ES2954284T3 - Los compuestos de cumarina y sus usos como etiquetas fluorescentes - Google Patents

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Abstract

La presente solicitud se refiere a nuevos compuestos de cumarina y sus usos como marcadores fluorescentes. Los compuestos pueden usarse como marcadores fluorescentes para nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Los compuestos de cumarina y sus usos como etiquetas fluorescentes
Campo
La presente solicitud se refiere a compuestos de cumarina. Los compuestos pueden utilizarse como etiquetas fluorescentes, particularmente para el etiquetado de nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de los ácidos nucleicos.
Antecedentes
La detección no radiactiva de ácidos nucleicos que utilizan etiquetas fluorescentes es una tecnología importante en la biología molecular. Numerosos procedimientos empleados en la tecnología de ADN recombinante se basaron previamente en el uso de nucleótidos o polinucleótidos etiquetados radioactivamente con, por ejemplo, 32P. Los compuestos radiactivos permiten la detección sensible de ácidos nucleicos y otras moléculas de interés. Sin embargo, existen graves limitaciones en el uso de isótopos radiactivos, como su gasto, su vida útil limitada y, más importante, las razones de seguridad. La eliminación de la necesidad de etiquetas radiactivas mejora la seguridad, al tiempo que reduce el impacto medioambiental y los costes asociados, por ejemplo, con la eliminación de los reactivos. Los métodos susceptibles de detección fluorescente no radiactiva incluyen, a modo de ejemplo no limitante, la secuenciación automatizada del ADN, los métodos de hibridación, la detección en tiempo real de productos de reacción de la cadena de la polimerasa, e inmunoensayos.
Para muchas aplicaciones es deseable emplear varias etiquetas fluorescentes espectralmente distinguibles para lograr la detección independiente de una pluralidad de analitos superpuestos espacialmente. En dichos métodos multiplexados, la cantidad de recipientes donde se producen reacciones puede reducirse para simplificar los protocolos experimentales y facilitar la producción de kits de reactivos específicos de la aplicación. En los sistemas multicolor automatizados de secuenciación del ADN, por ejemplo, la detección fluorescente multiplexada permite analizar varias bases de nucleótidos diferentes en un solo carril de electroforesis. Esto aumenta el rendimiento respecto de los sistemas de detección que emplean un solo color, y también puede reducir las incertidumbres asociadas a las variaciones de movilidad electroforética entre los carriles.
Sin embargo, la detección fluorescente multiplexada puede ser problemática y hay una serie de factores importantes que restringen la selección de las etiquetas fluorescentes. En primer lugar, es difícil encontrar compuestos de colorante cuyos espectros de absorción y emisión se resuelvan espectralmente. Además, cuando se emplean varios colorantes fluorescentes juntos, la excitación simultánea puede ser difícil, porque las bandas de absorción de los colorantes en las diferentes regiones espectrales pueden separarse ampliamente. Muchos métodos de excitación utilizan láseres de alta potencia y, por lo tanto, el colorante debe tener una fotoestabilidad suficiente para resistir dicha excitación láser. Una consideración final de particular importancia en los métodos de biología molecular es que los colorantes fluorescentes deben ser compatibles con las composiciones químicas del reactivo. De este modo, por ejemplo, los colorantes fluorescentes utilizados en la síntesis de ADN o las reacciones de la secuenciación deben ser compatibles con los disolventes y los reactivos, los búferes, las enzimas polimerasa y enzimas ligasa utilizados en esas reacciones. En un ejemplo, la publicación de PCT N.°. WO2007/135368 describe una clase de compuestos de rodamina empleados como etiquetas fluorescentes.
La familia de colorantes a base de cumarina ha atraído la atención de los químicos, debido a sus notables propiedades espectrales. Sin embargo, solo hay disponibles comercialmente algunos colorantes fluorescentes fotoestables con grandes desplazamientos de Stokes (LSS). La mayoría de estos colorantes también contienen el fragmento de cumarina como un armazón. Por ejemplo, la mayoría de los colorantes de Dyomics son derivados de la cumarina que absorben aproximadamente 480-520 nm, y emiten en la región de 560-630. Otros ejemplos de esta clase de colorantes a base de cumarina son los colorantes fosforilados derivados de la cumarina, como se describe en la publicación estadounidense N.° 2014/0220588 y los colorantes comercializados Star440SXP y Star 470SXP de Abberior. Otro colorante a base de cumarina de utilidad práctica es AlexaFluor™ 430 con máximos de absorción y emisión a 434 nm y 539 nm respectivamente. Otros colorantes fluorescentes del LSS incluyen el naranja del Pacífico™ (abs. de 390 nm, emisión de 540 nm; desplazamiento de Stokes de 150 nm, Invitrogen) y BD Horizon™ V500 (abs. de 415 nm, emisión de 500 nm; desplazamiento de Stokes de 85 nm, BD Biosciences) Chromeo™ 494 (abs. de 494 nm, emisión de 628 nm, desplazamiento de Stokes de 134 nm, Active Motive). Los compuestos fluorescentes se describen en el documento WO 2012/152698, US 2014/220588, Nizamov et al., Chem. Eur. J. 2012, vol. 18, n.° 51, páginas. 16339­ 16348, Schill et al., Chem. Eur. J. 2013, vol. 19, n.°49, páginas 16556-16565 y Nizamov et al., Chem. Eur. J. 2016, vol. 22, n.° 33, páginas 11631-11642.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la usabilidad del nucleótido A etiquetado con el nuevo colorante a base de cumarina 1-16, como se describe en la presente memoria en el análisis de la secuenciación.
La Figura 2 ilustra la usabilidad del nucleótido A etiquetado con un colorante fluorescente comercial DY510XL con desplazamiento de Stokes largo para el análisis de la secuenciación.
La Figura 3 ilustra la usabilidad del nucleótido A etiquetado con un colorante fluorescente comercial Chromeo494 con un desplazamiento de Stokes largo para el análisis de la secuenciación.
Descripción detallada
Las realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a los nuevos colorantes a base de cumarina y sus derivados de la estructura de la Fórmula (I) para su uso como etiquetas fluorescentes. Otras realizaciones se refieren al compuesto fluorescente de la estructura de la Fórmula (II) con un desplazamiento de Stokes de al menos 60 nm aproximadamente.
Estos nuevos colorantes fluorescentes pueden utilizarse como etiquetas fluorescentes, particularmente para el etiquetado de nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de los ácidos nucleicos. También se ejemplifican métodos para preparar estos colorantes fluorescentes y aplicaciones de secuenciación posteriores que utilizan estos colorantes. Sorprendentemente, se ha descubierto que las intensidades de la fluorescencia de los nuevos colorantes y sus bioconjugados son casi iguales cuando se irradian con fuentes de luz azul o verde. Por ejemplo, cuando los colorantes se excitan con láser o LED de 460 nm (azul) y 540 nm (verde), las intensidades de la fluorescencia son aproximadamente iguales en algunos casos. Como se describe a continuación, esta propiedad es cierta en soluciones y en celdas de flujo, lo que permite realizar un análisis de secuenciación simplificado de alta calidad.
Compuestos de la Fórmula (I)
las realizaciones descritas en la presente memoria están relacionadas con nuevos derivados de la cumarina de la Fórmula (I), o sales, formas mesoméricas de los mismos:
Figure imgf000003_0001
en donde R1 es
Figure imgf000003_0002
y en donde R1 opcionalmente está sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados en el grupo que consta de alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfinato, sulfonato, S-sulfonamido, N-sulfonamido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R2, R3, R4, R5 y R9 se selecciona independientemente en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxilo, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R6, R10a, R10b y R10c se selecciona independientemente en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R7 y R8 se selecciona independientemente en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxilo, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, S-sulfonamido, N sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
por otra parte, R6 y R7, junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo o sistema de anillos seleccionado en el grupo que consta de heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
X se selecciona en el grupo que consta de O, S, NR11 y Se;
R11 se selecciona en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; y el enlace representado por una línea continua y discontinua----------se selecciona en el grupo que consta de un enlace simple y un enlace doble, siempre que, cuando---------- sea un enlace doble, R3 esté ausente.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), el alquilo o el alquilo sustituido descrito en la presente memoria es alquilo C1-12 o más preferiblemente alquilo C1-6. En algunas realizaciones, el alcoxi descrito en la presente memoria es alcoxi C1-12 o, más preferiblemente, alcoxi C1-6. En algunas realizaciones, los grupos alquenilo y alquinilo descritos en la presente memoria son alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6. En algunas realizaciones, los grupos haloalquilo, haloalcoxi, aminoalquilo, hidroxialquilo, heteroalquilo descritos en la presente memoria son haloalquilo C1-12, haloalcoxi C1-12, aminoalquilo C1-12, hidroxialquilo C1-12 y heteroalquilo C1-12; más preferiblemente haloalquilo C1-6, haloalcoxi C1-6 , aminoalquilo C1-6 , hidroxialquilo C1-6 y heteroalquilo C1-6. En algunas realizaciones, el grupo alcoxialquilo descrito en la presente memoria es alcoxi C1-6 (alquilo C1-6). En algunas realizaciones, el arilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es arilo C6-10 opcionalmente sustituido, por ejemplo, fenilo. En algunas realizaciones, el heteroarilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es heteroarilo de 5­ 10 miembros opcionalmente sustituido; con mayor preferencia, heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el carbociclilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es carbociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, en particular, cicloalquilo de 3-7 miembros. En algunas realizaciones, el heterociclilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, más preferiblemente heterociclilo de 5-6 miembros.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), cualquiera de R2 hasta R9 se puede seleccionar en un alquilo sustituido por uno o más grupos sustituyentes seleccionados de carboxilo (-CO2H) o carboxilato (CO2-), sulfo (SO3H) o sulfonato (SO3- ). En algunas de dichas realizaciones, los compuestos de la Fórmula (I) también están representados por su Fórmula de forma salina (I') con un catión orgánico o inorgánico:
Figure imgf000004_0001
en donde K es un catión orgánico o inorgánico, y n es un número entero seleccionado de 1 a 20.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I) o (I'), R1 es
Figure imgf000004_0002
En algunas de dichas realizaciones, X es O. En algunas otras realizaciones, X es O. En algunas de dichas realizaciones, los compuestos de la Fórmula (I) también están representados por la Fórmula (Ia):
Figure imgf000004_0003
En algunas realizaciones, R1 está sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados en el grupo que consta de alquilo, halo y C-carboxi. En una sola realización, R1 está sustituido por un cloro (es decir, -Cl). En otra realización, R1 está sustituido por un carboxilo (es decir, -C(O)OH).
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I) o (I'), R1 es
Figure imgf000005_0001
En algunas otras realizaciones, R1 es
Figure imgf000005_0002
Se entiende que, cuando R10a, R10b o R10c está conectado a un grupo piridilo que porta una carga positiva en el átomo de nitrógeno, R10a, R10b o R10c puede contener una carga negativa para que R1, en su conjunto, tenga una carga neutra. Por otra parte, cuando R10a, R10b o R10c está conectado a un grupo piridilo que porta una carga positiva en el átomo de nitrógeno, el compuesto descrito en la presente memoria puede contener un contraión para que el compuesto, en su conjunto, tenga una carga neutra. En algunas de dichas realizaciones, R10a, R10b o R10c es un alquilo sustituido, por ejemplo, un alquilo C1, C2, C3, C4, C5, o C6 sustituido. En algunas de dichas realizaciones, el alquilo está sustituido por carboxilo (-CO 2H), carboxilato (CO2-), sulfo (SO3H) o sulfonato (SO3-). En algunas de dichas realizaciones, los compuestos de la Fórmula (I) también están representados por la Fórmula (Ib) y (Ic) o su fórmula salina (Ib') y (Ic'):
Figure imgf000005_0003
en donde Y es un anión que es capaz de formar un compuesto de carga neutra con Ib. En alguna realización, Y es un anión derivado de un ácido orgánico o inorgánico. En algunas realizaciones, Y es un anión halógeno.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (la), (Ib), (Ib'), (Ic) o (Ic'), el enlace representado por una línea continua y d iscontinua----------es un enlace doble, y los compuestos también se presentan por la Fórmula (1-1), (l'-1), (la-1), (lb-1), (lb'-1), (lc-1) o (lc'-1):
Figure imgf000005_0004
Figure imgf000006_0001
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (Ic-1) o (Ic'-1), R2 es alquilo. En una sola realización, R2 es alquilo. En algunas otras realizaciones, R2 es H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (Ic-1) o (Ic'-1), al menos uno de R4 y R5 es alquilo. En algunas de dichas realizaciones, cada R4 y R5 es alquilo. En una sola realización, tanto R4 como R5 son metilo. En algunas realizaciones alternativas, al menos uno de R4 y R5 es H. En una de dichas realizaciones, tanto R4 como R5 son H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (la), (Ib) o (Ib'), el enlace representado poruña línea continua y discontinua----------es un enlace simple, y los compuestos también se presentan por la Fórmula (I-2), (I-2), (la-2), (lb-2), (lb'-2), (lc-2) o (lc'-2):
Figure imgf000006_0002
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I-2), (I'-2), (Ia-2), (Ib-2), (Ib'-2), (Ic-2) o (Ic'-2), al menos uno de R2 y R3 es alquilo. En algunas realizaciones adicionales, tanto R2 como R3 son alquilo. En una sola realización, tanto R2 como R3 son metilo. En algunas otras realizaciones, al menos uno de R2 y R3 es H. En una sola realización, tanto R2 como R3 son H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I-2), (I'-2), (Ia-2), (Ib-2), (Ib'-2), (Ic-2) o (Ic'-2), al menos uno de R4 y R5 es H. En una de dichas realizaciones, tanto R4 como R5 son H. En algunas realizaciones alternativas, al menos uno de R4 y R5 es alquilo. En algunas de dichas realizaciones, cada R4 y R5 es alquilo. En una sola realización, tanto R4 como R5 son metilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (Ic-1), (Ic'-1), (I-2), (I'-2), (Ia-2), (Ib-2), (Ib'-2), (Ic-2) o (Ic'-2), R6 es un alquilo sustituido, por ejemplo, un alquilo C1 , C2, C3, C4, C5 o ¿ 6 sustituido. En una sola realización, R6 es alquilo sustituido por carboxilo. En algunas realizaciones, R6 es un alquilo sustituido por -C(O)OR12, y en donde R12 se selecciona en el grupo que consta de alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido. En una de dichas realizaciones, R12 es un alquilo, por ejemplo, metilo, etilo o t-butilo. En algunas realizaciones adicionales, R6 es un alquilo sustituido por -C(O)NR13R14, y en donde cada R13 y R14 se selecciona independientemente entre H, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones adicionales, R13 y R14 se seleccionan independientemente entre un alquilo sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados en el grupo que consta de carboxilo, carboxilato, -C(O)OR11, sulfo y sulfonato.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (Ic-1), (Ic'-1), (I-2>, (I'-2>, (Ia-2), (Ib-2), (Ib'-2), (Ic-2) o (Ic'-2), R7 es H.
En algunas realizaciones alternativas de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (I-2), (I'-2), (Ia-2), (Ib-2) o (Ib'-2), R6 y R7 se unen a los átomos a los que están acoplados para formar un heterociclilo de 3 a 10 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas de dichas realizaciones, el heterociclilo opcionalmente sustituido contiene un solo heteroátomo. En algunas de dichas realizaciones, el heterociclilo opcionalmente sustituido está sustituido por uno o más alquilos, por ejemplo, metilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (Ic-1), (Ic'-1), (I-2>, (I'-2>, (Ia-2), (Ib-2), (Ib'-2), (Ic-2) o (Ic'-2), R8 es H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), (I'), (I-1), (I'-1), (Ia-1), (Ib-1), (Ib'-1), (Ic-1), (Ic'-1), (I-2>, (I'-2>, (Ia-2), (Ib-2), (Ib'-2), (Ic-2) o (Ic'-2), R9 es H.
En algunas realizaciones específicas, los compuestos de ejemplo de Fórmula la (I) incluyen los compuestos 1-1 a 1­ 20 y los compuestos 1-22 a 1-32 como se muestra más adelante en la Tabla 1:
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0002
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (I), el compuesto se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido mediante de R6, y en donde R6 es un alquilo sustituido, por ejemplo, un alquilo C1 , C2, C3, C4, C5 o C6 sustituido. En una sola realización, R6 es un alquilo sustituido por carboxilo.
En algunas realizaciones alternativas, el compuesto se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido mediante R8, y en donde R8 es un alquilo sustituido, por ejemplo, un alquilo C1, C2, C3, C4, C5 o C6 sustituido. En una sola realización, R8 es un alquilo sustituido por carboxilo.
En algunas realizaciones alternativas, el compuesto se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido mediante R10a, R10b o R10c, y en donde cada uno de R10a, R10b o R10c es un alquilo sustituido, por ejemplo, un alquilo C1, C2, C3, C4, C5 o C6 sustituido. En una sola realización, cada uno de R10a, R10b o R10c es un alquilo sustituido por carboxilo. En algunas realizaciones, la estructura del compuesto de la Fórmula (I) está representada en una o más formas mesoméricas:
Figure imgf000009_0001
Compuestos de la Fórmula (II)
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria están relacionadas con los compuestos fluorescentes de la Fórmula (II) con un desplazamiento de Stokes de al menos 60 nm aproximadamente, o sales, formas mesoméricas de los mismos:
Figure imgf000010_0001
en donde RHet es un heteroarilo de 5 a 10 miembros opcionalmente sustituido por uno o más R10,
cada R1, R2, R3, R4 y R5 se selecciona independientemente en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxilo, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R6 se selecciona en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R7 y R8 se selecciona independientemente en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxilo, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R6 y R7, junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo o sistema de anillos seleccionado en el grupo que consta de heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5­ 10 miembros opcionalmente sustituido;
cada R10 se selecciona independientemente en el grupo que consta de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
el enlace representado por una línea continua y discontinua----------se selecciona en el grupo que consta de un enlace simple y un enlace doble, siempre que, cuando---------- sea un enlace doble, R3 esté ausente.
En algunas realizaciones, los compuestos fluorescentes de la Fórmula (II) tienen un desplazamiento de Stokes que oscila entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 100 nm, o entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 90 nm.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), el alquilo o el alquilo sustituido descrito en la presente realización es alquilo C1-12, o más preferiblemente alquilo C1-6. En algunas realizaciones, el alcoxi descrito en la presente memoria es alcoxi C1-12, o más preferiblemente alcoxi C1-6. En algunas realizaciones, los grupos alquenilo y alquinilo descritos en la presente memoria son alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6. En algunas realizaciones, los grupos haloalquilo, haloalcoxi, aminoalquilo, hidroxialquilo, heteroalquilo descritos en la presente memoria son haloalquilo C1-12, haloalcoxi C1-12, aminoalquilo C1-12, hidroxialquilo C1-12 y heteroalquilo C1-12; más preferiblemente haloalquilo C1-6, haloalcoxi C1-6, aminoalquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6 y heteroalquilo C1-6. En algunas realizaciones, el grupo alcoxialquilo descrito en la presente memoria es alcoxi C1-6 (alquilo C1-6). En algunas realizaciones, el arilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es arilo C6-10 opcionalmente sustituido, por ejemplo, fenilo. En algunas realizaciones, el heteroarilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es heteroarilo de 5­ 10 miembros opcionalmente sustituido; con mayor preferencia, heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el carbociclilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es carbociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, en particular, cicloalquilo de 3-7 miembros. En algunas realizaciones, el heterociclilo opcionalmente sustituido descrito en la presente memoria es heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, más preferiblemente heterociclilo de 5-6 miembros.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), cualquiera desde R1 hasta R8 se puede seleccionar en un alquilo sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados en grupos de carboxilo (-CO2H) o carboxilato (COs'), sulfo (SO3H) o sulfonato (SO3- ). En algunas de dichas realizaciones, el alquilo sustituido es un alquilo C1 , C2, C3, C4, C5 o C6 sustituido. En algunas de dichas realizaciones, los compuestos de la Fórmula (II) también están representados por su forma salina de la Fórmula (II') con un catión orgánico o inorgánico:
Figure imgf000011_0001
en donde K es un catión orgánico o inorgánico, y n es un número entero seleccionado de 1 a 20.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II) o (II'), RHet es un heteroarilo de 9 miembros opcionalmente sustituido por uno o más R10. En algunas de dichas realizaciones, RHet se selecciona entre benzotiazolilo o benzoxazolilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, 2-benzotiazolilo o 2-benzoxazolilo. En algunas otras realizaciones, RHet es un heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido por uno o más R10. En una de dichas realizaciones, R Het es un piridilo sustituido, por ejemplo, 4-piridilo con la estructura:
Figure imgf000011_0002
Se entiende que, cuando R10 está conectado a un grupo piridilo que porta una carga positiva en el átomo de nitrógeno, R10 puede contener una carga negativa para que RHet, en su conjunto, tenga una carga neutra. Por otra parte, cuando R10 está conectado a un grupo piridilo que porta una carga positiva en el átomo de nitrógeno, el compuesto descrito en la presente memoria puede contener un contraión para que el compuesto, en su conjunto, tenga una carga neutra. En algunas de dichas realizaciones, R10 es un alquilo sustituido, por ejemplo, alquilo C1, C2, C3, C4, C5 o C6 sustituido. En alguna de dichas realizaciones, R10 se sustituye por carboxilo (-CO2H), carboxilato (CO2-), sulfo (SO3H) o sulfonato (SO3-).
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II) o (II'), el enlace representado por una línea continua y d iscontinua----------en la Fórmula (II) es un enlace doble, y los compuestos también están representados por la Fórmula (11-1) o (ll'-1):
Figure imgf000011_0003
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), (II'), (II-1) o (II'-1), R2 es alquilo. En una sola realización, R2 es alquilo. En algunas otras realizaciones, R2 es H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), (II'), (II-1) o (II'-1), al menos uno de R4 y R5 es alquilo. En algunas de dichas realizaciones, cada R4 y R5 es alquilo. En una sola realización, tanto R4 como R5 son metilo. En algunas realizaciones alternativas, al menos uno de R4 y R5 es H. En una de dichas realizaciones, tanto R4 como R5 son H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II) o (II'), el enlace representado por una línea continua y discontinua----------es un enlace simple, y los compuestos también se presentan por la Fórmula (11-2) o (ll'-2):
Figure imgf000011_0004
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), (II'), (II-2) o (II'-2), al menos uno de R2 y R3 es alquilo. En algunas realizaciones adicionales, tanto R2 como R3 son alquilo. En una sola realización, tanto R2 como R3 son metilo. En algunas otras realizaciones, al menos uno de R2 y R3 es H. En una sola realización, tanto R2 como R3 son H.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), (II'), (II-2) o (II'-2), al menos uno de R4 y R5 es H. En una de dichas realizaciones, tanto R4 como R5 son H. En algunas realizaciones alternativas, al menos uno de R4 y R5 es alquilo. En algunas de dichas realizaciones, cada R4 y R5 es alquilo. En una sola realización, tanto R4 como R5 son metilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II), (II'), (II-1), (II'-1), (II-2) o (II'-2), R6 es un alquilo sustituido, por ejemplo, el alquilo C1 , C2, C3, C4, C5 o C6 sustituido. En una sola realización, R6 es alquilo sustituido por carboxilo. En algunas realizaciones, R6 es un alquilo sustituido por -C(O)OR12, y en donde R12 se selecciona en el grupo que consta de alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido. En una de dichas realizaciones, R12 es un alquilo, por ejemplo, metilo, etilo o t-butilo. En algunas realizaciones adicionales, R6 es un alquilo sustituido por -C(O)NR13R14, y en donde cada R13 y R14 se selecciona independientemente entre H, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones adicionales, R13 y R14 se seleccionan independientemente entre un alquilo sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados en el grupo que consta de carboxilo, carboxilato, -C(O)OR11, sulfo y sulfonato.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II
Figure imgf000012_0001
(II'), (II-1), (II'-1), (II-2) o (II'-2), R7 es
En algunas realizaciones alternativas de los compuestos de la Fórmula (II), (II'), (II-1), (II'-1), (II-2) o (II'-2), R6 y R7 se unen a los átomos a los que están acoplados para formar un heterociclilo de 3 a 10 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas de dichas realizaciones, el heterociclilo opcionalmente sustituido contiene un solo heteroátomo. En algunas de dichas realizaciones, el heterociclilo opcionalmente sustituido es sustituido por uno o más alquilos, por ejemplo, metilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II
Figure imgf000012_0002
(II'), (II-1), (II'-1), (II-2) o (II'-2), R1 es
En algunas realizaciones de los compuestos de la Fórmula (II
Figure imgf000012_0003
(II'), (II-1), (II'-1), (II-2) o (II'-2), R8 es
Como entiende un experto en la técnica, cuando un compuesto de la Fórmula (I) o (II) contiene grupos sustituyentes cargados positiva o negativamente, también puede contener un contraión cargado negativamente o positivamente, de manera que el compuesto, en su conjunto, sea neutro.
Definiciones
Los encabezados de secciones que se utilizan en la presente memoria tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. Además, el uso del término “ incluyendo” , así como otras formas, como “ incluyen” , “ incluye” e “ incluido” , no es limitativo. Además, el uso del término “ que tiene” , así como otras formas, como “tienen” , “ tiene” y “tenido” , no es limitativo. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, ya sea en una expresión de transición o en el cuerpo de la reivindicación, se ha de interpretar que las expresiones “ que consta de” y “ que constan de” tienen un significado abierto. Es decir, las expresiones se han de interpretar como sinónimos de las expresiones “ que tiene(n) al menos” o “ que incluye(n) al menos” . Cuando se utiliza en el contexto de un proceso, la expresión “ que consta de” significa que el proceso incluye al menos las etapas citadas, pero puede incluir etapas adicionales. Cuando se utiliza en el contexto de un compuesto, composición o dispositivo, la expresión “ que consta de” significa que el compuesto, la composición o el dispositivo incluye al menos las características o los componentes citados, pero que también puede incluir características o componentes adicionales.
Como se utilizan en la presente memoria, las abreviaturas orgánicas comunes se definen de la siguiente manera:
Ac Acetil
Ac2O Anhídrido acético
ac. Acuoso
BOC o Boc tert-butiloxicarbonilo
BOP (Benzotriazol-1-iloxi) tris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato
cat. Catalizador
°C temperatura en grados centígrados
dATP trifosfato de desoxiadenosina
dCTP trifosfato de desoxicitidina
dGTP trifosfato de desoxiguanosina
dTTP trifosfato de desoxitimidina
ddNTP(s) didesoxinucleótido(s)
DCM cloruro de metileno
DMA dimetilacetamida
DMF dimetilformamida
Et etilo
EtOAc acetato de etilo
ffC conjugado de nucleótido completamente funcionalizado
g gramo(s)
h o hr hora u horas
IPA alcohol isopropílico
LCMS cromatografía líquida-espectrometría de masas
MeCN acetonitrilo
mL mililitro(s)
PG grupo protector
Ph fenilo
ppt precipitado
PyBOP (benzotriazol-1-iloxi) hexafluorofosfato de tripirrolidinomio
RT temperatura ambiente
SBS secuenciación por síntesis
TEA trietilamina
TEAB bromuro de tetraetilamonio
TFA ácido trifluoroacético
TRIS tris(hidroximetil) aminometano
Tert, t terciario
THF tetrahidrofurano
TLC cromatografía en capa fina
TSTU tetrafluoroborato de O-(N-succinimidilo) N,N,N',N'-tetrametiluronio |jL microlitro(s)
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ unido covalentemente” o “ enlazado covalentemente” se refiere a la conformación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, una “ lámina de polímero unida covalentemente” , cuando se utiliza en referencia a la superficie de un sustrato, se refiere a una lámina de polímero que forma enlaces químicos con la superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con la unión a la superficie a través de otros medios, por ejemplo, la adhesión o la interacción electrostática. Se apreciará que los polímeros que se unen covalentemente a una superficie también se pueden unir a través de distintos medios, además de la unión covalente.
El término “ halógeno” o “ halo” , como se utiliza en la presente memoria, significa uno cualquiera de los átomos radioestables de la columna 7 de la Tabla periódica de los elementos, p. ej., flúor, cloro, bromo o yodo, prefiriéndose el flúor y el cloro.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que está completamente saturada (es decir, que no contiene enlaces dobles ni triples). El grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que aparezca en la presente memoria, un intervalo numérico tal como “ de 1 a 20” se refiere a cada número entero en el intervalo dado; p. ej., “ de 1 a 20 átomos de carbono” significa que el grupo alquilo puede constar de 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e inclusive 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ alquilo” donde no se designa ningún intervalo numérico). El grupo alquilo también puede ser un alquilo de tamaño medio que tenga de 1 a 9 átomos de carbono. El grupo alquilo podría ser un alquilo inferior que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo alquilo puede designarse como “ alquilo C1-4” o designaciones similares. Únicamente como ejemplo, “ alquilo C1-6” indica que hay de uno a cuatro átomos de carbono en la cadena alquilo, es decir, la cadena alquilo se selecciona en el grupo que consta de metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y t-butilo. Los grupos alquilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.
Como se emplea en la presente memoria, “ alcoxi” se refiere a la fórmula -OR en la que R es un alquilo como se definió anteriormente, tal como “ alcoxi C1-9” , que incluye, entre otros, metoxi, etoxi, n-propoxi, 1-metiletoxi (isopropoxi), nbutoxi, iso-butoxi, sec-butoxi y tert-butoxi, y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquenilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que contiene uno o más enlaces dobles. El grupo alquenilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ alquenilo” cuando no se designa ningún intervalo numérico. El grupo alquenilo también puede ser un alquenilo de tamaño medio que tenga de 2 a 9 átomos de carbono. El grupo alquenilo podría ser un alquenilo inferior que tenga de 2 a 6 átomos de carbono. El grupo alquenilo puede designarse como “ alquenilo C2-6” o designaciones similares. Únicamente como ejemplo, “ alquenilo C2-6” indica que hay de dos a seis átomos de carbono en la cadena de alquenilo, es decir, la cadena de alquenilo se selecciona en el grupo que consta de etenilo, propen-1-ilo, propen-2-ilo, propen-3-ilo, buten-1-ilo, buten-2-ilo, buten-3-ilo, buten-4-ilo, 1-metilpropen-1-ilo, 2-metil-propen-1-ilo, 1 -etil-eten-1 -ilo, 2-metil-propen-3-ilo, buta-1,3-dienilo, buta-1,2-dienilo y buta-1,2-dien-4-ilo. Los grupos alquenilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo y hexenilo, y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquinilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que contiene uno o más enlaces triples. El grupo alquinilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ alquinilo” cuando no se designa ningún intervalo numérico. El grupo alquinilo también puede ser un alquinilo de tamaño medio que tenga de 2 a 9 átomos de carbono. El grupo alquinilo podría ser un alquinilo inferior que tenga de 2 a 6 átomos de carbono. El grupo alquinilo puede designarse como “ alquinilo C2-6” o designaciones similares. Únicamente como ejemplo, “ alquinilo C2-6” indica que hay de dos a seis átomos de carbono en la cadena de alquinilo, es decir, la cadena de alquinilo se selecciona en el grupo que consta de etinilo, propin-1-ilo, propin-2-ilo, butin-1-ilo, butin-3-ilo, butin-4-ilo y 2-butinilo. Los grupos alquinilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo, y similares.
Como se emplea en la presente memoria, “ heteroalquilo” se refiere a una cadena de hidrocarburo recta o ramificada que contiene uno o más heteroátomos, es decir, un elemento distinto del carbono, que incluye, entre otros, nitrógeno, oxígeno y azufre, en la estructura molecular básica de la cadena. El grupo heteroalquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ heteroalquilo” cuando no se designa ningún intervalo numérico. El grupo heteroalquilo también puede ser un heteroalquilo de tamaño medio que tenga de 1 a 9 átomos de carbono. El grupo heteroalquilo podría ser un heteroalquilo inferior que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo heteroalquilo puede designarse como “ heteroalquilo C1-6” o designaciones similares. El grupo heteroalquilo puede contener uno o más heteroátomos. Solo a modo de ejemplo, “ heteroalquilo C1-6” indica que hay de uno a seis átomos de carbono en la cadena de heteroalquilos y adicionalmente uno o más heteroátomos en la estructura molecular básica de la cadena.
El término “ aromático” se refiere a un anillo o sistema de anillos que tiene un sistema de electrones pi conjugado e incluye grupos aromáticos carbocíclicos (por ejemplo, fenilo) y heterocíclicos (por ejemplo, piridina). El término incluye grupos monocíclicos o policíclicos de anillos condensados (es decir, anillos que comparten pares de átomos adyacentes), siempre que todo el sistema de anillos sea aromático.
Como se utiliza en la presente memoria, “ arilo” se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos fusionados que comparten dos átomos de carbono adyacentes) que solo contienen carbono en la estructura molecular básica del anillo. Cuando el arilo es un sistema de anillos, cada anillo del sistema es aromático. El grupo arilo puede tener de 6 a 18 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ arilo” cuando no se designa ningún intervalo numérico. En algunas realizaciones, el grupo arilo tiene de 6 a 10 átomos de carbono. El grupo arilo puede designarse como “ arilo C6-10” , “ arilo C6” o “ arilo C10” o designaciones similares. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, entre otros, fenilo, naftilo, fluorenilo, azulenilo, antrilo, fenantrilo, pirenilo, bifenilo y terfenilo.
Un “ aralquilo” o “ arilalquilo” es un grupo arilo conectado, como sustituyente, a través de un grupo alquileno, tal como “ aralquilo C7-14” y similares, que incluyen, entre otros, bencilo, 2-feniletilo, 3-fenilpropilo y naftilalquilo. En algunos casos, el grupo alquileno es un grupo alquileno inferior (es decir, un grupo alquileno C1-6).
Como se utiliza en la presente memoria, “ heteroarilo” se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos fusionados que comparten dos átomos adyacentes) que contiene/n uno o más heteroátomos, es decir, un elemento que no es carbono, incluidos, entre otros, nitrógeno, oxígeno y azufre, en la estructura molecular básica del anillo. Cuando el heteroarilo es un sistema de anillos, cada anillo en el sistema es aromático. El grupo heteroarilo puede tener 5-18 miembros de anillo (es decir, el número de átomos que forman la estructura molecular básica del anillo, que incluye átomos de carbono y heteroátomos), aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ heteroarilo” cuando no se designa ningún rango numérico. En algunas realizaciones, el grupo heteroarilo tiene 5 a 10 miembros del anillo o 5 a 7 miembros del anillo. El grupo heteroarilo puede designarse como “ heteroarilo de 5-7 miembros” , “ heteroarilo de 5-10 miembros” o designaciones similares. Los ejemplos de anillos de heteroarilo incluyen, entre otros, furilo, tienilo, ftalazinilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, quinolinilo, isoquinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, indolilo, isoindolilo y benzotienilo.
Un “ heteroaralquilo” o “ heteroarilalquilo” es un grupo heteroarilo conectado, como un sustituyente, mediante un grupo alquileno. Los ejemplos incluyen, entre otros, 2-tienilmetilo, 3-tienilmetilo, furilmetilo, tieniletilo, pirrolilalquilo, piridilalquilo, isoxazolilalquilo e imidazolilalquilo. En algunos casos, el grupo alquileno es un grupo alquileno inferior (es decir, un grupo alquileno C1-6).
Como se utiliza en la presente memoria, “ carbociclilo” hace referencia un anillo o sistema de anillos cíclicos no aromático/s que solo contiene átomos de carbono en la estructura molecular básica del sistema de anillo. Cuando el carbociclilo es un sistema de anillo, se pueden unir dos o más anillos de forma fusionada, por puentes o conectada en espiral. Los carbociclilos pueden tener cualquier grado de saturación, siempre que al menos un anillo de un sistema de anillos no sea aromático. Por lo tanto, los carbociclilos incluyen cicloalquilos, cicloalquenilos y cicloalquinilos. El grupo carbociclilo puede tener de 3 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ carbociclilo” cuando no se designa ningún intervalo numérico. El grupo carbociclilo también puede ser un carbociclilo de tamaño medio que tenga de 3 a 10 átomos de carbono. El grupo carbociclilo podría ser un carbociclilo que tenga de 3 a 6 átomos de carbono. El grupo carbociclilo puede designarse como “ carbociclilo C3-6” o designaciones similares. Los ejemplos de anillos de carbociclilo incluyen, entre otros, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 2,3-dihidro-indeno, biciclo[2.2.2]octanilo, adamantilo y espiro[4.4]nonanilo.
Como se utiliza en la presente memoria, “cicloalquilo” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo completamente saturado. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
Como se utiliza en la presente memoria, “ heterociclilo” hace referencia a un anillo o sistema de anillos cíclico no aromático que contiene al menos un heteroátomo en la estructura molecular básica del anillo. Los heterociclilos pueden unirse entre sí de forma fusionada, por puentes o conectada a espiro. Los heterociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo en el sistema de anillos no sea aromático. El/los heteroátomo/s puede/n estar presente/s en un anillo aromático o no aromático dentro del sistema de anillos. El grupo heterociclilo puede tener 3 a 20 miembros del anillo (es decir, el número de átomos que forman la estructura molecular básica del anillo, que incluye átomos de carbono y heteroátomos), aunque la presente definición también abarca la aparición del término “ heterociclilo” cuando no se designa ningún rango numérico. El grupo heterociclilo también puede ser un heterociclilo de tamaño medio que tenga de 3 a 10 miembros del anillo. El grupo heterociclilo también podría ser un heterociclilo que tenga de 3 a 6 miembros del anillo. El grupo heterociclilo puede designarse como ”heterocíclico de 3-6 miembros” o designaciones similares. En los heterociclilos monocíclicos preferidos de seis miembros, el heteroátomo o los heteroátomos se seleccionan en uno hasta tres de O, N o S, y entre los heterociclilos monocíclicos preferidos de cinco miembros, el heteroátomo o los heteroátomos se seleccionan entre uno o dos heteroátomos seleccionados de O, N o S. Los ejemplos de anillos heterociclilos incluyen, entre otros, azepinilo, acridinilo, carbazolilo, cinnolinilo, dioxolanilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, morfolinilo, oxiranilo, oxeanilo, tiepanilo, piperidinilo, piperazinilo, dioxoperazinilo, pirrolidinilo, pirrolidonilo, pirrolidionilo, 4-piperidonilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, 1,3-dioxinilo, 1,3-dioxanilo, 1,4-dioxinilo, 1,4-dioxanilo, 1,3-oxatianilo, 1,4-oxatiinilo, 1,4-oxatianilo, 2H-1,2-oxazinilo, trioxanilo, hexahidro-1,3,5-triazinilo, 1,3dioxolilo, 1,3-dioxolanilo, 1,3-ditiolilo, 1,3-ditiolanilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, oxazolidinonilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, 1,3-oxatiolanilo, indolinilo, isoindolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidro-1,4-tiazinilo, tiamorfolinilo, dihidrobenzofuranilo, bencimidazolidinilo y tetrahidroquinolina.
Un grupo “ O-carboxi” se refiere a un grupo “ -OC(=O)R” en el que R se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ C-carboxi” se refiere a un grupo “ -C(=O)OR” en el que R se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria. Un ejemplo no limitante incluye el carboxilo (es decir, -C(=O)OH).
Un grupo “ ciano” se refiere a un grupo “ -CN” .
Un grupo “ sulfonilo” se refiere a un grupo “ -SO2R” en el que R se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ sulfo” o “ hidróxido de sulfonilo” se refiere a un grupo “ -S(=O)2-OH” .
Un grupo “ sulfino” se refiere a un grupo “ -S(=O)OH” .
Un grupo “ sulfonato” se refiere a -SO3'.
Un grupo “ S-sulfonamido” se refiere a un grupo “ -SO2NRaRb” en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ N-sulfonamido” se refiere a un grupo “ -N(Ra)SO2Rb” en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ C-amido” se refiere a un grupo “ -C(=O)NRaRb” en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ N-amido” se refiere a un grupo “ -N(Ra)C(=O)Rb” en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ amino” se refiere a un grupo “ -NRaRb” en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en la presente memoria. Un ejemplo no limitativo incluye amino libre (es decir, -NH2).
Un grupo “ aminoalquilo” se refiere a un grupo amino conectado mediante un grupo alquileno.
Un grupo “ alcoxialquilo” se refiere a un grupo alcoxi conectado mediante un grupo alquileno, como un “ alcoxialquilo C2-8” y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, un grupo sustituido deriva del grupo original no sustituido en el que ha habido un intercambio de uno o más átomos de hidrógeno por otro átomo o grupo. A menos que se indique lo contrario, cuando se considera que un grupo es “ sustituido” , se entiende que el grupo es sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo C1-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), carbociclil-C3-C7-alquilo-C1-C6 (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclil-alquilo-C1-C6 de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), aril-alquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido por halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros alquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6-alquilo (C1-C6) (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), halo-alquilo (C1-C6) (p. ej., -CF3), halo-alcoxi (C1-C6) (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6, ariltio, amino, amino-alquilo (C1-C6), nitro, O-carbamilo, Ncarbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfo, sulfino, sulfonato y oxo (=O). Siempre que un grupo se describa como “ opcionalmente sustituido” , ese grupo puede estar sustituido por los sustituyentes anteriores.
Como entenderá un experto en la técnica, si un compuesto contiene grupos sustituyentes cargados positiva o negativamente, por ejemplo, SO3 -, también puede contener un contraión cargado negativamente o positivamente, de manera que el compuesto en su conjunto sea neutro.
Debe entenderse que ciertas convenciones de denominación de los radicales pueden incluir un monorradical o un dirradical, dependiendo del contexto. Por ejemplo, cuando un sustituyente requiere dos puntos de unión al resto de la molécula, se entiende que el sustituyente es un dirradical. Por ejemplo, un sustituyente identificado como el alquilo que requiere dos puntos de unión incluye dirradicales como -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- y similares. Otras convenciones de denominación de los radicales indican claramente que el radical es un dirradical, como “ alquileno” o “ alquenileno” .
Cuando se dice que dos grupos R “ adyacentes” forman un anillo “junto con el átomo al que están unidos” , significa que la unidad colectiva de los átomos, enlaces intermedios y los dos grupos R son el anillo mencionado. Por ejemplo, cuando está presente la siguiente subestructura:
Figure imgf000017_0001
y R1 y R2 se definen como seleccionados en el grupo que consta de hidrógeno y alquilo, o R1 y R2, junto con los átomos a los que están unidos, forman un arilo o carbociclilo, se entiende que R1 y R2 pueden seleccionarse entre hidrógeno o alquilo o, alternativamente, la subestructura tiene estructura:
Figure imgf000017_0002
Donde A es un anillo arilo o un carbociclilo que contiene el enlace doble representado.
Nucleótidos etiquetados
Los compuestos de colorante descritos en la presente memoria son adecuados para unirse a restos de sustrato. Los restos de sustrato pueden ser virtualmente cualquier molécula o sustancia con la que los colorantes fluorescentes descritos en el presente documento pueden conjugarse y, a modo de ejemplo no limitante, pueden incluir nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, ligandos, partículas, superficies sólidas, polímeros orgánicos e inorgánicos y combinaciones o conjuntos de los mismos, como cromosomas, núcleos, células vivas y similares. Los colorantes pueden conjugarse con un conector opcional mediante una serie de medios que incluyen la atracción hidrófoba, la atracción iónica y la unión covalente. Particularmente, los colorantes se conjugan con el sustrato mediante la unión covalente. Más particularmente, la unión covalente se realiza por medio de un grupo enlazador. En algunos casos, dichos nucleótidos etiquetados también se denominan “ nucleótidos modificados” .
Una aplicación particularmente útil de los nuevos colorantes fluorescentes con desplazamiento de Stokes largo, como se describe en la presente memoria, es para etiquetar las biomoléculas, por ejemplo, los nucleótidos o los oligonucleótidos. Algunas realizaciones de la presente solicitud están dirigidas a un nucleótido u oligonucleótido etiquetado con los nuevos compuestos fluorescentes, como se describe en la presente memoria.
Las moléculas de colorante fluorescente con propiedades de fluorescencia mejoradas (tales como el desplazamiento de Stokes, la intensidad de la fluorescencia, la posición del máximo de fluorescencia y la forma de la banda de fluorescencia) pueden mejorar la velocidad y la precisión de la secuenciación del ácido nucleico. El desplazamiento de Stokes es un aspecto esencial de la detección de la fluorescencia en las aplicaciones biológicas. Por ejemplo, la detección de la luz emitida puede ser difícil de distinguir de la luz de excitación cuando se utilizan fluoróforos con absorción y el máximo de fluorescencia muy cerca entre sí (es decir, pequeño desplazamiento de Stokes), porque las longitudes de onda de excitación y emisión se solapan en gran medida. Por el contrario, los fluoróforos con grandes desplazamientos de Stokes son fáciles de distinguir, debido a la mayor separación entre las longitudes de onda de excitación y emisión. El desplazamiento de Stokes es especialmente crítico en aplicaciones de fluorescencia multiplexada, porque la longitud de onda de emisión de un fluoróforo puede solaparse y, por lo tanto, excitar a otro fluoróforo en la misma muestra. Además, la intensidad de la señal de fluorescencia es especialmente importante cuando se realizan mediciones en búferes biológicos que contienen agua y/o a una temperatura más alta, ya que la fluorescencia de la mayoría de los colorantes es significativamente menor en dichas condiciones. Además, la naturaleza de la base a la que se une un colorante también afecta el máximo de la fluorescencia, la intensidad de la fluorescencia y a otras propiedades espectrales del colorante. Las interacciones específicas de la secuencia entre el colorante fluorescente y la nucleobase pueden adaptarse mediante un diseño específico de los colorantes fluorescentes. La optimización de la estructura de los colorantes fluorescentes puede mejorar sus propiedades fluorescentes y también mejorar la eficiencia de la incorporación de nucleótidos, reducir el nivel de errores de secuenciación y disminuir el uso de reactivos en la secuenciación de los ácidos nucleicos y, por lo tanto, de sus costes.
La unión a las biomoléculas puede ser mediante el resto R6, R8, R10a, R10b, R10c o R10 del compuesto de la Fórmula (I) o la Fórmula (II). En algunas realizaciones, R6, R8, R10a, R10b, R10c o R10 es un alquilo sustituido, por ejemplo, un alquilo sustituido por carboxilo (es decir, -CO2 H) o una forma activada del grupo carboxilo, por ejemplo, amida o éster, que puede utilizarse para unirse al grupo amino de las biomoléculas. En una sola realización R6, R8, R10a, R10b, R10c o R10 puede contener un residuo de éster o amida activado más adecuado para la formación adicional de enlaces amida/péptido. El término “ éster activado” , como se emplea en la presente memoria, se refiere a un derivado del grupo carboxilo que es capaz de reaccionar en condiciones suaves, por ejemplo, con un compuesto que contiene un grupo amino. Los ejemplos no limitantes de ésteres activados incluyen, entre otros, ésteres de p-nitrofenilo, pentafluorofenilo y succinimido.
En algunas realizaciones, los compuestos del colorante pueden unirse covalentemente a oligonucleótidos o nucleótidos a través de la base de nucleótidos. Por ejemplo, el nucleótido u oligonucleótido etiquetado puede tener la etiqueta unida a la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-deaza purina a través de un resto enlazador. El nucleótido u oligonucleótido etiquetado también puede tener un grupo bloqueante 3'-OH unido covalentemente al azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido.
Enlazadores
Los compuestos del colorante, como se describe en la presente memoria, pueden incluir un grupo enlazador reactivo en una de las posiciones de los sustituyentes de la unión covalente del compuesto a otra molécula. Los grupos enlazadores reactivos son restos capaces de formar un enlace covalente. En una realización particular, el enlanzador puede ser un enlazador escindible. El uso del término “ enlazador escindible” no pretende implicar que se requiera eliminar el enlazador completo. La zona de escisión puede ubicarse en una posición del conector que asegure que parte del enlazador permanezca unida al colorante y/o al resto del sustrato después de la escisión. Los enlazadores escindibles pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, enlazadores escindibles electrófilos, conectores escindibles nucleófilos, enlazadores fotoescindibles, escindibles en condiciones reductoras (por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro o azida), condiciones oxidativas, escindibles mediante el uso de enlazadores de captura de seguridad y pueden escindirse mediante mecanismos de eliminación. El uso de un enlazador escindible para unir el compuesto de colorante a un resto de sustrato asegura que la etiqueta pueda, si es necesario, eliminarse después de la detección, por lo que se evitará cualquier señal interferente en etapas posteriores.
Los ejemplos no limitantes de grupos enlazadores incluyen los descritos en la publicación de PCT N.° WO2004/018493, que conectan las bases de los nucleótidos a etiquetas como, por ejemplo, los nuevos compuestos fluorescentes descritos en la presente memoria. Estos enlazadores pueden escindirse utilizando fosfinas solubles en agua o catalizadores de metales de transición solubles en agua formados a partir de un metal de transición y al menos parcialmente ligandos solubles en agua. En solución acuosa, este último forma, al menos parcialmente, complejos de metales de transición solubles en agua. Los enlazadores adecuados adicionales que pueden utilizarse incluyen los descritos en la publicación de PCT N.° WO2004/018493 y WO 2007/020457. Se descubrió que al alterar, y en particular aumentar, la longitud del enlazador entre un colorante fluorescente (fluoróforo) y la base de guanina, mediante la introducción de un grupo espaciador de polietilenglicol, es posible aumentar la intensidad de la fluorescencia, en comparación con el mismo fluoróforo unido a la base de guanina a través de otros enlaces conocidos en la técnica. El diseño de los conectores, y especialmente su longitud aumentada, también permite mejorar el brillo de los fluoróforos unidos a las bases de guanina de los nucleótidos guanosina cuando se incorporan a polinucleótidos como ADN. Por lo tanto, cuando el colorante se emplea en cualquier método de análisis que requiere la detección de una etiqueta de colorante fluorescente unida a un nucleótido que contiene guanina, es ventajoso si el enlazador comprende un grupo espaciador de fórmula -((CH2)2O)n-, en donde n es un número entero entre 2 y 50, como se describe en el documento WO 2007/020457.
Los nucleósidos y nucleótidos pueden etiquetarse en zonas del azúcar o la nucleobase. Como entenderá un experto en la técnica, un “ nucleótido” consta de una base nitrogenada, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En el ARN, el azúcar es una ribosa, y en el ADN es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de la purina o la pirimidina. Las purinas son adenina (A) y guanina (G), y las pirimidinas son citosina (C) y timina (T) o en el contexto de ARN, uracilo (U). El átomo C-1 de la desoxirribosa se une al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleótido también es un éster de fosfato de un nucleósido, teniendo la esterificación en el grupo hidroxilo unido a la C-3 o C-5 del azúcar. Los nucleótidos generalmente son mono-, di- o trifosfatos.
Un “ nucleósido” es estructuralmente similar a un nucleótido, pero le faltan los restos de fosfato. Un ejemplo de un análogo de nucleósido sería uno en el que la etiqueta está unida a la base y no hay un grupo fosfato unido a la molécula de azúcar.
Aunque la base generalmente se denomina “ purina” o “ pirimidina” , el experto apreciará que los derivados y análogos disponibles no alteran la capacidad del nucleótido o nucleósido de someterse al emparejamiento de las bases de Watson-Crick. “ Derivado” o “ análogo” significa que hace referencia a un compuesto o una molécula cuya estructura central es la misma que la de un compuesto original, o se asemeja mucho a ella, pero que tiene una modificación química o física, como, por ejemplo, un grupo lateral diferente o adicional, que permite que el nucleótido derivado o el nucleósido se conecte a otra molécula. Por ejemplo, la base puede ser una desazopurina. Los derivados deben ser capaces de experimentar el emparejamiento de Watson-Crick. “ Derivado” y “ análogo” también hacen referencia a un nucleótido sintético o al derivado de un nucleósido que tiene restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados. De dichos derivados y análogos se habla, por ejemplo, en Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley&Son, 1980) y Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los análogos de nucleótidos también pueden constar de enlaces fosfodiéster modificados que incluyen enlaces de fosforotioato, fosforoditioato, alquilo-fosfonato, fosforanilida, fosforamidato y similares.
El colorante puede unirse a cualquier posición de la base de nucleótidos, a través de un enlazador, siempre que aún pueda llevarse a cabo el emparejamiento de bases de Watson-Crick. Determinadas zonas de etiquetado de nucleobase incluyen la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-deaza purina. Como se describió anteriormente, un grupo enlazador puede utilizarse para unir covalentemente un colorante al nucleósido o nucleótido.
En particular, el nucleósido o nucleótido etiquetado puede incorporarse enzimáticamente y ser enzimáticamente extensible. Por consiguiente, un resto enlazador puede ser de longitud suficiente para conectar el nucleótido al compuesto, de manera que el compuesto no interfiera significativamente en la unión general y el reconocimiento del nucleótido por una enzima de replicación de ácido nucleico. Por lo tanto, el conector también puede constar de una unidad separadora. Las distancias espaciadoras, por ejemplo, la base de los nucleótidos de una zona o una etiqueta de escisión.
Los nucleósidos o nucleótidos etiquetados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en la presente memoria pueden tener la fórmula:
Figure imgf000019_0001
donde Colorante es un compuesto de colorante, B es una nucleobase, como, por ejemplo, uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similares y L es un grupo enlazador opcional que puede o no estar presente. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un análogo de éster de fosfato, -O- unido a un grupo que contiene fósforo reactivo u -O- protegido por un grupo bloqueante. R” puede ser H, OH, una fosforamidita o un grupo bloqueante 3'-OH y Rm es H u OH; donde R” es fosforamidita, R' es un grupo protector hidroxilo escindible con ácido que permite el acoplamiento de monómero posterior en condiciones de síntesis automatizadas.
En algunos casos, el grupo bloqueante está separado e independiente del compuesto de colorante, es decir, no unido a él. Por otra parte, el colorante puede constar de todo o parte del grupo bloqueante 3'-OH. Por lo tanto, R” puede ser un grupo bloqueante 3'-OH que puede constar o no del compuesto colorante. En realizaciones alternativas adicionales, no hay ningún grupo bloqueante en el carbono 3' del azúcar pentosa y el colorante (o el colorante y la estructura enlazadora) unido a la base, por ejemplo, puede ser de un tamaño o estructura suficiente para actuar como un bloque para la incorporación de un nucleótido adicional de un punto distinto del sitio 3'. Por lo tanto, el bloqueo puede deberse a un impedimento estérico o puede deberse a una combinación de tamaño, carga y estructura.
El uso de un grupo bloqueante permite controlar la polimerización, como detener la extensión cuando se incorpora un nucleótido modificado. Si el efecto bloqueante es reversible, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, cambiando las condiciones químicas o mediante la retirada de un bloqueo químico, la extensión puede detenerse en ciertos puntos y luego dejar que continúe. Los ejemplos no limitantes de grupos bloqueantes 3'-OH incluyen los descritos en los documentos WO 2004/018497 y WO 2014/139596. Por ejemplo, el grupo bloqueante puede ser azidometilo (-CH2N3) o azidometilo sustituido (por ejemplo, -CH(CHF2)N3 o CH(CH2F)N3) o alilo.
En una realización particular, el enlazador y el grupo bloqueante están presentes y son restos separados que son ambos escindibles en condiciones sustancialmente similares. Por lo tanto, los procesos de desprotección y desbloqueo pueden ser más eficientes, ya que solo se requerirá un único tratamiento para eliminar tanto el compuesto colorante como el grupo bloqueante.
La presente realización también dirige la expresión de polinucleótidos que incorporan compuestos de colorante descritos en la presente memoria. Dichos polinucleótidos pueden ser ADN o ARN que consten de, respectivamente de, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos unidos en un enlace fosfodiéster. Los polinucleótidos pueden constar de nucleótidos naturales, nucleótidos no naturales (o modificados) distintos de los nucleótidos marcados descritos en la presente memoria o cualquier combinación de los mismos, siempre que se presente al menos un nucleótido etiquetado con un compuesto de colorante, de acuerdo con la presente solicitud. Los polinucleótidos también pueden incluir segmentos principales no naturales y/o modificaciones químicas no nucleotídicas. También se contemplan estructuras quiméricas compuestas por mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos que constan de al menos un nucleótido etiquetado.
Los nucleótidos etiquetados de ejemplo no limitantes, como se describen en la presente memoria incluyen:
Figure imgf000020_0001
en donde: L representa un enlazador y R representa un residuo de azúcar, como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones, se muestran a continuación ejemplos no limitantes de conjugados de colorante fluorescente:
Figure imgf000021_0001
Kits
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria son kits que incluyen nucleósidos y/o nucleótidos etiquetados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en la presente memoria. Dichos kits generalmente incluirán al menos un nucleótido o nucleósido etiquetado con un colorante junto con al menos un componente adicional. Los componentes adicionales pueden ser nucleótidos o nucleósidos modificados o no modificados adicionales. Por ejemplo, los nucleótidos etiquetados con colorantes pueden suministrarse en combinación con nucleótidos no etiquetados o nativos, y/o con nucleótidos etiquetados con fluorescencia o cualquier combinación de los mismos. Pueden proporcionarse combinaciones de nucleótidos como componentes individuales separados o como mezclas de nucleótidos. En algunas realizaciones, los kits comprenden uno o más nucleótidos en los que al menos un nucleótido es un nucleótido etiquetado con un nuevo compuesto fluorescente descrito en la presente memoria. Los kits pueden comprender dos o más nucleótidos etiquetados. Los nucleótidos pueden etiquetarse con dos o más etiquetas fluorescentes. Dos o más de las etiquetas pueden excitarse utilizando una única fuente de excitación, que puede ser un láser.
Los kits pueden contener cuatro nucleótidos, de los cuales el primero de los cuatro nucleótidos está etiquetado con un compuesto, como se describe en la presente memoria, y el segundo, tercer y cuarto nucleótidos pueden etiquetarse cada uno con un compuesto diferente, en el que cada compuesto tiene un máximo de fluorescencia distinto y cada uno de los compuestos es distinguible de los otros tres compuestos. Los kits pueden ser tales que dos o más de los compuestos tienen un máximo de absorbancia similar pero diferentes desplazamientos de Stokes.
Los compuestos de colorante fluorescente, nucleótidos o kits etiquetados descritos en la presente memoria pueden utilizarse en secuenciaciones, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN o ensayos de unión a proteínas. El uso puede estar en un instrumento de secuenciación automatizado. El instrumento de secuenciación puede contener dos láseres que funcionan a diferentes longitudes de onda.
Cuando los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, más particularmente cuatro, nucleótidos etiquetados con un compuesto de colorante, los diferentes nucleótidos pueden etiquetarse con diferentes compuestos de colorante, o uno puede ser oscuro, sin compuestos de colorante. Cuando los diferentes nucleótidos están etiquetados con diferentes compuestos de colorante, es una característica de los kits que dichos compuestos de colorante sean colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles. Como se emplea en el presente documento, el término “ colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles” se refiere a los colorantes fluorescentes que emiten energía fluorescente a longitudes de onda que pueden distinguirse por el equipo de detección fluorescente (por ejemplo, una plataforma comercial de secuenciación del ADN basada en capilares) cuando dos o más de dichos colorantes están presentes en una muestra. Cuando se suministran dos nucleótidos etiquetados con compuestos de colorante fluorescente en forma de kit, los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden excitarse a la misma longitud de onda, tal como, por ejemplo, por el mismo láser en algunas realizaciones. Cuando se suministran cuatro nucleótidos etiquetados con compuestos de colorante fluorescente en forma de kit, dos de los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden ser excitados a una longitud de onda y los otros dos colorantes espectralmente distinguibles pueden ser excitados en otra longitud de onda en algunas realizaciones. Las longitudes de onda de excitación particulares son de aproximadamente 460 nm.
En algunas realizaciones, al menos un nucleótido puede etiquetarse con un colorante excitable con dos láseres con diferente longitud de onda.
En una sola realización, un kit consta de un nucleótido etiquetado con un compuesto descrito en la presente memoria y un segundo nucleótido marcado con un segundo colorante en el que los colorantes tienen una diferencia en el máximo de absorbancia de al menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Más particularmente, los dos compuestos de colorante tienen desplazamientos de Stokes de entre 15-40 nm o entre 20-40 nm. Como se emplea en la presente memoria, el término “ desplazamiento de Stokes” es la distancia entre la absorción máxima y las longitudes de onda de emisión máxima.
En una realización adicional, dicho kit comprende además otros nucleótidos etiquetados con colorantes fluorescentes en los que dichos colorantes son excitados por los láseres desde aproximadamente 440 nm hasta aproximadamente 560 nm.
En una realización alternativa, los kits pueden contener nucleótidos donde la misma base está etiquetada con dos compuestos diferentes. Un primer nucleótido puede etiquetarse con un compuesto descrito en la presente memoria. Un segundo nucleótido puede etiquetarse con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo, un colorante “ rojo” que absorbe a más de 600 nm. Un tercer nucleótido puede etiquetarse como una mezcla del compuesto de colorante fluorescente descrito en la presente memoria y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleótido puede ser “ oscuro” y no contiene ninguna etiqueta. En términos simples, por lo tanto, los nucleótidos 1-4 pueden etiquetarse como “verde” , “ rojizo, “ rojo/verde” y oscuro. Para simplificar el instrumental, se pueden etiquetar cuatro nucleótidos con dos colorantes excitados con un solo láser y, por lo tanto, el etiquetado de los nucleótidos 1-4 puede ser “verde 1” , “verde 2” , “verde 1/verde 2” y oscuro.
En otras realizaciones, los kits pueden incluir una enzima polimerasa capaz de catalizar la incorporación de los nucleótidos a un polinucleótido. Otros componentes que se incluirán en dichos kits pueden incluir búferes y similares. Los nucleótidos etiquetados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en la presente memoria, y otros componentes de los nucleótidos que incluyen mezclas de diferentes nucleótidos, pueden proporcionarse en el kit en una forma concentrada para diluirse antes de su uso. En dichas realizaciones, también puede incluirse un búfer de dilución adecuado.
Métodos de secuenciación
Los nucleótidos (o nucleósidos) que constan de un nuevo colorante fluorescente descrito en la presente memoria pueden utilizarse en cualquier método de análisis que requiera la detección de una etiqueta fluorescente unida a un nucleótido o nucleósido, ya sea por sí misma o incorporada en o asociada a una estructura molecular o conjugada más grande. Algunas realizaciones de la presente solicitud se dirigen a métodos de secuenciación que incluyen: (a) incorporar al menos un nucleótido etiquetado, como se describe en la presente memoria, a un polinucleótido; y (b) detectar el o los nucleótidos etiquetados incorporados al polinucleótido detectando la señal fluorescente del nuevo colorante fluorescente unido a dicho nucleótido o nucleótidos modificados.
En algunas realizaciones, al menos un nucleótido etiquetado se incorpora a un polinucleótido en la fase de síntesis por la acción de una enzima polimerasa. Sin embargo, no se excluyen otros métodos para incorporar nucleótidos marcados a los polinucleótidos, como la síntesis de oligonucleótidos químicos o el ligamiento de oligonucleótidos marcados a oligonucleótidos no etiquetados. Por lo tanto, el término “ incorporar” un nucleótido a un polinucleótido abarca la síntesis de polinucleótidos mediante métodos químicos, así como métodos enzimáticos.
En todas las realizaciones de los métodos, la etapa de detección puede llevarse a cabo mientras la cadena polinucleotídica a la que se incorporan los nucleótidos etiquetados se hibrida con una cadena molde, o después de una etapa de desnaturalización en la que las dos cadenas se separan. Pueden incluirse etapas adicionales, por ejemplo, etapas de reacción química o enzimática o etapas de purificación entre la etapa de síntesis y la etapa de detección. En particular, la cadena diana que incorpora el o los nucleótidos etiquetados puede aislarse o purificarse y luego procesarse adicionalmente o utilizarse en un análisis posterior. A modo de ejemplo, los polinucleótidos diana etiquetados con nucleótidos modificados como se describe en la presente memoria en una etapa sintética pueden utilizarse posteriormente como sondas o cebadores etiquetados. En otras realizaciones, el producto de la fase de síntesis (a) puede someterse a etapas de reacción adicionales y, si se desea, el producto de estas etapas posteriores se purifica o aísla.
Las condiciones adecuadas para la etapa de síntesis serán bien conocidas por quienes estén familiarizados con las técnicas estándar de la biología molecular. En una sola realización, la etapa de síntesis puede ser análoga a una reacción de extensión de cebador estándar utilizando precursores de nucleótidos, incluidos los nucleótidos modificados de acuerdo con la presente realización, para formar una cadena diana extendida complementaria a la cadena molde en presencia de una enzima polimerasa adecuada. En otras realizaciones, la etapa de síntesis puede formar parte de una reacción de amplificación que genera un producto de amplificación bicatenario etiquetado compuesto por cadenas complementarias hibridadas derivadas de la copia de las cadenas de polinucleótidos diana y molde. Otras etapas “ sintéticas” de ejemplo incluyen la traslación de cortes, la polimerización por desplazamiento de la cadena, el etiquetado de ADN con cebado aleatorio, etc. La enzima polimerasa utilizada en la etapa de síntesis debe ser capaz de catalizar la incorporación de nucleótidos modificados de acuerdo con la presente realización. De lo contrario, la naturaleza precisa de la polimerasa no está particularmente limitada, pero puede depender de las condiciones de la reacción sintética. A modo de ejemplo, si la reacción sintética se lleva a cabo mediante termociclado, se requiere una polimerasa termoestable, mientras que esto puede no ser esencial para las reacciones de extensión del cebador estándar. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar a los nucleótidos modificados de acuerdo con la presente realización incluyen las descritas en WO 2005/024010 o WO 2006/120433. En las reacciones sintéticas que se llevan a cabo a temperaturas más bajas, como 37 °C, las enzimas polimerasa no necesitan necesariamente ser las polimerasas termoestables; por lo tanto, la elección de la polimerasa dependerá de una serie de factores, como la temperatura de reacción, el pH, la actividad de desplazamiento de la cadena y similares.
En las realizaciones específicas no limitantes, los nucleótidos o nucleósidos modificados etiquetados con los nuevos colorantes fluorescentes con desplazamiento de Stokes más largo según la presente solicitud pueden utilizarse en un método de secuenciación de los ácidos nucleicos, resecuenciación, secuenciación del genoma completo, puntuación del polimorfismo de un solo nucleótido, cualquier otra aplicación que implique la detección del nucleótido o nucleósido modificado cuando se incorpore a un polinucleótido, o cualquier otra aplicación que requiera el uso de polinucleótidos etiquetados con los nucleótidos modificados que consten de colorantes fluorescentes según la presente solicitud.
En una realización particular, la presente solicitud proporciona el uso de nucleótidos modificados que constan de compuestos de colorante descritos en la presente descripción en una reacción de “ secuenciación por síntesis” de polinucleótidos. La secuenciación por síntesis generalmente implica la adición secuencial de uno o más nucleótidos u oligonucleótidos a una cadena polinucleotídica en crecimiento en la dirección 5' a 3' utilizando una polimerasa o ligasa para formar una cadena polinucleotídica extendida complementaria al ácido nucleico molde que se va a secuenciar. La identidad de la base presente en uno o más de los nucleótidos añadidos se determina en una etapa de detección o “toma de imágenes” . La identidad de la base añadida puede determinarse después de cada etapa de incorporación de los nucleótidos. La secuencia del molde se puede inferir usando reglas convencionales de emparejamiento de bases Watson-Crick. El uso de los nucleótidos modificados marcados con colorantes según la presente realización para la determinación de la identidad de una sola base puede ser útil, por ejemplo, en la puntuación de los polimorfismos de un solo nucleótido, y dichas reacciones de extensión de una sola base están dentro del ámbito de esta solicitud.
En una realización, la secuencia de un polinucleótido molde se determina detectando la incorporación de uno o más nucleótidos a una cadena naciente complementaria al polinucleótido molde que se va a secuenciar a través de la detección de etiquetas fluorescentes unidas al nucleótido o nucleótidos incorporados. La secuenciación del polinucleótido molde se ceba con un cebador adecuado (o preparado como un constructo de horquilla que contendrá el cebador como parte de la horquilla), y la cadena naciente se extiende de manera escalonada mediante la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en una reacción catalizada por polimerasa.
En particular, cada uno de los diferentes trifosfatos de los nucleótidos (A, T, G y C) puede etiquetarse con un fluoróforo único y también consta de un grupo bloqueante en la posición 3' para prevenir la polimerización descontrolada. Por otra parte, uno de los cuatro nucleótidos puede no estar etiquetado (oscuro). La enzima polimerasa incorpora un nucleótido en la cadena naciente complementaria al polinucleótido molde, y el grupo bloqueante impide la incorporación adicional de nucleótidos. Cualquier nucleótido no incorporado se elimina y la señal fluorescente de cada nucleótido incorporado se “ lee” ópticamente con los medios adecuados, como un dispositivo de carga acoplada que emplea excitación láser y filtros de emisión adecuados. El grupo bloqueante 3' y los compuestos de colorante fluorescente se eliminan (desprotegen), particularmente por el mismo método químico o enzimático, para exponer la cadena naciente de una posterior incorporación de los nucleótidos. Típicamente, la identidad del nucleótido incorporado se determinará después de cada etapa de incorporación, pero esto no es estrictamente esencial. De forma similar, la patente estadounidense U.S. Pat. No. 5,302,509 describe un método para secuenciar polinucleótidos inmovilizados sobre un soporte sólido. El método se basa en la incorporación de nucleótidos A, G, C y T bloqueados en 3' etiquetados con fluorescencia en una cadena de crecimiento complementaria al polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido diana, pero se evitan más adiciones por el grupo bloqueante 3'. La etiqueta del nucleótido incorporado puede, luego, determinarse y el grupo bloqueante eliminarse por escisión química para permitir que se produzca la polimerización adicional. El molde de ácido nucleico que se va a secuenciar en una reacción de secuenciación por síntesis puede ser cualquier polinucleótido que se desee secuenciar. El molde de ácido nucleico para una reacción de secuenciación constará típicamente de una región bicatenaria que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como cebador o punto de iniciación para la adición de más nucleótidos en la reacción de secuenciación. La región del molde que se va a secuenciar colgará este grupo hidroxilo 3' libre en la cadena complementaria. La región sobresaliente del molde que secuenciar puede ser monocatenaria, pero puede ser bicatenaria, siempre que un “ corte esté presente” en la cadena complementaria a la cadena molde que se vaya a secuenciar para proporcionar un grupo 3' OH libre al inicio de la reacción de secuenciación. En dichas realizaciones, la secuenciación puede continuar mediante el desplazamiento de cadenas. En ciertas realizaciones, un cebador que porta el grupo hidroxilo 3' libre puede añadirse como un componente aparte (por ejemplo, un oligonucleótido corto) que se hibrida con una región monocatenaria del molde que se va a secuenciar. Por otra parte, el cebador y la cadena molde que se va a secuenciar pueden formar parte de una cadena de ácido nucleico parcialmente autocomplementaria capaz de formar un dúplex intramolecular, como por ejemplo, una estructura en bucle de horquilla. Los polinucleótidos de horquilla y los métodos por los que pueden unirse a soportes sólidos se describen en las publicaciones de PCT N.° w O 2001/057248 y WO 2005/047301. Los nucleótidos se añaden sucesivamente al grupo 3'-hidroxilo libre, lo que da como resultado la síntesis de una cadena de polinucleótidos en la dirección 5' a 3'. La naturaleza de la base que se ha añadido puede determinarse, particularmente pero no necesariamente, después de cada adición de nucleótidos, lo que así proporciona información de la secuencia del molde de ácido nucleico. El término “ incorporación” de un nucleótido a una cadena de ácido nucleico (o polinucleótido) en este contexto se refiere a la unión del nucleótido al grupo hidroxilo 3' libre de la cadena de ácido nucleico a través de la formación de un enlace fosfodiéster con el grupo fosfato 5' del nucleótido.
El molde de ácido nucleico que se va a secuenciar puede ser ADN o ARN, o incluso una molécula híbrida compuesta de desoxinucleótidos y ribonucleótidos. El molde de ácido nucleico puede constar de nucleótidos de origen natural y/o no natural y enlaces del segmento principal naturales o no naturales, siempre que estos no impidan copiar el molde en la reacción de secuenciación.
En ciertas realizaciones, el molde de ácido nucleico que se va a secuenciar puede unirse a un soporte sólido a través de cualquier método de enlace adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante unión covalente. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos molde pueden unirse directamente a un soporte sólido (por ejemplo, un soporte a base de sílice). Sin embargo, en otras realizaciones, la superficie del soporte sólido puede modificarse de alguna manera para permitir una unión covalente directa de los polinucleótidos del molde, o inmovilizar los polinucleótidos molde a través de un hidrogel o una multicapa polielectrolítica, que puede estar unido de forma no covalente al soporte sólido.
Las matrices en las que los polinucleótidos se han unido directamente a los soportes a base de sílice son las que se describen por ejemplo en la publicación de PCT N.° WO 2000/006770, en donde los polinucleótidos se inmovilizan sobre un soporte de vidrio mediante reacción entre un grupo epóxido colgante en el vidrio con un grupo amino interno en el polinucleótido. Además, la publicación de PCT N.° WO2005/047301 describe matrices de polinucleótidos unidos a un soporte sólido, por ejemplo, para su uso en la preparación de matrices de moléculas individuales, mediante la reacción de un nucleófilo basado en azufre con el soporte sólido. Otro ejemplo adicional de polinucleótidos molde admitidos en sólidos es cuando los polinucleótidos molde se unen al hidrogel admitido sobre soportes sólidos basados en sílice u otros. Los soportes a base de sílice se utilizan típicamente para admitir hidrogeles y matrices de hidrogel como se describe en las publicaciones de PCT N.° WO 00/31148, WO 01/01143, WO 02/12566, WO 03/014392, WO 00/53812 y la patente estadounidense U.S. Pat. No. 6,465,178.
Una superficie particular a la que se pueden inmovilizar polinucleótidos molde es un hidrogel de poliacrilamida. Los hidrogeles de poliacrilamida se describen en la técnica anterior, de algunos de los cuales se ha hablado anteriormente. Los hidrogeles específicos que pueden utilizarse en la presente solicitud incluyen los descritos en el documento WO 2005/065814 y la publicación estadounidense N.° 2014/0079923. En una sola realización, el hidrogel es PAZAM (poli (N-(5-azidoacetamidil) acrilamida-co-acrilamida).
Las moléculas molde de ADN se pueden unir a microesferas o micropartículas para efectuar la secuenciación; por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense U.S. Pat. No. 6,172,218. Otros ejemplos de la preparación de bibliotecas de microesferas donde cada microesfera contiene diferentes secuencias de ADN pueden encontrarse en Margulies et al., Nature 437, 376-380 (2005); Shendure et al., Science. 309(5741):1728-1732 (2005). La secuenciación de las matrices de dichas microesferas utilizando nucleótidos, como se describe, está dentro del ámbito de la presente solicitud.
El molde o los moldes que se van a secuenciar pueden formar parte de una “ matriz” sobre un soporte sólido, en cuyo caso la matriz puede tomar cualquier forma conveniente. Por lo tanto, el método de la presente realización es aplicable a todos los tipos de matrices de “ alta densidad” , que incluyen matrices de moléculas individuales, matrices agrupadas y matrices de microesferas. Los nucleótidos modificados etiquetados con compuestos de colorante de la presente solicitud pueden utilizarse en moldes de secuenciación sobre esencialmente cualquier tipo de matriz que consta de la inmovilización de moléculas de ácido nucleico sobre un soporte sólido y, más particularmente, cualquier tipo de matriz de alta densidad. Sin embargo, los nucleótidos modificados etiquetados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en la presente memoria son particularmente ventajosos en el contexto de la secuenciación de las matrices agrupadas.
En matrices múltiples o agrupadas, las regiones distintivas de la matriz constan de varias moléculas molde de polinucleótidos. El término “ matriz agrupada” se refiere a una matriz en la cual distintas regiones o zonas de la matriz constan de varias moléculas de polinucleótidos que no pueden resolverse individualmente por medios ópticos. Dependiendo de cómo se forme la matriz, cada zona en la matriz puede constar de varias copias de una sola molécula polinucleotídica individual o incluso de varias copias de un pequeño número de moléculas de polinucleótidos diferentes (por ejemplo, varias copias de dos cadenas de ácido nucleico complementarias). Las matrices múltiples de polinucleótidos o agrupadas de moléculas de ácido nucleico pueden producirse mediante el uso de técnicas generalmente conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos en los que tanto los productos molde como los de amplificación permanecen inmovilizados sobre un soporte sólido para formar matrices compuestas por agrupaciones o “ colonias” de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Las moléculas de ácido nucleico presentes en las matrices agrupadas preparadas de acuerdo con estos métodos son moldes adecuados para la secuenciación utilizando los nucleótidos modificados etiquetados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en la presente memoria.
Los nucleótidos modificados etiquetados con compuestos de colorante de la presente solicitud también son útiles en la secuenciación de moldes en las matrices de moléculas individuales. El término “ matriz de moléculas individuales” o “ SMA” , como se emplea en la presente rea, se refiere a una población de moléculas de polinucleótidos, distribuidas (o dispuestas) sobre un soporte sólido, en donde la separación de cualquier polinucleótido individual de todos los demás de la población es tal que es posible efectuar una resolución individual de los polinucleótidos. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico diana inmovilizadas sobre la superficie del soporte sólido deben ser capaces de resolverse por medios ópticos. Esto significa que, dentro del área resoluble del dispositivo de formación de imágenes particular utilizado, debe haber una o más señales distintas, cada una de las cuales representa un polinucleótido.
Esto puede lograrse allí donde la separación entre moléculas de polinucleótidos adyacentes en la matriz es de al menos 100 nm, más particularmente de al menos 250 nm, aún más particularmente de al menos 300 nm, incluso más particularmente de al menos 350 nm. Por lo tanto, cada molécula puede resolverse individualmente y detectarse como un punto fluorescente de una sola molécula, y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de molécula única también exhibe un fotoblanqueamiento de una sola etapa.
Los términos “ resueltas individualmente” y “ resolución individual” se utilizan en la presente memoria para especificar que, cuando se visualiza, es posible distinguir una molécula en la matriz de sus moléculas vecinas. La separación entre moléculas individuales en la matriz se determinará, en parte, por la técnica particular utilizada para resolver las moléculas individuales. Las características generales de las matrices de moléculas individuales se entenderán con referencia a las publicaciones de PCT N.° WO 2000/006770 y WO 2001/057248. Aunque una aplicación de los nucleótidos modificados de la presente memoria está en las reacciones de secuenciación por síntesis, la utilidad de dichos nucleótidos etiquetados no se limita a dichos métodos. De hecho, los nucleótidos pueden utilizarse ventajosamente en cualquier metodología de secuenciación que requiera la detección de etiquetas fluorescentes unidas a nucleótidos incorporados a un polinucleótido.
En particular, los nucleótidos modificados etiquetados con los compuestos de colorante de la presente solicitud pueden utilizarse en protocolos automatizados de secuenciación fluorescente, particularmente, en la secuenciación del ciclo terminador del colorante fluorescente en función del método de secuenciación de la terminación de la cadena de Sanger y colaboradores. Dichos métodos emplean generalmente enzimas y la secuenciación del ciclo para incorporar didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia en una reacción de secuenciación de extensión del cebador. Los denominados “ métodos de secuenciación de Sanger” y los protocolos relacionados (tipo de Sanger), dependen de la terminación de la cadena aleatoria con didesoxinucleótidos etiquetados.
Por lo tanto, la presente realización también abarca nucleótidos modificados etiquetados con compuestos de colorante como se describe en la presente memoria que son didesoxinucleótidos que carecen de grupos hidroxilo en ambas posiciones 3' y 2', dichos didesoxinucleótidos modificados son adecuados para su uso en métodos de secuenciación de tipo Sanger y similares.
Ejemplos
Se describen otras realizaciones con más detalle en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.
Ejemplo 1
4-[3-(benzo[d]tiazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano[3,2-g] quinolin-9(6H)-il] butanoato de tert-butilo (Compuesto 1-1)
Figure imgf000026_0001
4-(6-formil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il) butanoato de tert-butilo (0,19 g) se disolvió en etanol (2 mL). Se añadió 2-(benzo[d]tiazol-2-il) acetato de etilo (0,124 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió piperidina (5 ^L) y el color de la mezcla de reacción se volvió rojo-amarillo. La mezcla de la reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, la mezcla de la reacción cruda se sometió a tratamiento acuoso, secado y purificación por cromatografía (gel de sílice con éter de petróleo/acetato de etilo como eluyente) para producir el Compuesto I-1. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 518,22. Encontrado: (-) 517 (M-1).
Ejemplo 2
Ácido 4-[3-(Benzo[d]tiazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano [3,2-g1quinolin-9(6H)-illubutanoico (Compuesto I-2)
Figure imgf000026_0002
El compuesto I-1 (51,8 mg) se disolvió en DCM (5 mL) y se añadió ácido trifluoroacético (0,5 mL) mediante jeringa y la mezcla de la reacción se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación utilizando un evaporador rotatorio, el residuo se trituró con agua (5 mL) sólido filtrado y se secó para proporcionar el Compuesto I-2. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 462,16. Encontrado: (-) 461 (M-1).
Ejemplo 3
Tert-butilo 4-[3-(benzo [d] tiazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-2H-pirano[3,2-g] quinolin-9(6H)-il] butanoato (Compuesto I-3)
Figure imgf000026_0003
4-(6-formil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-quinolin-1(2H)-il) butanoato de tert-butilo (0,19 g) se disolvió en etanol (2 mL). Se añadió acetato de etilo 2-(benzo[d]tiazol-2-il) (0,124 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió piperidina (5 ^L) y el color de la mezcla de reacción se volvió rojo-amarillo. La mezcla de reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche y la mezcla de la reacción en bruto se sometió a tratamiento acuoso, secado y purificación por cromatografía (gel de sílice con éter de petróleo/acetato de etilo como eluyente) para producir el compuesto I-3. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 516,22. Encontrado: (-) 515 (M-1); (+) 517 (M+1).
Ejemplo 4
Ácido 4-[3-(Benzo[d]tiazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(6H)-il] butanoico (Compuesto I-4)
Figure imgf000027_0001
El compuesto I-3 (51,7 mg) se disolvió en DCM (6 mL) y se añadió ácido trifluoroacético (1 mL) mediante jeringa y la mezcla de la reacción se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación utilizando un evaporador rotatorio, y el residuo se trituró con agua (5 mL). El sólido formado se separó por filtración y se secó para proporcionar el Compuesto 1-4. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 460,15. Encontrado: (+) 461 (M+1).
Ejemplo 5
Butanoato de t-butilo 4-[3-(benzoxazolil-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(6H)-il] (Compuesto I-5)
Figure imgf000027_0002
4-(6-formil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il) butanoato de tert-butilo (0,18 g) se disolvió en etanol (3 mL). Se añadió acetato de etilo 2-(benzoxazolil) (0,124 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió piperidina (5 ^L). El color de la mezcla de la reacción se volvió rojo-amarillo. La mezcla de la reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de la reacción en bruto se sometió a tratamiento acuoso, secado y purificación por cromatografía (gel de sílice con éter de petróleo/acetato de etilo como eluyente) para producir el Compuesto 1-5. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 502,25. Encontrado: (-) 501 (M-1).
Ejemplo 6
Ácido 4-[3-Benzoxazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(6H)-illubutanoico (Compuesto I-6)
Figure imgf000027_0003
El compuesto I-5 (50 mg) se disolvió en DCM (5 mL) y se añadió ácido trifluoroacético (0,5 mL) mediante jeringa y la mezcla de la reacción se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación utilizando un evaporador rotatorio, y el residuo se trituró con agua (5 mL). El sólido formado se separó por filtración y se secó para proporcionar el compuesto I-6. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 446,16. Encontrado: (-) 445 (M-1).
Ejemplo 7
4-[3-(benzoxazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(6H)-illubutanoato de etilo (Compuesto I-7)
Figure imgf000028_0001
Butanoato de etilo 4-[6-formil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-3,4-quinolin-1(2H)-il] (0,17 g) se disolvió en etanol anhidro (2,5 mL). Se añadió acetato de etilo 2-(benzoxazol-2-il) (0,102 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió piperidina (5 ^L). La mezcla de la reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de la reacción en bruto se sometió a tratamiento acuoso, secado y purificación por cromatografía (gel de sílice con éter de petróleo/acetato de etilo como eluyente) para producir el Compuesto I-7. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 472,20. Encontrado: (+) 473 (M+1).
Ejemplo 8
Ácido 4-[3-(Benzoxazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(6H)-il] butanoico (Compuesto I-8)
Figure imgf000028_0002
El compuesto I-7 (51,8 mg) se disolvió en ácido acético (2,5 mL) y se añadió ácido clorhídrico (5 mL), y la mezcla de la reacción se dejó agitando durante la noche a 60 °C. El disolvente se separó por destilación utilizando un evaporador rotatorio, y el residuo se trituró con agua (5 mL). El compuesto I-8 se filtró y se secó al vacío. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 444,17. Encontrado: (+) 445 (M+1).
Ejemplo 9
Ácido 3-[4-(3-(benzoxazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(8H)-il)-N-(4-(tert-butoxi)-4-oxobutil) butanamido] propano-1-sulfónico (Compuesto I-9)
Figure imgf000028_0003
El compuesto I-8 (50 mg, 112 ^mol) se disolvió en dimetilformamida (1 mL) y después el disolvente se separó por destilación al vacío. Esta operación se repitió dos veces más; después, el compuesto seco I-8 se redisolvió en DMF (1 mL) a temperatura ambiente. Se añadió hexafluorofosfato de (Benzotriazol-1-iloxi) tripirrolidinofosfónico (PyBOP, 1,5 eq., 64 mg, 169 ^mol) al matraz, después se añadió N, N-Diisopropiletilamina (DIPEA, 3 eq., 336 ^mol, 43 mg, 58 ^ l) mediante micropipeta. El matraz de la reacción se selló con gas nitrógeno. Después de completar la reacción, la solución de colorante activado en DMF se mezcló con 3-[(4-(tert-butoxi)-4-oxobutil)amino]propano-1-sulfonato (1,5 eq., 224 ^mol, 63 mg). Se añadió más DIPEA (3 eq., 336 ^mol, 43 mg, 58 ^L). El matraz se cerró herméticamente con gas nitrógeno y se dejó durante la noche a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC, HPLC y (LCMS). Cuando se completó la reacción, se añadió agua (2 mL), la mezcla de la reacción se agitó durante 15 min y después el disolvente se separó por destilación de la mezcla de la reacción al vacío a temperatura ambiente. El compuesto I-9 se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Ejemplo 10
Ácido 4-[4-(3-(Benzoxazol-2-il)-6,8,8-trimetil-2-oxo-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(8H)-il)-N-(3-sulfopropil) butanamidolbutanoico (Compuesto I-10)
Figure imgf000029_0001
El compuesto en bruto seco I-9 se volvió a disolver en diclorometano (2 mL). Se añadió ácido trifluoroacético (0,5 mL) y la reacción se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió con agua concentrada en vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa. La pureza, la estructura y la composición del producto se confirmaron mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (d UiS): PM calculado 651,23. Encontrado: (-) 650 (M-1).
Ejemplo 11
Ácido 4-[3-(Benzoxazol-2-il)-8,8-dimetil-2-oxo-6-(sulfometil)-2H-pirano [3,2-g] quinolin-9(8H)-il) butanoico (Compuesto 1-11)
Figure imgf000029_0002
Se enfrió ácido sulfúrico (2,5 mL) hasta aproximadamente 5 °C, después se añadió el compuesto I-8 (45 mg) y la mezcla de la reacción se agitó a 20-25 °C durante 1 h. Después, la mezcla de la reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de la reacción se diluyó lentamente con éter anhidro en presencia de enfriamiento externo. El precipitado se separó por filtración, se disolvió en una mezcla de agua (5 mL) y acetonitrilo (5 mL). La solución se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa. La pureza, la estructura y la composición del producto se confirmaron mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 524,13. Encontrado: (-) 623 (M-1).
Ejemplo 12
1-[(5-carboxipentil)- 4-(11-oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1H, 5H, 11H-pirano [2,3-f]pirido [3,2,1 -ij] quinolin-10-il] piridinio bromuro (Compuesto I-12) (no según la invención)
Figure imgf000029_0003
8-Hidroxi-2,3,6,7-tetrahidro-1H, 5H-pirido [3,2,1 -ij] quinolina-9-carbaldehído (0,217 g) se disolvió en etanol (6 mL). A esta solución se le añadió bromuro de 1-[(5-carboxipentil)-(4-etxoxicarbonil) metilpiridinio (0,36 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió una solución de acetato de piperidina preparada a partir de piperidina (20 mg) y ácido acético (20 mg)/en etanol (5 mL) y esta mezcla de la reacción se agitó a 60 °C durante 5 horas y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación y el residuo se disolvió en una mezcla de agua (15 mL) y acetonitrilo (15 mL). La solución resultante se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa. Este compuesto se convirtió en forma de sal de bromhidrato más estable para proporcionar el compuesto I-12. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 432,20. Encontrado: (+) 433 (M+1).
Ejemplo 13
Bromuro de 1-(5-carboxipentil)-4-(1,1,7,7-tetrametil-11-oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1H, 5H, 11H-pirano [2,3-f] pirido [3,2,1-ij] quinolin-10-il) piridin-1-io (Compuesto I-13) (no según la invención)
Figure imgf000030_0001
Se disolvió 8-hidroxi-2,3,6,7-tetrahidro-1,1,7,7-tetrametil-1H, 5H-pirido [3,2,1 -ij] quinolina-9-carbaldehído (0,27 g) en etanol (7 mL). Se añadió bromuro de 1-[(5-carboxipentil)-(4-etxoxicarbonil) metilpiridinio (0,36 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió una solución de acetato de piperidina preparada a partir de piperidina (20 mg) y ácido acético (20 mg) en etanol (5 mL). Esta mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 5 horas y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación y el residuo de color rojo se disolvió en una mezcla de agua (15 mL) y acetonitrilo (15 mL). La solución resultante se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa. Este compuesto se convirtió en la forma de sal de bromhidrato más estable mediante reacción con solución de HBr en ácido acético (10 %, 0,3 mL) para proporcionar el compuesto I-13.
Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 488,27. Encontrado: (+) 489 (M+1).
Ejemplo 14
Bromuro de 1-(5-carboxipentil)-4-(9-etil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-3-il) piridin-1-io (Compuesto 1-14) (no según la invención)
Figure imgf000030_0002
Se disolvió 1-etil-7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolina-6-carbaldehído (0,2 g) en etanol (10 mL). Se añadió bromuro de 1-[(5-carboxipentil)-(4-etxoxicarbonil) metilpiridinio (0,36 g), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió una solución de acetato de piperidina preparada a partir de piperidina (20 mg) y ácido acético (20 mg)/en etanol (5 mL). Esta mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 2 horas y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación y el residuo se disolvió en una mezcla de agua (10 mL) y acetonitrilo (10 mL). La solución resultante se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa. Este compuesto se convirtió en la forma de sal de bromhidrato más estable mediante reacción con solución de HBr en ácido acético (10 %, 0,3 mL) para proporcionar el compuesto I-14. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 420,20. Encontrado: (+) 421 (M+1).
Ejemplo 15
4-[4-(9-(4-(tert-Butoxi)-4-oxobutil) -6,8,8-trimetil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano [3,2-g]quinolin-3-il)piridin-1 -io-1-il] butano-1-sulfonato (Compuesto I-15) (no según la invención)
Figure imgf000030_0003
4-(6-formil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il) butanoato de tert-butilo (0,72 g) se disolvió en etanol (25 mL). Se añadió 4-[4-(2-Etoxi-2-oxoetil) piridin-1-io-1-il) butano-1-sulfonato (0,60 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió la solución de acetato de piperidina preparada a partir de piperidina (50 mg) y ácido acético (50 mg)/en etanol (15 mL). Esta mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 3 horas y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación y el residuo se disolvió en una mezcla de agua (20 mL) y acetonitrilo (20 mL). La solución resultante se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el compuesto I-15. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 598,20. Encontrado: (+) 599 (M+1).
Ejemplo 16
4-[4-(9-(3-Carboxipropil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-3-il) piridin-1 -io-1 -il] butano-1-sulfonato (Compuesto 1-16) (no según la invención)
Figure imgf000031_0001
El compuesto I-15 se disolvió en DCM (5 ml) y se añadió TFA. La mezcla de la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación al vacío. Al residuo se le añadieron agua (1,5 mL) y acetonitrilo (10 mL) y el disolvente se separó por destilación de nuevo para eliminar el TFA. El producto cristalino naranja restante se disolvió en una mezcla de agua (12 mL) y acetonitrilo (12 mL). La solución resultante se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 542,21. Encontrado: (+) 543 (M+1).
Ejemplo 17
4-[4-(9-(4-(tert-Butoxi)-4-oxobutil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-3-il)pi ridin-1 -io-1 -i l]butano-1-sulfonato (Compuesto I-17) (no según la invención)
Figure imgf000031_0002
4-(6-formil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-quinolin-1(2H)-il) butanoato de tert-butilo (0,36 g) se suspendió en etanol (5 mL). Se añadió 4-[4-(2-Etoxi-2-oxoetil) piridin-1 -io-1 -il) butano-1-sulfonato (0,30 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió la solución de acetato de piperidina preparada a partir de piperidina (50 mg) y ácido acético (50 mg) en etanol (15 mL). Esta mezcla de reacción se agitó a 50 °C durante 5 horas y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se separó por destilación y el residuo se disolvió en una mezcla de agua (10 mL) y acetonitrilo (10 mL). La solución resultante se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el compuesto I-17. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMs . MS (DUIS): PM calculado 596,26. Encontrado: (+) 597 (M+1).
Ejemplo 18
4-[4-(9-(3-Carboxipropil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-3-il) piridin-1 -io-1 -il] butano-1-sulfonato (Compuesto 1-18) (no según la invención)
Figure imgf000031_0003
El compuesto 1-17 se disolvió en DCM (5 ml) y se añadió TFA. La mezcla de la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente; posteriormente, el disolvente se separó por destilación al vacío. Al residuo se añadieron agua (2 mL) y acetonitrilo (10 mL) y el disolvente se separó por destilación de nuevo para eliminar el TFA residual. El producto cristalino naranja restante se trituró con éter, se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el compuesto I-18. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 540,19. Encontrado: (-) 539 (M-1); (+) 541 (M+1).
Ejemplo 19
4-(4-(9-(4-(4-(tert-Butoxi)-4-oxobutil) (3-sulfopropil) amino)-4-oxobutil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g] quinolin-3-il)piridin-1-io-1-il)butano-1 -sulfonato (Compuesto I-19) (no según la invención)
Figure imgf000032_0001
El compuesto I-8 (50 mg) se disolvió en DMF (1 mL) y después el disolvente se separó por destilación al vacío. Esta operación se repitió dos veces. El compuesto seco I-8 se redisolvió en DMF (1,5 mL) a temperatura ambiente. Se añadió hexafluorofosfato de (Benzotriazol-1-iloxi) tripirrolidinofosfónico (PyBOP, 1,5 eq., 64 mg, 169 |jmol) al matraz; después se añadió el exceso de DIPEA (60 jL). El matraz de la reacción se cerró herméticamente con gas nitrógeno. Después de completar la reacción, la solución de colorante activado en DMF se mezcló con 3-[(4-(tert-butoxi)-4-oxobutil)amino]propano-1-sulfonato (63 mg). Se añadió más DIPEA (58 jL). El matraz se cerró herméticamente con gas nitrógeno y se dejó durante la noche a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC, HPLC y (LCMS). Cuando se completó la reacción, se añadió agua (2 mL). La mezcla de la reacción se agitó durante 15 min y después el disolvente se separó por destilación de la mezcla de la reacción al vacío a temperatura ambiente para proporcionar el Compuesto I-19. Este compuesto se utilizó en la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
Ejemplo 20
4-(4-(9-(4-( 3-Carboxipropil) (3-sulfopropil) amino) -4-oxobutil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-3-il) piridin-1-io-1-il) butano-1-sulfonato (Compuesto I-20) (no según a invención)
Figure imgf000032_0002
El compuesto seco I-19 se disolvió en diclorometano (5 mL). Se añadió ácido trifluoroacético (0,5 mL) y la reacción se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió con agua (0,5 mL), al vacío y luego se purificó mediante HPLC preparativa. La pureza, la estructura y la composición del producto se confirmaron mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 747,25. Encontrado: (-) 746 (M-1).
Ejemplo 21
bromuro de 1-(5-carboxipentil)-4-(7-(dietilamino) -2-oxo-2H-cromen-3-il) piridin-1-io (Compuesto 1-21) (no según la invención)
Figure imgf000032_0003
Se disolvió aldehido 4-dietilaminosalicílico (0,19 g) en etanol (5 mL). Se añadió bromuro de 1-[(5-carboxipentil)-(4-etxoxicarbonil) metilpiridinio (0,36 g), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió una solución de acetato de piperidina preparada a partir de piperidina (10 mg) y ácido acético (10 mg)/en etanol (5 mL).
Esta mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 5 horas y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se separó por filtración, se suspendió en una solución de HBr en ácido acético (20 %, 1 mL). Esta suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y el producto final se filtró para proporcionar la sal de HBr más estable en el Compuesto I-21. Este colorante se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Se confirmaron la pureza, la estructura y la composición mediante HPLC, RMN y LCMS. MS (DUIS): PM calculado 408,20. Encontrado: (+) 409 (M+1), 817 (2M+1).
La Tabla 2 resume el rendimiento, los datos de caracterización y las propiedades espectrales de los nuevos colorantes fluorescentes a base de cumarina descritos en los ejemplos.
Tabla 2.
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 22
Procedimiento general para la síntesis de conjugados de nucleótidos completamente funcionales
Los colorantes fluorescentes a base de cumarina descritos en la presente memoria se acoplan al nucleótido sustituido por el amino A-LN3-NH2 o C-LN3-NH2 correspondiente después de la activación del grupo carboxílico;
Figure imgf000034_0001
El colorante (10 jm ol) se disuelve en dimetilformamida (1 mL) y después el disolvente se separó por destilación al vacío. Este procedimiento se repite dos veces más. El colorante seco se disuelve en N, N-dimetilacetamida (DMA, 0,2 mL) en un matraz de fondo redondo de 5 mL a temperatura ambiente.
Se añade el tetrafluoroborato de N,N,N',N'-Tetrametil-O-(N-succinimidilo) uronio (TSTU, 1,5 eq., 15 jmol, 4,5 mg) al matraz que N, N-diisopropiletilamina (DIPEA, 3 eq., 30 jmol, 3,8 mg, 5,2 j L) mediante micropipeta a esta solución. El matraz de la reacción se sella con gas nitrógeno. Después de 15 minutos, el progreso de la reacción se controla mediante TLC (H2O eluyente/acetonitrilo 1:9) y HPLC. Mientras tanto, la solución de derivados de N-LN3-NH 2 correspondientes (20 mM, 1,5 eq, 15 jmol, 0,75 mL) se concentró al vacío y luego se volvió a disolver en agua (20 j L). La solución del colorante activado en DMA se transfirió al matraz que contenía la solución de N-LN3-NH2. Se añade más DIPEA (3 eq, 30 jmol, 3,8 mg, 5,2 j L) junto con trietilamina (1 j L). El progreso del acoplamiento se controla cada hora mediante TLC, HPLC y LCMS.
Cuando la reacción se completa, se añade búfer de bicarbonato de trietilamina (TEAB, 0,05 M aprox., 3 ml) mediante pipeta. La purificación inicial del nucleótido completamente funcionalizado se lleva a cabo ejecutando la mezcla de la reacción inactivada mediante una columna DEAE-Sephadex ® (Sephadex vertida en un cartucho Biotage de 25 g vacío, sistema de disolvente TEAB/MeCN). Esto eliminará la mayor parte del colorante restante.
Se concentran las fracciones de la columna Sephadex al vacío. El material en bruto se volvió a disolver en el volumen mínimo de agua y acetonitrilo, antes de filtrarlo a través de un filtro de nailon de 20 jm . La solución filtrada se purifica mediante HPLC preparativa. La composición de los compuestos preparados se confirmó mediante LCMS.
La Tabla 3 resume la estructura y las propiedades espectrales de varios nucleótidos etiquetados con nuevos colorantes a base de cumarina descritos en la presente memoria. El colorante ffA-LN3 se refiere a un nucleótido A completamente funcionalizado con un enlazador LN3 y etiquetado con un colorante a base de cumarina descrito en la presente memoria. El colorante ffC-LN3 se refiere a un nucleótido C completamente funcionalizado con conector LN3 y etiquetado con un colorante a base de cumarina descrito en este documento. El grupo R de cada una de las estructuras se refiere al resto del colorante a base de cumarina después de la conjugación.
Figure imgf000035_0001
Tabla 3.
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000036_0001
La eficacia de los nucleótidos A etiquetados con el nuevo colorante a base de cumarina I-16 con desplazamiento de Stokes largo se demostró por comparación con los nucleótidos A correspondientes etiquetados con los colorantes comerciales DY510XL y Chromeo™ 494 (CH494). En este ejemplo de secuenciación, se utilizó el método de detección de dos canales. Con respecto a los métodos de dos canales descritos en la presente memoria, los ácidos nucleicos pueden secuenciarse utilizando métodos y sistemas descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente Estadounidense N.° 2013/0079232. En la detección de dos canales, un ácido nucleico puede secuenciarse proporcionando un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal, un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal, un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal y un cuarto tipo de nucleótido que carece de una etiqueta que no está, o mínimamente, detectada en cualquiera de los canales. Los diagramas de dispersión se generaron mediante análisis RTA2.0.93 de un experimento para comparar las intensidades relativas del nucleótido A completamente funcionalizado etiquetado con I-16, Dy510XL y Chromeo™ 494 Las comparaciones se realizaron en la misma ejecución (misma celda de flujo y mismos reactivos de secuenciación) rehibridando el cebador de secuenciación y realizando un ciclo SBS corto (26 ciclos). Los diagramas de dispersión ilustrados en la Figura 1 hasta la Figura 3 estaban en el ciclo 5 de cada una de las 26 ejecuciones de los ciclos.
La Figura 1 ilustra el diagrama de dispersión de una mezcla de nucleótidos completamente funcionalizados (ffN) que contiene: A-I-16 (2 |j M), C-NR440 (2 j i M), G oscuro (2 j i M) y T-NR550S0 (1 j i M) en búfer de incorporación con Pol812 (la exposición al azul (Canal 1) 500 ms, la exposición al verde (Canal 2) 1000 ms; escaneado en la mezcla de barrido).
La Figura 2 ilustra el diagrama de dispersión de una mezcla de ffN que contiene: A-DY510XL (2 jiM), C-NR440 (2 jiM), G oscuro (2 j i M) y T-NR550S0 (1 j i M) en el búfer de incorporación con Pol812 (la exposición al azul (Canal 1) 500 ms, la exposición al verde (Canal 2) 1000 ms; escaneado en SRE).
La Figura 3 ilustra el diagrama de dispersión de una mezcla de ffN que contiene: A-CH494 (2 ji M), C-NR440 (2 ji M), G oscuro (2 j i M) y T-NR550S0 (1 j i M) en el búfer de incorporación con Pol812 (la exposición al azul (Canal 1) 500 ms, la exposición al verde (Canal 2) 1000 ms; escaneado en la mezcla de barrido).
En cada una de las Figuras 1 a 3 , el nucleótido “ G” no está marcado y se muestra como la nube izquierda inferior (“ G oscuro” ). La señal del nuevo colorante a base de cumarina I-16, DY510XL, y el nucleótido “A” marcado con CH494 se muestra como la nube superior derecha en las Figuras 1,2 y 3 respectivamente. La señal del nucleótido NR550S0 etiquetada con el colorante “ T” se indica mediante la nube superior izquierda, y la señal de nucleótidos “ C” etiquetada con el colorante NR440 se indica mediante la nube inferior derecha. El eje X muestra la intensidad de la señal de un canal, y el eje Y muestra la intensidad de la señal del otro canal. Muestra que los conjugados de nucleótidos A completamente funcionales etiquetados con colorante I-16 proporcionan intensidades de señal suficientes y una separación de las nubes sustancialmente mejor, en comparación con los colorantes para el desplazamiento de Stokes largo DY510XL y CH494. La estructura de NR440 se describe en la solicitud provisional estadounidense N.° 62/402,635.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de la Fórmula (I), o sales, formas mesoméricas de los mismos:
Figure imgf000038_0001
en donde R1 es
Figure imgf000038_0002
cada R2, R3, R4 y R5 se selecciona independientemente del grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo;
R6 es alquilo sustituido por carboxilo, -C(O)OR12 o -C(O)NR13R14;
R9 es H;
cada R7 y R8 se selecciona independientemente del grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo;
X se selecciona en el grupo que consta de O, S, NR11 y Se;
R11 se selecciona en el grupo que consta de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo, heteroarilo, carbociclilo y heterociclilo;
R12 se selecciona en el grupo que consta de alquilo, arilo, heteroarilo y cicloalquilo de 3 a 7 miembros;
cada R13 y R14 se selecciona independientemente entre H, alquilo, arilo, heteroarilo y cicloalquilo de 3 a 7 miembros; y
el enlace representado por una línea continua y discontinua----------se selecciona en el grupo que consta de un enlace simple y un enlace doble, siempre que, cuando---------- sea un enlace doble, R3 esté ausente.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde X es O.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde X es S.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el enlace representado por una línea continua y discontinua----------es un enlace doble y
en donde R2 es alquilo, preferiblemente metilo.
5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde al menos uno de R4 y R5 es alquilo.
6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el enlace representado por una línea continua y discontinua............es un enlace simple y en el que al menos uno de R2 y R3 es alquilo.
7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde al menos uno de R4 y R5 es alquilo.
8. El compuesto de la reivindicación 1, seleccionado en el grupo que consta de:
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
y sales, formas mesoméricas de los mismos.
9. Un nucleótido u oligonucleótido etiquetado con un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. El nucleótido u oligonucleótido etiquetado de la reivindicación 9, en donde el compuesto está unido covalentemente a un nucleótido o oligonucleótido a través de R6.
11. El nucleótido u oligonucleótido etiquetado de la reivindicación 9, en donde el compuesto está unido a la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-deaza purina del nucleótido u oligonucleótido a través de un resto enlazador.
12. Kit que consta de uno o más nucleótidos, en donde al menos un nucleótido es un nucleótido etiquetado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Método de secuenciación que incluye incorporar un nucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en un ensayo de secuenciación que incluye opcionalmente detectar el nucleótido.
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