはそれよりも大きくともよい。
一実施形態では、ペプチドは、トリプシン消化物に由来する。ヒトプロテオームでは、およそ５００，０００個の異なるトリプシンペプチドが存在し、１タンパク質当たりのトリプシンペプチドは約２０〜３０個である。試料中のタンパク質分子を定量化および特徴付けるために、タンパク質を、分配バーコード付き記録タグで標識された１セットのペプチドに変換する。結合から所与の分子に由来するトリプシンペプチドへの情報はすべて、分配バーコードによって分子（または分子の小さなサブセット）にマッピングし戻すことができる。好ましい実施形態では、結合物質を識別するバーコード情報を含むＤＮＡコーディングタグで標識されたＮ末端ジペプチドおよび／またはトリペプチド（Ｎ末端ジアミノ酸／トリアミノ酸とも呼ばれる）結合性物質を、固定化されたペプチド（Ｎ末端が遊離するように）と共にインキュベートする。結合時にまたは結合後に、情報は、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションによってコーディングタグから記録タグに（またはその逆に）移行する。このプロセスを、複数サイクル繰り返して、交差反応性結合事象に由来するエラーを低減することができる。Ｎ末端ジペプチド結合物質の完全なセットは、各々が異なる識別バーコードで標識されている１セットの４００個の異なる結合物質で構成されるであろう。単一の結合サイクルは、分配の概念を使用してヒトプロテオーム全体を識別するのに十分であることを優に超えているべきである。例えば、所与のタンパク質分子に由来する１セットの２０個のペプチドのうち５つのトリプシンペプチドのみが検出された場合でさえ、トリプシン消化情報と組み合わせたＮ末端ジアミノ酸情報は、タンパク質を一意に識別するのに十分であることを優に超えている。
まずポリペプチドを分配バーコード付きビーズに固定化し、分析基材に再固定化する代わりに、変性ペプチドを、共有結合または非共有結合相互作用により、ビーズ全体が同一のバーコード付き記録タグの集団で覆われているＤＮＡバーコード付きビーズに直接固定化することができる（例えば、図５２を参照されたい）。ポリペプチドをビーズ上で消化して、トリプシン消化物などの断片にする。プロテアーゼ消化後、Ｎ末端ジペプチド結合物質と、バーコード付きビーズ上のポリペプチドの露出Ｎ−末端との結合が続いて起こる。ジペプチド結合物質のコーディングタグとビーズに付着した記録タグのいずれかと間に、情報移行が生じる。以前の「距離をおいて間隔があけられている」ペプチドモデル（例えば、図５１を参照されたい）とは異なり、ペプチド複合体は、単一結合サイクルのみが実施される限り、以前の実施形態のように間隔をあける必要はない。結合および情報移行の後、得られた伸長記録タグを、線形増幅またはＰＣＲを使用して、ビーズ表面から溶液中へと直接増幅することができる。
一部の実施形態では、上記で開示されたアッセイは、コーディングタグと記録タグとの間のサイクル情報移行を必要としない。したがって、これらのアッセイは、単一結合サイクルで実施することができる。
Ｐ． 結合物質／リガンドダウン手法
現代的創薬は、標的タンパク質との結合について非常に多様な小分子化合物を初期にスクリーニングし、後に治療有効性を試験することによって可能になる。ＤＮＡにコードされたライブラリー（ＤＥＬ）は、標的分子に結合すると、付随するＤＮＡタグまたはバーコード配列によりアレイまたは次世代シーケンシングで読み出すことができる多様な小分子を生成するために手法を提供する。ＤＮＡにコードされたライブラリーを創出するためのいくつかの戦略が開発されている（参照により組み込まれる（Shi, Zhou et al. 2017)）。１つの戦略は、各ビーズが、識別ＤＮＡバーコードタグに付随した単一タイプの小分子化合物の集団で埋め尽くされるように、ビーズ上に化合物のコンビナトリアルセットを創出することを含む。ＤＮＡコード化固相合成法（ＤＥＳＰＳ、ＤＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と称されるこの手法では、単一タイプの小分子化合物の集団およびその付随するＤＮＡバーコードタグ情報が両方とも単一ビーズ上に創出される、つまり１ビーズ１化合物手法（ＯＢＯＣ）である（参照により組み込まれる（MacConnell,McEnaney et al. 2015））。
このＯＢＯＣ手法を使用してリガンド結合アッセイを生成するために、小分子結合物質の付随するコーディングタグは、コンビナトリアルライブラリーの形成中に創出されるＤＮＡバーコードタグを含む。単一のビーズが、ビーズに付着された小分子の単一集団を表わす、すべてが同じバーコードを含むＤＮＡコーディングタグの集団を有する。単一集団のバーコードのみを有するビーズを用いる単一サイクルアッセイでは、ビーズ上の小分子間の間隔要件はもはや必要ではない。
以下の例示的な実施形態が例示として提供される。
１．
（ａ）
（ｉ）生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットであって、各生物学的標的に、生物学的標的を識別するエンコーディングバーコードを必要に応じて含む記録タグが直接または間接的に付随している、生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットを、
（ｉｉ）作用物質のライブラリーであって、各作用物質が、少なくとも１つの別々の支持体に固定化されており、別々の支持体のそれぞれが、支持体に固定化された作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグをさらに含む、作用物質のライブラリーと
接触させるステップと；
（ｂ）
（ｉ）作用物質の１つまたは複数と（直接または間接的に）結合および／または（直接または間接的に）反応する各生物学的標的に付随する記録タグと、
（ｉｉ）１つまたは複数の作用物質のコーディングタグと
の間の情報の移行を可能にするステップであって、
情報の移行により、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
（ｃ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析し、それにより、生物学的標的のセットと作用物質のライブラリーとの間の相互作用（複数可）をアッセイするステップと
を含む方法。
２．別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ作用物質の多数の分子および／または同じコーディングタグの多数の分子が固定化されている、実施形態１に記載の方法。
３．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された作用物質と固定化されたコーディングタグが、コンジュゲートまたは複合体を形成している、実施形態１または２に記載の方法。
４．固定化された作用物質および／または固定化されたコーディングタグが、支持体に直接固定化されている、実施形態３に記載の方法。
５．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された作用物質および固定化されたコーディングタグが、支持体に（直接または間接的に）独立に固定化されている、実施形態１または２に記載の方法。
６．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された作用物質と固定化されたコーディングタグがリンカーによって（直接または間接的に、共有結合によりまたは非共有結合により）接続されており、リンカーが支持体に（直接または間接的に）固定化されている、実施形態１または２に記載の方法。
７．作用物質のライブラリーが、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の方法。
８．別々の支持体のそれぞれにおいて、コーディングタグの固定化された分子の密度が、作用物質の固定化された分子の密度と等しいまたはそれよりも大きい、実施形態１から７までのいずれか１つに記載の方法。
９．コーディングタグの固定化された分子の密度が、作用物質の固定化された分子の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれよりも大きい、実施形態８に記載の方法。
１０．少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグを生成する、実施形態１から９までのいずれか１つに記載の方法。
１１．少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長コーディングタグを生成する、実施形態１から９までのいずれか１つに記載の方法。
１２．コーディングタグからの情報と記録タグからの情報とを含む少なくとも１つのジタグ構築物が生成される、実施形態１から１１までのいずれか１つに記載の方法。
１３．生物学的標的の少なくとも１つが、作用物質の２つまたはそれよりも多くと結合および／または反応する、実施形態１から１２までのいずれか１つに記載の方法。
１４．伸長記録タグまたは伸長コーディングタグが、２つまたはそれよりも多くの作用物質に関する識別情報を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．生物学的標的の少なくとも１つに２つまたはそれよりも多くの記録タグが付随しており、２つまたはそれよりも多くの記録タグが同じであっても異なってもよい、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載の方法。
１６．少なくとも１つの別々の支持体が、同じ作用物質についての２つまたはそれよりも多くのコーディングタグを含み、２つまたはそれよりも多くのコーディングタグが同じであっても異なってもよい、実施形態１から１５までのいずれか１つに記載の方法。
１７．情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成される、実施形態１から１６までのいずれか１つに記載の方法。
１８．生物学的標的のセットが、プロテオームまたはそのサブセットを含み、必要に応じて、タンパク質のセットが、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、実施形態１から１７までのいずれか１つに記載の方法。
１９．プロテオームのサブセットが、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／またはニトロシル化）によって規程されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（または脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１８に記載の方法。
２０．生物学的標的のセットが、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、例えば、酵母、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウイルス、例えば、ＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来する、実施形態１から１９までのいずれか１つに記載の方法。
２１．生物学的標的のセットが、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、実施形態１から２０までのいずれか１つに記載の方法。
２２．記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態１から２１までのいずれか１つに記載の方法。
２３．記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態１から２２までのいずれか１つに記載の方法。
２４．記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含み、例えば、ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、実施形態１から２３までのいずれか１つに記載の方法。
２５．記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態１から２４までのいずれか１つに記載の方法。
２６．記録タグが、生物学的標的を識別するエンコーディングバーコード、試料バーコード、コンパートメントバーコード、分配バーコード、エラー訂正バーコード、またはこれらの任意の組合せなどのバーコードを含む、実施形態１から２５までのいずれか１つに記載の方法。
２７．記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、実施形態１から２６までのいずれか１つに記載の方法。
２８．別々の支持体が、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体であり、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、実施形態１から２７までのいずれか１つに記載の方法。
２９．別々の支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１から２８までのいずれか１つに記載の方法。
３０．支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態２９に記載の方法。
３１．生物学的標的−作用物質結合マトリックスを創出するために、生物学的標的のセットと作用物質のライブラリーとの間の相互作用を並行解析するための、実施形態１から４２までのいずれか１つに記載の方法。
３２．マトリックスのサイズが、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、またはそれよりも大きい、例えば、約２×１０１３である、実施形態３１に記載の方法。
３３．コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態１から３２までのいずれか１つに記載の方法。
３４．コーディングタグが、作用物質を識別するエンコーダー配列を含む、実施形態１から３３までのいずれか１つに記載の方法。
３５．コーディングタグが、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１から３４までのいずれか１つに記載の方法。
３６．作用物質とコーディングタグが、リンカーまたは結合対によって接合されている、実施形態１から３５までのいずれか１つに記載の方法。
３７．作用物質とコーディングタグが、別々の支持体上に共局在している、実施形態１から３５までのいずれか１つに記載の方法。
３８．別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ作用物質の多数の分子および／または同じコーディングタグの多数の分子が固定化されており、分子が、共局在していてよく、互いに低密度に間隔をあける必要はない、実施形態１から３７までのいずれか１つに記載の方法。
３９．
（ａ）
（ｉ）生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットであって、各生物学的標的が、少なくとも１つの別々の支持体に固定化されており、別々の支持体のそれぞれが、支持体に固定化された生物学的標的に関する識別情報を含む記録タグをさらに含む、生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットを
（ｉｉ）作用物質のライブラリーであって、各作用物質に作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグが直接または間接的に付随している、作用物質のライブラリーと
接触させるステップと；
（ｂ）
（ｉ）作用物質の１つまたは複数と（直接または間接的に）結合および／または（直接または間接的に）反応する各生物学的標的に付随する記録タグと、
（ｉｉ）１つまたは複数の作用物質のコーディングタグと
の間の情報の移行を可能にするステップであって、
情報の移行により、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
（ｃ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析し、それにより、生物学的標的のセットと作用物質のライブラリーとの間の相互作用（複数可）をアッセイするステップと
を含む方法。
４０．別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ生物学的標的の多数の分子および／または同じ記録タグの多数の分子が固定化されている、実施形態３９に記載の方法。
４１．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された生物学的標的と固定化された記録タグがコンジュゲートまたは複合体を形成している、実施形態３９または４０に記載の方法。
４２．固定化された生物学的標的および／または固定化された記録タグが、支持体に直接固定化されている、実施形態４１に記載の方法。
４３．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された生物学的標的および固定化された記録タグが支持体に（直接または間接的に）独立に固定化されている、実施形態３９または４０に記載の方法。
４４．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された生物学的標的と固定化された記録タグがリンカーによって（直接または間接的に、共有結合によりまたは非共有結合により）接続されており、リンカーが支持体に（直接または間接的に）固定化されている、実施形態３９または４０に記載の方法。
４５．作用物質のライブラリーが、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態３９から４４までのいずれか１つに記載の方法。
４６．別々の支持体のそれぞれにおいて、固定化された記録タグの分子の密度が、固定化された生物学的標的の分子の密度と等しいまたはそれよりも大きい、実施形態３９から４５までのいずれか１つに記載の方法。
４７．固定化された記録タグの分子の密度が、固定化された生物学的標的の分子の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれよりも大きい、実施形態４６に記載の方法。
４８．少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグを生成する、実施形態３９から４７までのいずれか１つに記載の方法。
４９．少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長コーディングタグを生成する、実施形態３９から４７までのいずれか１つに記載の方法。
５０．コーディングタグからの情報と記録タグからの情報とを含む少なくとも１つのジタグ構築物が生成される、実施形態３９から４９までのいずれか１つに記載の方法。
５１．生物学的標的の少なくとも１つが、作用物質の２つまたはそれよりも多くと結合および／または反応する、実施形態３９から５０までのいずれか１つに記載の方法。
５２．伸長記録タグまたは伸長コーディングタグが、２つまたはそれよりも多くの作用物質に関する識別情報を含む、実施形態５１に記載の方法。
５３．生物学的標的の少なくとも１つに２つまたはそれよりも多くの記録タグが付随しており、２つまたはそれよりも多くの記録タグが同じであっても異なってもよい、実施形態３９から５２までのいずれか１つに記載の方法。
５４．少なくとも１つの別々の支持体が、同じ生物学的標的についての２つまたはそれよりも多くの記録タグを含み、２つまたはそれよりも多くの記録タグが同じであっても異なってもよい、実施形態３９から５３までのいずれか１つに記載の方法。
５５．情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成される、実施形態３９から５４までのいずれか１つに記載の方法。
５６．生物学的標的のセットが、プロテオームまたはそのサブセットを含み、必要に応じて、タンパク質のセットが、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、実施形態３９から５５までのいずれか１つに記載の方法。
５７．プロテオームのサブセットが、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／またはニトロシル化）によって規程されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（または脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含む、実施形態５６に記載の方法。
５８．生物学的標的のセットが、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、例えば、酵母、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウイルス、例えば、ＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来する、実施形態３９から５７までのいずれか１つに記載の方法。
５９．生物学的標的のセットが、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、実施形態３９から５８までのいずれか１つに記載の方法。
６０．記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態３９から５９までのいずれか１つに記載の方法。
６１．記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態３９から６０までのいずれか１つに記載の方法。
６２．記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含み、例えば、ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、実施形態３９から６１までのいずれか１つに記載の方法。
６３．記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態３９から６２までのいずれか１つに記載の方法。
６４．記録タグが、生物学的標的を識別するエンコーディングバーコード、試料バーコード、コンパートメントバーコード、分配バーコード、エラー訂正バーコード、またはこれらの任意の組合せなどのバーコードを含む、実施形態３９から６３までのいずれか１つに記載の方法。
６５．記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、実施形態３９から６４までのいずれか１つに記載の方法。
６６．別々の支持体が、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体であり、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、実施形態３９から６５までのいずれか１つに記載の方法。
６７．別々の支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態３９から６６までのいずれか１つに記載の方法。
６８．支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態６７に記載の方法。
６９．生物学的標的−作用物質結合マトリックスを創出するために、生物学的標的のセットと作用物質のライブラリーとの間の相互作用を並行解析するための、実施形態３９から６８までのいずれか１つに記載の方法。
７０．マトリックスのサイズが、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、またはそれよりも大きい、例えば、約２×１０１３である、実施形態６９に記載の方法。
７１．コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態３９から７０までのいずれか１つに記載の方法。
７２．コーディングタグが、作用物質を識別するエンコーダー配列を含む、実施形態３９から７１までのいずれか１つに記載の方法。
７３．コーディングタグが、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態３９から７２までのいずれか１つに記載の方法。
７４．作用物質とコーディングタグが、リンカーまたは結合対によって接合されている、実施形態３９から７３までのいずれか１つに記載の方法。
７５．生物学的標的と記録タグが、別々の支持体上に共局在している、実施形態３９から７４までのいずれか１つに記載の方法。
７６．別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ生物学的標的の多数の分子および／または同じ記録タグの多数の分子が固定化されており、分子が、共局在していてよく、互いに低密度に間隔をあける必要はない、実施形態３９から７５までのいずれか１つに記載の方法。
７７．
（ａ）（ｉ）第１のユニバーサルプライマー配列を含む記録タグが直接または間接的に付随する生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）を、（ｉｉ）第１の支持体に固定化された作用物質と接触させるステップであって、第１の支持体が、支持体に固定化された作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグをさらに含む、ステップと；
（ｂ）生物学的標的と固定化された作用物質との間の結合および／または反応時に記録タグとコーディングタグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、情報の移行により、生物学的標的に付随する伸長記録タグが生成する、ステップと；
（ｃ）伸長記録タグを、サイクル特異的タグおよび第２のユニバーサルプライマー配列と接触させるステップであって、サイクル特異的タグおよび第２のユニバーサルプライマー配列の両方が第２の支持体に固定化されており、第１のユニバーサルプライマー配列および第２のユニバーサルプライマー配列の全部または一部が互いと相補的である、ステップと；
（ｄ）固定化されたサイクル特異的タグと伸長記録タグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、情報の移行により、生物学的標的に付随するさらなる伸長記録タグが生成する、ステップと；
（ｅ）コーディングタグおよびサイクル特異的タグからの情報を含むさらなる伸長記録タグを解析するステップと
を含み、ステップ（ｅ）の前にステップ（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことができる方法。
７８．
（ａ）（ｉ）記録タグが直接または間接的に付随した生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）を、（ｉｉ）支持体に固定化された作用物質と接触させるステップであって、支持体が、支持体に固定化された作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグをさらに含む、ステップと；
（ｂ）生物学的標的と固定化された作用物質との間の結合および／または反応時に記録タグとコーディングタグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、情報の移行により、支持体に固定化された伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
（ｃ）伸長コーディングタグをサイクル特異的タグと接触させるステップと；
（ｄ）伸長コーディングタグとサイクル特異的タグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、情報の移行により、支持体に固定化されたさらなる伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
（ｅ）記録タグおよびサイクル特異的タグからの情報を含むさらなる伸長コーディングタを解析するステップと；
を含み、ステップ（ｅ）の前にステップ（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことができる方法。
７９．情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成される、実施形態７７または７８に記載の方法。
８０．実施形態１から７９までのいずれかに記載の方法において開示および／もしくは使用されている任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的または生物学的）、作用物質、構造（例えば、支持体、表面、粒子、またはビーズ）、反応中間体、反応産物、結合複合体、または任意の他の製造品、またはこれらの任意の組合せを含むキット。
上述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、ポリペプチドなどの生物学的標的を識別するエンコーディングバーコードをさらに含んでいてもよい。あるいは、リガンドアッセイ（例えば、本明細書で開示されているようなＮＧＬＡ）を実施し、後に本明細書で開示されるようなＮＧＰＡアッセイにて生物学的標的の同一性をデコンボリューションしてもよい。
上述の実施形態のいずれかでは、作用物質は、小分子、ペプトイド、ペプチド、ポリマーなどを含んでいてもよい。上述の実施形態のいずれかでは、作用物質は、例えばスプリット・プール手法を使用してコンビナトリアル的に合成することができる。上述の実施形態のいずれかでは、作用物質は、支持体上でコンビナトリアル的に合成することができる。
上述の実施形態のいずれかでは、ポリペプチドなどの生物学的標的のセットは、合成遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）を使用して準備することができる。一部の態様では、個々の遺伝子または合成遺伝子のプールのいずれかをＩＶＴＴに供して、コーディング情報を有する記録タグ標識タンパク質を創出することができる。したがって、記録タグを有する生物学的標的のセットは、例えば、ＩＶＴＴを使用することによって、溶液中で生成することができる（例えば、結合物質ダウン手法で使用するために）。あるいは、記録タグを有する生物学的標的のセットは、ビーズなどの支持体に固定化されたセットの各メンバーを用いて、例えばＩＶＴＴを使用することによって生成され得る（例えば、分析物ダウン手法で使用するために）。
ＩＶ． 例示的な実施形態
実施形態１Ａ．（ａ）各タンパク質に記録タグが直接または間接的に付随しているタンパク質のセットを、作用物質のライブラリーであって、各作用物質が、（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）、および（ｉｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングタグを含む、作用物質のライブラリーと接触させるステップであって、各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各作用物質が支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の作用物質の小分子（複数可）、ペプチド（複数可）もしくはペプチドの模倣物（複数可）、ペプチド模倣物（複数可）（例えば、ペプトイド（複数可）、β−ペプチド（複数可）、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物（複数可））、多糖（複数可）、またはアプタマー（複数可）と結合および／または反応する各タンパク質に付随する記録タグと（ｉｉ）１つまたは複数の作用物質のコーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｃ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
実施形態２Ａ．支持体上で各タンパク質と他のタンパク質との間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける、実施形態１Ａに記載の方法。
実施形態３Ａ．支持体上で各タンパク質およびそれに付随する記録タグと他のタンパク質およびそれらに付随する記録タグとの間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける、実施形態１Ａまたは２Ａに記載の方法。
実施形態４Ａ． タンパク質および／またはそれらの付随する記録タグの１つまたは複数が、共有結合で支持体に固定化されているか（例えば、リンカーを介して）、または非共有結合で支持体に固定化されている（例えば、結合対を介して）、実施形態１Ａから３Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態５Ａ． タンパク質および／またはそれらの付随する記録タグのサブセットが、共有結合で支持体に固定化されており、タンパク質および／またはそれらの付随する記録タグの別のサブセットが、非共有結合で支持体に固定化されている、実施形態１Ａから４Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態６Ａ． 記録タグの１つまたは複数が、支持体に固定化されており、それにより付随するタンパク質が固定化される、実施形態１Ａ〜５ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７Ａ． タンパク質の１つまたは複数が、支持体に固定化されており、それにより付随する記録タグが固定化される、実施形態１Ａ〜６Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８Ａ． 少なくとも１つのタンパク質が、その付随する記録タグと共局在化しており、各々が独立して支持体に固定されている、実施形態１Ａから７Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態９Ａ． 少なくとも１つのタンパク質および／またはその付随する記録タグが、固定用リンカーに直接的または間接的に付随し、固定用リンカーが、支持体に直接的または間接的に固定化されており、それにより少なくとも１つのタンパク質および／またはその付随する記録タグが支持体に固定化される、実施形態１Ａから８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０Ａ． 固定化された記録タグの密度が、固定化されたタンパク質の密度と等しいかまたはそれより大きい、実施形態１Ａから９Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１Ａ． 固定化された記録タグの密度が、固定化されたタンパク質の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍であるか、またはそれよりも大きい、実施形態１０Ａに記載の方法。
実施形態１２Ａ．各作用物質と支持体に固定化された他の作用物質との間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける、実施形態１Ａに記載の方法。
実施形態１３Ａ．作用物質の１つまたは複数を支持体に共有結合により固定化する（例えば、リンカーを介して）、または支持体に非共有結合により固定化する（例えば、結合対を介して）、実施形態１２Ａに記載の方法。
実施形態１４Ａ． 作用物質のサブセットが、共有結合で支持体に固定化されており、作用物質の別のサブセットが非共有結合で支持体に固定されている、実施形態１２Ａまたは１３Ａに記載の方法。
実施形態１５Ａ． 作用物質の１つまたは複数では、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーが、支持体に固定化されており、それによりコーディングタグが固定化される、実施形態１２Ａ〜１４ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６Ａ． 作用物質の１つまたは複数では、コーディングタグが支持体に固定化されており、それにより小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーが固定化される、実施形態１２Ａ〜１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７Ａ． 少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに情報が移行し、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグが生成する、実施形態１Ａから１６Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８Ａ． 少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに情報が移行し、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグが生成する、実施形態１Ａから１７Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９Ａ． コーディングタグからの情報と記録タグからの情報とを含む少なくとも１つのジタグ構築物が生成する、実施形態１Ａから１８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０Ａ． タンパク質の少なくとも１つが、２つまたはそれよりも多くの作用物質の小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと結合および反応する、実施形態１Ａから１９Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１Ａ． 伸長記録タグまたは伸長コーディングタグが、２つまたはそれよりも多くの作用物質の低分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに関する識別情報を含む、実施形態２０Ａに記載の方法。
実施形態２２Ａ． タンパク質の少なくとも１つに、２つまたはそれよりも多くの記録タグが付随しており、２つまたはそれよりも多くの記録タグは、同じであっても異なってもよい、実施形態１Ａから２１Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３Ａ． 作用物質の少なくとも１つが、２つまたはそれよりも多くの記録タグを含み、２つまたはそれよりも多くの記録タグは、同じであっても異なってもよい、実施形態１Ａから２２Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４Ａ．情報の移行を、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成する、実施形態１Ａから２３Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５Ａ． ライゲーションおよび／またはポリメラーゼ媒介性反応が、タンパク質と小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーとの間の結合占有時間または反応時間と比べて速いカイネティクスを有し、必要に応じて、ライゲーションおよび／またはポリメラーゼ媒介性反応用の試薬が、タンパク質と小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーとの間の結合または反応と同じ反応体積で存在し、さらに必要に応じて、情報の移行が、同時結合／エンコーディングステップを使用することによって、および／または、結合性物質の解離速度を遅くするために低下させるエンコーディングまたは情報書き込みステップの温度を使用することによってもたらされる、実施形態２４Ａに記載の方法。
実施形態２６Ａ． 各タンパク質は、個々の付着によりその記録タグに付随し、および／あるいは各低分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーは、個々の付着によりそのコーディングタグに付随する、実施形態１Ａから２５Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７Ａ． 付着が、リボソームまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイにより生じ、記録タグおよび／またはコーディングタグ配列情報がｍＲＮＡ配列に含まれている、実施形態２６Ａに記載の方法。
実施形態２８Ａ． 記録タグおよび／またはコーディングタグが、ｍＲＮＡ配列の３’末端にユニバーサルプライマー配列、バーコード、および／またはスペーサー配列を含む、実施形態２７Ａに記載の方法。
実施形態２９Ａ． 記録タグおよび／またはコーディングタグが、３’末端に制限酵素消化部位をさらに含む、実施形態２８Ａに記載の方法。
実施形態３０Ａ． タンパク質のセットが、プロテオームまたはそのサブセットであり、必要に応じて、タンパク質のセットが、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製されるか、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によって作製される、実施形態１Ａから２９Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１Ａ． プロテオームのサブセットが、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／もしくはニトロシル化）によって規程されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは器官、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（もしくは脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態３０Ａに記載の方法。
実施形態３２Ａ． タンパク質のセットが、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、例えば、酵母、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウイルス、例えば、ＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来する、実施形態１Ａから３１Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３Ａ． タンパク質のセットが、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、実施形態１Ａから３２Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４Ａ． 記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態１Ａから３３Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５Ａ． 記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、実施形態１Ａから３４Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６Ａ． 記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含み、例えば、ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、実施形態１Ａから３５Ａまでのいずれか一項に記載の方法。
実施形態３７Ａ． 記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態１Ａから３６Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８Ａ． 記録タグが、バーコードを含む、実施形態１Ａから３７Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９Ａ． 記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、実施形態１Ａから３８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０Ａ．支持体が、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体であり、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、実施形態１Ａから３９Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１Ａ．支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１Ａから４０Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２Ａ．支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態４１Ａに記載の方法。
実施形態４３Ａ． 小分子−タンパク質結合マトリックス、および／またはペプチド／ペプチドの模倣物−タンパク質結合マトリックス、および／またはペプチド模倣物−タンパク質結合マトリックス（例えば、ペプトイド−タンパク質結合マトリックス、β−ペプチド−タンパク質結合マトリックス、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物−タンパク質結合マトリックス）、および／または多糖−タンパク質結合マトリックス、および／またはアプタマー−タンパク質結合マトリックスを創出するために、タンパク質のセットと、小分子、および／またはペプチドもしくはペプチドの模倣物、および／またはペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、および／または多糖、および／またはアプタマーのライブラリーとの間の相互作用の並行解析のための、実施形態１Ａから４２Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４Ａ． マトリックスのサイズが、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４であるか、またはそれよりも大きい、例えば、約２×１０１３である、実施形態４３Ａに記載の方法。
実施形態４５Ａ． コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態１Ａから４４Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６Ａ． コーディングタグが、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーを識別するエンコーダー配列を含む、実施形態１Ａから４５Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７Ａ． コーディングタグが、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１Ａから４６Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８Ａ． 小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーおよびコーディング配列が、リンカーまたは結合対によって接合されている、実施形態１Ａから４７Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９Ａ． 小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーおよびコーディング配列が、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（接合しようとする２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅが、ＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合し、したがって２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ソルターゼ、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガーゼ対、またはこれらの任意の組合せによって接合されている、実施形態１Ａから４８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０Ａ．ポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）（ｉ）各断片に記録タグが直接または間接的に付随している、ポリペプチドの断片のセットを、（ｉｉ）各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、各断片および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；（ｂ）結合性部分と断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）各断片に付随する記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｃ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
実施形態５１Ａ．１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸が、（ｉ）Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）；（ｉｉ）Ｎ末端ジペプチド配列；（ｉｉｉ）Ｎ末端トリペプチド配列；（ｉｖ）内部アミノ酸；（ｖ）内部ジペプチド配列；（ｖｉ）内部トリペプチド配列；（ｖｉｉ）Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）；（ｖｉｉｉ）Ｃ末端ジペプチド配列；または（ｉｘ）Ｃ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せを含み、必要に応じて、（ｉ）〜（ｉｘ）内のアミノ酸残基の任意の１つまたは複数が修飾または官能化されている、実施形態５０Ａに記載の方法。
実施形態５２Ａ．１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸が、各残基において独立に、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで選択される、実施形態５１Ａに記載の方法。
実施形態５３Ａ． 結合性部分が、ポリペプチドもしくはその断片、タンパク質もしくはポリペプチド鎖もしくはその断片、または抗体もしくはその抗原結合性断片などのタンパク質複合体もしくはそのサブユニットを含む、実施形態５０Ａから５２Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４Ａ． 結合性部分が、アンチカリンまたはその変異体、突然変異体、もしくは修飾タンパク質；アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼまたはその変異体、突然変異体、もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはその変異体、突然変異体、もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳまたはその変異体、突然変異体、もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはその変異体、突然変異体、もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、つまりバンコマイシンまたはその変異体、突然変異体、もしくは修飾タンパク質；あるいはこれらの任意の組合せを含む、実施形態５０Ａから５３Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５Ａ． 結合性部分が、機能化Ｎ−末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）、Ｎ末端ジペプチド配列、またはＮ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せに選択的におよび／または特異的に結合することが可能である、実施形態５０Ａから５４Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６Ａ．複数のポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）複数のポリペプチドの各分子を複数のユニバーサルタグで標識するステップと；（ｂ）複数のポリペプチドと複数のコンパートメントタグを、複数のユニバーサルタグと複数のコンパートメントタグのアニーリングまたは接合に適した条件下で接触させ、それにより、複数のポリペプチドを複数のコンパートメント（例えば、ビーズ表面、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せ）に分配するステップであって、複数のコンパートメントタグが、各コンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｃ）各コンパートメント内のポリペプチド（複数可）を断片化し、それにより、それぞれに少なくとも１つのユニバーサルポリヌクレオチドタグおよび少なくとも１つのコンパートメントタグを含む記録タグに付随するポリペプチド断片のセットを生成するステップと；（ｄ）ポリペプチド断片のセットを支持体に直接または間接的に固定化するステップと；（ｅ）固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと接触させるステップと；（ｆ）結合性部分と断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）各断片に付随する記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｇ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
実施形態５７Ａ．同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドが、同じタンパク質に属する、実施形態５６Ａに記載の方法。
実施形態５８Ａ．同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドが、異なるタンパク質、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれよりも多くのタンパク質に属する、実施形態５６Ａに記載の方法。
実施形態５９Ａ． 複数のコンパートメントタグが、複数の基材に固定化されており、各基材がコンパートメントを画成する、実施形態５６Ａから５８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０Ａ． 複数の基材が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態５９Ａに記載の方法。
実施形態６１Ａ． 複数の基材の各々が、バーコード付きビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどのバーコード付き粒子を含む、実施形態５９Ａまたは６０Ａに記載の方法。
実施形態６２Ａ．支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態５９Ａから６１Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３Ａ．支持体が、配列決定ビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態６２Ａに記載の方法。
実施形態６４Ａ．支持体上で各断片およびそれに付随する記録タグと他の断片およびそれらに付随する記録タグとの間に約２０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約１５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約２５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約３５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約４５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約５５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約６５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約７５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約８５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９００ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、約９５０ｎｍと等しいもしくはそれよりも大きい、または約１μｍと等しいもしくはそれよりも大きい平均距離で間隔をあける、実施形態５６Ａから６３Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５Ａ．複数のポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）複数のポリペプチドを複数の基板に固定化するステップであって、各基板が、それぞれがコンパートメントタグを含む複数の記録タグを含み、必要に応じて、各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せである、ステップと；（ｂ）各基板に固定化されたポリペプチド（複数可）を断片化し（例えば、プロテアーゼ消化によって）、それにより、基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するステップと；（ｃ）固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと接触させるステップと；（ｄ）（ｉ）結合性部分と各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｅ）伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
実施形態６６Ａ．同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドが、同じタンパク質に属する、実施形態６５Ａに記載の方法。
実施形態６７Ａ．同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドが、異なるタンパク質、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれよりも多くのタンパク質に属する、実施形態６５Ａに記載の方法。
実施形態６８Ａ．各基板によりコンパートメントが規程される、実施形態６５Ａから６７Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９Ａ．複数の基板が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロースメンブレン、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態６５Ａから６８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０Ａ．複数の基板はそれぞれが、バーコードが付された粒子、例えば、バーコードが付されたビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどを含む、実施形態６５Ａから６９Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１Ａ．官能化試薬が、化学薬剤、酵素、および／または生物学的薬剤、例えば、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬を含む、実施形態５０Ａから７０Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２Ａ．記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態５０Ａから７１Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３．記録タグが、ユニバーサルプライミング部位；増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位；必要に応じて、一意の分子識別子（ＵＭＩ）；バーコード；必要に応じて、その３’末端のスペーサー；またはこれらの組合せを含む、実施形態５０Ａから７２Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４Ａ． ポリペプチドまたは複数のポリペプチドの配列を決定するためである、実施形態５０Ａから７３Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５Ａ． コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、実施形態５０Ａから７４Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６Ａ． コーディングタグが、エンコーダー配列、必要に応じたスペーサー、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態５０Ａから７５Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７Ａ． 結合性部分およびコーディングタグが、リンカーまたは結合対により接合されている、実施形態５０Ａから７６Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７８Ａ． 結合性部分およびコーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（接合しようとする２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅが、ＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合し、したがって２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ソルターゼ、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガーゼ対、またはこれらの任意の組合せにより接合されている、実施形態５０Ａから７７Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９Ａ． コーディングタグおよび／または記録タグが、１つもしくは複数のエラー訂正コード、１つもしくは複数のエンコーダー配列、１つもしくは複数のバーコード、１つもしくは複数のＵＭＩ、１つもしくは複数のコンパートメントタグ、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１Ａから７８Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８０Ａ． エラー訂正コードが、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される、実施形態７９Ａに記載の方法。
実施形態８１Ａ． 伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグの解析が核酸配列解析を含む、実施形態１Ａから８０Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８２Ａ． 核酸配列解析が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシング、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態８１Ａに記載の方法。
実施形態８３Ａ． 核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、実施形態８２Ａに記載の方法。
実施形態８４Ａ． １つまたは複数の洗浄ステップをさらに含む、実施形態１Ａから８３Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５Ａ． 伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが、解析前に増幅される、実施形態１Ａから８４Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８６Ａ． 伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが、解析前に標的濃縮アッセイを受ける、実施形態１Ａから８５Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７Ａ． 伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが、解析前にサブトラクションアッセイを受ける、実施形態１Ａから８６Ａまでのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８８Ａ．（ａ）作用物質のライブラリーであって、各作用物質が、（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、および／またはアプタマー、ならびに（ｉｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングタグを含む作用物質のライブラリーと、必要に応じて（ｂ）各タンパク質に記録タグが直接または間接的に付随している、タンパク質のセットとを含み、各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各作用物質が支持体に直接または間接的に固定化されており、タンパク質のセット、記録タグ、および作用物質のライブラリーが、（ｉ）１つまたは複数の作用物質の小分子（複数可）、ペプチド（複数可）もしくはペプチドの模倣物（複数可）、ペプチド模倣物（複数可）（例えば、ペプトイド（複数可）、β−ペプチド（複数可）、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物（複数可））、多糖（複数可）、またはアプタマー（複数可）と結合および／または反応する、各タンパク質に付随する記録タグと（ｉｉ）１つまたは複数の作用物質のコーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されているキット。
実施形態８９Ａ．ポリペプチドを解析するためのキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと、必要に応じて（ｂ）各断片に記録タグが直接または間接的に付随しているポリペプチドの断片のセット、または（ｂ’）プロテアーゼなどの、ポリペプチドを断片化するための手段とを含み、各断片および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されており、ポリペプチドの断片のセット、記録タグ、および結合性物質のライブラリーが、結合性部分と断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）各断片に付随する記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されているキット。
実施形態９０Ａ．複数のポリペプチドを解析するためのキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分および結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬によって修飾された１つもしくは複数のＮ末端、内部、もしくはＣ末端のアミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと、（ｂ）複数のポリペプチドが必要に応じて固定化された複数の基板であって、各基板が、それぞれがコンパートメントタグを含む複数の記録タグを含み、必要に応じて、各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せであり、各基板に固定化されたポリペプチド（複数可）が、断片化されて（例えば、プロテアーゼ切断によって）、基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するように構成されている、複数の基板とを含み、複数のポリペプチド、記録タグ、および結合性物質のライブラリーが、結合性部分と各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部、またはＣ末端のアミノ酸との間の結合時に（ｉ）記録タグと（ｉｉ）コーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されているキット。
Ｖ． 実施例
以下の例は、説明のために含まれているに過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されていない。これらの方法の関連背景情報および実施可能性は周知であり、ＷＯ２０１８／０８９６４１ Ａ２号の、およびLam, K.S., M. Lebl and V. Krchnak (1997), "The"One-Bead-One-Compound" Combinatorial Library Method," Chem Rev97(2): 411-448の情報を含む。これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例１）
プロテイナーゼＫによるタンパク質試料の消化
ペプチドのライブラリーを、トリプシン、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼで消化することによりタンパク質試料から調製する。トリプシンは、例えば、リシンおよびアルギニンのような正電荷のアミノ酸のＣ末端側を切断するが、プロテイナーゼＫは、タンパク質の全体にわたって非選択的に切断する。そのため、プロテイナーゼＫ消化は、短鎖ペプチド（約３０個のアミノ酸）を生成するのに十分なタンパク質分解を提供するが、試料が過剰消化されないような好ましい酵素対ポリペプチドの比を使用して、注意深くタイトレーションすることが必要である。一般的に、所与のプロテイナーゼＫロット毎に、機能活性のタイトレーションを実施することが必要である。この例では、タンパク質試料を、１×ＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．５％ＳＤＳ（ｐＨ８．０）中で１：１０〜１：１００（ｗ／ｗ）の酵素：タンパク質比にてプロテイナーゼＫを用いて、１時間３７℃にて消化する。インキュベーション後、ＰＭＳＦを、終濃度が５ｍＭになるように添加して、さらなる消化を阻害する。
プロテイナーゼＫの特異的活性は、「化学的基質」ベンゾイルアルギニン−ｐ−ニトロアニリドをプロテイナーゼＫと共にインキュベートし、約４１０ｎｍで吸収を示す黄色ｐ−ニトロアニリン産物の発色を測定することにより、測定することができる。酵素活性は、１単位が毎分１μモルのｐ−ニトロアニリドの産生と等しい単位で測定し、特異的活性は、酵素活性／ｍｇ総タンパク質の単位で測定する。その後、溶液中のタンパク質の総量で酵素活性を除算することにより、特異的活性を算出する。
（実施例２）
ＳＰ３オンビーズプロテアーゼ消化および標識を使用した試料調製
Ｈｕｇｈｅｓら（２０１４年、Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ、１０巻：７５７頁）により記載されているようなＳＰ３試料調製プロトコールを使用して、タンパク質を抽出し、変性させる。抽出した後、タンパク質ミックス（およびビーズ）を、０．０２％ＳＤＳで補完された１ｍＭ ＥＤＴＡを有する５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で１時間３７℃で溶解した。タンパク質溶解後、ジスルフィド結合を、終濃度が５ｍＭになるようにＤＴＴを添加し、試料を５０℃で１０分間インキュベートすることにより還元する。終濃度が１０ｍＭになるようにヨードアセトアミドを添加することによりシステインをアルキル化し、室温で２０分間、暗所でインキュベートする。反応を、５０ｍＭホウ酸緩衝液で２倍に希釈し、Ｇｌｕ−ＣまたはＬｙｓ−Ｃを、１：５０（ｗ／ｗ）の最終プロテイナーゼ：タンパク質比で添加する。試料を３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートして、消化を完了した。Ｈｕｇｈｅｓら（上記）により記載されているように試料を消化した後、８分間のインキュベーション中、アセトニトリルの終濃度が９５％になるように１００％アセトニトリルを添加することによりペプチドをビーズに結合させ、アセトニトリルで洗浄する。洗浄した後、５分間のピペット混合ステップにより、１０μｌの２％ＤＭＳＯ中でビーズからペプチドを溶出する。
（実施例３）
記録タグとペプチドとのカップリング
ＤＮＡ記録タグを、いくつかの方法でペプチドにカップリングする（Aslam etal., 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences, Macmillan Reference LTD；Hermanson GT, 1996, Bioconjugate Techniques,Academic Press Inc., 1996を参照）。１つの手法では、カルボジイミド化学を使用してペプチドのＣ末端にカップリングされる５’アミン、およびクリック化学を使用してアジドビーズにカップリングされる内部歪みアルキンＤＢＣＯ−ｄＴ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡ）を用いて、オリゴヌクレオチド記録タグを構築する。カルボジイミドカップリングを完了へと駆動し、ペプチド間カップリングを制限するために、大幅に過剰なモル濃度の記録タグを使用して、溶液中で記録タグをペプチドにカップリングする。あるいは、５’歪みアルキン（ＤＢＣＯ−ｄＴ）を用いてオリゴヌクレオチドを構築し、アジド誘導体化ペプチドにカップリングし（ペプチドのＣ末端にカップリングするアジド−ＰＥＧ−アミンおよびカルボジイミドにより）、その後アルデヒド反応性ＨｙＮｉｃヒドラジンビーズにカップリングする。この目的のために、記録タグオリゴヌクレオチドを、内部アルデヒドホルミルインドール（Ｔｒｉｌｉｎｋ）基で容易に標識することができる。あるいは、Ｃ末端アミンにカップリングするのではなく、その代わりに、記録タグを、内部リシン残基にカップリングしてもよい（例えば、Ｌｙｓ−Ｃ消化後に、またはその代わりにＧｌｕ−Ｃ消化後に）。１つの手法では、これは、ＮＨＳ−アジド（またはＮＨＳ−ＰＥＧ−アジド）基を用いてリシンアミンを活性化し、その後５’アミン標識記録タグにカップリングすることにより達成することができる。別の手法では、５’アミン標識記録タグを、ＤＳＳなどの過剰なＮＨＳホモ二機能性架橋試薬と反応させて、５’ＮＨＳ活性化記録タグを創出することができる。この５’ＮＨＳ活性化記録タグは、ペプチドのリシン残基のε−アミノ基に直接カップリングすることができる。
（実施例４）
ペプチドのアミノ酸の部位特異的標識
アミノ酸は、ＤＮＡタグで直接的または間接的のいずれかにより部位選択的に修飾することができる。直接標識の場合、ＤＮＡタグを部位選択的化学で活性化することができ、またはその代わりに間接標識の場合、ヘテロ二機能性化学を使用して、特定のアミノ酸反応性部分を、ＤＮＡタグを後に付着させることができるユニバーサルクリック化学に変換することができる（Lundblad 2014）。１つの場合では、５つの異なるアミノ酸を部位特異的に標識する例が記載される。タンパク質またはペプチドのアミノ酸の５つの異なる例を、活性化ＤＮＡタグで直接的に（ヘテロ二機能性アミノ酸部位特異的試薬による活性化を使用して）、またはＤＮＡタグの同種クリック部分に付着させるために後に使用されるクリック部分でアミノ酸を部位特異的に標識するクリック化学ヘテロ二機能性試薬により間接的に修飾することができる。
典型的なタンパク質入力は、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）ＳＦ界面活性剤および５ｍＭ ＴＣＥＰを含む５０μｌの適切な水性緩衝液中に１μｇのタンパク質を含む。ＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）ＳＤは、標識または消化を向上させるためにタンパク質をポリペプチドへと変性させるための酸分解性界面活性剤として有用である。以下のアミノ酸標識戦略を使用することができる：マレイミド化学を使用したシステイン−−−２００μＭのスルホ−ＳＭＣＣ活性化ＤＮＡタグを使用して、システインを、１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）＋１％ＴＸ−１００中で１時間、部位特異的に標識する；ＮＨＳ化学を使用したリシン−−−２００μＭのＤＳＳまたはＢＳ３活性化ＤＮＡタグを使用して、溶液相タンパク質またはビーズ結合ペプチドのリシンを、室温にて１時間、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）＋１％ＴＸ−１００中で部位特異的に標識する；チロシンは、４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾリン−３，５（４Ｈ）−ジオン（ＰＴＡＤ）で修飾する；またはジアゾニウム化学−−−ジアゾニウム化学の場合、ＤＮＡタグを、ＥＤＣおよび４−カルボキシルベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート（Ａｉｋｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｈｉｎａ）で活性化する。タンパク質またはビーズ結合ペプチドを、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．５）＋１％ＴＸ−１００中で、２００μＭのジアゾニウム誘導体化ＤＮＡタグと共に１時間氷上にてインキュベートすることにより、チロシンとのジアゾ連結を創出する（Ｎｇｕｙｅｎ、Ｃａｏら、２０１５年）。ＥＤＣ化学を使用してアスパラテート／グルタメートを修飾する−−−アミン標識ＤＮＡタグを、ｐＨ６．５のＭＥＳ中でビーズ結合ペプチドおよび１００ｍＭ ＥＤＣ／５０ｍＭイミダゾールと共に、室温で１時間にわたってインキュベートする（Ｂａｓｌｅら、２０１０年、Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、１７巻：２１３〜２２７頁）。標識の後、過剰な活性化ＤＮＡタグを、Ｃ４レジンＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からのタンパク結合溶出を使用して除去する。溶出したタンパク質を、１×ＰＢＳ緩衝液で５０μｌにする。
（実施例５）
歪みアルキン記録タグ標識ペプチドのアジド活性化ビーズへの固定化
市販のアミンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０を、アジドＰＥＧ ＮＨＳエステルヘテロ二機能性リンカー（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｘ）と反応させることにより、アジド誘導体化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ビーズを生成する。さらに、メトキシまたはヒドロキシルＰＥＧ ＮＨＳエステルと適切な比で混合することにより、アジドの表面密度をタイトレーションすることができる。所与のペプチド試料毎に、１〜２ｍｇのアジド誘導体化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ビーズ（約１．３×１０８個のビーズ）を、１００μｌのホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）で希釈し、１ｎｇの記録タグペプチドを添加し、２３〜３７℃で１時間インキュベートする。２００μｌのホウ酸緩衝液で３回洗浄する。
（実施例６）
ホルミルインドール反応性ＨｙＮｉｃビーズの創出
アミンビーズのＨｙＮｉｃ誘導体化により、ホルミルインドール反応性ビーズを創出する。２０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０アミンビーズ（２．８μｍ）のアリコートを、２００μｌのホウ酸緩衝液に懸濁する。短時間の超音波処理後、１〜２ｍｇのスルホ−Ｓ−ＨｙＮｉｃ（スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン、ＳＡＮＨ）（カタログ＃Ｓ−１００２、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を添加し、反応混合物を室温で１時間にわたって振とうする。その後、ビーズを、ホウ酸緩衝液で２回およびクエン酸緩衝液（２００ｍＭクエン酸ナトリウム）で１回洗浄する。ビーズを、終濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるようにクエン酸緩衝液に懸濁する。
（実施例７）
記録タグホルミルインドール（ｆｏｒｍｌｉｎｄｏｌｅ）標識ペプチドの活性化ビーズへの固定化
１〜２ｍｇのＨｙＮｉｃ活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ビーズのアリコート（約１．３×１０８個ビーズ）を、５０ｍＭアニリンで補完された１００μｌのクエン酸緩衝液で希釈し、約１ｎｇの記録タグペプチドコンジュゲートを添加し、３７℃で１時間にわたってインキュベートする。ビーズを、２００μｌのクエン酸緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのホウ酸緩衝液に再懸濁した。
（実施例８）
オリゴヌクレオチドモデル系−コーディングタグの識別情報をサイクル様式で記録タグへと移行させることによる結合性物質履歴の記録
核酸コーディングタグおよび記録タグの場合、標準的核酸酵素学を使用したライゲーションまたはプライマー伸長により、結合されている結合性物質のコーディングタグから近位の記録タグへと、情報を移行させることができる。これは、結合性物質標的を表す５’部分および記録タグを表す３’部分を有するオリゴヌクレオチドで構成される単純なモデル系で実証することができる。オリゴヌクレオチドの内部部位を、ｄＴ−アルキン修飾（ＤＢＣＯ−ｄＴ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によるクリック化学を使用して固定化することができる。図２４Ａに示されている例では、固定化されたオリゴヌクレオチド（ＡＢ標的）は、同種オリゴヌクレオチド「結合性物質」であるＡオリゴおよびＢオリゴが結合することができる、ＡおよびＢと標識されている２つの標的結合領域を含む。ＡオリゴおよびＢオリゴヌクレオチドは、共通スペーサー（Ｓｐ）を介して記録タグと相互作用して、プライマー伸長（またはライゲーション）を開始するコーディングタグ（配列および長さが異なる）に連結されている。Ｓｐの長さは、結合性物質結合中の非特異的相互作用を最小限に抑えるために、短く（例えば、６〜９塩基）しておくべきである。この特定の例では、コーディングタグの長さは、「Ａ」オリゴ結合事象（１０塩基エンコーダー配列）と「Ｂ」オリゴ結合事象（２０塩基エンコーダー配列）がゲル解析で容易に区別されるように設計されている。
ＰＡＧＥゲルを単に解析することにより、ＡまたはＢコーディングタグ移行の効率を測定することが可能であり、実験パラメーターの容易な最適化が可能である。ＡＢ標的配列に加えて、ＣおよびＤが、ＡおよびＢと相互作用しない異なるハイブリダイゼーション配列であることを除いて、同様のオリゴヌクレオチドＣＤ標的配列が用いられる（例えば図２４Ｂを参照されたい）。さらに、ＣおよびＤは、それぞれ３０塩基ＤＮＡコードおよび４０塩基ＤＮＡコードを含む、異なる配列および長さのコーディングタグを含む。第２の標的配列ＣＤの目的は、ＡＢおよびＣＤ標的分子間の交差相互作用を評価することである。特定のハイブリダイゼーションを考慮すると、ＡＢ標的に結合されたオリゴに接続されているＡまたはＢコーディングタグ間に分子間交差が生じない限り、ＣＤ標的の伸長記録タグが、ＡまたはＢコーディングタグ情報を含むことはない。同様に、ＡＢ標的の伸長記録タグは、ＣまたはＤコーディングタグ情報を含むはずがない。ＡＢおよびＣＤ標的が物理的近傍に接近している状況では（つまり＜５０ｎｍ）、掛け合い応答が起こる可能性が高い。したがって、表面の標的巨大分子を適切に離間させることが重要である。
このオリゴヌクレオチドモデル系は、結合性物質履歴の記録能力の十分な特徴付けを可能にする。図２５は、プライマー伸長ではなくライゲーションによる情報移行を示す。まずゲルで最適化した後、種々の結合およびアッセイプロトコールを実施し、配列決定により評価する。一意の分子識別子（ＵＭＩ）配列は、計数のために使用され、単一の巨大分子に由来するリードの識別を可能にし、元の試料中の総合的で全体的な巨大分子複雑性の尺度を提供する。例示的な履歴結合プロトコールとしては、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｃなどが挙げられる：得られる最終産物は、それぞれ、ＵＭＩ−Ｓｐ−Ａ−Ｓｐ−Ｂ−Ｓｐ−Ｂ−Ｓｐ−Ａ−Ｓｐ＋ＵＭＩ−Ｓｐ−Ｃ−Ｓｐ；ＵＭＩ−Ｓｐ−Ａ−Ｓｐ−Ｂ−Ｓｐ−Ａ−Ｓｐ−Ａ−Ｓｐ−Ｂ−Ｓｐ−Ａ；ＵＭＩ−Ａ−Ｓｐ−Ｂ−Ｓｐ−Ａ＋ＵＭＩ−Ｓｐ−Ｃ−Ｓｐ−Ｄ−Ｓｐ−Ｃ−Ｓｐと読み取られるはずである。この解析の結果は、さらなる最適化を可能にする。
（実施例９）
オリゴヌクレオチド−ペプチドモデル系−コーディングタグの識別情報をサイクル様式で記録タグへと移行させることによる結合性物質履歴の記録
オリゴヌクレオチドモデル系を検証した後、例示的な標的オリゴヌクレオチド配列の５’末端にペプチドエピトープタグをコンジュゲートすることにより、オリゴヌクレオチド系からペプチドモデル系を構築する（例えば図２６Ａおよび２６Ｂを参照されたい）。例示的なペプチドエピトープタグとしては以下のものが挙げられる：ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１７１）、Ｖ５（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号１７２）、ｃ−Ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１７３）、ＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号１７４）、Ｖ５（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号１７５）、ＳｔｒｅｐＴａｇ ＩＩ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号１７６）など。ペプチドエピトープタグをオリゴヌクレオチドにカップリングするための、任意選択のＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーが含まれていてもよい。実施例７のＡＢオリゴヌクレオチド鋳型を、Ａ＿オリゴヌクレオチド−ｃＭｙｃペプチド構築物に取り替え、実施例７のＣＤオリゴヌクレオチド鋳型を、Ｃ＿オリゴヌクレオチド−ＨＡペプチド構築物に取り替える（例えば図２６を参照されたい）。また、Ａ＿オリゴヌクレオチド−ｃＭｙｃペプチド構築物は、ＣＳＧリンカーおよびＮ末端ホスホチロシンを含む。同様に、同種ペプチド結合性物質であるｃＭｙｃ抗体およびＨＡ抗体を、それぞれＢオリゴヌクレオチドコーディングタグおよびＤオリゴヌクレオチドコーディングタグでタグ化する。ホスホチロシン特異的抗体は、別の「Ｅ」コーディングタグでタグ化する。このように、ペプチドモデル系は、オリゴヌクレオチド系と対応しており、オリゴ結合および抗体結合の両方が、このモデル系で試験される。
抗ｃ−ｍｙｃ抗体（２Ｇ８Ｄ５、マウスモノクローナル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、抗ＨＡ抗体（５Ｅ１１Ｄ８、マウスモノクローナル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ抗体（５Ａ９Ｆ９、マウスモノクローナル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、または抗ＦＬＡＧ抗体（５ＡＥ８５、マウスモノクローナル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用した固定化ＤＮＡペプチド構築物の抗体染色を、０．１〜１μｇ／ｍｌの１×ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を使用して実施する。インキュベーションを、典型的には室温で３０分間実施する。また、１×ＰＢＳＴ中１％のＰＶＰを使用した標準的プレブロッキングおよび染色後洗浄を実施する。抗体脱染色は、高濃度塩（１Ｍ ＮａＣｌ）および低ｐＨ（グリシン、ｐＨ２．５）または高ｐＨ（トリエチルアミン、ｐＨ１１．５）のいずれかで洗浄することにより効果的に達成される。
標的オリゴヌクレオチドは、アジドビーズに付着させるための内部アルキン標識を含み、５’末端は、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０１０年、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ． 第４章：４．４１項）に記載されているように、ペプチドのＣ末端システインにＳＭＣＣ媒介性付着させるためのアミノ基を含む。あるいは、標準的カルボジイミドカップリングを、オリゴヌクレオチドおよびペプチドのコンジュゲーション反応に使用する（Ｌｕら、２０１０年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、２１巻：１８７〜２０２頁）。この場合、過剰なオリゴを使用して、カルボジイミド反応を駆動し、ペプチド間カップリングを最小限に抑える。コンジュゲーション後、ＰＡＧＥゲルから切除し、溶出することにより、最終産物を精製する。
（実施例１０）
ＤＮＡ／ＰＮＡコーディングタグ相補体を記録タグにライゲーションさせることによるコーディングタグ移行
コーディングタグを、ライゲーションにより直接的または間接的のいずれかで記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成する。一実行例では、アニーリングされたコーディングタグの相補体を、記録タグにライゲーションさせる（例えば図２５を参照されたい）。このコーディングタグ相補体は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であってもよく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよく、または成長中の記録タグにライゲーションすることが可能ないくつかの他のコードディング分子であってもよい。ライゲーションは、ＤＮＡおよびＲＮＡの場合、標準的なＡＴＰ依存性およびＮＡＤＨ依存性リガーゼを使用して酵素的であってもよく、またはライゲーションは、ＤＮＡ／ＲＮＡおよび特にペプチド核酸ＰＮＡの両方の場合、化学媒介性であってもよい。
ＤＮＡの酵素的ライゲーションの場合、アニーリングされたコーディングタグは、記録タグの３’ヒドロキシルとライゲーションするために、５’リン酸塩を必要とする。例示的な酵素的ライゲーション条件は、以下の通りである（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、Ｈｕａｎｇら、１９９８年）。標準的Ｔ４ ＤＮＡライゲーション反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＴＸ−１００、および２．０Ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ反応は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ＴＸ−１００、および０．０２５Ｕ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む。Ｔａｑ ＤＮＡライゲーション反応は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２５ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および１．０Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む。Ｔ４およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ反応は、室温で１時間にわたって実施し、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ反応は、４０℃で１時間にわたって実施する。
ＤＮＡ／ＰＮＡコーディングタグ移行の場合、鋳型化ＤＮＡ／ＰＮＡの化学的ライゲーションのいくつかの方法を用いることができる。そうした方法としては、標準的な化学的ライゲーションおよびクリック化学手法が挙げられる。鋳型ＤＮＡライゲーションの例示的な化学的ライゲーション条件は、以下の通りである（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、Ｈｕａｎｇら、１９９８年）：鋳型３’リン酸塩リポータータグと５’リン酸塩コーディングタグとのライゲーションは、５０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ＫＯＨでｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ＳＤＳ、新しく調製した２００ｍＭ ＥＤＣ、５０ｍＭイミダゾール（ＨＣｌでｐＨ６．０）または５０ｍＭ ＨＯＢｔ（ＨＣｌでｐＨ６．０）、および３．０〜４．０Ｍ ＴＭＡＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を含む反応中で、室温にて１時間以内に生じる。
ＰＮＡの鋳型依存性ライゲーションの例示的な条件としては、ＮＨ２−ＰＮＡ−ＣＨＯポリマー（例えば、コーディングタグ相補体および伸長記録タグ）のライゲーションが挙げられ、Ｂｒｕｄｎｏら（Ｂｒｕｄｎｏ、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、２０１０年）により記載されている。ＰＮＡは、５’アミン等価物および３’アルデヒド等価物を有しており、化学的ライゲーションにより２つの部分がカップリングされてシッフ塩基が創出され、シッフ塩基は、その後シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元される。このカップリングの典型的な反応条件は、以下の通りである：１００ｍＭ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）、８０ｍＭ ＮａＣｌ、および８０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム、室温で６０分間。５’アミノ末端１，２−アミノチオール修飾および３’Ｃ末端チオエステル修飾を含む機能化ＰＮＡを使用する未変性化学的ライゲーションの例示的な条件は、Ｒｏｌｏｆｆら（２０１４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１０５０巻：１３１〜１４１頁）により記載されている。また、他のＮ−およびＣ−末端ＰＮＡ部分を、ライゲーションに使用することができる。別の例は、クリック化学を使用したＰＮＡの化学的ライゲーションを含む。Ｐｅｎｇら（２０１０年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、２０１０年：４１９４〜４１９７頁）の手法を使用して、ＰＮＡを、５’アジドおよび３’アルキンで誘導体化し、クリック化学を使用してライゲーションすることができる。「クリック」化学ライゲーションの例示的な反応条件は、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＴＨＰＴＡ（ｔｒｉｓ−ヒドロキシプロピルトリゾリル（ｔｒｉｚｏｌｙｌ）アミン）、０．５ｍＭ ＣｕＳＯ４、および２．５ｍＭ Ｎａ−アスコルビン酸塩を含む１００μｌの反応ミックス中での、１〜２ｍｇビーズとの鋳型化ＰＮＡ−ＰＮＡである。化学的ライゲーション反応は、室温で１時間インキュベートされる。ＰＮＡライゲーションの他の例示的な方法は、Ｓａｋｕｒａｉら（Ｓａｋｕｒａｉ、Ｓｎｙｄｅｒら、２００５年）により記載されている。
（実施例１１）
ＤＮＡへのＰＮＡ変換
ＰＮＡ鋳型にアニーリングされたＤＮＡオリゴヌクレオチドのクリック化学媒介性重合を使用して、ＰＮＡをＤＮＡへと変換する。ＤＮＡオリゴは、ＤＮＡポリメラーゼにより複製することが可能なヌクレオチド間トリアゾール連結を創出するために、反応性５’アジドおよび３’アルキンを含む（Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、２０１１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０８巻：１１３３８〜１１３４３頁）。ＰＮＡのあらゆる考え得るコーディングタグに相補的なＤＮＡオリゴの完全なセット（１０ｎＭ、１×ハイブリダイゼーション緩衝液中：１０ｍＭ Ｎａ−ホウ酸塩（ｐＨ８．５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を、固相に結合されているＰＮＡ分子と共に３０分間インキュベートする（２３〜５０℃）。アニーリングの後、固相に結合されているＰＮＡ−ＤＮＡ構築物を、アスコルビン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄する。「クリック化学」反応条件は、以下の通りである：ビーズ上のＰＮＡ−ＤＮＡを、新たなアスコルビン酸ナトリウム緩衝液中でインキュベートし、１０ｍＭ ＴＨＰＴＡ＋２ｍＭ ＣｕＳＯ４のミックスと１：１で組み合わせて、室温で１時間インキュベートする。その後、ビーズを、ハイブリダイゼーション緩衝液で１回、およびＰＣＲ緩衝液で２回洗浄する。化学的ライゲーションの後、得られたライゲーションＤＮＡ産物を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（２０１１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０８巻：１１３３８〜１１３４３頁）により記載されているような条件下でＰＣＲにより増幅する。
（実施例１２）
核酸記録およびコーディングタグと適合性の穏やかなＮ末端エドマン分解
Ｎ末端エドマン分解とＤＮＡコーディングとの適合性は、この手法が、ペプチド配列決定で機能することを可能にする。無水ＴＦＡが用いられるＮ末端エドマン分解の標準的条件では、ＤＮＡは破壊される。しかしながら、この効果は、より穏やかな切断条件を開発し、より高い酸耐性を有する修飾ＤＮＡを開発することにより緩和される。Ｎ末端エドマン分解のより穏やかな条件を、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）−ペプチドの切断を最適化すること、および切断条件下でＤＮＡ／ＰＮＡコード付きライブラリーの安定性を測定することの組合せを使用して開発する。さらに、天然ＤＮＡは、低ｐＨでの脱プリンを低減する７−デアザプリンなどの塩基修飾、および脱ピリミジン化を低減する５’メチル修飾シトシンを使用することにより、酸加水分解に対して安定化させることができる（Schneider and Chait, 1995, Nucleic Acids Res. 23:1570-1575）。チミンが酸断片化に対して最も安定した塩基であることを考慮すると、Ｔ豊富なコーディングタグも有用であり得る。穏やかなＮ末端エドマン分解の条件は、無水ＴＦＡ切断の代わりに、Barrettet al.（その全体が参照により組み込まれる、1985, Tetrahedron Lett. 26:4375-4378）に記載されているように、アセトニトリル中のトリエチルアミンアセテートを６０℃で使用する穏やかな１０分間の塩基切断を使用することである。こうした穏やかな条件は、ほとんどのタイプのＤＮＡ記録タグおよびコーディングタグと適合性である。代替選択肢として、ＰＮＡは完全に酸安定性であるため、ＰＮＡをコーディングタグに使用する（Rayand Norden, 2000, FASEB J. 14:1041-1060）。上記の手法に加えて、エドマン標識および切断の両方を生き残るＤＮＡバーコードをスクリーニングにより経験的に選択することができる。
ＮＴＡＡ結合物質の同一性をコードするためにＤＮＡコーディングタグ／記録タグを使用することと、穏やかなＮ末端エドマン分解反応を実施することとの適合性を、以下のアッセイを使用して実証する。抗ホスホチロシンおよび抗ｃＭｙｃ抗体の両方を使用して、モデルペプチドを読み取る。単一のエドマン分解ステップを使用した、Ｃ−ＭｙｃおよびＮ末端ホスホチロシン検出、コーディングタグ書き込み、およびＮ末端ホスホチロシンの除去。このステップの後、ペプチドを、抗ホスホチロシンおよび抗ｃＭｙｃ抗体で再び染色する。Ｎ末端分解に対する記録タグの安定性を、ｑＰＣＲにより評価する。ホスホチロシンの効果的な除去は、配列決定、ｑＰＣＲ、またはゲル電気泳動により解析して、最終記録タグ配列にＥ−オリゴヌクレオチドコーディングタグ情報が存在しないことにより示される。
（実施例１３）
コンパートメントタグ付きビーズの調製。
コンパートメントタグ付きビーズを調製するには、ホスホラミダイト合成またはスプリット・アンド・プールライゲーションのいずれかが使用されるスプリット・アンド・プール合成手法を使用して、ビーズに固定化されているオリゴヌクレオチドにバーコードを組み込む。コンパートメントタグは、コンパートメントタグがそれに接合される各ペプチドまたはタンパク質分子を一義的に標識するための一意の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。例示的なコンパートメントタグ配列は、以下の通りである：５’−ＮＨ２−ＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧ−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−ＮＮＮＮＮ−ＴＧＣＡＡＧＧＡＴ−３’（配列番号１７７）。ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号１７８）バーコード配列は、スプリット−プールオンビーズ合成により生成されるビーズ毎の核酸塩基配列の固定集団であり、この固定配列は、ビーズ毎に異なる。ＮＮＮＮＮ（配列番号１７９）配列は、その後それに接合されるペプチド分子の一意の分子識別子（ＵＭＩ）としての役目を果たすように、ビーズ内で無作為化される。バーコード配列は、Ｍａｃｏｓｋｏら（その全体が参照により組み込まれる、２０１５年、Ｃｅｌｌ、１６１巻：１２０２〜１２１４頁）により記載されているようなスプリット・アンド・プール手法を使用して、ビーズ上で合成することができる。ＵＭＩ配列は、縮重塩基混合物（各カップリングステップに存在する４つのホスホラミダイト塩基すべての混合物）を使用して、オリゴヌクレオチドを合成することにより創出することができる。５’−ＮＨ２を、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ末端からＣ末端への配列「ＣＧＧＳＳＧＳＮＨＶ」（配列番号１８０）を有するシステイン含有ブテラーゼＩペプチド基質で活性化し、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０１０年、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ． 第４章：４．４１項）により記載されているような修飾プロトコールを使用して、ＳＭＣＣ活性化コンパートメントタグ付きビーズにカップリングする。すなわち、２００μｌの磁気ビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れる。１ｍｌのカップリング緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４を有する１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．２）をチューブに添加し、短時間ボルテックスする。新たに調製した４０μｌのスルホ−ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、磁気ビーズに添加し、混合する。反応を、室温にて１時間、ロータリーミキサーでインキュベートする。インキュベーション後、磁石でビーズを上清から分離し、５００μｌのカップリング緩衝液で３回洗浄する。ビーズを、４００μｌのカップリング緩衝液に再懸濁する。１ｍＬのＣＧＧＳＳＧＳＮＨＶ（配列番号１８０）ペプチドを磁気ビーズに添加する（ＴＣＥＰ還元（５ｍＭ）および氷冷アセトン沈殿後、カップリング緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ）。反応を、室温にて２時間、ロータリーミキサーでインキュベートする。反応を、カップリング緩衝液で１回洗浄する。４００μｌのクエンチング緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬのメルカプトコハク酸、ｐＨ７．４を有する１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．２）を反応混合物に添加し、ロータリーミキサーで２時間インキュベートする。反応混合物を、カップリング緩衝液で３回洗浄する。得られたビーズを、保管緩衝液（０．０２％ＮａＮ３、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４を含む１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．２）に再懸濁し、４℃で保管する。
（実施例１４）
封入ビーズおよびタンパク質の生成
コンパートメントタグ付きビーズおよびタンパク質を、エンドプロテアーゼＡｓｐＮ（Ｅｎｄｏ ＡｓｐＮ）などの亜鉛メタロ−エンドペプチダーゼ、任意選択の光ケージ化Ｚｎキレート剤（例えば、ＺｉｎｃＣｌｅａｖ Ｉ）、および遺伝子操作された耐熱性ブテラーゼＩホモログ（Ｂａｎｄａｒａ、Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００９年、Ｂａｎｄａｒａ、Ｗａｌｓｈら、２０１１年、Ｃａｏ、Ｎｇｕｙｅｎら、２０１５年）と組み合わせる。実施例１２のコンパートメントタグ付きビーズをタンパク質と混合し、Ｔ字路型マイクロ流体または流動フォーカスデバイス（例えば図２１を参照されたい）で乳化する。二水流構成では、一方の流動中のタンパク質およびＺｎ２＋を、他方の流動からのメタロ−エンドペプチダーゼと組み合わせて、液滴形成時に直ちに消化を開始させることができる。一流動構成では、すべての試薬を予め混合し、一緒に乳化する。これには、任意選択の光ケージ化Ｚｎキレート剤（例えば、ＺｉｎｃＣｌｅａｖ Ｉ）を使用して、液滴形成後に、ＵＶ光への曝露によりタンパク質消化を開始させることが必要である。濃度および流動条件は、１液滴当たりのビーズが平均で１つ未満になるように調整する。最適化された実験では、１０８個のフェムト液滴を、液滴の約１０％がビーズを含有する含有率で製作することができる（Ｓｈｉｍら、２０１３年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、７巻：５９５５〜５９６４頁）。一流動手法では、液滴を形成した後、エマルジョンをＵＶ−３６５ｎｍの光に曝露して光ケージ化Ｚｎ２＋を放出させ、Ｅｎｄｏ ＡｓｐＮプロテアーゼを活性化することにより、プロテアーゼを活性化する。エマルジョンを、３７℃で１時間インキュベートして、タンパク質をペプチドへと消化する。消化した後、エマルジョンを８０℃で１５分間加熱することにより、Ｅｎｄｏ ＡｓｐＮを不活化する。二流動調合では、２つの流動の組み合わせ中に、Ｚｎ２＋を液滴内に導入する。この場合、Ｅｎｄｏ ＡｓｐＮは、キレート剤がＵＶ光への曝露時に活性化される光活性化Ｚｎ２＋ケージ分子を使用することにより、または２−アルキルマロン酸もしくはＥＤＴＡ−ＭＯなどの両親媒性Ｚｎ２＋キレート作用剤を、油相に添加することにより不活化することができる。両親媒性ＥＤＴＡ分子の例としては、ＥＤＴＡ−ＭＯ、ＥＤＴＡ−ＢＯ、ＥＤＴＡ−ＢＰ、ＤＰＴＡ−ＭＯ、ＤＰＴＡ−ＢＯ、ＤＰＴＡ−ＢＰなど（Ｏｊｈａ、Ｓｉｎｇｈら ２０１０年、Ｍｏｇｈａｄｄａｍ、ｄｅ Ｃａｍｐｏら ２０１２年）が挙げられる。また、エマルジョン油に両親媒性の酸または塩基を添加することにより液滴のｐＨを変更することを含む、他のモダリティを使用して、液滴内部の反応を制御することができる。例えば、液滴ｐＨは、水／油に可溶性である酢酸を使用して低下させることができる。フルオロ−エマルジョンへの酢酸の添加は、酢酸分子が両親媒性の性質を持つため、液滴コンパートメント内のｐＨの低下に結び付く（Ｍａｓｈａｇｈｉおよびｖａｎ Ｏｉｊｅｎ、２０１５年、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、５巻：１１８３７頁）。同様に、塩基であるプロピルアミンを添加すると、液滴内部はアルカリ化される。同様の手法を、油／水に可溶性の酸化還元試薬、還元剤、キレート剤、および触媒などの他のタイプの両親媒性分子に使用することができる。
コンパートメント化されたタンパク質をペプチドへと消化した後、ブテラーゼＩまたは化学的ライゲーション（例えば、アルデヒド−アミノなど）を使用して、ペプチドを、ビーズ上のコンパートメントタグにライゲーションする（オリゴヌクレオチドペプチドバーコードキメラ）（例えば図１６および図２２Ａを参照されたい）。任意選択の手法では、オリゴ−チオデプシペプチド「化学的基質」を用いて、ブテラーゼＩライゲーションを不可逆的にする（Ｎｇｕｙｅｎ、Ｃａｏら、２０１５年）。ライゲーションの後、エマルジョンを「クラック」し、コンパートメントタグ付きペプチド構築物が固定化されているビーズをバルクで収集するか、またはコンパートメント付きペプチドをビーズから切断し、バルクで収集する。コンパートメントタグ付きペプチドが固定化されているビーズが記録タグを含む場合、これらビーズは、本明細書に記載されている核酸コーディングに基づくペプチド解析法に直接使用することができる。対照的に、コンパートメントタグ付きペプチドをビーズ基材から切断した場合、コンパートメントタグ付きペプチドを、コンパートメントタグ付きペプチドのＣ末端へのコンジュゲーションにより記録タグに付随させ、その後、本明細書に記載のように、コーディングタグ付き結合性物質との結合サイクルおよび配列決定解析を行うために、固体支持体に固定化する。記録タグとコンパートメントタグ付きペプチドとの付随は、三機能性リンカー分子を使用して達成することができる。サイクルシーケンシング解析を行うために、付随する記録タグを有するコンパートメントタグ付きペプチドを固体支持体に固定化した後、コンパートメント情報を、プライマー伸長またはライゲーションを使用して、付随する記録タグへと移行させる（例えば図２２Ｂを参照されたい）。コンパートメントタグ情報を記録タグに移行させた後、元のペプチド消化で使用されたものと同じ酵素を使用して、コンパートメントタグをペプチドから切断することができる（例えば図２２Ｂを参照されたい）。これにより、ペプチドの元のＮ末端が回復されるため、本明細書に記載のようなＮ末端分解ペプチド配列決定法が可能になる。
（実施例１５）
３プライマー融合エマルジョンＰＣＲにより、アミノ酸特異的コーディングタグで共有結合的に修飾されたペプチドの記録タグを付随させることによるジタグ生成
コンパートメントタグおよび分子ＵＭＩで構成される記録タグを有するペプチドを、コーディングタグ部位特異的化学標識で化学的に修飾する。また、コーディングタグは、修飾ペプチド内の所与のタイプのアミノ酸の数を計数することが可能になるようにＵＭＩを含む。ＴｙｓｏｎおよびＡｒｍｏｒ（ＴｙｓｏｎおよびＡｒｍｏｕｒ、２０１２年）の改変プロトコールを使用して、エマルジョンＰＣＲを、１×ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）ＧＣ反応緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１μＭプライマーＵ１、１μＭプライマーＵ２ｔｒ、２５ｎＭプライマーＳｐ、１４単位のＰＨＵＳＩＯＮ（商標）高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む１００μｌの総水性容積中で調製する。１０μｌの水相を、ＴｕｒｎｅｒおよびＨｕｒｌｅｓ（２００９年、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．、４巻：１７７１〜１７８３頁）により以前に記載されているように、２ｍｌクライオバイアル中の軽油（Ｓｉｇｍａ）に溶解した２００μｌの油相（４．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｓｐａｎ８０、０．４％ｖｏｌ／ｖｏｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に、合計５分間にわたって１０００ｒｐｍで撹拌しながら、５〜１０秒ごとに添加する。得られたエマルジョンの平均液滴サイズは、約５ミクロンだった。Ｔ字路および流動フォーカスの使用などのエマルジョンを生成するための他の方法も用いることができる（Ｂｒｏｕｚｅｓ、Ｍｅｄｋｏｖａら、２００９年）。エマルジョン生成後、１００μｌの水／油混合物を０．５ｍｌのＰＣＲチューブに移し、第１ラウンドの増幅を、以下の条件で実施する：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、７０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を４０サイクル；その後７２℃で５分間の伸長。第２ラウンドの増幅反応を、以下の条件で実施する：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を４０サイクル；その後４℃で維持。ＰＣＲの最終サイクル後できるだけ早く、２００μｌのヘキサン（Ｓｉｇｍａ）をＰＣＲチューブに直接添加し、２０秒間ボルテックスし、１３，０００ｇで３分間遠心分離することにより、エマルジョンを崩壊させる。
（実施例１６）
伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ構築物の配列決定
記録タグまたはコーディングタグのスペーサー（Ｓｐ）またはユニバーサルプライミング部位は、配列の本体に３つの塩基のみ（例えばＡ、Ｃ、およびＴ）および配列の５’末端に第４の塩基（例えば、Ｇ）を使用して設計することができる。合成による配列決定（ＳＢＳ）の場合、これにより、標準的非発光性（ｄａｒｋ）（未標識および非終端化）ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）および単一ｆｆＣ色素標識可逆的ターミネーター（例えば、完全に機能的なシトシン三リン酸塩）のミックスを使用して、スペーサー配列全体にわたって非発光性塩基を迅速に組み込むことが可能になる。このようにすると、関連するエンコーダー配列、一意の分子識別子、コンパートメントタグ、伸長リポータータグの結合サイクル配列、伸長コーディングタグ、またはジタグのみがＳＢＳ配列決定され、無関連のスペーサーまたはユニバーサルプライミング配列は「スキップ」される。スペーサーの塩基および配列の５’末端の第４の塩基の同一性は、変更してもよく、上記の同一性は、例示のために提供されているに過ぎない。
（実施例１７）
タンパク質ライセートの調製。
種々の試料タイプからタンパク質ライセートを製作するための幅広く様々なプロトコールが、当技術分野で公知である。プロトコールの相違点の多くは、細胞タイプ、およびライセート中の抽出されたタンパク質が未変性状態で解析されるかまたは変性状態で解析されるかに依存する。ＮＧＰＡアッセイの場合、天然コンフォメーションのタンパク質または変性タンパク質のいずれも、固体基材に固定化することができる（例えば図３２を参照されたい）。さらに、未変性タンパク質を固定化した後、基材の表面に固定化されたタンパク質を変性させてもよい。変性タンパク質を用いる利点は２つある。第１に、多数の抗体試薬は、線形エピトープ（例えば、ウエスタンブロットＡｂ）に結合し、変性タンパク質は、線形エピトープへのより良好な接近を提供する。第２に、ＮＧＰＡアッセイワークフローは、変性タンパク質を使用すると単純化される。それは、固定化されているタンパク質が既に変性されているため、アルカリ性（例えば、０．１ＮａＯＨ）剥離条件を使用して、アニーリングされたコーディングタグを伸長記録タグから剥離することができるためである。これは、結合事象および情報移行後に、アニーリングされているコーディングタグを酵素的に除去することが必要とされる、天然コンフォメーションのタンパク質を含むアッセイを使用して、アニーリングされているコーディングタグを除去する場合と対照的である。
未変性タンパク質溶解緩衝液の例としては、５０ｍｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロールで構成されるＲＰＰＡ緩衝液；およびＭ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などの市販の緩衝液が挙げられる。変性溶解緩衝液は、５０ｍｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．）、１％ＳＤＳを含む。尿素（１Ｍ〜３Ｍ）またはグアニジンＨＣｌ（１〜８Ｍ）の添加も、タンパク質試料の変性に使用することができる。溶解緩衝液の上記成分に加えて、一般的には、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤も含まれている。プロテアーゼ阻害剤および典型的な濃度の例としては、アプロチニン（ａｐｔｒｏｔｉｎｉｎ）（２μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（５〜１０μｇ／ｍｌ）、ベンズアミジン（１５μｇ／ｍｌ）、ペプスタチンＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、およびＥＧＴＡ（１ｍＭ）が挙げられる。ホスファターゼ阻害剤の例としては、Ｎａピロリン酸塩（１０ｍＭ）、フッ化ナトリウム（５〜１００ｍＭ）、およびオルトバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）が挙げられる。追加の添加剤としては、タンパク質試料からＤＮＡを除去するためのＤＮＡａｓｅＩ、およびジスルフィド結合を還元するためのＤＴＴなどの還元剤を挙げることができる。
組織培養細胞から調製される未変性タンパク質ライセートプロトコールの一例は、以下の通りである。接着細胞をトリプシン処理し（ＰＢＳ中０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ）、遠心分離（２００ｇで５分間）により収集し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄する。プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤および添加剤（例えば、ＥＤＴＡ非含有完全阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｈｏｓＳｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ）で補完された氷冷Ｍ−ＰＥＲ哺乳動物抽出試薬（１０７細胞／１００ｍｍ皿または１５０ｃｍ２フラスコ当たり約１ｍＬ）を添加する。得られた細胞懸濁液を、４℃にて２０分間にわたって回転振とう器でインキュベートし、その後、４℃にて２０分間、約１２，０００ｒｐｍ（細胞タイプに依存する）で遠心分離して、タンパク質上清を単離する。ＢＣＡアッセイを使用してタンパク質を定量化し、ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁する。タンパク質ライセートは、直ちに使用してもよく、または液体窒素で瞬間凍結して、−８０℃で保管してもよい。
ＨｕｇｈｓらのＳＰ３プロトコールに基づく、組織培養細胞から調製される変性タンパク質ライセートプロトコールの一例は、以下の通りである。接着細胞をトリプシン処理し（ＰＢＳ中０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ）、遠心分離（２００ｇで５分間）により収集し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄する。プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤および添加剤（例えば、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））で補完された氷冷変性溶解緩衝液（１０７細胞／１００ｍｍ皿または１５０ｃｍ２フラスコ当たり約１ｍＬ）を添加する。得られた細胞懸濁液を、９５℃で５分間インキュベートし、５分間氷上に置く。ベンゾナーゼヌクレアーゼ（５００Ｕ／ｍｌ）をライセートに添加し、３７℃で３０分間インキュベートしてＤＮＡおよびＲＮＡを除去する。
ライセート１００μｌ当たり５μＬの２００ｍＭ ＤＴＴを添加することによりタンパク質を還元し、４５℃で３０分間インキュベートする。タンパク質システイン基のアルキル化（alklylation)は、ライセート１００μｌ当たり１０μｌの４００ｍＭヨードアセトアミドを添加することにより達成し、２４°で３０分間、暗所でインキュベートする。ライセート１００μｌ当たり１０μｌの２００ｍＭ ＤＴＴを添加することにより、反応をクエンチする。必要に応じて、ライセート１００μｌ当たり２μｌの酸無水物および１００μｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ８．５）を添加することにより、タンパク質をアシル化する。室温で３０分間インキュベートする。「ｉｎ ｖｉｖｏ」でアセチル化されたリシンと、アシル化によるリシン基の「ｉｎ ｓｉｔｕ」ブロッキングとの区別が可能になるように、無水酢酸ではなく、吉草酸無水物、安息香酸無水物、およびプロピオン酸無水物が推奨される（Sidoli,Yuan et al. 2015）。５ｍｇのＴｒｉｓ（２−アミノエチル）アミン、ポリマー（Ｓｉｇｍａ）を添加し、室温で３０分間インキュベーションすることにより反応をクエンチする。ポリマー樹脂は、ライセートを２０００ｇで１分間遠心分離して、０．４５μｍ酢酸セルロースＳｐｉｎ−Ｘチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通過させることにより除去する。ＢＣＡアッセイを使用してタンパク質を定量化し、ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁する。
追加の例では、タンパク質閉じ込め、アルキル化、およびペプチダーゼ消化に、ＭＷＣＯ濾過デバイスが使用される、Ｅｒｄｅらに記載のフィルター支援試料調製（ＦＡＳＰ）プロトコールを使用して標識ペプチドを生成する（Ｅｒｄｅ、Ｌｏｏら ２０１４年、ＦｅｉｓｔおよびＨｕｍｍｏｎ ２０１５年）。
（実施例１８）
分配タグ付きペプチドの生成。
ＤＮＡタグ（任意選択の試料バーコードおよび直交性付着部分を有する）を、標準的バイオコンジュゲーション法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、２０１３年）を使用して、変性ポリペプチドのリシンのε−アミノ基を標識するために使用するか、またはその代わりにベンゾフェノンなどの光親和性標識（ＰＡＬ）法を使用して、ポリペプチドに付着させる（Ｌｉ、Ｌｉｕら、２０１３年）。ポリペプチドのリシン基をまたは無作為にＣＨ基（ＰＡＬにより）をＤＮＡタグで標識し、アシル無水物でのアシル化により未標識基をブロッキングした後、ＤＮＡタグ標識アシル化ポリペプチドを、ユニバーサルプライミング配列、コンパートメントバーコード、任意選択のＵＭＩ、およびポリペプチドに付着したＤＮＡタグの部分に相補的なプライマー配列を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドが付着しているコンパートメントビーズにアニーリングさせる（例えば図３１を参照されたい）。複数のＤＮＡハイブリダイゼーションタグには協同性があるため、単一のポリペプチド分子は、主に単一のビーズと相互作用し、同じコンパートメントバーコードを、ポリペプチド分子のすべてのＤＮＡタグに書き込むことが可能である。アニーリング後、ポリペプチド結合ＤＮＡタグは、アニーリングされたビーズ結合ＤＮＡ配列のポリメラーゼ伸長反応にプライミングする。このように、コンパートメントバーコードおよび他の機能的エレメントは、結合されているポリペプチドに付着したＤＮＡタグに書き込まれる。このステップの完了時には、複数の記録タグがポリペプチドに付着しており、記録タグは、共通スペーサー配列、バーコード配列（例えば、試料、画分、コンパートメント、空間など）、任意選択のＵＭＩ、および他の機能的エレメントを有する。この標識ポリペプチドは、トリプシン、ＧｌｕＣ、プロテイナーゼＫなどの標準的エンドプロテアーゼを使用して、ペプチド断片へと消化することができる。注：リシン標識ポリペプチドの消化にトリプシンを使用する場合、ポリペプチドは、Ａｒｇ残基でのみ切断され、Ｌｙｓ残基では切断されない（Ｌｙｓ残基は標識されているため）。プロテアーゼ消化は、ビーズ上で直接実施してもよく、または標識ポリペプチドをバーコード付きビーズから除去した後で実施してもよい。
（実施例１９）
モデル系のＤＮＡ記録タグ−ペプチドコンジュゲートの調製
５’ＮＨ２基および後にビーズにカップリングするための内部ｍＴｅｔｒａｚｉｎｅ基を有する記録タグオリゴヌクレオチドを合成する（ｍＴｅｔ−ＰＥＧ−Ｎ３ヘテロ二機能性架橋剤により、アルキン−ｄＴをｍＴｅｔｒａｚｉｎｅ−ｄＴに変換する）。オリゴヌクレオチドの５’ＮＨ２を、Williams et al.（Williams and Chaput 2010）に記載されているように、ＬＣ−ＳＭＣＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのＮＨＳ／マレイミドヘテロ二機能性架橋剤を使用して、ペプチドの反応性システインにカップリングする。特に、２０ｎｍｏｌの５’ＮＨ２標識オリゴヌクレオチドをエタノール沈殿し、シリコーン処理チューブ中の１８０μｌリン酸カップリング緩衝液（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）に再懸濁する。５ｍｇのＬＣ−ＳＭＣＣを、１ｍＬのＤＭＦ（５ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁する（アリコートにして−２０で保管）。２０μｌのＬＣ−ＳＭＣＣ（５ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを、１８０μｌの再懸濁したオリゴヌクレオチドに添加し、混合し、室温で１時間インキュベートする。混合物を２回エタノール沈殿する。得られたマレイミド（malemide）誘導体化オリゴヌクレオチドを、２００μｌのリン酸カップリング緩衝液に再懸濁する。システイン残基を含むペプチド（＞９５％純度、脱塩）を、１ｍｇ／ｍｌ（約０．５ｍＭ）でＤＭＳＯに再懸濁する。およそ５０ｎｍｏｌのペプチド（１００μｌ）を、反応ミックスに添加し、室温で一晩インキュベートする。得られたＤＮＡ記録タグ−ペプチドコンジュゲートを、Williamset al.（Williams and Chaput 2010）に記載されているように、未変性ＰＡＧＥを使用して精製する。コンジュゲートを、１００μＭ濃度でシリコーン処理チューブ中のリン酸カップリング緩衝液に再懸濁する。
（実施例２０）
ＤＮＡ−ペプチド固定化用の基材の開発。
一部の実験において、Ｍ−２７０アミン磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、それぞれアルキンまたはメチルテトラジン標識オリゴ−ペプチドコンジュゲートにカップリングすることが可能なアジド誘導体化ビーズまたはＴＣＯ誘導体化ビーズのいずれかに変換することにより、クリック化学固定化に好適な磁気ビーズを創出する（例えば、図２９Ｄ〜２９Ｅ；図３０Ｄ〜３０Ｅを参照されたい）。すなわち、１０ｍｇのＭ−２７０ビーズを、５００μｌのホウ酸緩衝液（１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）で洗浄および再懸濁する。ＴＣＯ−ＰＥＧ（１２−１２０）−ＮＨＳ（Ｎａｎｏｃｓ）およびメチル−ＰＥＧ（１２−１２０）−ＮＨＳの混合物を、１ｍＭでＤＭＳＯに再懸濁し、Ｍ−２７０アミンビーズと共に室温で一晩インキュベートする。メチルのＴＣＯ ＰＥＧに対する比をタイトレーションして、ＴＣＯ部分が＜１００個／ｕｍ２で存在するように、ビーズの最終ＴＣＯ表面密度を調整する（例えば、図３１Ｅ、図３４を参照されたい）。未反応アミン基を、ＤＭＦ中の０．１Ｍ無水酢酸および０．１Ｍ ＤＩＥＡの混合物を用いて（１０ｍｇビーズ毎に５００μｌ）、室温で２時間キャッピングする。キャッピングし、ＤＭＦで３回洗浄した後、ビーズを、１０ｍｇ／ｍｌでリン酸カップリング緩衝液に再懸濁する。
１つの実験では、５’アミノ基修飾および内部アルキン基修飾を含んでいた合計で１０ｎｍｏｌの記録タグを、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭメチルテトラジン−ＰＥＧ４−アジド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）、２．５ｍＭ ＣｕＳＯ４、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、８ｍＭアスコルビン酸ナトリウムで室温にてインキュベートした。１６時間インキュベーションした後、記録タグを、ＬｉＣｌＯ４および８３％アセトンで沈殿させ、その後５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でＡ２６０を測定することにより記録タグ濃度を推定し、１００μＭに調整した。
ＴＣＯ（ｔｒａｎｓ−シクロオクテン）ビーズを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０アミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から調製した。合計で０．４５ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０アミンを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。一方で、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）／ＤＭＦを、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ＭＷ５５０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）／ＤＭＦに対して１：１０２、１：１０３、および１：１０４の比でタイトレーションすることにより、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ／ｍＰＥＧ−ＳＣＭ混合物のＤＭＦ溶液を調製した。合計で１０μｌの個々のＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ／ｍＰＥＧ−ＳＣＭ混合物を、１５０ｕｌの予洗浄ビーズ懸濁物に添加し、室温で３０分間インキュベートして、ビーズを異なる分布のＴＣＯでコーティングした。ＴＣＯコーティングビーズを、１５０μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１５０ｕｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。６．７μＭ ＮＨＳアセテート（ＴＣＩ）で１５分間室温にてインキュベーションすることにより、ビーズの残留アミン基をブロッキングした。得られたビーズを、１５０ｕＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄した。
合計で０．４５ｍｇの個々のＴＣＯ修飾ビーズを、１０μｌの１００ｕＭメチルテトラジン修飾記録タグ溶液に再懸濁し、３０分間室温でインキュベートし、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄した。記録タグ固定化ビーズを、７５μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。
システイン含有ペプチドを、ビーズ上の記録タグの５’アミン基にＳＭ（ＰＥＧ）８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介して付着させた。合計で５μｌの１００ｍＭ ＳＭ（ＰＥＧ）／ＤＭＦ溶液を、１５０μｌのビーズ懸濁物に添加し、室温で３０分間インキュベートした。得られたビーズを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、２０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。合計で６μｌの８ｍＭペプチド／ＤＭＦ溶液を、２０μＬのビーズ懸濁物に添加し、室温で２時間、その後４℃で１６時間インキュベートした。ビーズを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１５０μｌの１０μｇ／ｍｌ Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に再懸濁し、室温で２時間インキュベートして、残留マレイミド基を除去した。ビーズを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、７５μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。
（実施例２１）
記録タグ標識ペプチドの基材への固定化。
解析のため、記録タグ標識ペプチドを、記録タグのｍＴｅｔ基および活性化ビーズまたは基材の表面のＴＣＯ基を使用してＩＥＤＤＡクリック化学反応により、基材に固定化する。この反応は、反応物の入力濃度が低い場合でさえ、迅速および効率的である。さらに、メチルテトラジンを使用することにより、より大きな安定性が結合に付与される（Selvaraj and Fox 2013, Knall, Hollauf et al. 2014, Wu and Devaraj2016）。約５０μｇ〜約２００μｇのＭ−２７０ ＴＣＯビーズを、１００μｌのリン酸カップリング緩衝液に再懸濁する。記録タグにｍＴｅｔ部分を含む５ｐｍｏｌのＤＮＡ記録タグ標識ペプチドを、終濃度が約５０ｎＭになるようにビーズに添加する。反応を、室温にて１時間インキュベートする。固定化した後、基材の未反応ＴＣＯ基を、リン酸カップリング緩衝液中の１ｍＭメチルテトラジン酸で室温にて１時間クエンチする。
ペプチドビーズのバルク調製。５’アミノ基修飾および内部アルキン基修飾を含んでいた合計で１０ｎｍｏｌの記録タグを、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭメチルテトラジン−ＰＥＧ４−アジド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）、２．５ｍＭ ＣｕＳＯ４、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、８ｍＭアスコルビン酸ナトリウムで室温にてインキュベートした。１６時間インキュベーションした後、記録タグを、ＬｉＣｌＯ４および８３％アセトンで沈殿させ、その後５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でＡ２６０を測定することにより記録タグ濃度を推定し、１００μＭに調整した。ＴＣＯ（ｔｒａｎｓ−シクロオクテン）ビーズを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０アミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から調製した。合計で０．４５ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０アミンを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。一方で、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）／ＤＭＦを、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ＭＷ５５０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）／ＤＭＦに対して１：１０２、１：１０３、および１：１０４の比でタイトレーションすることにより、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ／ｍＰＥＧ−ＳＣＭ混合物のＤＭＦ溶液を調製した。合計で１０μｌの個々のＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ／ｍＰＥＧ−ＳＣＭ混合物を、１５０μｌの予洗浄ビーズ懸濁物に添加し、室温で３０分間インキュベートして、ビーズを異なる分布のＴＣＯでコーティングした。ＴＣＯコーティングビーズを、１５０μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。６．７μＭ ＮＨＳアセテート（ＴＣＩ）で１５分間室温にてインキュベーションすることにより、ビーズの残留アミン基をブロッキングした。得られたビーズを、１５０μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄した。合計で０．４５ｍｇの個々のＴＣＯ修飾ビーズを、１０μｌの１００μＭメチルテトラジン修飾記録タグ溶液に再懸濁し、３０分間室温でインキュベートし、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄した。記録タグ固定化ビーズを、７５μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。システイン含有ペプチドを、ＳＭ（ＰＥＧ）８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介してビーズの記録タグの５’アミン基に付着させた。合計で５μｌの１００ｍＭ ＳＭ（ＰＥＧ）／ＤＭＦ溶液を、１５０μｌのビーズ懸濁物に添加し、室温で３０分間インキュベートした。得られたビーズを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、２０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。合計で６μｌの８ｍＭペプチド／ＤＭＦ溶液を、２０μＬのビーズ懸濁物に添加し、室温で２時間、その後４℃で１６時間インキュベートした。ビーズを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１５０μｌの１０μｇ／ｍｌ Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に再懸濁し、室温で２時間インキュベートして、残留マレイミド基を除去した。ビーズを、１５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４で２回洗浄し、７５μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ＮａＰｈｏｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。
（実施例２２）
Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）修飾
化学的ＮＴＡＡアセチル化：
ペプチドのＮＴＡＡを、有機または水性溶液（スルホ−ＮＨＳ−アセテート）中で、無水酢酸またはＮＨＳ−アセテートのいずれかを使用してアセチル化する。無水酢酸誘導体化の場合、ＤＭＦ中１０ｍＭの無水酢酸を、ペプチドと共に室温で３０分間インキュベートする（Ｈａｌｐｉｎ、Ｌｅｅら、２００４年）。あるいは、１００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホネート（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）中５０ｍＭの無水酢酸および１ＭのＮａＣｌを使用して、室温で３０分間、ペプチドを水溶液中でアセチル化する（Ｔｓｅ、Ｓｎｙｄｅｒら、２００８年）。ＮＨＳ−アセテート誘導体化の場合、スルホ−ＮＨＳ−アセテートのストック溶液（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）を調製し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）または１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．４）に、終濃度が５〜１０ｍＭになるように添加し、室温で１０〜３０分間インキュベートする（Ｇｏｏｄｎｏｗ、２０１４年）。
酵素的ＮＴＡＡアセチル化：
以下の条件を使用して、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓに由来するＳｓＡｒｄ１）に曝露することにより、ペプチドのＮＴＡＡを酵素的にアセチル化する。ペプチドを、２μＭのＳｓＡｒｄ１と共に、ＮＡＴ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭアセチル−ＣｏＡ）中で、１０分間６０℃にてインキュベートする（ＣｈａｎｇおよびＨｓｕ、２０１５年）。
化学的ＮＴＡＡアミジン化（グアニジニル化）：
ペプチドを、１０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）チオ尿素、２０ｍＭトリメチルアミン、および１２ｍＭ向山試薬（２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド）のＤＭＦ溶液で、３０分間室温にてインキュベートする。あるいは、ペプチドを、１０ｍＭ １Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩、１０ｍＭ ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液で、３０分間室温にてインキュベートする。標準的脱ブロッキング法を使用して、保護基を除去する。あるいは、ペプチドを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）または１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中１０ｍＭ Ｓ−メチルイソチオ尿素で、３０分間１０℃にてインキュベートする（Ｔｓｅ、Ｓｎｙｄｅｒら、２００８年）。
ＰＩＴＣ標識：
ペプチドを、イオン性液体［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ４］中５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＰＩＴＣで、５分間室温にてインキュベートする。伸長ＤＮＡ記録タグに存在するヌクレオチド塩基の環外アミンの異所標識を最小限に抑えつつ、ＮＴＡＡが定量的にＰＩＴＣで標識されるように、反応時間を最適化する。
ＤＮＦＢ標識：
２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を、メタノール中５ｍｇ／ｍｌのストックとして調製する。溶液は、光から保護し、毎日新しく調製する。１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中０．５〜５．０ｕｇ／ｍｌのＤＮＦＢで、５〜３０分間３７℃にてインキュベーションすることにより、ペプチドを標識する。
ＳＮＦＢ標識：
４−スルホニル−２−ニトロ−フルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）を、メタノール中５ｍｇ／ｍｌのストックとして調製する。溶液は、光から保護し、毎日新しく調製すべきである。１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中０．５〜５．０μｇ／ｍｌのＤＮＦＢで、５〜３０分間３７℃にてインキュベーションすることにより、ペプチドを標識する。
アセチル化ＮＴＡＡペプチドの切断：
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で１０ｕＭのアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）酵素（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来、ＳＳＯ２６９３）と共に、１０分間９０℃にてインキュベーションすることにより、アセチル化ＮＴＡＡをペプチドから切断する（Ｇｏｇｌｉｅｔｔｉｎｏ、Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉら、２０１２年）。
アミジン化ＮＴＡＡペプチドの切断：
アミジン化（グアニジニル化）ＮＴＡＡを、約０．１Ｎ〜約０．５Ｎ ＮａＯＨ中で１０分間３７℃にてインキュベーションすることにより、ペプチドから切断する（Hamada 2016）。
（実施例２３）
モデル系によるコーディングタグ情報の記録タグへの分子内移行の実証
ＤＮＡモデル系を使用して、ビーズに固定化されている記録タグへのコーディングタグ情報の「分子内」移行を試験した（図３６Ａを参照されたい）。２つの異なるタイプの記録タグオリゴヌクレオチドを使用した。ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（配列番号１４１）は、「Ａ」ＤＮＡ捕捉配列（配列番号１５３）（「Ａ’」結合性物質の模倣エピトープ）および対応する「Ａ」バーコード（ｒｔＡ＿ＢＣ）を含んでいた。ｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（配列番号１４２）は、「Ｂ」ＤＮＡ捕捉配列（配列番号１５４）（「Ｂ’」結合性物質の模倣エピトープ）および対応する「Ｂ」バーコード（ｒｔＢ＿ＢＣ）を含んでいた。これらバーコードは、基本的な６５セットの１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）およびそれらのリバース相補的配列（配列番号６６〜１３０）の組合せだった。ｒｔＡ＿ＢＣは、２つのバーコード、ＢＣ＿１およびＢＣ＿２の同鎖上の組合せであり、ｒｔＢ＿ＢＣは、１つのバーコード、ＢＣ＿３のみである。同様に、コーディングタグのバーコード（エンコーダー配列）も、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）の基本的なセットに由来するバーコードで構成されていた。ＣＴ＿Ａ’−ｂｃ＿１ＰＥＧ（配列番号１４４）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（配列番号１４７）コーディングタグは、それぞれ相補的捕捉配列Ａ’およびＢ’で構成され、それぞれ１５ｍｅｒバーコードＢＣ＿５、およびＢＣ＿５＆ＢＣ＿６と割り当てた。記録タグおよびコーディングタグのこの設計設定により、容易なゲル解析が可能になる。所望の「分子内」プライマー伸長は、類似サイズのオリゴヌクレオチド産物を生成するが、望ましくない「分子間」伸長は、「分子内」産物よりも１５塩基大きな１つのオリゴ産物および１５塩基短い別のオリゴ産物を生成する（図３６Ｂ）。
「分子内」対「分子間」情報移行に対する記録タグ密度の効果を評価した。正しい情報移行のためには、「分子間」情報移行（Ａ’コーディングタグはＡ記録タグと結合するが、情報はＢ記録タグへと移行されること、およびその逆）ではなく、「分子内」情報移行（「Ａ’」コーディングタグからＡ記録タグ；Ｂ’コーディングタグからＢ記録タグ）が観察されなければならない。ビーズ表面の記録タグ間隔の効果を試験するために、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチドｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（配列番号１４１）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿ｖ２（配列番号１４２）を１：１の比で混合し、その後、１：０、１：１０、１：１０２、１：１０３、および１：１０４の比で、ｓａＤｕｍｍｙ−Ｔ１０オリゴヌクレオチド（配列番号１４３）に対してタイトレーションした。合計で２０ｐｍｏｌの記録タグオリゴヌクレオチドを、５０μｌの固定化緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ）中で５μｌのＭ２７０ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に、３７℃にて１５分間インキュベートした。ビーズを、１００μｌの固定化緩衝液で３回、室温にて洗浄した。ほとんどのその後の洗浄ステップでは、１００μｌの容積を使用した。ビーズを２５μｌの５×アニーリング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、コーディングタグミックスを添加することにより、コーディングタグ（後のサイクルには、ＤｕｐＣＴ配列との二本鎖アニーリングが必要である）を、ビーズに固定化されている記録タグとアニーリングさせる。６５℃で１分間加熱し、その後室温へと徐々に冷却する（０．２℃／秒）ことにより、コーディングタグを記録タグにアニーリングさせる。あるいは、コーディングタグを、３７℃にてＰＢＳＴ緩衝液中でアニーリングさせてもよい。ビーズを、室温にてＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）で洗浄し、３７℃にて５分間ＰＢＳＴで２回洗浄し、室温にてＰＢＳＴで１回洗浄し、１×アニーリング緩衝液で最終洗浄した。ビーズを、１９．５μｌの伸長緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２５μＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に再懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした。クレノウｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、５Ｕ／μｌ）を、０．１２５Ｕ／μｌの終濃度でビーズに添加し、３７℃で５分間インキュベートした。プライマー伸長後、ビーズを、ＰＢＳＴで２回、および５０μｌの０．１ＮａＯＨで１回室温にて５分間、およびＰＢＳＴで３回、およびＰＢＳで１回洗浄した。下流ＰＣＲアダプター配列Ｒ１’を付加するために、ＥｎｄＣａｐ２Ｔオリゴ（Ｒ１（配列番号１５２）で構成される）を、コーディングタグオリゴヌクレオチドで実施したのと同様に、ハイブリダイズさせ、ビーズ上で伸長させた。アダプター配列を付加した後、最終伸長記録タグオリゴヌクレオチドを、９５％ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で５分間６５℃にてインキュベーションすることにより、ストレプトアビジンビーズから溶出した。溶出産物のおよそ１／１００を、２０μｌにて１８サイクルでＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物の１μｌを、１０％変性ＰＡＧＥゲルで解析した。得られたゲルは、コーディングタグ情報がポリメラーゼ伸長により記録タグに書き込まれるという原理の証明を示し（例えば、図３６Ｃを参照）、ビーズ表面の記録タグ密度を希釈すると、「分子間」伸長事象よりも「分子内」伸長事象を主に生成することができることを示した。
このモデル系では、対応するエンコーダー配列およびユニバーサルリバースプライマー部位を含む記録タグＲＴ＿ＡＢＣおよびＲＴ＿ＢＢＣからのＰＣＲ産物のサイズは、１００塩基対（例えば図３６Ｃを参照されたい）であるが、ｓａＲＴ＿ＡＢＣ（配列番号１４１）／ＣＴ＿Ｂ’ＢＣ（配列番号１４７）およびｓａＲＴ＿ＢＢＣ（配列番号１４２）／ＣＴ＿Ａ’ＢＣ（配列番号１４４）の誤対合による産物は、それぞれ１１５塩基対および８５塩基対である。図３６Ｄに示されているように、ビーズにｓａＲＴ＿ＡＢＣ（配列番号１４１）およびｓａＲＴ＿ＢＢＣ（配列番号１４２）が高密度で存在する場合、３つのバンドが観察された。高密度では、記録タグは、それ自体に結合する近位のコーディングタグ（分子内事象）または近隣の記録タグ（分子間事象）で伸長することが予想された。しかしながら、誤対合による産物のバンドは、ダミーオリゴヌクレオチドの記録タグを希釈することにより減少し、１：１００００の比では消失した。この結果は、記録タグがビーズ表面に低密度で離間されていたため、分子間事象が減少したことを実証した。
/3SpC3/=3'C3(3個炭素)スペーサー
/5Biosg/=5'ビオチン
/iSP18/=18個原子ヘキサ-エチレングリコールスペーサー
（実施例２４）
ナノポアシーケンサーでの伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ構築物の配列決定
ＤＮＡバーコードは、現在の塩基コールエラー率が１０％台またはそれよりも高いナノポアに基づくシーケンサーなどの、非常にエラーを起こしやすいＮＧＳシーケンサーでの使用に耐えるように設計することができる。いくつかのエラー訂正コード系が文献に記載されている。こうしたエラー訂正コード系としては、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎコード、Ｌｅｅコードなどが挙げられる。エラー耐性バーコードは、選択した設計パラメーターに応じて、挿入エラー、欠失エラー、および置換エラーを訂正することが可能なＲ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ「ＤＮＡｂａｒｃｏｄｅｓ」を使用した、ＨａｍｍｉｎｇおよびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎコードに基づいていた（ＢｕｓｃｈｍａｎｎおよびＢｙｓｔｒｙｋｈ、２０１３年）。６５個の異なる１５ｍｅｒ Ｈａｍｍｉｎｇバーコードのセットが、図２７Ａに示されている（配列番号１〜６５に示されており、それらのリバース相補的配列はそれぞれ配列番号６６〜１３０に示されている）。これらのバーコードは、最小Ｈａｍｍｉｎｇ距離が１０であり、４つの置換エラーおよび２つのインデルエラーまでを自己訂正する。これは、１０％のエラー率でのナノポアシーケンサーの正確な読み出しに十分過ぎる程である。さらに、これらのバーコードは、予測ナノポア電流シグネチャを使用して、７７個のオリジナルバーコードのセットから濾過されている（例えば図２７Ｂを参照されたい）。これらのバーコードは、バーコード全体にわたって大きな電流レベル差を示し、そのセットの他のバーコードと極力相関しないように濾過した。このようにすると、これらバーコードを使用したアッセイからの実際の生ナノポア電流レベルプロットを、塩基コールアルゴリズムを使用せずに、予測バーコードシグネチャに対して直接的にマッピングすることができる（Ｌａｓｚｌｏ、Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０１４年）。
ナノポアシーケンシングを使用した伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ構築物の解析を模倣するために、４つのフォワードプライマー（ＤＴＦ１（配列番号１５７）、ＤＴＦ２（配列番号１５８）、ＤＴＦ３（配列番号１５９）、ＤＴＦ４（配列番号１６０））および４つのリバースプライマー（ＤＴＲ９（配列番号１６１）、ＤＴＲ１０（配列番号１６２）、ＤＴＲ１１（配列番号１６３）、ＤＴＲ１２（配列番号１６４））を使用した１５ｍｅｒバーコードの小さなサブセットで構成されるＰＣＲ産物を生成した（例えば図２７Ｃを参照されたい）。この８個プライマーのセットを、隣接するフォワードプライマーＦ１（配列番号１６５）およびリバースプライマーＲ１（配列番号１６６）と共にＰＣＲ反応に含めた。ＤＴＦおよびＤＴＲプライマーは、相補的１５ｍｅｒスペーサー配列（Ｓｐ１５）（配列番号１６７）を介してアニーリングした。４つのＤＴＦフォワードプライマーおよび４つのＤＴＲリバースプライマーの組合せは、１６個の考え得るＰＣＲ産物をもたらす。
ＰＣＲ後、アンプリコンを、平滑末端ライゲーション（例えば、図２７Ｃを参照）により、以下のように鎖状化した：２０μｌのＰＣＲ産物を、２０μｌのＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）と直接混合し、室温で一晩インキュベートした。長さが約０．５〜２ｋｂの得られたライゲーション産物を、Ｚｙｍｏ精製カラムを使用して精製し、２０μｌの水に溶出した。この精製ライゲーション産物の約７μｌを、ＭｉｎＩｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｅｐキット（ＳＱＫ−ＲＡＤ００２）に直接使用し、ＭｉｎＩＯＮ Ｍｋ １Ｂ（Ｒ９．４）デバイスで解析した。品質スコアが７．２（正確性が約８０％）の７３４ｂｐナノポアリードの一例が、図２７Ｄに示されている。配列決定の正確性が不良であるにもかかわらず、ＭｉｎＩｏｎ配列リードに対するバーコードのｌａｌｉｇｎに基づくアラインメントにより示されているように、配列中の多数のバーコードは容易に読み取り可能である（図２７Ｄは、伸長記録タグ構築物の配列である配列番号１６８を示す）。
（実施例２５）
ゲルビーズへの単一細胞の封入
単一細胞を、標準的技法（ＴａｍｍｉｎｅｎおよびＶｉｒｔａ ２０１５年、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｔａｍｍｉｎｅｎら ２０１６年）を使用して、液滴（約５０μｍ）に封入する（例えば図３８を参照されたい）。ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド（２９：１）（３０％ｗ／ｖｏｌ））、ベンゾフェノンメタクリルアミド（ＢＭ）、およびＡＰＳを、細胞と共に不連続相に含有させて、連続油相にＴＥＭＥＤを添加する（液滴内に拡散する）と重合を起こすことが可能な液滴を創出する。ベンゾフェノンを、ポリアクリルアミドゲル液滴のマトリックスに架橋させる。これは、その後のタンパク質とポリアクリルアミドマトリックスとの光親和性架橋を可能にする（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓｐｅｌｋｅら ２０１４年、Ｋａｎｇ、Ｙａｍａｕｃｈｉら ２０１６年）。得られた単一細胞ゲルビーズ内に固定化されたタンパク質を、様々な方法を使用して単一細胞バーコード化することができる。一実施形態では、ＤＮＡタグを、以前に記載されているようなアミン反応性作用剤または光活性ベンゾフェノンＤＮＡタグを使用して化学的にまたは光化学的に、単一細胞ゲルビーズ内の固定化されているタンパク質に付着させる。単一細胞ゲルビーズは、以前に記載されているようなバーコード付きビーズとの同時封入により、バーコードを含む液滴に封入することができ、タンパク質に移行されたＤＮＡバーコードタグまたはその代わりに単一細胞ゲルビーズ内のタンパク質を、Ａｍｉｎｉ、Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈ、およびＧｕｎｄｅｒｓｏｎら（Ａｍｉｎｉ、Ｐｕｓｈｋａｒｅｖら ２０１４年、Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈ、Ｄａｚａら ２０１５年）（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｔｅｅｍｅｒｓら ２０１６年）により記載されているような一連のプール・アンド・スプリットステップによりコンビナトリアル的にインデックス化することができる。最も単純な実行例では、単一細胞ゲルビーズ内のタンパク質を、まず「クリック化学」部分で標識し（例えば図４０を参照されたい）、その後コンビナトリアルＤＮＡバーコードを、プール・アンド・スプリット手法を使用して、タンパク質試料にクリックする。
（実施例２６）
ＤＮＡに基づくモデル系を使用した一本鎖ＤＮＡライゲーションによる情報移行の実証
ＤＮＡモデル系を使用して、ビーズに固定化されている記録タグへのコーディングタグ情報の移行を試験した（例えば、図４６Ａを参照）。２つの異なるタイプの記録タグオリゴヌクレオチドを使用した：５’リン酸化および３’ビオチン化されており、一意の６塩基ＤＮＡバーコードＢＣａ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、および標的結合性「Ｂ」配列を含むｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇ（配列番号１８１）ｓｓＤＮＡ構築物；５’リン酸化および３’ビオチン化されており、一意の６塩基ＤＮＡバーコードＢＣａ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、および標的結合性「Ａ」配列を含むｓａＲＴ＿Ａｂｃａ＿ｓｓＬｉｇ（配列番号１８２）ｓｓＤＮＡ構築物。コーディングタグオリゴヌクレオチドＣＴ＿Ｂ’ｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇ（配列番号１８３）は、Ｂ’配列を含む。記録タグおよびコーディングタグおよび付随する結合性エレメントのこの設計により、容易なゲル解析が可能になる。所望の一本鎖ＤＮＡライゲーション産物を、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で生成し、コーディングタグのＢ’配列を、固体表面に固定されている記録タグのＢ配列とアニーリングさせることより、記録タグの５’リン酸基およびコーディングタグの３’ヒドロキシル基が近接近する。
ＢコーディングタグとＢ記録タグとの特異的な相互作用による情報移行を、ゲル解析により評価した。ｍＰＥＧ−ビオチン、ＭＷ５５０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）を１：１０の比でビオチン化記録タグオリゴヌクレオチドｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿ｓｓＬｉｇまたはｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｓｓＬｉｇでタイトレーションすることにより、表面の記録タグの密度を調整した。合計で２ｐｍｏｌの記録タグオリゴヌクレオチドを、５０μｌの固定化緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ）中で５μｌのＭ２７０ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に、３７℃で１５分間インキュベートし、１５０μｌの固定化緩衝液で１回洗浄し、１５０μｌのＰＢＳＴ＋４０％ホルムアミドで１回洗浄した。モデルアッセイでは、合計で４０ｐｍｏｌのＣＴ＿Ｂ’ｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇを、５μｌの記録タグ固定化ビーズと共に５０μｌのＰＢＳＴ中で１５分間３７℃にてインキュベートした。ビーズを、室温にて１５０μｌのＰＢＳＴ＋４０％ホルムアミドで２回洗浄した。ビーズを、１０μｌのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ反応ミックス（０．０３３Ｍ Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ７．５、０．０６６Ｍ酢酸カリウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５Ｍベタイン、および４Ｕ／μＬ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ）に再懸濁し、２時間４５℃でインキュベートした。ライゲーション反応後、ビーズを、固定化緩衝液＋４０％ホルムアミドで１回、およびＰＢＳＴ＋４０％ホルムアミドで１回洗浄した。１０μｌの９５％ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で５分間６５℃にてインキュベーションすることより、最終伸長記録タグオリゴヌクレオチドをストレプトアビジンビーズから溶出し、２．５μｌの溶出物を１５％ＰＡＧＥ−尿素ゲルにローディングした。
このモデル系では、４７塩基記録タグに由来するライゲーション産物のサイズは９６塩基である（例えば、図４６Ｂを参照）。ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇの存在下ではライゲーション産物バンドが観察されたが、ｓａＲＴ＿Ａｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇの存在下では産物バンドは観察されなかった。この結果は、特異的なＢ／Ｂ’ｓｅｑ結合事象が、記録タグへのコーディングタグの情報移行によりコードされたことを実証した。さらに、第１のサイクルライゲーション産物を、ＵＳＥＲ酵素で処理し、第２の情報移行に使用した。これらの事象は、ゲル解析により観察された（例えば、図４６Ｃを参照）。
/5Phos/=5'リン酸化
/3Bio/=3'ビオチン化
/iSP18/=18個原子ヘキサ-エチレングリコールスペーサー
（実施例２７）
ＤＮＡに基づくモデル系を使用した二本鎖ＤＮＡライゲーションによる情報移行の実証
ＤＮＡモデル系を使用して、ビーズに固定化されている記録タグへのコーディングタグ情報の移行を試験した（図４７Ａを参照）。記録タグオリゴヌクレオチドは２本の鎖で構成される。ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｄｓＬｉｇ（配列番号１８４）は、標的結合性物質Ａ配列、ユニバーサルフォワードプライマー配列、２つの一意の１５塩基ＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２、ならびに４塩基突出を含む５’ビオチン化ＤＮＡであり、Ｂｌｋ＿ＲＴ＿Ａｂｃ＿ｄｓＬｉｇ（配列番号１８５）は、２つの一意の１５塩基ＤＮＡバーコードＢＣ２’およびＢＣ１’、ユニバーサルフォワードプライマー配列を含む５’リン酸化された３’Ｃ３スペーサー修飾ＤＮＡである。二本鎖コーディングタグオリゴヌクレオチドは、２本の鎖で構成される。ｄＵ、一意のＢＣ５、および突出を含む一方の鎖ＣＴ＿Ａ’ｂｃ５＿ｄｓＬｉｇ（配列番号１８６）は、ポリエチレングリコールリンカーを介して標的指向性物質Ａ’配列に連結する。コーディングタグの他方の鎖は、５’ホスフェート、ｄＵ、および一意のバーコードＢＣ５’を含むＤｕｐ＿ＣＴ＿Ａ’ｂｃ５（配列番号１８７）である。記録タグおよびコーディングタグのこの設計設定により、容易なゲル解析が可能になる。コーディングタグの標的指向性物質Ａ’が、固体表面に固定化されている記録タグの標的結合性物質Ａとハイブリダイゼーションすることにより両タグの５’リン酸基および３’ヒドロキシル基が互いに接近すると、所望の二本鎖ＤＮＡライゲーション産物がＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）によりライゲーションされる。
標的結合性物質Ａと標的指向性物質Ａ’との間の特異的相互作用による情報移行を評価した。ビーズ表面の記録タグの間隔をあけるために、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド、Ｂｌｋ＿ＲＴ＿Ａｂｃ＿ｄｓＬｉｇにハイブリダイズされた合計で２ｐｍｏｌのｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｄｓＬｉｇを、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ＭＷ５５０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）に対して１：１０の比でタイトレーションし、５μｌのＭ２７０ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に、５０μｌの固定化緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ）中で１５分間３７℃にてインキュベートした。記録タグ固定化ビーズを、１５０μｌの固定化緩衝液で１回洗浄し、１５０μｌの固定化緩衝液＋４０％ホルムアミドで１回洗浄した。第１のサイクルアッセイでは、合計で４０ｐｍｏｌの二本鎖コーディングタグＣＴ＿Ａ’ｂｃ５＿ｄｓＬｉｇ：Ｄｕｐ＿ＣＴ＿Ａ’ｂｃ５を、５μｌの記録タグ固定化ビーズと共に、５０μｌのＰＢＳＴ中で１５分間３７℃にてインキュベートした。ビーズを、室温にて１５０μｌのＰＢＳＴ＋４０％ホルムアミドで２回洗浄した。ビーズを、１０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ反応ミックス（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、７．５％ＰＡＧ８０００、０．１μｇ／μｌ ＢＳＡ、および２０Ｕ／μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）に再懸濁し、ｒ．ｔ．で６０分間インキュベートした。ライゲーション反応後、ビーズを、固定化緩衝液＋４０％ホルムアミドで１回、およびＰＢＳＴ＋４０％ホルムアミドで１回洗浄した。ビーズをＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）で処理して、二本鎖コーディングタグを除去し、ＣＴ＿Ａ’ｂｃ１３−Ｒ＿ｄｓＬｉｇ：Ｄｕｐ＿ＣＴ＿Ａ’ｂｃ１３−Ｒ＿ｄｓＬｉｇ（それぞれ、配列番号１８８および配列番号１８９）を用いた第２のサイクルライゲーションアッセイに使用した。各処理の後、１０μｌの９５％ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で５分間６５℃にてインキュベーションすることより、二本鎖記録タグをストレプトアビジンビーズから溶出し、２．５μｌの溶出物を１５％ＰＡＧＥ−尿素ゲルにローディングした。
このモデル系では、７６塩基および５４塩基の記録タグと二本鎖コーディングタグとのライゲーション産物のサイズは、それぞれ１１６塩基および１１１塩基である（例えば、図４７Ｂを参照）。第１のサイクルライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）消化で完全に消失させ、第２のサイクルアッセイで使用した。第２のサイクルライゲーション産物バンドが、１５０塩基付近で観察された。これらの結果は、特異的Ａｓｅｑ／Ａ’ｓｅｑ結合事象が、第１のサイクル二本鎖ライゲーションアッセイおよび第２のサイクル二本鎖ライゲーションアッセイでコードされたことを実証した。
/3SpC3/=3'C3(3個炭素)スペーサー
/5Phos/=5'リン酸化
/iSP18/=18個原子ヘキサ-エチレングリコールスペーサー
（実施例２８）
ペプチドおよびＤＮＡに基づくモデル系を使用した連続情報移行サイクルの実証
ペプチドモデル系を使用して、ビーズに固定化されている記録タグ複合体へのコーディングタグ情報の第１のサイクル移行を試験した（例えば、図４８Ａを参照）。ＰＡペプチド配列（配列番号１９５）を、ビーズに固定化されている記録タグオリゴヌクレオチドａｍＲＴ＿Ａｂｃ（配列番号１９０）に付着させた。ａｍＲＴ＿Ａｂｃ配列は、「Ａ」ＤＮＡ捕捉配列（「Ａ’」結合性物質の模倣エピトープ）および対応する「Ａ」バーコード（ｒｔＡ−ＢＣ）を含む。ｒｔＡ＿ＢＣ配列は、２つのバーコードＢＣ＿１およびＢＣ＿２（配列番号１〜６５）の同鎖上の組合せである。結合性物質については、抗ＰＡ抗体を、１５ｍｅｒのバーコードＢＣ５（配列番号６６〜１３０）を含むコーディングタグオリゴヌクレオチドａｍＣＴ＿ｂｃ５（配列番号１９１）に付着させた。さらに、ＤＮＡモデル系を使用して、記録タグへのコーディングタグ情報の第２のサイクル移行を試験した（例えば、図４８Ｂを参照）。ＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３は相補的捕捉配列Ａ’を含み、１５ｍｅｒのバーコードＢＣ５（配列番号：６６〜１３０）を割り当てた。この設計は、特異的プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅後の容易なゲル解析を可能にする。
内部アルキン修飾記録タグオリゴヌクレオチドａｍＲＴ＿Ａｂｃ（配列番号１９０）を、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−アジド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）で修飾した。ビーズ表面の記録タグの密度を制御するため、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）をｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ＭＷ５５０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）に対して１：１０２、１：１０３、および１：１０４の比でタイトレーションすることにより誘導体化（derivitized）されたＭ−２７０アミンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から、種々の密度の機能性カップリング部位（ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ＴＣＯ）を有するビーズを調製した。メチルテトラジン修飾ａｍＲＴ＿Ａｂｃ記録タグを、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）−誘導体化ビーズに付着させた。Ｃｙｓ含有ペプチドを、ＳＭ（ＰＥＧ）８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介してビーズ上のａｍＲＴ＿Ａｂｃの５’アミン基に付着させた。抗ＰＡ抗体（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とａｍＣＴ＿ｂｃ５コーディングタグとのコンジュゲーションは、タンパク質−オリゴヌクレオチドコンジュゲーションキット（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を使用して達成した。手短に言えば、ａｍＣＴ＿ｂｃ５の５’アミン基をＳ−４ＦＢで修飾し、その後０．５ｍＬのＺｅｂａカラムで脱塩した。抗ＰＡ抗体をＳ−ＨｙＮｉｃで修飾し、その後０．５ｍＬのＺｅｂａカラムで脱塩した。最後に、４ＦＢ修飾ａｍＣＴ＿ｂｃ５およびＨｙＮｉｃ修飾抗ＰＡ抗体を混合して、抗体−コーディングタグコンジュゲートを調製し、その後Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してサイズ排除を行った。
第１のサイクル結合アッセイでは、５μｌのペプチド−記録タグ（ＲＴ）固定化ビーズを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１５分間ｒ．ｔ．にてインキュベートして、ビーズをブロッキングした。合計で２ｐｍｏｌの抗体−コーディングタグコンジュゲートを、５μｌのペプチド−記録タグ固定化ビーズと共に、５０μｌのＰＢＳＴ中で３０分間３７℃にてインキュベートした。ビーズを、室温にて１０００μｌのＰＢＳＴ＋３０％ホルムアミドで２回洗浄した。ビーズを、５０μｌの伸長反応マスターミックス（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２５μＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および０．０５Ｕ／μＬクレノウｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ）に再懸濁し、５分間３７℃でインキュベートした。プライマー伸長後、ビーズを、固定化緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、３０％ホルムアミド）で１回、５０μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで５分間室温にて１回、およびＰＢＳＴ＋３０％ホルムアミドで１回、およびＰＢＳで１回洗浄した。第２の結合サイクルアッセイでは、ＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３を使用して、記録タグ内のその同種Ａ配列に結合させ、第１のサイクル伸長記録タグの伸長が、第２のサイクルコーディングタグ配列上で伸長することを可能にした。伸長させた後、最終伸長記録タグオリゴヌクレオチドを、特異的プライマーを有する２０μｌのＰＣＲ混合物中でＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物の１μｌを１０％ＰＡＧＥゲルで解析した。得られたゲルは、コーディングタグ情報がポリメラーゼ伸長により記録タグに書き込まれるという原理の証明を示す（図４８Ｃ〜Ｅ）。
図４８Ａに示されているモデル系では、プライマーセットＰ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２を使用した、記録タグａｍＲＴ＿Ａｂｃに由来するＰＣＲ産物のサイズは、５６塩基対である。図４８Ｃに示されているように、ａｍＲＴ＿Ａｂｃ密度依存性バンド強度が観察された。抗ＰＡ抗体−ａｍＣＴ＿ｂｃ５コンジュゲートによる第１のサイクル結合アッセイでは、同種ＰＡタグ固定化ビーズをアッセイに使用した場合、８０塩基対ＰＣＲ産物の強いバンドが観察されたが、非同種アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）またはナノタグ固定化ビーズを使用した場合、ＰＣＲ産物収量は最小限だったことが観察された（例えば、図４８Ｄを参照）。ＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３コーディングタグに付着されたＡ’ＤＮＡタグを用いた第２の結合アッセイでは（例えば、図４８Ｂを参照）、ペプチド記録タグコンジュゲートの３つ変種はすべて、アニーリングされたＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３配列上で伸長する。図４８Ｅに示されているように、ペプチド固定化ビーズすべてで、元の記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）の第２のサイクル伸長にのみに対応する、ＰＣＲ産物の比較的強いバンドが１１７塩基対で観察された。ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用した場合にのみ、第１の伸長記録タグの第２の伸長（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に対応するバンドが、９３塩基対で観察された。こうした結果は、特異的ペプチド／抗体およびＡｓｅｑ／Ａ’ｓｅｑ結合事象が、それぞれ第１のサイクルアッセイおよび第２のサイクルアッセイでコードされたことを実証した。
/3SpC3/=3'C3(3個炭素)スペーサー
/i5OctdU/=5'-オクタジイニルdU
/iSP18/=18個原子ヘキサ-エチレングリコールスペーサー
（実施例２９）
ｍＲＮＡディスプレイを使用した、ＤＮＡ記録タグによるタンパク質またはペプチドの標識
ＰＣＲにより、各ＤＮＡコード付きタンパク質の３’末端に個々のバーコードを設置し、バーコード付きＤＮＡをプールする。増幅したＤＮＡプールを、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して転写する。転写反応物を、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してクリーンアップし、ＮａｎｏＤｒｏｐ ３０００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化する。ＤＮＡアダプターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して、ｍＲＮＡの３’末端に付着させる。ライゲーションしたｍＲＮＡ分子を、１０％ＴＢＥ−尿素変性ゲルを使用して精製する。ｍＲＮＡ−ピューロマイシン分子を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓキット（ＮＥＢ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳中、リボソームの停止により、ピューロマイシン残基が、リボソームＡ部位に進入し、タンパク質のＣ末端に付着して、タンパク質−ｍＲＮＡ融合体を創出することが可能になる。タンパク質−ｍＲＮＡ融合を、シリカビーズに付着された相補的オリゴヌクレオチドで捕捉する。ｍＲＮＡ部分を、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＮＥＢ）を使用してｃＤＮＡに変換する。タンパク質−ｃＤＮＡ／ＲＮＡプールを、ＲＮａｓｅ Ｈ（ＮＥＢ）およびＲＮａｓｅカクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理して、タンパク質−ｃＤＮＡを生成し、その後カットアウトフィルターで精製する。ｃＤＮＡのＩＩ型制限部位に相補的な配列を添加して二本鎖を形成させ、制限酵素と共にインキュベートして、ｃＤＮＡの３’末端にスペーサー配列（Ｓｐ）を生成する。プールの一部を、開始タンパク質−ｃＤＮＡプール中のタンパク質表示を特徴付けるための配列決定に使用する。
（実施例３０）
リボソームディスプレイに基づくタンパク質バーコード付与
比較的小規模のタンパク質ライブラリー（例えば、この研究では＜２００個）の場合、バーコード付きプライマーを用いて個々のＰＣＲ反応を実施することにより、バーコード付与配列をＤＮＡ鋳型に導入することができる。バーコード付き線形ＤＮＡ鋳型をプールし、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７キット（ＮＥＢ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写する。転写したｍＲＮＡを、ＤＮＡ−ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化する。ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを生成するために、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で０．１０μＭ ｍＲＮＡ、１μＭ ５’−アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）およびデスチオビオチン修飾プライマー、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０Ｕ／μＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を３０分間５０℃でインキュベートすることにより、ｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを、イソプロパノール沈殿により濃縮し、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ストレプトアビジン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で精製する。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓΔリボソームキット（ＮＥＢ）を適用して、Ｅ．ｃｏｌｉリボソームにタンパク質を提示させる。典型的には、０．４０μＭ ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドおよび０．３０μＭリボソームを有する２５０μＬのＩＶＴ反応を３０分間３７℃にてインキュベートし、２５０μＬの氷冷緩衝液ＨＫＭ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭ ＫＯＡｃ、２５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．２５Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を添加することによりクエンチし、１０分間遠心分離（１４，０００ｇ、４℃）して不溶性成分を除去する。常に氷上でまたはコールドルームで維持したＰＲＭＣ複合体を、２段階Ｆｌａｇタグおよびデスチオビオチンタグ親和性精製に供して、全長のバーコード付き標的タンパク質を濃縮する。したがって、タンパク質は、１００μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡおよび１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡで補完された緩衝液ＨＫＭでブロッキングされている抗Ｆｌａｇ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびストレプトアビジン磁気ビーズを使用して逐次的に精製する。結合したタンパク質を、１００ｇ／ｍｌ Ｆｌａｇペプチドまたは５ｍＭビオチンを含む緩衝液ＨＫＭで溶出し、それらのバーコード付きＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで定量化する。
（実施例３１）
コード付きＯＢＯＣ手法を使用したリガンド結合アッセイ
図５４は、付随するコーディングタグと共にビーズに固定化されている小分子リガンドを、記録タグ標識タンパク質（例えば、ＩＶＴＴ生成タンパク質−記録タグ複合体）のプールと接触させ、コーディングタグと記録タグとの間の情報移行により結合情報が記録されるリガンド結合アッセイを示す。図５４Ａは、MacConnell et al.（MacConnell, McEnaney et al. 2015）に記載のように作製したＤＮＡコード付き１ビーズ１化合物（ＯＤＢＣ）ビーズの構築を示す。コーディングタグは、ユニバーサルプライマー部位Ｒ１’、ＤＮＡにコードされるライブラリーバーコード（ＤＥＬ ＢＣ）、および情報移行を容易にするためのスペーサー配列（Ｓｐ’）で構成される。図５４Ｂは、タンパク質（または他の巨大分子）が、固体支持体（例えばビーズ）に付着されているリガンド結合性物質と結合した後の、コーディングタグ（または記録タグ）から記録タグ（またはコーディングタグ）への情報の書き込みの概要を示す。図５４Ｃは、プライマー伸長を使用して、リガンド結合性物質のコーディングタグの識別情報を、タンパク質に付随する記録タグへと移行して伸長記録タグを生成するための、伸長記録タグの例示的な構築を示す。記録タグは、相補的スペーサー配列（Ｓｐ）を介してコーディングタグにアニーリングし、プライマー伸長反応は、スペーサー（Ｓｐ）をプライミング部位として使用してコーディングタグ情報の記録タグへの移行を媒介し、それにより伸長記録タグを生成する。一意のＤＮＡにコードされるライブラリーエンコーダー配列または結合性物質に関する識別情報を有するバーコードを含むコーディングタグは、ユニバーサルプライミング部位Ｒ１’により隣接されており、必要に応じて一方の末端が情報移行に有用な共通スペーサー配列（Ｓｐ’）により隣接されている。あるいは、巨大分子が結合性物質／リガンドに結合した後にコーディングタグから記録タグに情報を書き込むのではなく、図５４Ｄは、ＵＭＩ配列（例えば、特定のペプチドまたはタンパク質分子を識別する）および少なくとも１つのバーコード（例えば、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、空間的位置バーコードなど）を含む記録タグからコーディングタグへと情報を移行させ、それにより伸長コーディングタグを生成するための例示的な構築を示す。
（実施例３２）
コーディングタグから記録タグへと情報を書き込むことによる結合物質ダウンＮＧＰＳアッセイ
図５５Ａ〜５５Ｃは、巨大分子を結合性物質に結合させ、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されている単一の結合性物質の部位に共局在化されている複数のコーディングタグのうちの個々のコーディングタグの情報を、巨大分子に付着されている記録タグへと移行させ、それにより所与の巨大分子の時間的結合履歴を表す、コーディングタグを含む伸長記録タグを産生する複数サイクルのプロセスを示す。この図では、例示のために過ぎないが、巨大分子は、ペプチドであり、各ラウンドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を結合性物質に結合させること、コーディングタグ情報を記録タグに移行させることにより結合事象を記録すること、サイクル特異的タグ情報を記録タグに移行させることにより結合事象順序を記録し、その後そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。図５５Ａは、結合性物質と共にビーズに共局在化されている複数のコーディングタグ（エンコーダを含む）を示す。ペプチドは、記録タグ（ユニバーサルフォワードプライミング配列およびＵＭＩを含む）に付着されている。個々のコーディングタグは、伸長反応をプライミングして、コーディングタグ情報を記録タグへと移行するために使用することができる、結合性物質のコーディングタグ内の共通スペーサー配列（Ｓｐ）に相補的な共通スペーサー配列（Ｓｐ’）を有する。結合サイクル１中に、ペプチドの第１の遊離ＮＴＡＡが、ＮＴＡＡ結合性物質に結合し、第１のコーディングタグの情報が、プライマー伸長により記録タグに移行する。結合サイクル１後に、伸長記録タグに付着されたペプチドが、サイクル１タグ付与に使用される。記録タグ内のユニバーサルフォワードプライミング部位（Ｕ１）が、相補的配列（Ｕ１’）に結合し、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されたＵ１’の部位に共局在化されている複数のサイクル１特異的配列のうちの個々のサイクル１特異的配列の情報が、ペプチドに付着されている記録タグへと移行し、それにより所与の巨大分子の時間的結合順序を表す、サイクル１特異的配列を含む伸長記録タグが産生される。ＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させると、ペプチドの第２の遊離ＮＴＡＡがＮＴＡＡ結合性物質に結合し、第２のコーディングタグの情報がプライマー伸長により記録タグに移行する。こうしたサイクルを「ｎ」結合サイクルまで繰り返し、最後の伸長記録タグを、ユニバーサルリバースプライミング配列でキャッピングする。各エンコーディングステップの後でサイクル特異的タグ付与が行われるため、結合サイクル情報を、得られる伸長記録タグの結合性物質情報と関連付けることができる。図５５Ｂは、各ＮＴＡＡ結合物質および各サイクルタグ付与のＤＮＡエンコーディングのための複数カラムの全体的なワークフローの例を示す。図５５Ｃは、結合（「．．．」は、伸長記録タグに示されていないその間の結合サイクルを表わす）、およびコーディングタグ情報の移行、および３’末端へのユニバーサルプライミング部位の付加の「ｎ」回のサイクル後に産生される最終伸長記録タグを示す。
（実施例３３）
記録タグからコーディングタグへと情報を書き込むことによる結合物質ダウンＮＧＰＳアッセイ
図５６Ａ〜５６Ｃは、巨大分子を結合性物質に結合させ、巨大分子に付着されている記録タグの情報を、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されている単一の結合性物質の部位に共局在化されている複数のコーディングタグのうちの個々のコーディングタグに移行させ、それにより結合性物質を集合的に表す複数の伸長コーディングタグを生成する複数サイクルのプロセスを示す。この図では、例示のために過ぎないが、結合性物質は、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合性物質であり、各ラウンドは、ペプチドのＮＴＡＡを結合性物質に結合させること、記録タグ情報をコーディングタグに移行させることにより結合事象を記録すること、サイクル特異的タグ情報をコーディングタグに移行させることにより結合事象順序を記録し、その後そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。図５６Ａは、結合性物質と共に固体支持体に共局在化されている複数のコーディングタグ（ユニバーサルフォワードプライミング配列およびエンコーダーを含む）を示す。巨大分子は、記録タグ（ＵＭＩおよびサイクルタグ付与のためのスペーサー配列を含む）に付着されている。個々のコーディングタグは、伸長反応をプライミングして、記録タグ情報をコーディングタグへと移行するために使用することができる、結合性物質のコーディングタグ内のスペーサー配列（Ｓｐ’）に相補的なスペーサー配列（Ｓｐ）を有する。結合サイクル１中に、ペプチドの第１の遊離ＮＴＡＡが、ＮＴＡＡ結合性物質に結合し、第１の記録タグの情報およびＳｐ２配列が、相補的Ｓｐ１スペーサー配列とハイブリダイズしたＳｐ１’配列からプライマー伸長によりコーディングタグへと移行する。結合サイクル１の後、サイクル１特異的配列が、相補的Ｓｐ２スペーサー配列とハイブリダイズしたＳｐ２’配列からプライマー伸長によりコーディングタグへと移行し、それにより所与の巨大分子の時間的結合順序を表す、サイクル１特異的配列を含む伸長コーディングタグが産生される。ＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させると、ペプチドの第２のＮＴＡＡがＮＴＡＡ結合性物質に結合し、第２の記録タグの情報がプライマー伸長によりコーディングタグに移行する。こうしたサイクルを、「ｎ」結合サイクルまで繰り返す。各エンコーディングステップの後でサイクル特異的タグ付与が行われるため、結合サイクル情報を、得られる伸長コーディングタグの結合性物質情報と関連付けることができる。図５６Ｂは、各ＮＴＡＡ結合物質および各サイクル付与のＤＮＡエンコーディングのための複数のカラムの全体的なワークフローの例を示す。図５６Ｃは、「ｎ」サイクルの結合後に産生される伸長記録タグを示し、それを、エンコーダー、サイクル特異的配列、およびＵＭＩを含む伸長コーディングタグ情報に基づいて組み立てると、巨大分子の順序付けられた配列を提供することができる。
（実施例３４）
複数サイクル結合／エンコーディングアッセイ
ペプチドモデル系を使用して、コーディングタグに由来する情報が、ビーズに固定化されている記録タグに移行される３サイクルのエンコーディングを試験した（図５７）。ＰＡペプチド配列（配列番号１９５）を、ビーズに固定化されている記録タグオリゴヌクレオチドａｍＲＴ＿Ｂｂｃ（配列番号２１３）に付着させた。ａｍＲＴ＿Ｂｂｃ配列は、ＢＣ＿３（配列番号：６６〜１３０）を含む。結合性物質の場合、抗ＰＡ抗体（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、それぞれ１５ｍｅｒのバーコードＢＣ４、ＢＣ５、およびＢＣ１３Ｒ１（配列番号：６６〜１３０）を含むコーディングタグオリゴヌクレオチドａｍＣＴ＿ｂｃ４、ａｍＣＴ＿ｂｃ５、およびａｍＣＴ＿ｂｃ１３ｒ１（配列番号２０８〜２１０）に付着させた。この設計は、特異的プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅後のゲル解析を容易にする。
磁気アッセイビーズの生成−２段階プロセス。
ＤＮＡ記録タグ−ペプチドキメラを、キメラを単一ユニットとしてカップリングするのではなく、記録タグを固定化した後にペプチドをカップリングすること以外は、図３４に記載の１段階アッセイビーズプロセスと同様の２段階固定化プロセスを使用して、制御された密度で磁気ビーズに固定化した。すなわち、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）を、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ＭＷ５５０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）に対して１：１０３の比でタイトレーションすることにより、Ｍ−２７０アミンＤｙｎａｂｅａｄｓビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）基でまばらに表面機能化した。過剰なアミン基を、ＮＨＳ−アセテートでキャッピングした。２段階キメラ固定化プロセスでは、内部アルキン修飾および５’アミン修飾を含む二機能性ＤＮＡ記録タグを、まず内部アルキンオリゴヌクレオチド修飾因子をｍＴｅｔに変換し、その後ＴＣＯビーズに直接カップリングすることによりＴＣＯビーズに固定化し、その後ペプチドを記録タグオリゴの５’アミンにカップリングした。具体的には、内部アルキン修飾記録タグオリゴヌクレオチドを、ｍＴｅｔ−ＰＥＧ４−アジド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）で修飾し、その後ＴＣＯ誘導体化ビーズに付着させる。ペプチドをビーズ上の５’アミン記録タグにカップリングするために、システイン含有ペプチドを、固定化された記録タグの５’アミン基にＮＨＳ−ＰＥＧ８−Ｍａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介して付着させる。
コーディングタグ標識ＰＡ抗体の生成
抗ＰＡ抗体とコーディングタグ（ａｍＣＴ＿ｂｃ４、またはａｍＣＴ＿ｂｃ５、またはａｍＣＴ＿ｂｃ１３ｒ１オリゴヌクレオチド）とのコンジュゲーションは、タンパク質−オリゴヌクレオチドコンジュゲーションキット（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を使用して達成した。手短に言えば、コーディングタグの５’アミン基をＳ−４ＦＢで修飾し、その後０．５ｍＬのＺｅｂａカラムで脱塩した。抗ＰＡ抗体をＳ−ＨｙＮｉｃで修飾し、その後０．５ｍＬのＺｅｂａカラムで脱塩した。最後に、４ＦＢ修飾コーディングタグおよびＨｙＮｉｃ修飾抗ＰＡ抗体を混合して、抗体−コーディングタグコンジュゲートを調製し、その後０．５ｍＬのＺｅｂａカラムを使用して脱塩した。
抗体に基づく結合／エンコーディングアッセイ：
ＰＡペプチド−記録タグａｍＲＴ＿Ｂｂｃ（配列番号２１３）ビーズを、上記に記載のように調製した。第１のサイクル結合アッセイでは、１００万個のビーズを、まず、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１５分間室温（ｒ．ｔ．）にてインキュベートすることによりブロッキングした。４０ｎＭのコーディングタグ（ＢＣ４）標識ＰＡ抗体を、アッセイビーズと共に５０ｕｌのＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中で３０分間３７℃にてインキュベートした。ビーズを、１０％ホルムアミドを含む１ｍｌのＰＢＳＴで１回ｒ．ｔ．にて洗浄した。ビーズを、５０ｕｌの伸長反応マスターミックス（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２５ｕＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および０．０５Ｕ／ｕＬクレノウｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ）に再懸濁し、５分間３７℃でインキュベートした。プライマー伸長後、ビーズを、１５０ｕｌのＰＢＳＴ／１０％ホルムアミドで１回、１５０ｕｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで１回５分間、１５０ｕｌのＰＢＳＴ／１０％ホルムアミドで１回、および５０ｕｌのＰＢＳＴで１回洗浄した（ｒ．ｔ．にて）。第２および第３の結合サイクルアッセイでは（図５７を参照）、コーディングタグ（ＢＣ５）標識ＰＡ抗体およびコーディングタグ（ＢＣ１３）標識ＰＡ抗体を、それぞれ結合／エンコーディングアッセイに使用した。第３のエンコーディングサイクル伸長の後、最終伸長記録タグを、バーコード特異的プライマーを有する２０ｕｌのＰＣＲ混合物でＰＣＲ増幅し、１ｕｌのＰＣＲ産物を１０％ＰＡＧＥゲルで解析した。得られたゲルは、結合、およびポリメラーゼ伸長によるコーディングタグ情報の記録タグへの書き込みの３サイクルの原理の証明を示す（図５７Ｂを参照）。ゲル解析に加えて、第３の結合アッセイ後に生成された伸長記録タグをプライマーで増幅して、ＮＧＳシーケンシングライブラリーを生成した。得られたライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。結果は図５７Ｃに示されている。７８％よりも多くの伸長記録タグが３つのバーコードを含んでいた。これは、段階的エンコーディングが比較的効率的だったことを示す。
（実施例３５）
アッセイブロッキングオリゴによるエンコーディングの増強（図３および図３６Ａも参照されたい）
様々なＤＮＡブロッカーを３サイクルエンコーディングアッセイに使用して、エンコーディング効率に対する効果を評価し、結合およびエンコーディングのオリゴモデル系を評価した（図５８）。記録タグオリゴヌクレオチドａｍＲＴ＿Ｂｂｃ（配列番号２１３）を、以前に記載のようにビーズに固定化した。この記録タグ配列は、「Ｂ」ＤＮＡ捕捉配列（「Ｂ’」結合性物質の模倣エピトープ）およびＢＣ＿３バーコード（配列番号１〜６５）を含む。このモデル系では、結合物質−コーディングタグは、ＤＮＡコーディングタグに追加されたＢ相補的配列（Ｂ’）を有するオリゴヌクレオチドを用いる。３つのタイプのＤＮＡブロッカーを試験した（図５８Ａ）。ＣＴブロッカーは、コーディングタグ５’Ｓｐ’領域およびバーコード配列とハイブリダイズする。３’Ｓｐ’配列は、アニーリングのために空いている。記録タグでは、Ｓｐ’ブロッカーおよびＲＴブロッカーは、それぞれ記録タグのＳｐスペーサー配列およびＳｐ−バーコードにハイブリダイズする。エンコーディング後、伸長記録タグをＰＣＲ増幅し、ＰＡＧＥを使用して解析した。図５８Ｂに示されているように、ＣＴブロッカーの存在下での３サイクルに由来するＰＣＲ産物では、第３のサイクルでエンコードされたバンドが観察されたが、Ｓｐ’ブロッカーまたはＲＴブロッカー単独の存在下では観察されなかった。このデータは、ＣＴブロッカーが、コーディングタグ情報の記録タグへの効率的な移行を容易にすることを示した。
（実施例３６）
伸長記録タグ増幅中の鋳型スイッチングの最小化
ＰＣＲ中の鋳型スイッチングを、２つの伸長記録タグオリゴヌクレオチドモデル鋳型ＴＳ＿Ｃｔｒｌ１（配列番号２１１）およびＴＳ＿Ｃｔｒｌ４（配列番号２１２）を使用して評価した（図５９Ａ）。こうしたモデル鋳型は、共通Ｓｐ配列およびバーコード配列を共有し、伸長記録タグ鋳型構造を模倣するように設計した。図５９Ａに示されているモデル鋳型を１：１比で混合し、種々の温度で異なるポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅した。鋳型スイッチング率を、１０％ＰＡＧＥゲルを使用したＰＣＲ産物の解析により、またＮＧＳ読み出し（図示せず）により評価した。
詳しくは、上記の２つの鋳型の１０ｆｍｏｌ １：１混合物を、図５９に示されているようなＦｗｄプライマーおよびＲｅｖプライマーを使用して１０ｕｌのＰＣＲ反応中で増幅し、１０％ＰＡＧＥでゲルを解析し、またＭｉＳｅｑ ＤＮＡシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＮＧＳにより解析した。以下のポリメラーゼの鋳型スイッチング率を、５０〜６８℃のアニーリング温度窓にわたってアッセイした：Ｑ５ホットスタート（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔａｑ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅホットスタート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）。図５９に示されているように、ＴＳ＿Ｃｔｒｌ１およびＴＳ＿Ｃｔｒｌ４に由来するＰＣＲ産物に対応する２つの主要バンド（１２５ｂｐおよび１７３ｂｐ）が観察された。鋳型スイッチング副産物バンドは、ゲルのより低い分子量のバンドにより示されるように、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−を含む複数のポリメラーゼで観察されたが（図５９Ｂを参照）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（図５９Ｂを参照）およびＫＯＤ ＸｔｒｅｍｅホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（データは示さず）では最小化された。その後これらのポリメラーゼを、ＮＧＳでより詳細に解析した。ＮＧＳは、ＴａｑおよびＫＯＤ ＸｔｒｅｍｅホットスタートＤＮＡポリメラーゼでは、鋳型スイッチングを示すマッピングされたリード割合がそれぞれ５．６％および２．４％だったことを示した。
（実施例３７）
完全サイクルＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅペプチド配列決定アッセイの実証。
１サイクルＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅ ＮＧＰＳアッセイの実証が図６０に記載されている。本発明者らのＮ末端機能化およびＮ末端除去（ＮＴＦ／ＮＴＥ）試薬によるペプチドのＮ末端アミノ酸の除去を、２サイクルのＦ−結合物質結合アッセイにより検出した（図６０を参照）。内部ＰＡペプチド配列を有するＮ末端ＦＡ、ＡＦ、およびＡペプチド（配列番号２０１、２０２、および２０３）を、実施例１に記載の２段階プロセスを使用して、ビーズに固定化されている記録タグオリゴヌクレオチドａｍＲＴ＿Ｃｂｃ（配列番号２１４）に個々に付着させた。
Ｆ−結合物質と、コーディングタグａｍＣＴ＿ｂｃ４およびａｍＣＴ＿ｂｃ５（配列番号２０８、２０９）とのコンジュゲーションを、以前に記載のようなＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質カップリング法を使用して達成した。手短に言えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合したＦ−結合物質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＰＢＳで透析した。Ｃｙｓ含有ペプチドＳｐｙＴａｇ（配列番号１９８）を、ＳＭ（ＰＥＧ）２４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介してａｍＣＴ＿ｂｃ４およびａｍＣＴ＿ｂｃ５の５’アミンに付着させた。最後に、ＳｐｙＴａｇ修飾コーディングタグおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合Ｆ−結合物質を混合して、Ｆ−結合物質−コーディングタグコンジュゲートを調製した。
２サイクルのＦ結合およびエンコーディング、プレＮＴＦ／ＮＴＥ化学、およびポストＮＴＦ／ＮＴＥ化学を実施した。結合およびエンコーディングアッセイを実施例１に記載のように実施した。第１のサイクルＦ−結合物質結合／エンコーディングアッセイの後、アッセイビーズをＮＴＦ／ＮＴＥ試薬による処理に供して、ＮＴＡＡを除去した。ＮＴＦ処理の場合、アッセイビーズを、１５０ｕｌの１５ｍＭ Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ＴＦＡ−ピラゾール−１−カルボキサミジン（Ｓｉｇｍａ）と共に０．５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ８．５／アセトニトリル（１：１）、０．０５％Ｆ−１２７中で１時間５０℃にてインキュベートした。ビーズを、２００ｕｌの０．５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ８．５／アセトニトリル（１：１）、０．０５％Ｆ−１２７で３回洗浄した。ＮＴＥ処理は、アッセイビーズを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１５０ｕｌの０．５Ｍ ＮａＯＨで１時間４０℃にてインキュベートすることにより実施した。ビーズを、１０％ホルムアミドを含む１ｍｌのＰＢＳＴで洗浄し、Ｆ−結合物質−コーディングタグでの第２のサイクルＦ−結合物質結合アッセイに使用した。Ｆ−結合物質を、プレ化学対ポスト化学結合／エンコーディングサイクルのために、異なるサイクル特異的バーコードコーディングタグとコンジュゲートした。アッセイの伸長記録タグをＮＧＳで解析した。ＮＧＳ結果は、第１のサイクルでは、Ｆ−結合物質によりＦＡペプチドが検出されるが、ＡＦペプチドの検出は最小限であり、対照的に、第２のサイクルでは、ＮＴＦ／ＮＴＥ処理後、Ｆ−結合物質によりＡＦペプチドがより高い効率で検出されるが、ＦＡペプチドの検出は不良であることを示す。要約すると、化学処理の前後でＦ−結合物質エンコーディングがおよそ４倍増加したことがＡＦペプチド−記録タグで検出され、一方では、化学処理前後でＦＡペプチドにおけるＦ−結合物質エンコーディングがおよそ４分の１に減少したことは、ＤＮＡエンコーディングを使用した単一サイクルペプチド配列決定の原理の証明を効果的に示す。
（実施例３８）
掛け合い応答測定
図３６は、ビーズ上のＤＮＡモデル系キメラ密度を使用する効果および分子間掛け合い応答を示す。本発明者らは、ｍＴｅｔ誘導体化カルボキシルＭ２７０−Ｄｙｎａｌビーズ上のペプチド−ＲＴキメラの表面タイトレーションを使用して、４−ｐｌｅｘペプチド−記録タグ（ＲＴ）掛け合い応答モデル系を発生した。ビーズ表面上のペプチド−ＲＴキメラの密度を制御するために、機能性カップリング部位（メチルテトラジン、ｍＴｅｔ）を有するビーズを、ＮＨ２−ＰＥＧ４−メチルテトラジン（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）を、１：１００、１：１０００、１：１００００、および１：１０００００の比で、ｍ−ＰＥＧ４アミン（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）に対してタイトレーションすることにより、活性化Ｍ−２７０カルボキシルＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から誘導体化した。ＴＣＯ／ｍＴｅｔカップリングにより、４−ｐｌｅｘ、無ペプチド、ＦＡ、ＡＡ、およびＡＦペプチド付着記録タグを、１：１００、１：１０００、１：１００００、および１：１０００００の比でビーズに固定化した。
１セットのペプチド−ＲＴキメラを、まず、ＴＣＯ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）にカップリングすることによってＲＴオリゴヌクレオチドの５’アミンを「活性化する」ことにより創出した。ＴＣＯ活性化後、内部アルキン基を用いて設計されたＲＴオリゴヌクレオチドを、アジド含有ＦＡ、ＡＡ、およびＡＦペプチドにカップリングした。Ｎ末端ＦＡ、ＡＡ、およびＡＦアミノ酸配列ならびに内部ＰＡエピトープを有するペプチド（配列番号１９５）を、それぞれ記録タグオリゴヌクレオチドａｍＲＴ＿Ｃｓ２、ａｍＲＴ＿Ｃｓ４、およびａｍＲＴ＿Ｃｓ５（配列番号２１６〜２１８）に個々に付着させた。第４の記録タグａｍＲＴ＿Ｃｓ１（配列番号２１５）は、無ペプチド対照として含まれていた。Ｆ−結合物質結合性物質を、８ｍｅｒのバーコードＢＣ＿ｓ７（配列番号２２０）を含むコーディングタグオリゴヌクレオチドａｍＣＴ＿ｓ７（配列番号２１９）にコンジュゲートした。４つのキメラ（ＦＡペプチド、ＡＡペプチド、ＡＦペプチド、および無ペプチド）を、ｉＥＤＤＡ ＴＣＯ−ｍＴｅｔ化学を使用して、ｍＴｅｔビーズと組み合わせ、固定化した。Ｆ−結合物質コーディングタグ構築物を実施例４に記載のように創出した。
記録タグ間の掛け合い応答アッセイシグナルを、４−ｐｌｅｘアッセイビーズでの１サイクルＦ−結合／エンコーディングアッセイにより検出した（図６１を参照）。アッセイ条件は、２００ｎＭ Ｆ−結合物質結合性物質を用いたこと以外は、実施例１に記載の通りだった。４つの異なるキメラの絶対ローディング量を、ユニバーサルＰＡ抗体を用いた結合／エンコーディングの第２のサイクルにより測定し、３つのペプチドタイプすべてがＰＡ抗原配列を含んでいた。図６１Ａは、４つのキメラがすべて、ほぼ等しい量でビーズにローディングされたことを示す。特異的エンコーディングは、伸長記録タグのバーコードのＮＧＳ読み出しにより決定される、Ｎ末端Ｆ−ペプチド記録タグのＦ−結合物質エンコーディングにより識別した。掛け合い応答は、Ｎ末端非Ｆ（ＡＡペプチド、ＡＦペプチド、および無ペプチド）ペプチド記録タグのＦ−結合物質エンコーディングにより識別した。図６１Ｂに示されているように、１：１００および１：１０００活性部位ビーズでは、キメラ記録タグはすべてＦ−結合物質バーコードを受け取ったが、１：１００００および１：１０００００ビーズでは、ＦＡ記録タグのみがＦ−結合物質バーコードを受け取った。データは、高記録タグ密度ビーズ（１：１００および１：１０００）では分子間ならびに分子内エンコーディングが生じ、より低密度ビーズ（１：１０，０００および１：１００，０００）では分子内エンコーディングのみが生じたことを示した。結論として、このモデル系は、密度がまばらなビーズでの分子内単一分子結合およびエンコーディングを実証した。なお、この例の密度タイトレーションは、異なるビーズ化学を用いたため、実施例３６のＤＮＡモデル系とは直接相関しない。
（実施例３９）
塩基が保護されたＤＮＡでのエンコーディング
また、本発明者らのＮＴＦ／ＮＴＥエドマン様化学の課題は、高反応性ＮＴＦ試薬が、ペプチドのＮ末端アミンの修飾に加えて、ＤＮＡの核酸塩基の環外および他のアミン基も修飾する場合があるということである。ＤＮＡ修飾は、アッセイのＤＮＡのエンコーディング機能を損なう場合がある。ＤＮＡの修飾は、核酸塩基が保護されたＤＮＡを使用することにより大幅に低減することができる。この手法は、ＮＴＡＡ基の迅速な修飾を容易にする非常に幅広いセットの化学反応および反応条件の使用を可能にする。
核酸塩基が保護されたＤＮＡを用いた上記の手法を実施するための１つ課題は、ほとんどの核酸塩基保護基が、プライマー伸長および複数のライゲーションエンコーディングアッセイに有用な前提条件であるＤＮＡのハイブリッド形成能力を低減させることである。
驚くべきことに、ＤＮＡエンコーディングプロセスにおける保護ｓｓＤＮＡの使用は、完全に保護されたオリゴヌクレオチドを共にライゲーションするｓｓＤＮＡリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを使用することにより可能になる。本発明者らは、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅが、ライゲーション接合部のいずれかの側（３’または５’）に天然「Ｔ」オリゴヌクレオチドスペーサー配列を有する完全に保護されたオリゴヌクレオチドをライゲーションする能力を試験した。本発明者らは、５’側のＴスペーサーの非存在下で、ライゲーション接合部に直に隣接する保護Ｇ塩基を使用して、効率的なライゲーションを達成することができたことを見出した。３’側には天然Ｔスペーサーを使用した。
オリゴモデル系を使用して、ビーズに固定化されている記録タグ複合体へのコーディングタグ情報の第１のサイクル移行を試験した（図６２を参照）。ＰＲＴ＿０Ｔ＿Ｂ’＿ｂｉｏを、ストレプトアビジン機能化ビーズに対する強力なビオチンストレプトアビジン相互作用を使用してビーズに固定化した。ＰＲＴ＿０Ｔ＿Ｂ’＿ｂｉｏ配列は、「Ｂ’」ＤＮＡ捕捉配列（「Ｂ」結合性物質の模倣エピトープ）ならびに保護ｄＡ、ｄＧ、およびｄＣを含む対応する「Ｂ’」バーコードを含有する。結合性物質では、相補的「Ｂ」結合配列ＣＴ＿Ｂ＿ｔｈｉｏ（配列番号２０６）を、ヘテロ二機能性リンカーを介して、保護ｄＡ、ｄＧ、およびｄＣを含むコーディングタグオリゴヌクレオチドＰＣＴ＿１Ｔ（配列番号２０７）にカップリングした。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを使用した一本鎖ライゲーションにより特異的Ｂｓｅｑ／Ｂ’ｓｅｑ結合事象をエンコーディングし、ゲル解析で確認した。
チオール含有「Ｂ’」配列ＲＴ＿ｔｈｉｏ＿Ｂ’＿ｂｉｏ（配列番号２０４）を、ＳＭ（ＰＥＧ）８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介してＰＲＴ＿０Ｔ（ｄＵ）（配列番号２０５）の５’アミン基に付着させ、得られた記録タグＰＲＴ＿０Ｔ＿Ｂ’ｂｉｏを１５％変性ＰＡＧＥで精製した。ｍＰＥＧ−ビオチン、ＭＷ１０００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）に対して１：１０の比でタイトレーションすることにより誘導体化されたＭ−２７０ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に記録タグを固定化した。ビーズをＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理して、記録タグ−５’ホスフェートＧの５’末端にリン酸化部位を生成した。「Ｂ」結合配列Ｂ＿ｔｈｉｏとＰＣＴ＿１Ｔとのコンジュゲーションを、ＳＭ（ＰＥＧ）８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介して連結し、コーディングタグコンジュゲートを、１５％変性ＰＡＧＥで精製した。
第１のサイクル結合アッセイは、８００ｎＭのコーディングタグコンジュゲートを、５’リン酸化記録タグ固定化ビーズと共に５０ｕｌのＰＢＳＴ中で３０分間３７℃にてインキュベートした以外は、以前に記載したものと同様であった。ビーズを、４０％ホルムアミドを含む５０ｕｌのＰＢＳＴで２回、および５０ｕｌの３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５で１回、室温にて洗浄した。ビーズを、５０ｕｌのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩライゲーション反応マスターミックス（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ７．５、６６ｍＭ酢酸カリウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１Ｍベタイン、および０．２５Ｕ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））に再懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。ライゲーション反応後、ビーズを、固定化緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、４０％ホルムアミド）で１回、４０％ホルムアミドを含むＰＢＳＴで１回洗浄した。９５％ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で５分間６５℃にてインキュベートすることにより、記録タグをビーズから溶出した。溶出したコンジュゲートを、ＰＡＧＥゲルで解析した。得られたゲルでは、図６２のレーン４のバンドがシフトしており、これは、一本鎖ＤＮＡライゲーションを使用して保護ｄＡ、ｄＣ、およびｄＧ塩基を含む記録タグにコードタグ情報を書き込む原理の証明を示す（図６２を参照）。
（実施例４０）
ＤＮＡビーズとのハイブリダイゼーションおよびライゲーションを使用した、ＤＮＡタグ付きペプチドの固定化
ビーズに対するペプチド−記録タグＤＮＡキメラの効率的な固定化は、ＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイの重要な部分であり、化学的に達成することができるが、ハイブリダイゼーション捕捉および酵素的または化学的ライゲーションにより実施することもできる。本発明者らは、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉が、化学カップリングよりも約１０，０００倍効率的であることを見出した。このように、本発明者らは、ＤＮＡ捕捉ビーズに対するＤＮＡタグ付きペプチドのハイブリダイゼーションおよび酵素的ライゲーション固定化の有用性を実証した。
ＤＮＡ−ペプチドキメラを、磁気ビーズに化学的に固定化されたヘアピン捕捉ＤＮＡにハイブリダイズおよびライゲーションさせた（図６３を参照）。捕捉ＤＮＡを、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）およびメチルテトラジン（ｍＴｅｔ）に基づくクリック化学を使用してビーズにコンジュゲートした。ＴＣＯ修飾短鎖ヘアピンＤＮＡ（１６塩基対ステム、２４塩基５突出）を、ｍＴｅｔコーディング磁気ビーズと反応させた。リン酸化ＤＮＡ−ペプチドキメラ（１ｎＭ）を、５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ中でヘアピンＤＮＡビーズとアニーリングさせ、３０分間３７℃にてインキュベートした。ビーズを、ＰＢＳＴで１回洗浄し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを有するおよび有していない１×Ｑｕｉｃｋライゲーション溶液（ＮＥＢ）に再懸濁した。２５℃で３０分間インキュベーションした後、ビーズを、ＰＢＳＴで１回洗浄し、２０ｕｌのＰＢＳＴに再懸濁した。全捕捉ＤＮＡ、ＤＮＡタグ付きペプチド、およびライゲーションＤＮＡタグ付きペプチドを、特異的なプライマーセットを使用してｑＰＣＲで定量化した（図６３Ｄ）。図６３Ｅに示されているように、ビーズ／ＤＮＡペプチドハイブリッドを用いたｑＰＣＲでは、リガーゼの存在下でのみ低Ｃｔ値が得られた。これは、ＤＮＡタグ付きペプチドが、ビーズに効果的にライゲーションおよび固定化されたことを示す。
/3SpC3/=3'C3(3個炭素)スペーサー
/i5OctdU/=5'-オクタジイニルdU
/iSP18/=18個原子ヘキサ-エチレングリコールスペーサー
5ProtP=5'シアノエチル保護ホスフェート
3ProtP=3'シアノエチル保護ホスフェート
*=保護された塩基(Bz-dA、ibu-dG、Ac-dC)
本開示は、特定の開示された実施形態の範囲に限定されないことが意図されている。そうした実施形態は、例えば本発明の種々の態様を例示するために提供されている。記載されている組成物および方法の種々の改変は、本明細書の説明および教示から明白になるであろう。そのような変異は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱せずに実施することができ、本開示の範囲以内に入ることが意図されている。上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に対してなすことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲においては、使用されている用語は、特許請求の範囲を、本明細書および本特許請求の範囲で開示されている特定の実施形態に限定するものとは解釈されるべきでなく、考え得るすべての実施形態ならびにそのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の完全な範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (80)

  1. （ａ）
    （ｉ）生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットであって、各生物学的標的に、前記生物学的標的を識別するエンコーディングバーコードを必要に応じて含む記録タグが直接または間接的に付随している、生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットを、
    （ｉｉ）作用物質のライブラリーであって、各作用物質が、少なくとも１つの別々の支持体に固定化されており、別々の支持体のそれぞれが、前記支持体に固定化された前記作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグをさらに含む、作用物質のライブラリーと
    接触させるステップと；
    （ｂ）
    （ｉ）前記作用物質の１つまたは複数と（直接または間接的に）結合および／または（直接または間接的に）反応する各生物学的標的に付随する前記記録タグと、
    （ｉｉ）前記１つまたは複数の作用物質のコーディングタグと
    の間の情報の移行を可能にするステップであって、
    前記情報の移行により、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
    （ｃ）前記伸長記録タグおよび／または前記伸長コーディングタグを解析し、それにより、前記生物学的標的のセットと前記作用物質のライブラリーとの間の相互作用（複数可）をアッセイするステップと
    を含む方法。
  2. 別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ作用物質の複数の分子および／または同じコーディングタグの複数の分子が固定化されている、請求項１に記載の方法。
  3. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された作用物質と前記固定化されたコーディングタグが、コンジュゲートまたは複合体を形成している、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記固定化された作用物質および／または前記固定化されたコーディングタグが、前記支持体に直接固定化されている、請求項３に記載の方法。
  5. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された作用物質および前記固定化されたコーディングタグが、前記支持体に（直接または間接的に）独立に固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
  6. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された作用物質と前記固定化されたコーディングタグがリンカーによって（直接または間接的に、共有結合によりまたは非共有結合により）接続されており、前記リンカーが前記支持体に（直接または間接的に）固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
  7. 前記作用物質のライブラリーが、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
  8. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記コーディングタグの固定化された分子の密度が、前記作用物質の固定化された分子の密度と等しいまたはそれよりも大きい、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記コーディングタグの固定化された分子の密度が、前記作用物質の固定化された分子の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれよりも大きい、請求項８に記載の方法。
  10. 少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグを生成する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
  11. 少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長コーディングタグを生成する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記コーディングタグからの情報と前記記録タグからの情報とを含む少なくとも１つのジタグ構築物が生成される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記生物学的標的の少なくとも１つが、前記作用物質の２つまたはそれよりも多くと結合および／または反応する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記伸長記録タグまたは前記伸長コーディングタグが、前記２つまたはそれよりも多くの作用物質に関する識別情報を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記生物学的標的の少なくとも１つに２つまたはそれよりも多くの記録タグが付随しており、前記２つまたはそれよりも多くの記録タグが同じであっても異なってもよい、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
  16. 少なくとも１つの別々の支持体が、同じ作用物質についての２つまたはそれよりも多くのコーディングタグを含み、前記２つまたはそれよりも多くのコーディングタグが同じであっても異なってもよい、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記生物学的標的のセットが、プロテオームまたはそのサブセットを含み、
    必要に応じて、タンパク質のセットが、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記プロテオームのサブセットが、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／またはニトロシル化）によって規定されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（または脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記生物学的標的のセットが、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、例えば、酵母、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウイルス、例えば、ＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記生物学的標的のセットが、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含み、例えば、前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記記録タグが、前記生物学的標的を識別するエンコーディングバーコード、試料バーコード、コンパートメントバーコード、分配バーコード、エラー訂正バーコード、またはこれらの任意の組合せなどのバーコードを含む、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記別々の支持体が、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体であり、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記別々の支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 生物学的標的−作用物質結合マトリックスを創出するために、前記生物学的標的のセットと前記作用物質のライブラリーとの間の相互作用を並行解析するための、請求項１から４２までのいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記マトリックスのサイズが、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、またはそれよりも大きい、例えば、約２×１０１３である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記コーディングタグが、前記作用物質を識別するエンコーダー配列を含む、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記コーディングタグが、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記作用物質と前記コーディングタグが、リンカーまたは結合対によって接合されている、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記作用物質と前記コーディングタグが、前記別々の支持体上に共局在している、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
  38. 別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ作用物質の複数の分子および／または同じコーディングタグの複数の分子が固定化されており、前記分子が、共局在していてよく、互いに低密度に間隔をあける必要はない、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
  39. （ａ）
    （ｉ）生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットであって、各生物学的標的が、少なくとも１つの別々の支持体に固定化されており、別々の支持体のそれぞれが、前記支持体に固定化された前記生物学的標的に関する識別情報を含む記録タグをさらに含む、生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）のセットを
    （ｉｉ）作用物質のライブラリーであって、各作用物質に作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグが直接または間接的に付随している、作用物質のライブラリー
    と
    接触させるステップと；
    （ｂ）
    （ｉ）前記作用物質の１つまたは複数と（直接または間接的に）結合および／または（直接または間接的に）反応する各生物学的標的に付随する前記記録タグと、
    （ｉｉ）前記１つまたは複数の作用物質のコーディングタグと
    の間の情報の移行を可能にするステップであって、
    前記情報の移行により、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
    （ｃ）前記伸長記録タグおよび／または前記伸長コーディングタグを解析し、それにより、前記生物学的標的のセットと前記作用物質のライブラリーとの間の相互作用（複数可）をアッセイするステップと
    を含む方法。
  40. 別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ生物学的標的の複数の分子および／または同じ記録タグの複数の分子が固定化されている、請求項３９に記載の方法。
  41. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された生物学的標的と前記固定化された記録タグがコンジュゲートまたは複合体を形成している、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記固定化された生物学的標的および／または前記固定化された記録タグが、前記支持体に直接固定化されている、請求項４１に記載の方法。
  43. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された生物学的標的および前記固定化された記録タグが前記支持体に（直接または間接的に）独立に固定化されている、請求項３９または４０に記載の方法。
  44. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された生物学的標的と前記固定化された記録タグがリンカーによって（直接または間接的に、共有結合によりまたは非共有結合により）接続されており、前記リンカーが前記支持体に（直接または間接的に）固定化されている、請求項３９または４０に記載の方法。
  45. 前記作用物質のライブラリーが、小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチド、またはＤ−ペプチドのペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー）、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３９から４４までのいずれか一項に記載の方法。
  46. 別々の支持体のそれぞれにおいて、前記固定化された記録タグの分子の密度が、前記固定化された生物学的標的の分子の密度と等しいまたはそれよりも大きい、請求項３９から４５までのいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記固定化された記録タグの分子の密度が、前記固定化された生物学的標的の分子の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれよりも大きい、請求項４６に記載の方法。
  48. 少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグを生成する、請求項３９から４７までのいずれか一項に記載の方法。
  49. 少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに情報が移行され、それにより、少なくとも１つの伸長コーディングタグを生成する、請求項３９から４７までのいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記コーディングタグからの情報と前記記録タグからの情報とを含む少なくとも１つのジタグ構築物が生成される、請求項３９から４９までのいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記生物学的標的の少なくとも１つが、前記作用物質の２つまたはそれよりも多くと結合および／または反応する、請求項３９から５０までのいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記伸長記録タグまたは前記伸長コーディングタグが、前記２つまたはそれよりも多くの作用物質に関する識別情報を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記生物学的標的の少なくとも１つに２つまたはそれよりも多くの記録タグが付随しており、前記２つまたはそれよりも多くの記録タグが同じであっても異なってもよい、請求項３９から５２までのいずれか一項に記載の方法。
  54. 少なくとも１つの別々の支持体が、同じ生物学的標的についての２つまたはそれよりも多くの記録タグを含み、前記２つまたはそれよりも多くの記録タグが同じであっても異なってもよい、請求項３９から５３までのいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成される、請求項３９から５４までのいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記生物学的標的のセットが、プロテオームまたはそのサブセットを含み、
    必要に応じて、前記タンパク質のセットが、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して作製される、請求項３９から５５までのいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記プロテオームのサブセットが、カイノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加、および／またはニトロシル化）によって規定されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−カイノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生段階、または生理的もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞周期、分化（または脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移などの細胞プロセスに関連するプロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記生物学的標的のセットが、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、例えば、酵母、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウイルス、例えば、ＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来する、請求項３９から５７までのいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記生物学的標的のセットが、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、請求項３９から５８までのいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、請求項３９から５９までのいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項３９から６０までのいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含み、例えば、前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、請求項３９から６１までのいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項３９から６２までのいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記記録タグが、前記生物学的標的を識別するエンコーディングバーコード、試料バーコード、コンパートメントバーコード、分配バーコード、エラー訂正バーコード、またはこれらの任意の組合せなどのバーコードを含む、請求項３９から６３までのいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、請求項３９から６４までのいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記別々の支持体が、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟性固体支持体などの固体支持体であり、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、請求項３９から６５までのいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記別々の支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子、および／または銀ナノ粒子などの金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３９から６６までのいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 生物学的標的−作用物質結合マトリックスを創出するために、前記生物学的標的のセットと前記作用物質のライブラリーとの間の相互作用を並行解析するための、請求項３９から６８までのいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記マトリックスのサイズが、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、またはそれよりも大きい、例えば、約２×１０１３である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、請求項３９から７０までのいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記コーディングタグが、前記作用物質を識別するエンコーダー配列を含む、請求項３９から７１までのいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記コーディングタグが、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３９から７２までのいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記作用物質と前記コーディングタグが、リンカーまたは結合対によって接合されている、請求項３９から７３までのいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記生物学的標的と前記記録タグが、前記別々の支持体上に共局在している、請求項３９から７４までのいずれか一項に記載の方法。
  76. 別々の支持体のそれぞれにおいて、同じ生物学的標的の複数の分子および／または同じ記録タグの複数の分子が固定化されており、前記分子が、共局在していてよく、互いに低密度に間隔をあける必要はない、請求項３９から７５までのいずれか一項に記載の方法。
  77. （ａ）（ｉ）第１のユニバーサルプライマー配列を含む記録タグが直接または間接的に付随する生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）を、（ｉｉ）第１の支持体に固定化された作用物質と接触させるステップであって、前記第１の支持体が、前記支持体に固定化された前記作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグをさらに含む、ステップと；
    （ｂ）前記生物学的標的と前記固定化された作用物質との間の結合および／または反応時に前記記録タグと前記コーディングタグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、前記情報の移行により、前記生物学的標的に付随する伸長記録タグが生成する、ステップと；
    （ｃ）前記伸長記録タグを、サイクル特異的タグおよび第２のユニバーサルプライマー配列と接触させるステップであって、サイクル特異的タグおよび第２のユニバーサルプライマー配列の両方が第２の支持体に固定化されており、前記第１のユニバーサルプライマー配列および前記第２のユニバーサルプライマー配列の全部または一部が互いと相補的である、ステップと；
    （ｄ）前記固定化されたサイクル特異的タグと前記伸長記録タグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、前記情報の移行により、前記生物学的標的に付随するさらなる伸長記録タグが生成する、ステップと；
    （ｅ）前記コーディングタグおよび前記サイクル特異的タグからの情報を含む前記さらなる伸長記録タグを解析するステップと
    を含み、ステップ（ｅ）の前にステップ（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことができる方法。
  78. （ａ）（ｉ）記録タグが直接または間接的に付随した生物学的標的（例えば、タンパク質またはポリペプチド）を、（ｉｉ）支持体に固定化された作用物質であって、前記支持体が、前記支持体に固定化された前記作用物質に関する識別情報を含むコーディングタグをさらに含む、作用物質と接触させるステップと；
    （ｂ）前記生物学的標的と前記固定化された作用物質との間の結合および／または反応時に前記記録タグと前記コーディングタグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、前記情報の移行により、前記支持体に固定化された伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
    （ｃ）前記伸長コーディングタグをサイクル特異的タグと接触させるステップと；
    （ｄ）前記伸長コーディングタグと前記サイクル特異的タグとの間の情報の移行を可能にするステップであって、前記情報の移行により、前記支持体に固定化されたさらなる伸長コーディングタグが生成する、ステップと；
    （ｅ）前記記録タグおよび前記サイクル特異的タグからの情報を含む前記さらなる伸長コーディングタを解析するステップと；
    を含み、ステップ（ｅ）の前にステップ（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことができる方法。
  79. 前記情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介性反応（例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せによって達成される、請求項７７または７８に記載の方法。
  80. 請求項１から７９までのいずれかに記載の方法において開示および／もしくは使用されている任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的または生物学的）、作用物質、構造（例えば、支持体、表面、粒子、またはビーズ）、反応中間体、反応産物、結合複合体、または任意の他の製造品、またはこれらの任意の組合せを含むキット。
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