ES2914688T3 - Nuevos colorantes fluorescentes y sus usos como biomarcadores - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de Fórmula (I) o formas mesómeras del mismo: **(Ver fórmula)** en el que cada R1, R2 y R1' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido; alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido; R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S- sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; R se selecciona de -OR7 o -NR8R9; R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; cada R8 y R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; X se selecciona del grupo que consiste en O, S, NR10, y Se; R10 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; m es un número entero seleccionado de 0 a 4; y n es un número entero seleccionado de 0 a 4; siempre que cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es -NHCH(CH3)CH2OH; entonces X se selecciona de O, S o Se; cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es-OH; entonces X se selecciona de S o Se; cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es metilo; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se; y cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es -S(O2)Et; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se; en el que el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono; el grupo alquenilo tiene de 2 a 20 átomos de carbono, el grupo alquinilo tiene de 2 a 20 átomos de carbono; y en el que sustituido significa que un grupo está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C1-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), carbociclilo-C3- C7-alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros -alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1- C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilalquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros alquilo(C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 alquilo (C1-C6) (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), haloalquilo (C1-C6) (p. ej., -CF3), haloalcoxi (C1-C6) (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6, ariltio, amino, aminoalquilo (C1-C6), nitro, O-carbamilo, N-carbamilo, O- tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato y oxo (=O).

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos colorantes fluorescentes y sus usos como biomarcadores
Antecedentes
Campo
La presente solicitud se refiere a nuevos derivados de benzopirano para uso como colorantes fluorescentes. Los compuestos pueden usarse como etiquetas fluorescentes, particularmente para el etiquetado de nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos.
Antecedentes
La detección no radiactiva de ácidos nucleicos utilizando etiquetas fluorescentes es una tecnología importante en biología molecular. Muchos procedimientos empleados en la tecnología del ADN recombinante dependían anteriormente en gran medida del uso de nucleótidos o polinucleótidos marcados radiactivamente con, por ejemplo, 32P. Los compuestos radiactivos permiten la detección sensible de ácidos nucleicos y otras moléculas de interés. Sin embargo, existen serias limitaciones en el uso de isótopos radiactivos, como su costo, vida útil limitada y, lo que es más importante, consideraciones de seguridad. La eliminación de la necesidad de etiquetas radiactivas mejora la seguridad al tiempo que reduce el impacto ambiental y los costos asociados con, por ejemplo, la eliminación de reactivos. Los métodos susceptibles de detección fluorescente no radiactiva incluyen, a modo de ejemplo no limitante, secuenciación automática de ADN, métodos de hibridación, detección en tiempo real de productos de reacción en cadena de la polimerasa e inmunoensayos.
Para muchas aplicaciones, es deseable emplear múltiples etiquetas fluorescentes espectralmente distinguibles para lograr la detección independiente de una pluralidad de analitos superpuestos espacialmente. En dichos métodos múltiples, el número de recipientes de reacción puede reducirse simplificando los protocolos experimentales y facilitando la producción de kits de reactivos específicos de la aplicación. En la secuenciación de ADN automatizada multicolor, por ejemplo, la detección fluorescente múltiple permite el análisis de múltiples bases de nucleótidos en un solo carril de electroforesis, lo que aumenta el rendimiento sobre los métodos de un solo color y reduce las incertidumbres asociadas con las variaciones de movilidad electroforética entre carriles.
Sin embargo, la detección fluorescente múltiple puede ser problemática y hay una serie de factores importantes que limitan la selección de etiquetas fluorescentes. En primer lugar, es difícil encontrar compuestos colorantes cuyos espectros de absorción y emisión tengan una resolución espectral adecuada. Además, cuando se utilizan varios colorantes fluorescentes juntos, la excitación simultánea puede resultar difícil porque las bandas de absorción de los colorantes para diferentes regiones espectrales suelen estar muy separadas. Muchos métodos de excitación utilizan láseres de alta potencia y, por lo tanto, el colorante debe tener suficiente fotoestabilidad para soportar tal excitación por láser. Una consideración final de particular importancia en los métodos de biología molecular es que los colorantes fluorescentes deben ser compatibles con los reactivos químicos utilizados, como por ejemplo, disolventes y reactivos de síntesis de ADN, tampones, enzimas polimerasa y enzimas ligasa.
A medida que avanza la tecnología de secuenciación, se ha desarrollado la necesidad de más compuestos colorantes fluorescentes, sus conjugados de ácido nucleico y conjuntos de colorantes que satisfagan todas las limitaciones anteriores y que sean particularmente adecuados para métodos moleculares de alto rendimiento, como la secuenciación en fase sólida y similares.
La publicación PCT No. WO 2007/135368 describe una clase de compuestos de rodamina adecuados para su uso como etiquetas fluorescentes. Los compuestos allí descritos son adecuados para su uso en protocolos de secuenciación de ácidos nucleicos en fase sólida. Los avances en la tecnología y el rendimiento de la secuenciación de ácidos nucleicos en fase sólida han llevado a nuevos desarrollos y mejoras en el diseño molecular de etiquetas fluorescentes, particularmente en el contexto de la interacción entre los reactivos fluorescentes y secuencias de ácidos nucleicos particulares.
Las moléculas de colorante fluorescente con propiedades de fluorescencia mejoradas (como el desplazamiento de Stokes, la intensidad de la fluorescencia, la posición del máximo de fluorescencia y la forma de la banda de fluorescencia) pueden mejorar la velocidad y la precisión de la secuenciación de ácidos nucleicos. El desplazamiento de Stokes es un aspecto clave en la identificación de las señales fluorescentes en aplicaciones biológicas. Por ejemplo, la detección de la luz emitida puede ser difícil de distinguir de la luz de excitación cuando se usan fluoróforos con un máximo de absorción y fluorescencia muy cerca el uno del otro (es decir, un pequeño desplazamiento de Stokes), porque las bandas de excitación y emisión se superponen en gran medida. Por el contrario, los fluoróforos con grandes desplazamientos de Stokes son fáciles de distinguir debido a la mayor separación entre las longitudes de onda de excitación y emisión. El desplazamiento de Stokes es especialmente crítico en aplicaciones de fluorescencia múltiples, porque la longitud de onda de emisión de un fluoróforo puede superponerse y, por lo tanto, excitar a otro fluoróforo en la misma muestra. Además, la intensidad de la señal de fluorescencia es especialmente importante cuando las mediciones se realizan en tampones biológicos con base de agua y/o a una temperatura más alta, ya que la fluorescencia de la mayoría de los colorantes es significativamente menor en tales condiciones. Además, la naturaleza de la base a la que se une un colorante también afecta el máximo de fluorescencia, la intensidad de fluorescencia y otras propiedades espectrales del colorante. Las interacciones específicas de secuencia entre el colorante fluorescente y la nucleobase se pueden adaptar mediante un diseño específico de los colorantes fluorescentes. La optimización de la estructura de los colorantes fluorescentes puede mejorar sus propiedades fluorescentes y también mejorar la eficacia de la incorporación de nucleótidos, reducir el nivel de errores de secuenciación y disminuir el uso de reactivos y, por tanto, los costes de la secuenciación de ácidos nucleicos.
En el presente documento se describen nuevos derivados de benzopirano y su uso como etiquetas de biomoléculas, particularmente como etiquetas para nucleótidos usados en la secuenciación de ácidos nucleicos. Las mejoras se pueden ver en los mayores desplazamientos de Stokes de dichos colorantes cuando se preparan como conjugados de biomoléculas y en la longitud, intensidad y calidad de la lectura de secuenciación que se puede obtener utilizando los nuevos compuestos fluorescentes.
Compendio
La presente invención proporciona un compuesto de Fórmula (I) o formas mesómeras del mismo según la reivindicación independiente 1. Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. La presente invención proporciona además un método para preparar un compuesto de Fórmula (Ia), según la reivindicación independiente 15.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con nuevos derivados de benzopirano de Fórmula (I) o formas mesómeras de los mismos:
Figure imgf000003_0001
en los que cada R1, R2 y R1' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C -amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R se selecciona de -OR7 o -NR8R9;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R8 y R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, NR10, y Se;
R10 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
m es un número entero seleccionado de 0 a 4; y
n es un número entero seleccionado de 0 a 4; siempre que
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es - NHCH(CH3)CH2OH; entonces X se selecciona de O, S o Se;
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es -OH; entonces X se selecciona de S o Se; cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es metilo; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se; y
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es -S(O2)Et; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un compuesto fluorescente de fórmula (V) con un desplazamiento de Stokes que oscila entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 100 nm:
Figure imgf000004_0001
en el que cada R1, R1' y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
RHet es un heteroarilo opcionalmente sustituido con uno o más R5;
cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R se selecciona de -OR7 o -NR8R9;
Y se selecciona de O o NH;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R8 y R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; y
n es un número entero de 0 a 4.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con nucleótidos u oligonucleótidos marcados con un compuesto de fórmula (I) o (V).
Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con kits que contienen uno o más nucleótidos donde al menos un nucleótido es un nucleótido marcado con un colorante fluorescente descrito en el presente documento.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con métodos de secuenciación que incluyen la incorporación de un nucleótido marcado descrito en el presente documento en un ensayo de secuenciación y la detección del nucleótido marcado.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de fórmula (Ia), los métodos incluyen hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IIa)
Figure imgf000005_0001
o Fórmula (IIb)
Figure imgf000005_0002
con un compuesto de Fórmula (III)
Figure imgf000005_0003
para formar
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, X, m y n se definen anteriormente en la descripción de los compuestos de Fórmula (I), y R" se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de fórmula (Ia'), los métodos incluyen hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IIa)
Figure imgf000006_0001
o Fórmula (IIb)
Figure imgf000006_0002
con un compuesto de Fórmula (IIIa)
Figure imgf000006_0003
Para formar
Figure imgf000006_0004
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R", X, m y n se definen anteriormente.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de Fórmula (Ia'), el método incluye convertir un compuesto de Fórmula (Ia) en un compuesto de Fórmula (Ia') a través de la activación del ácido carboxílico:
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, X, m y n se definen anteriormente en la descripción de los compuestos de fórmula (I).
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de Fórmula (Ib), el método incluye convertir un compuesto de Fórmula (Ia) en un compuesto de Fórmula (Ia') a través de la activación del ácido carboxílico:
Figure imgf000007_0001
y hacer reaccionar el compuesto de Fórmula (Ia') con una amina primaria o secundaria de Fórmula (IV),
Figure imgf000007_0002
donde las variables R1, R1’
Figure imgf000007_0003
m y n se definen an compuestos de fórmula (I).
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de fórmula (Ib), los métodos incluyen hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IIa)
Figure imgf000007_0004
o Fórmula (IIb)
Figure imgf000007_0005
con un compuesto de Fórmula (IIIb)
Figure imgf000007_0006
para formar
Figure imgf000008_0001
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R", X, m y n se definen anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1 es un gráfico de líneas que ilustra los espectros fluorescentes de los colorantes fluorescentes de benzopirano como se describe en el presente documento en comparación con los colorantes comerciales con absorción en la misma región espectral.
FIGS. 2A y 2B son gráficos que ilustran la usabilidad del nucleótido C marcado con los nuevos colorantes fluorescentes nuevos como se describe en el presente documento (como se muestra en negro) para el análisis de secuenciación.
FIG. 3 es un gráfico de barras que ilustra la intensidad fluorescente del nucleótido C marcado con los nuevos colorantes fluorescentes como se describe en el presente documento cuando estos colorantes se excitaron con luz azul (460 nm) o verde (530 nm).
FIG. 4 es un gráfico de barras que ilustra la intensidad fluorescente del nucleótido C marcado con un nuevo colorante fluorescente como se describe en el presente documento en comparación con un colorante comercial a dos temperaturas diferentes.
Descripción detallada
Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a nuevos derivados de benzopirano de estructura de fórmula (I) o (V) para uso como colorantes fluorescentes. Estos nuevos colorantes fluorescentes tienen mayores desplazamientos de Stokes y pueden usarse como etiquetas fluorescentes, particularmente para el etiquetado de nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. También se ejemplifican los métodos para preparar estos colorantes fluorescentes y las aplicaciones de secuenciación aguas abajo que utilizan estos colorantes.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a nuevos derivados de benzopirano de Fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:
Figure imgf000008_0002
en el que cada R1, R2 y R1' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R se selecciona de -OR7 o -NR8R9;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R8 y R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, NR10, y Se;
R10 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
m es un número entero seleccionado de 0 a 4; y
n es un número entero seleccionado de 0 a 4; siempre que
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es - NHCH(CH3)CH2OH; entonces X se selecciona de O, S o Se;
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es -OH; entonces X se selecciona de S o Se;
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es metilo; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se; y
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es -S(O2)Et; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1; R5 es Cl; entonces X se selecciona de S, O o Se, preferiblemente O.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), el arilo opcionalmente sustituido descrito en el presente documento es arilo C6-10 opcionalmente sustituido, por ejemplo, fenilo. En algunas realizaciones, el heteroarilo opcionalmente sustituido descrito en el presente documento es heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido; más preferiblemente, heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el carbociclilo opcionalmente sustituido descrito en el presente documento es carbociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, en particular cicloalquilo de 3-7 miembros. En algunas realizaciones, los heterociclilos opcionalmente sustituidos descritos en el presente documento son heterociclilos de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituidos, más preferiblemente heterociclilos de 5 a 6 miembros.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), R es -OR7 y el compuesto de fórmula (I) también está representado por la fórmula (Ia'):
Figure imgf000009_0001
En una realización, R7 es H y el compuesto de fórmula (I) también está representado por la fórmula (Ia):
Figure imgf000010_0001
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), R es -NR8R9 y el compuesto de fórmula (I) también está representado por la fórmula (Ib):
Figure imgf000010_0002
En una realización, cada R8 y R9 es H. En algunas otras realizaciones, R8 es H y R9 es alquilo sustituido. En algunas realizaciones adicionales, tanto R8 como R9 son alquilo sustituido. En algunas de tales realizaciones, el alquilo sustituido se selecciona de alquilo sustituido con carboxilo (-C(=O)OH), sulfo (-SO3H) o sulfonato (-SO3-). En algunas otras realizaciones, el alquilo sustituido se selecciona de alquilo sustituido con un grupo C-amido.
En algunas realizaciones de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), cada R1, R1' y R2 es H. En algunas otras realizaciones, al menos uno de R1, R1' y R2 es un alquilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), cada R3 y R4 es un alquilo. En algunas de tales realizaciones, R3 y/o R4 se puede seleccionar de metilo o etilo. En algunas otras realizaciones, R3 es H y R4 es un alquilo. En algunas realizaciones, R3 y R4 son etilo.
En algunas otras realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de heterociclilo tiene un heteroátomo (es decir, nitrógeno). En algunas otras realizaciones, el anillo de heterociclilo puede tener dos o más heteroátomos. En una realización, el heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido tiene la estructura
Figure imgf000010_0003
donde e l -------representa un enlace simple o un enlace doble, de modo que cada uno de los átomos de carbono en el anillo es neutro y no está cargado. En algunas de tales realizaciones, R4 se selecciona de H o alquilo. En una realización, R4 es etilo. En algunas de tales realizaciones, al menos uno de R1' y R2 es H. En una realización, tanto R1' como R2 son H.
En algunas otras realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de heterociclilo tiene un heteroátomo (es decir, nitrógeno). En algunas otras realizaciones, el anillo de heterociclilo puede tener dos o más heteroátomos. En una realización, el heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido tiene la estructura
donde e l ------ representa un enlace simple o un enlace doble, de modo que cada uno de los átomos de carbono en el anillo es neutro y no está cargado. En algunas de tales realizaciones, R3 se selecciona de H o alquilo. En una realización, R3 es etilo. En algunas de tales realizaciones, al menos uno de R1' y R1 es H. En una realización, tanto R1' como R1 son H.
En algunas realizaciones alternativas de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido; y R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el sistema de anillos heterociclilo condensado resultante tiene un heteroátomo (es decir, nitrógeno). En algunas otras realizaciones, el sistema de anillos heterociclilo condensado resultante puede tener dos o más heteroátomos. En una realización, el sistema de anillos heterociclilo condensado resultante tiene la estructura
Figure imgf000011_0001
donde-------representa un enlace simple o un enlace doble, de modo que cada uno de los átomos de carbono en el anillo es neutro y no está cargado. En una realización, R1' es H.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), el anillo heterociclilo de 3-7 miembros formado por R1 / R3 y/o R2 / R4 no están sustituidos. En algunas otras realizaciones, tal heterociclilo de 3-7 miembros está sustituido con uno o más alquilo, por ejemplo, metilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), m es 0. En algunas otras realizaciones, m es 1. En algunas de tales realizaciones, R5 se selecciona de sulfo, haluro de sulfonilo, por ejemplo, cloruro de sulfonilo o aminosulfonilo. En algunas realizaciones, R5 es halógeno. En algunas realizaciones, R5 es cloro.
En algunas realizaciones de fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib), n es 0.
En cualquiera de las realizaciones de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib) descritas en el presente documento, X puede ser S (azufre). En cualquiera de las realizaciones de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia') o (Ib) descritas en el presente documento, X puede ser O (oxígeno). En alguna de tales realizaciones, los compuestos de fórmula (Ia), (Ia') y (Ib) también pueden representarse por la fórmula (Ic), (Ic') y (Id) respectivamente:
Figure imgf000011_0002
En algunas realizaciones específicas, los ejemplos de compuestos de Fórmula (I) incluyen:
Figure imgf000012_0001
o formas mesómeras de los mismos.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (I), el compuesto se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido a través de C(=O)R, en el que R es -OR7, y en el que R7 es un alquilo sustituido.
En algunas realizaciones alternativas, el compuesto se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido a través de C(=O)R, en el que R es -NR8R9, y en el que al menos uno de R8 o R9 comprende al menos un grupo funcional que puede usarse para la unión a las biomoléculas, por ejemplo, uno de R8 o R9 es un alquilo sustituido que comprende al menos un grupo carboxilo.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (I) está presente en una o más formas mesómeras (I-A), (I-B) o (I-C):
Figure imgf000013_0001
Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con un compuesto fluorescente de fórmula (V) con un desplazamiento de Stokes que oscila entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 100 nm:
Figure imgf000013_0002
en el que cada R1, R1' y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
RHet es un heteroarilo opcionalmente sustituido con uno o más R5;
cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R se selecciona de -OR7 o -NR8R9;
Y se selecciona de O o NH;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R8 y R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; y
n es un número entero de 0 a 4.
En algunas realizaciones de fórmula (V), RHet se selecciona de heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido. En algunas de tales realizaciones, RHet se selecciona de heteroarilo de 9 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, benzotiazol opcionalmente sustituido. En una realización, RHet es 2-benzotiazolilo opcionalmente sustituido:
Figure imgf000014_0001
En una realización, RHet es 2-benzoxazolilo opcionalmente sustituido con la estructura
Figure imgf000014_0002
En algunas de tales realizaciones, RHet está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de sulfo, haluro de sulfonilo o aminosulfonilo. En algunas de tales realizaciones, RHet está sustituido con uno o más halógenos. En algunas de tales realizaciones, RHet se sustituye por un cloro.
En algunas realizaciones, R es -OR7 y los compuestos de fórmula (V) también están representados por la fórmula (Va):
Figure imgf000014_0003
En una realización, R7 es H. En otra realización, R7 es alquilo sustituido.
En algunas realizaciones, R es -NR8R9 y los compuestos de fórmula (V) también están representados por la fórmula (Vb):
Figure imgf000014_0004
En una realización, cada R8 y R9 es H. En algunas otras realizaciones, R8 es H y R9 es alquilo sustituido. En algunas realizaciones adicionales, tanto R8 como R9 son alquilo sustituido. En algunas de tales realizaciones, el alquilo sustituido se selecciona de alquilo sustituido con carboxilo (-C(=O)OH) o sulfo (-SO3H) o sulfonato (-SO3-). En algunas otras realizaciones, el alquilo sustituido se selecciona de alquilo sustituido con un grupo C-amido.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), Y es O.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), cada R1, R1' y R2 es H. En algunas otras realizaciones, al menos uno de R1, R1' y R2 es un alquilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), cada R3 y R4 es un alquilo. En algunas de tales realizaciones, R3 y/o R4 se puede seleccionar de metilo o etilo. En algunas otras realizaciones, R3 es H y R4 es un alquilo.
En algunas otras realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de heterociclilo tiene un heteroátomo (es decir, nitrógeno). En algunas otras realizaciones, el anillo de heterociclilo puede tener dos o más heteroátomos. En una realización, el heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido tiene la estructura
Figure imgf000015_0001
donde e l ------- representa un enlace simple o un enlace doble, de modo que cada uno de los átomos de carbono en el anillo es neutro y no está cargado. En algunas de tales realizaciones, R4 se selecciona de H o alquilo. En una realización, R4 es etilo. En algunas realizaciones adicionales, al menos uno de R1' y R2 es H. En una realización, tanto R1' como R2 son H.
En algunas otras realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de heterociclilo tiene un heteroátomo (es decir, nitrógeno). En algunas otras realizaciones, el anillo de heterociclilo puede tener dos o más heteroátomos. En una realización, el heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido tiene la estructura
Figure imgf000015_0002
donde el representa un enlace simple o un enlace doble, de modo que cada uno de los átomos de carbono en el anillo es neutro y no está cargado. En algunas de tales realizaciones, R3 se selecciona de H o alquilo. En una realización, R3 es etilo. En algunas realizaciones adicionales, al menos uno de R1' y R1 es H. En una realización, tanto R1' como R1 son H.
En algunas realizaciones alternativas de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido; y R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido, por ejemplo, un heterociclilo de 6 miembros opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el sistema de anillo de heterociclilo condensado resultante tiene un heteroátomo (es decir, nitrógeno). En algunas otras realizaciones, el sistema de anillo de heterociclilo condensado resultante puede tener dos o más heteroátomos. En una realización, el sistema de anillo de heterociclilo condensado resultante tiene la estructura
Figure imgf000015_0003
donde el ........ representa un enlace simple o un enlace doble, de modo que cada uno de los átomos de carbono en el anillo es neutro y no está cargado. En una realización, R1' es H.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), el anillo heterociclilo de 3-7 miembros formado por R1 / R3 y/o R2 / R4 no están sustituidos. En algunas otras realizaciones, tal heterociclilo de 3-7 miembros está sustituido con uno o más alquilo, por ejemplo, metilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb), n es 0.
En algunas realizaciones específicas de fórmula (V), (Va) o (Vb), los ejemplos de compuestos de fórmula (V) incluyen compuestos 1-1 a 1-15 como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el compuesto fluorescente de fórmula (V) se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido a través de C(=O)R, en el que R es -OR7, y en el que R7 es un alquilo sustituido.
En algunas realizaciones alternativas, el compuesto fluorescente de Fórmula (V) se une covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido a través de C(=O)R, en el que R es -NR8R9, y en el que al menos uno de R8 o R9 es un alquilo sustituido.
Definición
Los encabezados de las secciones que se utilizan en el presente documento tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación del tema descrito.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por un experto en la materia. El uso del término "que incluye", así como otras formas, como "incluyen", "incluye" e "incluido", no es limitante. El uso del término "que tiene", así como otras formas, como "tienen", "tiene" y "tuvo", no es limitante. Como se usa en esta memoria descriptiva, ya sea en una frase de transición o en el cuerpo de la reivindicación, los términos "comprende(n)" y "que comprende" deben interpretarse con un significado abierto. Es decir, los términos anteriores deben interpretarse como sinónimos de las frases "que tiene al menos" o "que incluye al menos". Por ejemplo, cuando se usa en el contexto de un proceso, el término "que comprende" significa que el proceso incluye al menos los pasos enumerados, pero puede incluir pasos adicionales. Cuando se usa en el contexto de un compuesto, composición o dispositivo, el término "que comprende" significa que el compuesto, composición o dispositivo incluye al menos las características o componentes enumerados, pero también puede incluir características o componentes adicionales.
Como se usa en el presente documento, las abreviaturas orgánicas comunes se definen de la siguiente manera: Ac Acetilo
AC2O Anhídrido acético
ac. Acuoso
BOC o Boc terc-butoxicarbonilo
BOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio
cat. Catalítico
°C Temperatura en grados centígrados
dATP Trifosfato de desoxiadenosina
dCTP trifosfato de desoxicitidina
dGTP Trifosfato de desoxiguanosina
dTTP Trifosfato de desoxitimidina
ddNTP(s) Didesoxinucleótido(s)
DCM Cloruro de metileno
DMA dimetilacetamida
DMF dimetilformamida
Et Etilo
EtOAc Acetato de etilo
ffN Conjugado de nucleótido completamente funcional
ffC Conjugado de citidina completamente funcional
g gramo(s)
h hora(s)
IPA Alcohol isopropílico
LCMS Cromatografía líquida-espectrometría de masas
MeCN acetonitrilo
mL Mililitro(s)
PG grupo protector
Ph Fenilo
ppt precipitado
PyBOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio
Ta Temperatura ambiente
SBS Secuenciación por Síntesis
TEA trietilamina
TEAB bicarbonato de tetraetilamonio
TFA Ácido trifluoroacético
Terc, t terciario
THF tetrahidrofurano
TLC Cromatografía de capa fina
TSTU Tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
ml Microlitro(s)
Como se usa en el presente documento, el término "unido covalentemente" o "enlazado covalentemente" se refiere a la formación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, un recubrimiento de polímero unido covalentemente se refiere a un recubrimiento de polímero que forma enlaces químicos con una superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con la unión a la superficie a través de otros medios, por ejemplo, adhesión o interacción electrostática. Se apreciará que los polímeros que se unen covalentemente a una superficie también se pueden unir por medios además de la unión covalente.
El término "halógeno" o "halo", como se usa en el presente documento, significa cualquiera de los átomos radioestables de la columna 7 de la Tabla Periódica de los Elementos, por ejemplo, flúor, cloro, bromo o yodo, prefiriéndose el flúor y el cloro.
Como se usa en el presente documento, "alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que está completamente saturada (es decir, no contiene enlaces dobles o triples). El grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que aparezca en el presente documento, un rango numérico como "1 a 20" se refiere a cada número entero en el rango dado; p.ej., "1 a 20 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta 20 átomos de carbono inclusive, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquilo" donde no se designa un rango numérico). El grupo alquilo también puede ser un alquilo de tamaño medio que tiene de 1 a 9 átomos de carbono. El grupo alquilo también podría ser un alquilo inferior que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo alquilo puede designarse como "alquilo C1-4" o denominaciones similares. Sólo a modo de ejemplo, "alquilo C1-6" indica que hay de uno a seis átomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, y t-butilo Los grupos alquilo típicos incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.
Como se usa en el presente documento, "alcoxi" se refiere a la fórmula -OR en la que R es un alquilo como se define anteriormente, como "alcoxi C1-9", que incluye pero no está limitado a, metoxi, etoxi, n-propoxi, 1-metiletoxi (isopropoxi), n-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi y terc-butoxi, y similares.
Como se usa en el presente documento, "alquenilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene uno o más dobles enlaces. El grupo alquenilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquenilo" donde no se designa rango numérico. El grupo alquenilo también puede ser un alquenilo de tamaño medio que tiene de 2 a 9 átomos de carbono. El grupo alquenilo también podría ser un alquenilo inferior que tenga de 2 a 6 átomos de carbono. El grupo alquenilo se puede designar como "alquenilo C2-6" o designaciones similares. Sólo a modo de ejemplo, "alquenilo C2-6" indica que hay de dos a seis átomos de carbono en la cadena de alquenilo, es decir, la cadena de alquenilo se selecciona del grupo que consiste en etenilo, propen-1-ilo, propen-2-ilo, propen-3-ilo, buten-1-ilo, buten-2-ilo, buten-3-ilo, buten-4-ilo, 1-metil-propen-1-ilo, 2-metil-propen-1-ilo, 1 -etil-eten-1 -ilo, 2-metil-propen-3-ilo, buta-1,3-dienilo, buta-1,2-dienilo y buta-1,2-dien-4-ilo Los grupos alquenilo típicos incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo y hexenilo, y similares.
Como se usa en el presente documento, "alquinilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene uno o más enlaces triples. El grupo alquinilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquinilo" donde no se designa un rango numérico. El grupo alquinilo también puede ser un alquinilo de tamaño medio que tenga de 2 a 9 átomos de carbono. El grupo alquinilo también podría ser un alquinilo inferior que tenga de 2 a 6 átomos de carbono. El grupo alquinilo se puede designar como "alquinilo C2-6" o designaciones similares. Sólo a modo de ejemplo, "alquinilo C2-6" indica que hay de dos a seis átomos de carbono en la cadena de alquinilo, es decir, la cadena de alquinilo se selecciona del grupo que consiste en etinilo, propin-1 -ilo, propin-2-ilo, butin-1 -ilo, butin-3-ilo, butin-4-ilo y 2-butinilo. Los grupos alquinilo típicos incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo, y similares.
Como se usa en el presente documento, "heteroalquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene uno o más heteroátomos, es decir, un elemento distinto del carbono, que incluye pero no se limita a, nitrógeno, oxígeno y azufre, en el esqueleto de la cadena. El grupo heteroalquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "heteroalquilo" donde no se designa un rango numérico. El grupo heteroalquilo también puede ser un heteroalquilo de tamaño medio que tiene de 1 a 9 átomos de carbono. El grupo heteroalquilo también podría ser un heteroalquilo inferior que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo heteroalquilo se puede designar como "heteroalquilo C1-6" o designaciones similares. El grupo heteroalquilo puede contener uno o más heteroátomos. Sólo a modo de ejemplo, "heteroalquilo C1-6" indica que hay de uno a seis átomos de carbono en la cadena de heteroalquilo y, además, uno o más heteroátomos en el esqueleto de la cadena.
El término "aromático" se refiere a un anillo o sistema de anillos que tiene un sistema de electrones pi conjugados e incluye tanto grupos aromáticos carbocíclicos (p. ej., fenilo) como aromáticos heterocíclicos (p. ej., piridina). El término incluye grupos monocíclicos o policíclicos de anillos condensados (es decir, anillos que comparten pares de átomos adyacentes) siempre que todo el sistema de anillos sea aromático.
Como se usa en el presente documento, "arilo" se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos condensados que comparten dos átomos de carbono adyacentes) que contienen solo carbono en la estructura del anillo. Cuando el arilo es un sistema de anillos, todos los anillos del sistema son aromáticos. El grupo arilo puede tener de 6 a 18 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "arilo" donde no se designa rango numérico. En algunas realizaciones, el grupo arilo tiene de 6 a 10 átomos de carbono. El grupo arilo se puede designar como "arilo C6-10", "arilo C6 o C10", o designaciones similares. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, azulenilo y antracenilo.
Un "aralquilo" o "arilalquilo" es un grupo arilo conectado, como sustituyente, a través de un grupo alquileno, como "aralquilo C7-14" y similares, que incluye pero no se limita a, bencilo, 2-feniletilo, 3-fenilpropilo y naftilalquilo. En algunos casos, el grupo alquileno es un grupo alquileno inferior (es decir, un grupo alquileno C1-6).
Como se usa en el presente documento, "heteroarilo" se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos condensados que comparten dos átomos adyacentes) que contiene(n) uno o más heteroátomos, es decir, un elemento distinto del carbono, que incluye pero no se limita a, nitrógeno, oxígeno y azufre, en el esqueleto del anillo. Cuando el heteroarilo es un sistema de anillos, todos los anillos del sistema son aromáticos. El grupo heteroarilo puede tener de 5 a 18 miembros en el anillo (es decir, el número de átomos que constituyen el esqueleto del anillo, incluidos los átomos de carbono y los heteroátomos), aunque la presente definición también cubre la aparición del término "heteroarilo" donde no se designa un rango numérico. En algunas realizaciones, el grupo heteroarilo tiene de 5 a 10 miembros en el anillo o de 5 a 7 miembros en el anillo. El grupo heteroarilo se puede designar como "heteroarilo de 5-7 miembros", "heteroarilo de 5-10 miembros" o designaciones similares. Los ejemplos de anillos de heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, furilo, tienilo, ftalazinilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, quinolinilo, isoquinilinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, indolilo, isoindolilo y benzotienilo.
Un "heteroaralquilo" o "heteroarilalquilo" es un grupo heteroarilo conectado, como sustituyente, a través de un grupo alquileno. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, 2-tienilmetilo, 3-tienilmetilo, furilmetilo, tieniletilo, pirrolilalquilo, piridilalquilo, isoxazolilalquilo e imidazolilalquilo. En algunos casos, el grupo alquileno es un grupo alquileno inferior (es decir, un grupo alquileno C1-6).
Como se usa en el presente documento, "carbociclilo" significa un anillo o sistema de anillo cíclico no aromático que contiene solo átomos de carbono en el esqueleto del sistema de anillo. Cuando el carbociclilo es un sistema de anillos, se pueden unir dos o más anillos de forma condensada, a través de puentes o espiroconectada. Los carbociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo en un sistema de anillos no sea aromático. Por lo tanto, los carbociclilos incluyen cicloalquilos, cicloalquenilos y cicloalquinilos. El grupo carbociclilo puede tener de 3 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "carbociclilo" donde no se designa rango numérico. El grupo carbociclilo también puede ser un carbociclilo de tamaño medio que tiene de 3 a 10 átomos de carbono. El grupo carbociclilo también podría ser un carbociclilo que tenga de 3 a 6 átomos de carbono. El grupo carbociclilo se puede designar como "carbociclilo C3-6" o designaciones similares. Los ejemplos de anillos de carbociclilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 2,3-dihidro-indeno, biciclo[2.2.2]octanilo, adamantilo y espiro[4.4]nonanilo.
Como se usa en el presente documento, "cicloalquilo" significa un anillo o sistema de anillos de carbociclilo completamente saturado. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
Como se usa en el presente documento, "heterociclilo" significa un anillo o sistema de anillos cíclico no aromático que contiene al menos un heteroátomo en el esqueleto del anillo. Los heterociclilos se pueden unir entre sí de forma condensada, a través de puentes o espiroconectada. Los heterociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo en el sistema de anillos no sea aromático. El o los heteroátomos pueden estar presentes en un anillo aromático o no aromático en el sistema de anillos. El grupo heterociclilo puede tener de 3 a 20 miembros en el anillo (es decir, el número de átomos que constituyen el esqueleto del anillo, incluidos los átomos de carbono y los heteroátomos), aunque la presente definición también cubre la aparición del término "heterociclilo" donde no se designa un rango numérico. El grupo heterociclilo también puede ser un heterociclilo de tamaño medio que tiene de 3 a 10 miembros en el anillo. El grupo heterociclilo también podría ser un heterociclilo que tenga de 3 a 6 miembros en el anillo. El grupo heterociclilo puede designarse como "heterociclilo de 3-6 miembros" o designaciones similares. En los heterociclilos monocíclicos de seis miembros preferidos, el (los) heteroátomo(s) se selecciona(n) de uno a tres de O, N o S, y en los heterociclilos monocíclicos de cinco miembros preferidos, el (los) heteroátomo(s) se selecciona(n) de uno o dos heteroátomos seleccionados de O, N o S. Los ejemplos de anillos heterociclilo incluyen, pero no se limitan a, azepinilo, acridinilo, carbazolilo, cinolinilo, dioxolanilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, morfolinilo, oxiranilo, oxepanilo, tiepanilo, piperidinilo, piperazinilo, dioxopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolidonilo, pirrolidionilo, 4-piperidonilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, 1,3-dioxinilo, 1,3-dioxanilo, 1,4-dioxinilo, 1,4-dioxanilo, 1,3-oxatianilo, 1,4-oxatiinilo, 1,4-oxatianilo, 2H-1,2-oxazinilo, trioxanilo, hexahidro-1,3,5-triazinilo, 1,3-dioxolilo, 1,3-dioxolanilo, 1,3-ditiolilo, 1,3-ditiolanilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, oxazolidinonilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, 1,3-oxatiolanilo, indolinilo, isoindolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidro-1,4-tiazinilo, tiamorfolinilo, dihidrobenzofuranilo, bencimidazolidinilo y tetrahidroquinolina.
Un grupo "O-carboxi" se refiere a un grupo "-OC(=O)R" en el que R se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6,alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento.
Un grupo "C-carboxi" se refiere a un grupo "-C(=O)OR" en el que R se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento. Un ejemplo no limitante incluye carboxilo (es decir, -C(=O)OH).
Un grupo "ciano" se refiere a un grupo "-CN".
Un grupo "sulfonilo" se refiere a un grupo "-SO2R" en el que R se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento.
Un grupo "hidróxido de sulfonilo" o "sulfo" se refiere a un grupo "-S(=O)2-OH".
Un grupo "sulfino" se refiere a un grupo "-S(=O)OH".
Un grupo "sulfonato" se refiere a -SO3-.
Un grupo "haluro de sulfonilo" se refiere a un grupo "-S(=O)2-X", en el que X es un haluro.
Un grupo "S-sulfonamido" se refiere a un grupo "-SO2NRaRb" grupo en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento.
Un grupo "N-sulfonamido" se refiere a un grupo "-N(Ra)SO2Rb" en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento.
Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo "-C(=O)NRaRb" en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento.
Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo "-N(Ra)C(=O)Rb" en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento.
Un grupo "amino" se refiere a un grupo "-NRaRb" en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 3-10 miembros, como se define en el presente documento. Un ejemplo no limitante incluye amino libre (es decir, -NH2).
Un grupo "aminoalquilo" se refiere a un grupo amino conectado a través de un grupo alquileno.
Un grupo "aminosulfonilo" se refiere a un grupo "-S(=O)2NH2".
Un grupo "alcoxialquilo" se refiere a un grupo alcoxi conectado a través de un grupo alquileno, como un "alcoxialquilo C2-8" y similares.
Como se usa en el presente documento, un grupo sustituido se deriva del grupo original no sustituido en el que ha habido un intercambio de uno o más átomos de hidrógeno por otro átomo o grupo. A menos que se indique lo contrario, cuando se considera que un grupo está "sustituido", se entiende que el grupo está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C1-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), carbociclilo C3-C7-alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros-alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilalquilo(C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros alquilo(C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 alquilo (C1-C6) (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), haloalquilo (C1-C6) (p. ej., -CF3), haloalcoxi (C1-C6) (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6, ariltio, amino, aminoalquilo (C1-C6), nitro, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato y oxo (=O). Siempre que un grupo se describa como "opcionalmente sustituido", ese grupo puede estar sustituido con los sustituyentes anteriores.
Como entenderá un experto en la materia, si un compuesto contiene grupos sustituyentes cargados positiva o negativamente, por ejemplo, SO3- , también puede contener un contraion cargado positiva o negativamente, de modo que el compuesto en su conjunto sea neutro.
Debe entenderse que ciertas convenciones de denominación de radicales pueden incluir un mono-radical o un di-radical, dependiendo del contexto. Por ejemplo, cuando un sustituyente requiere dos puntos de unión al resto de la molécula, se entiende que el sustituyente es un di-radical. Por ejemplo, un sustituyente identificado como alquilo que requiere dos puntos de unión incluye di-radicales como -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, y similares. Otras convenciones de denominación de radicales indican claramente que el radical es un di-radical como "alquileno" o "alquenileno".
Cuando se dice que dos grupos R "adyacentes" forman un anillo "junto con el átomo al que están unidos", se entiende que la unidad colectiva de los átomos, los enlaces intermedios y los dos grupos R son el anillo mencionado. Por ejemplo, cuando la siguiente subestructura está presente:
Figure imgf000020_0001
y R1 y R2 se definen como seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, o R1 y R2 junto con los átomos a los que están unidos forman un arilo o carbociclilo, se entiende que R1 y R2 pueden seleccionarse de hidrógeno o alquilo, o alternativamente, la subestructura tiene estructura:
Figure imgf000020_0002
donde A es un anillo de arilo o un carbociclilo que contiene el doble enlace representado.
Nucleótidos marcados
Los compuestos colorantes descritos en el presente documento son adecuados para unirse a restos de sustrato. Los restos de sustrato pueden ser prácticamente cualquier molécula o sustancia a la que se puedan conjugar los colorantes fluorescentes descritos en el presente documento y, a modo de ejemplo no limitante, pueden incluir nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, ligandos, partículas, superficies sólidas, polímeros orgánicos e inorgánicos. y combinaciones o colecciones de los mismos, tales como cromosomas, núcleos, células vivas y similares. Los colorantes se pueden conjugar mediante un enlazador opcional por una variedad de medios que incluyen atracción hidrofóbica, atracción iónica y unión covalente. En particular, los colorantes se conjugan con el sustrato mediante unión covalente. Más particularmente, la unión covalente se realiza por medio de un grupo enlazador. En algunos casos, dichos nucleótidos marcados también se denominan ''nucleótidos modificados".
Una aplicación particularmente útil de los nuevos colorantes fluorescentes con un desplazamiento de Stokes largo como se describe en el presente documento es para el marcaje de biomoléculas, por ejemplo, nucleótidos u oligonucleótidos. Algunas realizaciones de la presente solicitud están dirigidas a un nucleótido u oligonucleótido marcado con los nuevos compuestos fluorescentes como se describe en el presente documento.
La unión a las biomoléculas puede ser a través del resto -C(=O)R del compuesto de Fórmula (I) o (V). En algunas realizaciones, R es -OR7 y R7 es un alquilo sustituido, que puede usarse para la unión al grupo amino de las biomoléculas. En una realización, el resto -C(O)R puede ser un residuo éster activado más adecuado para la formación adicional de enlaces amida/péptido. El término "éster activado", como se usa en el presente documento, se refiere a un derivado del grupo carboxi que es capaz de reaccionar en condiciones suaves, por ejemplo, con un compuesto que contiene un grupo amino. Los ejemplos no limitantes de ésteres activados incluyen, pero no se limitan a, ésteres de p-nitrofenilo, pentafluorofenilo y succinimido. En algunas otras realizaciones, R es -NR8R9 y al menos uno de R8 o R9 contiene al menos un grupo funcional que puede usarse para la unión a las biomoléculas, por ejemplo, uno de R8 o R9 es un alquilo sustituido que comprende al menos un carboxilo.
En algunas realizaciones, los compuestos colorantes pueden unirse covalentemente a oligonucleótidos o nucleótidos a través de la base de nucleótidos. Por ejemplo, el nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener la etiqueta unida a la posición C5 de una base de pirimidina o a la posición C7 de una base de 7-deazapurina a través de un resto enlazador. El nucleótido u oligonucleótido marcado también puede tener un grupo de bloqueo 3'-OH unido covalentemente al azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido.
Enlazadores
Los compuestos colorantes como se describen en el presente documento pueden incluir un grupo enlazador reactivo en una de las posiciones de los sustituyentes para la unión covalente del compuesto a otra molécula. Los grupos de enlace reactivos son restos capaces de formar un enlace covalente. En una realización particular, el enlazador puede ser un enlazador escindible. El uso del término "enlazador escindible" no pretende implicar que sea necesario eliminar todo el enlazador. El sitio de escisión se puede ubicar en una posición en el enlazador que asegure que parte del enlazador permanezca unido al colorante y/o resto de sustrato después de la escisión. Los enlazadores escindibles pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, enlazadores escindibles electrofílicamente, enlazadores escindibles nucleofílicamente, enlazadores fotoescindibles, escindibles en condiciones reductoras (por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro o azida), condiciones oxidativas, escindibles mediante el uso de enlazadores de captura de seguridad y escindible por mecanismos de eliminación. El uso de un enlazador escindible para unir el compuesto colorante a un resto de sustrato garantiza que la etiqueta, si es necesario, se puede eliminar después de la detección, evitando cualquier señal de interferencia en los pasos corriente abajo.
Los ejemplos no limitantes de grupos enlazadores incluyen los descritos en la Publicación PCT No. WO2004/018493, que conectan las bases de nucleótidos a etiquetas como, por ejemplo, los nuevos compuestos fluorescentes descritos en el presente documento. Estos enlazadores se pueden escindir usando fosfinas solubles en agua o catalizadores de metales de transición solubles en agua formados a partir de un metal de transición y ligandos al menos parcialmente solubles en agua. En solución acuosa, estos últimos forman complejos de metales de transición al menos parcialmente solubles en agua. Los enlazadores adecuados adicionales que se pueden usar incluyen los descritos en las Publicaciones PCT No. WO2004/018493 y WO 2007/020457. Se descubrió que alterando, y en particular aumentando, la longitud del enlazador entre un colorante fluorescente (fluoróforo) y la base de guanina, introduciendo un grupo espaciador de polietilenglicol, es posible aumentar la intensidad de la fluorescencia en comparación con el mismo fluoróforo. unido a la base de guanina a través de otros enlaces conocidos en la técnica. El diseño de los enlazadores, y especialmente su mayor longitud, también permite mejoras en el brillo de los fluoróforos unidos a las bases de guanina de los nucleótidos de guanosina cuando se incorporan a polinucleótidos como el ADN. Por lo tanto, cuando el colorante es para usar en cualquier método de análisis que requiera la detección de una etiqueta de colorante fluorescente unido a un nucleótido que contiene guanina, es ventajoso si el enlazador comprende un grupo espaciador de fórmula -((CH2)2O)n-, en el que n es un número entero entre 2 y 50, como se describe en el documento WO 2007/020457.
Los nucleósidos y los nucleótidos se pueden marcar en sitios del azúcar o de la nucleobase. Como entenderá un experto en la materia, un "nucleótido" consiste en una base nitrogenada, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En el ARN, el azúcar es la ribosa y en el ADN es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas son adenina (A) y guanina (G), y las pirimidinas son citosina (C) y timina (T) o en el contexto del ARN, uracilo (U). El átomo C-1 de la desoxirribosa está unido al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleótido es también un éster fosfato de un nucleósido, produciéndose la esterificación en el grupo hidroxilo unido al C-3 o C-5 del azúcar. Los nucleótidos son normalmente mono, di o trifosfatos.
Un "nucleósido" es estructuralmente similar a un nucleótido pero le faltan los restos fosfato. Un ejemplo de un análogo de nucleósido sería uno en el que la etiqueta está unida a la base y no hay un grupo fosfato unido a la molécula de azúcar.
Aunque la base se denomina normalmente purina o pirimidina, el experto en la materia apreciará que están disponibles derivados y análogos que no alteran la capacidad del nucleótido o nucleósido para experimentar el apareamiento de bases de Watson-Crick. "Derivado" o "análogo" significa un compuesto o molécula cuya estructura central es igual o muy parecida a la de un compuesto original pero que tiene una modificación química o física, como, por ejemplo, un grupo lateral diferente o adicional, lo que permite unir el nucleótido o nucleósido derivado a otra molécula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. Los derivados deben ser capaces de experimentar el apareamiento de Watson-Crick. "Derivado" y "análogo" también significan un derivado sintético de nucleótido o nucleósido que tiene restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados. Dichos derivados y análogos se tratan, por ejemplo, en Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) y Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los análogos de nucleótidos también pueden comprender enlaces fosfodiéster modificados que incluyen enlaces fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.
El colorante se puede unir a cualquier posición en la base del nucleótido, a través de un enlazador, siempre que se pueda llevar a cabo aún el apareamiento de bases de Watson-Crick. Los sitios de marcaje de nucleobases particulares incluyen la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-deaza purina. Como se describió anteriormente, se puede usar un grupo enlazador para unir covalentemente un colorante al nucleósido o nucleótido.
En realizaciones particulares, el nucleósido o nucleótido marcado puede incorporarse enzimáticamente y extenderse enzimáticamente. En consecuencia, un resto enlazador puede tener la longitud suficiente para conectar el nucleótido al compuesto de manera que el compuesto no interfiera significativamente con la unión y el reconocimiento global del nucleótido por parte de una enzima de replicación de ácido nucleico. Así, el enlazador también puede comprender una unidad espaciadora. El espaciador distancia, por ejemplo, la base de nucleótidos de un sitio de escisión o etiqueta.
Los nucleósidos o nucleótidos marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento pueden tener la fórmula:
B-L-colorante
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donde Colorante es un compuesto colorante, B es una nucleobase, como, por ejemplo, uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similares y L es un grupo enlazador opcional que puede estar presente o no. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un análogo de éster fosfato, -O- unido a un grupo reactivo que contiene fósforo o -O- protegido por un grupo de bloqueo. R" puede ser H, OH, una fosforamidita o un grupo de bloqueo 3'-OH y R"' es H u OH; donde R" es fosforamidita, R' es un grupo protector de hidroxilo escindible con ácido que permite el acoplamiento posterior de monómeros en condiciones de síntesis automatizadas.
En algunos casos, el grupo de bloqueo está separado y es independiente del compuesto colorante, es decir, no está unido a él. Alternativamente, el colorante puede comprender todo o parte del grupo de bloqueo 3'-OH. Por lo tanto, R" puede ser un grupo de bloqueo 3'-OH que puede comprender o no el compuesto colorante. En realizaciones alternativas adicionales, no hay un grupo de bloqueo en el carbono 3' del azúcar pentosa y el colorante (o el colorante y la construcción enlazadora) unido a la base, por ejemplo, puede tener un tamaño o una estructura suficiente para actuar como un obstáculo para la incorporación de otro nucleótido desde un punto distinto del sitio 3'. Por lo tanto, el bloqueo puede deberse a un impedimento estérico o puede deberse a una combinación de tamaño, carga y estructura.
El uso de un grupo de bloqueo permite controlar la polimerización, por ejemplo, deteniendo la extensión cuando se incorpora un nucleótido modificado. Si el efecto de bloqueo es reversible, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante cambiando las condiciones químicas o mediante la eliminación de un bloqueo químico, la extensión se puede detener en ciertos puntos y luego dejar que continúe. Los ejemplos no limitantes de grupos de bloqueo 3'-OH incluyen los descritos en los documentos w O 2004/018497 y WO2014/139596. Por ejemplo, el grupo de bloqueo puede ser azidometilo (-CH2N3) o azidometilo sustituido (p. ej., -CH(CHF2)N3 o CH(CH2F)N3), o alilo.
En una realización particular, el enlazador y el grupo de bloqueo están ambos presentes y son restos separados que pueden escindirse en condiciones sustancialmente similares. Por lo tanto, los procesos de desprotección y desbloqueo pueden ser más eficientes ya que solo se requerirá un único tratamiento para eliminar tanto el compuesto colorante como el grupo de bloqueo.
La presente descripción también se refiere a incluir a los polinucleótidos que incorporan compuestos colorantes descritos en el presente documento. Dichos polinucleótidos pueden ser ADN o ARN compuestos respectivamente por desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos unidos en enlace fosfodiéster. Los polinucleótidos pueden comprender nucleótidos de origen natural, nucleótidos de origen no natural (o modificados) distintos de los nucleótidos marcados descritos en el presente documento o cualquier combinación de los mismos, siempre que esté presente al menos un nucleótido marcado con un compuesto colorante, según la presente solicitud. Los polinucleótidos también pueden incluir enlaces del esqueleto no naturales y/o modificaciones químicas no nucleotídicas. También se contemplan estructuras quiméricas comprendidas por mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos que comprenden al menos un nucleótido marcado.
Los nucleótidos marcados ejemplares no limitantes como se describen en el presente documento incluyen:
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Kits
Algunas realizaciones descritas en el presente documento son kits que incluyen nucleósidos y/o nucleótidos marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento. Dichos kits incluirán generalmente al menos un nucleótido o nucleósido marcado con un colorante junto con al menos un componente adicional. El (Los) componente(s) adicional(es) puede(n) ser nucleótidos o nucleósidos modificados o no modificados. Por ejemplo, los nucleótidos marcados con colorantes pueden suministrarse en combinación con nucleótidos nativos o no marcados y/o con nucleótidos marcados con fluorescencia o cualquier combinación de los mismos. Las combinaciones de nucleótidos se pueden proporcionar como componentes individuales separados o como mezclas de nucleótidos. En algunas realizaciones, los kits comprenden uno o más nucleótidos en los que al menos un nucleótido es un nucleótido marcado con un nuevo compuesto fluorescente descrito en el presente documento. Los kits pueden comprender dos o más nucleótidos marcados. Los nucleótidos pueden estar marcados con dos o más etiquetas fluorescentes. Se pueden excitar dos o más de las etiquetas utilizando una única fuente de excitación, que puede ser un láser.
Los kits pueden contener cuatro nucleótidos marcados, donde el primero de cuatro nucleótidos está marcado con un compuesto como se describe en el presente documento, y el segundo, tercero y cuarto nucleótidos están marcados cada uno con un compuesto diferente, en el que cada compuesto tiene un máximo de fluorescencia distinto y cada uno de los compuestos es distinguible de los otros tres compuestos. Los kits pueden ser tales que dos o más de los compuestos tengan un máximo de absorbancia similar pero un desplazamiento de Stokes diferente.
Los compuestos colorantes fluorescentes, los nucleótidos marcados o los kits descritos en el presente documento pueden usarse en secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN o ensayos de unión a proteínas. El uso puede ser en un instrumento de secuenciación automatizado. El instrumento de secuenciación puede contener dos láseres que funcionan a diferentes longitudes de onda.
Cuando los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, más particularmente cuatro, nucleótidos marcados con un compuesto colorante, los diferentes nucleótidos pueden marcarse con diferentes compuestos colorantes, o uno puede ser oscuro, sin compuestos colorantes. Cuando los diferentes nucleótidos están marcados con diferentes compuestos colorantes, una característica de los kits es que dichos compuestos colorantes son colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles. Como se usa en el presente documento, el término "colorantes fluorescentes distinguibles espectralmente" se refiere a los colorantes fluorescentes que emiten energía fluorescente en longitudes de onda que pueden distinguirse mediante un equipo de detección fluorescente (por ejemplo, una plataforma comercial de secuenciación de ADN basada en capilares) cuando están presentes dos o más de dichos colorantes. en una muestra. Cuando se suministran dos nucleótidos marcados con compuestos colorantes fluorescentes en forma de kit, los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles se pueden excitar a la misma longitud de onda, como, por ejemplo, mediante el mismo láser en algunas realizaciones. Cuando se suministran en forma de kit cuatro nucleótidos marcados con compuestos colorantes fluorescentes, dos de los colorantes fluorescentes distinguibles espectralmente pueden excitarse ambos a una longitud de onda y los otros dos colorantes distinguibles espectralmente pueden excitarse ambos a otra longitud de onda en algunas realizaciones. Las longitudes de onda de excitación particulares son de aproximadamente 460 nm.
En una realización, un kit comprende un nucleótido marcado con un compuesto descrito en el presente documento y un segundo nucleótido marcado con un segundo colorante en el que los colorantes tienen una diferencia en la absorbancia máxima de al menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Más particularmente, los dos compuestos colorantes tienen desplazamientos de Stokes de entre 15-40 nm o entre 20-40 nm. Como se usa en el presente documento, el término "desplazamiento de Stokes" es la diferencia entre las posiciones de los máximos de banda de los espectros de absorción y emisión de la misma transición electrónica.
En una realización adicional, dicho kit comprende además otros dos nucleótidos marcados con colorantes fluorescentes en los que dichos colorantes son excitados por el mismo láser a aproximadamente 460 nm a aproximadamente 540 nm.
En una realización alternativa, los kits pueden contener nucleótidos donde la misma base está marcada con dos compuestos diferentes. Un primer nucleótido puede marcarse con un compuesto descrito en el presente documento. Un segundo nucleótido se puede marcar con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo, un colorante 'rojo' que absorbe a más de 600 nm. Un tercer nucleótido puede marcarse como una mezcla del compuesto colorante fluorescente descrito en el presente documento y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleótido puede ser "oscuro" y no contener etiqueta. En términos simples, por lo tanto, los nucleótidos 1-4 pueden etiquetarse como 'verde', 'rojo', 'rojo/verde' y oscuro. Para simplificar aún más la instrumentación, se pueden etiquetar cuatro nucleótidos con dos colorantes excitados con un solo láser y, por lo tanto, el etiquetado de los nucleótidos 1 -4 puede ser 'verde 1', 'verde 2', 'verde 1/verde 2' y oscuro.
En otras realizaciones, los kits pueden incluir una enzima polimerasa capaz de catalizar la incorporación de los nucleótidos en un polinucleótido. Otros componentes para incluir en dichos kits pueden incluir tampones y similares. Los nucleótidos marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento, y otros componentes de nucleótidos cualquiera que incluyen mezclas de diferentes nucleótidos, pueden proporcionarse en el kit en forma concentrada para diluir antes de su uso. En tales realizaciones, también se puede incluir un tampón de dilución adecuado.
Métodos de secuenciación
Los nucleótidos (o nucleósidos) que comprenden un nuevo colorante fluorescente descrito en el presente documento pueden usarse en cualquier método de análisis que requiera la detección de una etiqueta fluorescente adherida a un nucleótido o nucleósido, ya sea solo o incorporado o asociado con una estructura molecular o conjugado más grande. Algunas realizaciones de la presente solicitud están dirigidas a métodos de secuenciación que incluyen: (a) incorporar al menos un nucleótido marcado como se describe en el presente documento en un polinucleótido; y (b) detectar el (los) nucleótido(s) marcado(s) incorporado(s) en el polinucleótido mediante la detección de la señal fluorescente del nuevo colorante fluorescente unido a dicho(s) nucleótido(s) modificado(s).
En algunas realizaciones, al menos un nucleótido marcado se incorpora a un polinucleótido en el paso de síntesis mediante la acción de una enzima polimerasa. Sin embargo, no se excluyen otros métodos de incorporación de nucleótidos marcados a polinucleótidos, tales como la síntesis química de oligonucleótidos o la unión de oligonucleótidos marcados a oligonucleótidos no marcados. Por lo tanto, el término "incorporar" un nucleótido en un polinucleótido abarca la síntesis de polinucleótidos mediante métodos químicos así como métodos enzimáticos.
En todas las realizaciones de los métodos, el paso de detección puede llevarse a cabo mientras la cadena polinucleotídica en la que se incorporan los nucleótidos marcados se hibrida con una cadena molde, o después de un paso de desnaturalización en el que se separan las dos cadenas. Se pueden incluir pasos adicionales, por ejemplo, pasos de reacción química o enzimática o pasos de purificación, entre el paso de síntesis y el paso de detección. En particular, la hebra diana que incorpora el o los nucleótidos marcados puede aislarse o purificarse y luego procesarse adicionalmente o usarse en un análisis posterior. A modo de ejemplo, los polinucleótidos diana marcados con nucleótido(s) modificado(s) como se describe en el presente documento en un paso de síntesis pueden utilizarse posteriormente como sondas o cebadores marcados. En otras realizaciones, el producto del paso sintético (a) puede someterse a otros pasos de reacción y, si se desea, el producto de estos pasos posteriores puede purificarse o aislarse.
Las condiciones adecuadas para la paso de síntesis serán bien conocidas por aquellos familiarizados con las técnicas estándar de biología molecular. En una realización, el paso de síntesis puede ser análogo a una reacción de extensión de cebador estándar que utiliza precursores de nucleótidos, incluidos los nucleótidos modificados según la presente descripción, para formar una cadena diana extendida complementaria a la cadena molde en presencia de una enzima polimerasa adecuada. En otras realizaciones, el paso de síntesis puede formar parte de una reacción de amplificación que produce un producto de amplificación de doble cadena marcado comprendido por cadenas complementarias hibridadas derivadas de la copia de las cadenas de polinucleótidos diana y molde. Otros pasos "sintéticos" ejemplares incluyen traducción de cortes, polimerización por desplazamiento de cadena, marcaje de ADN cebado al azar, etc. La enzima polimerasa usada en el paso sintético debe ser capaz de catalizar la incorporación de nucleótidos modificados según la presente descripción. De lo contrario, la naturaleza precisa de la polimerasa no está particularmente limitada pero puede depender de las condiciones de la reacción sintética. A modo de ejemplo, si la reacción de síntesis se lleva a cabo usando termociclado, entonces se requiere una polimerasa termoestable, mientras que esto puede no ser esencial para las reacciones estándar de extensión de cebadores. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar los nucleótidos modificados según la presente descripción incluyen las descritas en los documentos WO 2005/024010 o WO 2006/120433. En las reacciones sintéticas que se llevan a cabo a temperaturas más bajas, como 37°C, las enzimas polimerasas no necesitan ser necesariamente polimerasas termoestables, por lo que la elección de la polimerasa dependerá de una serie de factores, como la temperatura de reacción, el pH, la actividad de desplazamiento de la cadena y similares.
En realizaciones específicas no limitantes, los nucleótidos o nucleósidos modificados marcados con los nuevos colorantes fluorescentes con un desplazamiento de Stokes más largo según la presente solicitud pueden usarse en un método de secuenciación de ácidos nucleicos, re-secuenciación, secuenciación del genoma completo, clasificación de polimorfismos de un solo nucleótido, cualquier otra aplicación que implique la detección del nucleótido o nucleósido modificado cuando se incorpora a un polinucleótido, o cualquier otra aplicación que requiera el uso de polinucleótidos marcados comprendiendo los nucleótidos modificados colorantes fluorescentes según la presente solicitud.
En una realización particular, la presente solicitud proporciona el uso de nucleótidos modificados que comprenden compuestos colorantes descritos en el presente documento en una reacción de "secuenciación por síntesis" de polinucleótidos. La secuenciación por síntesis generalmente implica la adición secuencial de uno o más nucleótidos u oligonucleótidos a una cadena de polinucleótidos en crecimiento en la dirección 5' a 3' usando una polimerasa o ligasa para formar una cadena de polinucleótidos extendida complementaria al ácido nucleico molde que se va a secuenciar. La identidad de la base presente en uno o más de los nucleótidos añadidos se determina en un paso de detección o "formación de imágenes". La identidad de la base añadida se puede determinar después de cada paso de incorporación de nucleótidos. A continuación, la secuencia del molde se puede inferir utilizando las reglas convencionales de apareamiento de bases de Watson-Crick. El uso de los nucleótidos modificados marcados con colorantes según la presente descripción para la determinación de la identidad de una sola base puede ser útil, por ejemplo, en la clasificación de polimorfismos de un solo nucleótido, y tales reacciones de extensión de una sola base están dentro del alcance de esta solicitud.
En una realización, la secuencia de un polinucleótido molde se determina mediante la detección de la incorporación de uno o más nucleótidos en una cadena naciente complementaria al polinucleótido molde que se va a secuenciar mediante la detección de etiqueta(s) fluorescente(s) unida(s) al (a los) nucleótido(s) incorporado(s). La secuenciación del polinucleótido molde se ceba con un cebador adecuado (o se prepara como una construcción de horquilla que contendrá el cebador como parte de la horquilla), y la cadena naciente se extiende por pasos mediante la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en una reacción catalizada por polimerasa.
En realizaciones particulares, cada uno de los diferentes nucleótidos trifosfato (A, T, G y C) puede marcarse con un fluoróforo único y también comprende un grupo de bloqueo en la posición 3' para evitar la polimerización incontrolada. Alternativamente, uno de los cuatro nucleótidos puede estar sin marcar (oscuro). La enzima polimerasa incorpora un nucleótido en la cadena naciente complementaria al polinucleótido molde, y el grupo de bloqueo evita la incorporación adicional de nucleótidos. Cualquier nucleótido no incorporado se elimina y la señal fluorescente de cada nucleótido incorporado se "lee" ópticamente por medios adecuados, como un dispositivo de carga acoplada que usa excitación láser y filtros de emisión adecuados. A continuación, se eliminan (desprotegen) el grupo de bloqueo 3' y los compuestos colorantes fluorescentes, en particular mediante el mismo método químico o enzimático, para exponer la cadena naciente a la incorporación adicional de nucleótidos. Normalmente, la identidad del nucleótido incorporado se determinará después de cada paso de incorporación, pero esto no es estrictamente esencial. Similarmente, la Patente de EE.UU. No. 5.302.509 describe un método para secuenciar polinucleótidos inmovilizados en un soporte sólido. El método se basa en la incorporación de nucleótidos A, G, C y T bloqueados en 3', marcados con fluorescencia, en una cadena en crecimiento complementaria al polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido diana, pero el grupo de bloqueo 3' impide otra adición. A continuación, se puede determinar la etiqueta del nucleótido incorporado y eliminar el grupo de bloqueo mediante escisión química para permitir que se produzca una polimerización adicional. El molde de ácido nucleico a secuenciar en una reacción de secuenciación por síntesis puede ser cualquier polinucleótido que se desee secuenciar. El molde de ácido nucleico para una reacción de secuenciación normalmente comprenderá una región de doble cadena que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como cebador o punto de iniciación para la adición de nucleótidos adicionales en la reacción de secuenciación. En la región del molde que se va a secuenciar sobresaldrá este grupo hidroxilo 3' libre en la cadena complementaria. La región sobresaliente del molde que se va a secuenciar puede ser monocatenaria pero puede ser bicatenaria, siempre que “esté presente un corte" en la cadena complementaria a la cadena molde que se va a secuenciar para proporcionar un grupo OH 3' libre para la iniciación de la reacción de secuenciación. En tales realizaciones, la secuenciación puede continuar por desplazamiento de cadena. En ciertas realizaciones, se puede agregar un cebador que lleva el grupo hidroxilo 3' libre como un componente separado (por ejemplo, un oligonucleótido corto) que se hibrida con una región monocatenaria del molde que se va a secuenciar. Alternativamente, el cebador y la cadena molde a secuenciar pueden formar parte cada uno de una cadena de ácido nucleico parcialmente auto-complementaria capaz de formar un dúplex intramolecular, como por ejemplo una estructura de bucle en horquilla. Los polinucleótidos de la horquilla y los métodos mediante los cuales se pueden unir a soportes sólidos se describen en las Publicaciones PCT Nos. WO 2001/057248 y WO 2005/047301. Los nucleótidos se agregan sucesivamente al grupo 3'-hidroxilo libre, lo que da como resultado la síntesis de una cadena de polinucleótidos en la dirección 5' a 3'. La naturaleza de la base que se ha añadido puede determinarse, particularmente pero no necesariamente después de cada adición de nucleótido, proporcionando así información de secuencia para el molde de ácido nucleico. El término "incorporación" de un nucleótido en una cadena de ácido nucleico (o polinucleótido) en este contexto se refiere a la unión del nucleótido al grupo hidroxilo 3' libre de la cadena de ácido nucleico mediante la formación de un enlace fosfodiéster con el grupo fosfato 5' del nucleótido.
El molde de ácido nucleico a secuenciar puede ser ADN o ARN, o incluso una molécula híbrida comprendida por desoxinucleótidos y ribonucleótidos. El molde de ácido nucleico puede comprender nucleótidos de origen natural y/o no natural y uniones del esqueleto naturales o no naturales, siempre que estos no impidan la copia del molde en la reacción de secuenciación.
En ciertas realizaciones, el molde de ácido nucleico que se va a secuenciar se puede unir a un soporte sólido a través de cualquier método de unión adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, a través de la unión covalente. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos molde se pueden unir directamente a un soporte sólido (p. ej., un soporte basado en sílice). Sin embargo, en otras realizaciones, la superficie del soporte sólido se puede modificar de alguna manera para permitir la unión covalente directa de los polinucleótidos molde o para inmovilizar los polinucleótidos molde a través de una multicapa de hidrogel o polielectrolito, que a su vez puede estar unida de forma no covalente al soporte sólido.
Las matrices en las que los polinucleótidos se han unido directamente a soportes basados en sílice son, por ejemplo, los descritos en la Publicación PCT No. WO 2000/006770, en el que los polinucleótidos se inmovilizan sobre un soporte de vidrio mediante la reacción entre un grupo epóxido pendiente sobre el vidrio con un grupo amino interno sobre el polinucleótido. Además, la Publicación PCT No. WO2005/047301 describe matrices de polinucleótidos unidos a un soporte sólido, p.ej. para uso en la preparación de SMA, por reacción de un nucleófilo a base de azufre con el soporte sólido. Otro ejemplo adicional de polinucleótidos molde con soporte sólido es cuando los polinucleótidos molde están unidos a un hidrogel soportado sobre soportes basados en sílice u otros soportes sólidos. Los soportes a base de sílice se utilizan normalmente para soportar hidrogeles y matrices de hidrogel como se describe en las Publicaciones PCT Nos. WO 00/31148, WO 01/01143, WO02/12566, WO 03/014392, WO 00/53812 y en la Patente de EE.UU. No. 6.465.178.
Una superficie particular en la que se pueden inmovilizar los polinucleótidos molde es un hidrogel de poliacrilamida. Los hidrogeles de poliacrilamida se describen en la técnica anterior, algunos de los cuales se tratan anteriormente. Los hidrogeles específicos que se pueden usar en la presente solicitud incluyen los descritos en los documentos WO 2005/065814 y Publicación de e E.UU. No. 2014/0079923. En una realización, el hidrogel es PAZAM (poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida)).
Las moléculas molde de ADN se pueden unir a perlas o micropartículas con fines de secuenciación; por ejemplo como se describe en la Patente de EE.UU. No. 6.172.218. Se pueden encontrar más ejemplos de la preparación de bibliotecas de perlas donde cada perla contiene diferentes secuencias de ADN en Margulies et al., Nature 437, 376­ 380 (2005); Shendure et al., Science. 309 (5741): 1728-1732 (2005). La secuenciación de matrices de tales perlas usando nucleótidos como se describe está dentro del alcance de la presente solicitud.
El (los) molde(s) a secuenciar puede(n) formar parte de una “matriz” sobre un soporte sólido, en cuyo caso la matriz puede adoptar cualquier forma conveniente. Por lo tanto, el método de la presente descripción es aplicable a todos los tipos de matrices de "alta densidad", incluidas las matrices de una sola molécula, las matrices agrupadas y las matrices de perlas. Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente solicitud pueden usarse para secuenciar moldes en esencialmente cualquier tipo de matriz formada por inmovilización de moléculas de ácido nucleico en un soporte sólido, y más particularmente cualquier tipo de matriz de alta densidad. Sin embargo, los nucleótidos modificados marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento son particularmente ventajosos en el contexto de la secuenciación de matrices agrupadas.
En matrices multi-polinucleotídicas o agrupadas, distintas regiones de la matriz comprenden múltiples moléculas molde de polinucleótidos. El término "matriz agrupada" se refiere a una matriz en la que distintas regiones o sitios en la matriz comprenden múltiples moléculas de polinucleótidos que no se pueden resolver individualmente por medios ópticos. Dependiendo de cómo se forme la matriz, cada sitio de la matriz puede comprender múltiples copias de una molécula de polinucleótido individual o incluso múltiples copias de un pequeño número de moléculas de polinucleótido diferentes (p. ej., múltiples copias de dos cadenas de ácido nucleico complementarias). Se pueden producir matrices multipolinucleotídicas o agrupadas de moléculas de ácido nucleico utilizando técnicas generalmente conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 ambos describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos en los que tanto el molde como los productos de amplificación permanecen inmovilizados sobre un soporte sólido para formar matrices comprendidas por grupos o "colonias" de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Las moléculas de ácido nucleico presentes en las matrices agrupadas preparadas según estos métodos son moldes adecuados para la secuenciación utilizando los nucleótidos modificados marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento.
Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente solicitud también son útiles en la secuenciación de moldes en matrices de moléculas individuales. El término "matriz de una sola molécula" o "SMA", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de polinucleótidos, distribuidas (o dispuestas) sobre un soporte sólido, en el que la separación de cualquier polinucleótido individual de todos los demás de la población es tal que es posible efectuar la resolución individual de los polinucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico diana inmovilizadas sobre la superficie del soporte sólido deberían, por lo tanto, ser capaces de resolverse por medios ópticos. Esto significa que, dentro del área resoluble del dispositivo de formación de imágenes particular utilizado, debe haber una o más señales distintas, cada una de las cuales representa un polinucleótido.
Esto se puede lograr cuando la separación entre moléculas de polinucleótidos adyacentes en la matriz es de al menos 100 nm, más particularmente de al menos 250 nm, aún más particularmente de al menos 300 nm, incluso más particularmente de al menos 350 nm. Por lo tanto, cada molécula puede resolverse individualmente y detectarse como un punto fluorescente de una sola molécula, y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de una sola molécula también muestra un fotoblanqueo de un solo paso.
Los términos "resuelto individualmente" y "resolución individual" se usan en el presente documento para especificar que, cuando se visualiza, es posible distinguir una molécula en la matriz de sus moléculas vecinas. La separación entre moléculas individuales en la matriz estará determinada, en parte, por la técnica particular utilizada para resolver las moléculas individuales. Las características generales de las matrices de una sola molécula se entenderán con referencia a las Publicaciones PCT Nos. WO 2000/006770 y WO 2001/057248. Aunque una aplicación de los nucleótidos modificados de la presente descripción es en reacciones de secuenciación por síntesis, la utilidad de tales nucleótidos marcados no se limita a tales métodos. De hecho, los nucleótidos pueden usarse ventajosamente en cualquier metodología de secuenciación que requiera la detección de etiquetas fluorescentes unidas a los nucleótidos incorporados en un polinucleótido.
En particular, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente solicitud pueden usarse en protocolos de secuenciación fluorescente automatizados, en particular la secuenciación del ciclo de terminador de colorante fluorescente basada en el método de secuenciación de terminación de cadena de Sanger y colaboradores. Dichos métodos generalmente usan enzimas y secuenciación cíclica para incorporar didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia en una reacción de secuenciación de extensión de cebador. Los llamados métodos de secuenciación de Sanger y los protocolos relacionados (tipo Sanger) se basan en la terminación aleatoria de la cadena con didesoxinucleótidos marcados.
Por lo tanto, la presente descripción también abarca nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes como se describe en el presente documento que son didesoxinucleótidos que carecen de grupos hidroxilo en las posiciones tanto 3' como 2', siendo tales didesoxinucleótidos modificados adecuados para su uso en métodos de secuenciación de tipo Sanger y similares.
Métodos de preparación
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de fórmula (Ia), los métodos incluyen hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IIa)
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o Fórmula (Ilb)
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con un compuesto de Fórmula (III)
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para formar
Figure imgf000028_0003
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, X, m y n se definen anteriormente en la descripción de los compuestos de Fórmula (I), y R" se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido; heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de fórmula (Ia'), los métodos incluyen hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IIa)
Figure imgf000028_0004
o Fórmula (IIb)
Figure imgf000028_0005
con un compuesto de Fórmula (IIIa)
Figure imgf000029_0001
para formar
Figure imgf000029_0002
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R", X, m y n se definen anteriormente.
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de Fórmula (Ia'), el método incluye convertir un compuesto de Fórmula (Ia) en un compuesto de Fórmula (Ia') a través de la activación del ácido carboxílico:
Figure imgf000029_0003
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, X, m y n se definen anteriormente en la descripción de los compuestos de fórmula (I).
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de Fórmula (Ib), el método incluye convertir un compuesto de Fórmula (la) en un compuesto de Fórmula (la') a través de la activación del ácido carboxílico:
Figure imgf000029_0004
y hacer reaccionar el compuesto de Fórmula (la') con una amina primaria o secundaria de Fórmula (IV),
Figure imgf000030_0001
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, X, m y n se definen anteriormente en la descripción de los compuestos de fórmula (I).
Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con un método para preparar un compuesto de fórmula (Ib), los métodos incluyen hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IIa)
Figure imgf000030_0002
o Fórmula (IIb)
Figure imgf000030_0003
con un compuesto de Fórmula (IIIb)
Figure imgf000030_0004
para formar
Figure imgf000030_0005
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R", X, m y n se definen anteriormente.
La preparación de los compuestos de Fórmula (la) se puede lograr haciendo reaccionar los materiales de partida de Fórmula (lla) o (IIb) con el compuesto intermedio de Fórmula (III) preferiblemente en una relación molar de uno a uno en un disolvente orgánico con o sin catalizador. Pueden usarse tanto catalizadores orgánicos (por ejemplo, ácido trifluoroacético o ácido metanosulfónico) como catalizadores inorgánicos (por ejemplo, ácido fosfórico o sulfúrico). En algunas realizaciones, la preparación se puede realizar sin disolvente o utilizando un catalizador como disolvente.
La preparación de los compuestos de Fórmula (Ia') o (Ib) se puede lograr mediante la primera activación con ácido de los materiales de partida de Fórmula (Ia) en un disolvente orgánico a temperatura ambiente utilizando, por ejemplo, carbodiimida, sales de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio, BOP o PyBOP como reactivo de activación, seguido de reacción con los derivados hidroxi apropiados HOR7 o amina de fórmula (IV) para el paso de acoplamiento. Los compuestos de Fórmula (V), (Va) o (Vb) pueden prepararse siguiendo esquemas sintéticos similares a los descritos anteriormente en la preparación de compuestos de Fórmula (Ia), (Ia') o (Ib).
Los compuestos de fórmula (I) pueden usarse en algunas reacciones orgánicas, por ejemplo, en reacciones de sustitución aromática electrófila como materiales de partida para la síntesis de nuevos colorantes. Por ejemplo, se demostró previamente por Alan S. Waggoner (Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2):105-111; véase también la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2015/0274976) que algunas modificaciones de las moléculas de colorantes de cianina por reacción de sulfonación pueden mejorar las propiedades fluorescentes de dichos derivados.
La sulfonación de los compuestos (I) puede realizarse por reacción con trióxido de azufre, con derivados o soluciones de trióxido de azufre, por ejemplo en ácido sulfúrico.
Figure imgf000031_0001
La sulfocloración de los compuestos (I) puede realizarse por reacción con ácido clorosulfónico.
Figure imgf000031_0002
Los compuestos de fórmula (I) que contienen grupos sulfónicos o clorosulfónicos pueden modificarse aún más, por ejemplo, haciendo reaccionar con amoníaco, aminas primarias o secundarias de fórmula (IV):
Figure imgf000031_0003
donde las variables R1, R1’, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, X, n se definen anteriormente en la descripción de los compuestos de Fórmula (I).
Ejemplos
Realizaciones adicionales se describen con mayor detalle en los siguientes ejemplos, que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.
Procedimiento general para la síntesis de compuestos de Fórmula (Ia)
Figure imgf000032_0001
Se disolvió una mezcla de ácido etilbenzotiazolil-2-acético (2,2 g, 0,01 moles) y un derivado apropiado de ácido hidroxibenzoilbenzoico (0,011 moles) en ácido sulfúrico concentrado (5 ml). Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se calentó, por ejemplo, a 80-120°C durante 1-2 horas hasta que se completó la reacción. La mezcla de reacción se vertió en hielo (aproximadamente 50 g) y el producto se filtró y se lavó con agua. En muchos casos, los productos finales no necesitan purificación adicional.
Procedimiento general para la síntesis de compuestos de Fórmula (Ia')
Figure imgf000032_0002
Se disolvió un compuesto de fórmula (Ia) (0,001 moles) en DMF anhidra (1,5 ml). A esta solución se añadió carbodiimida (0,0012 moles) u otro reactivo de activación. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se añadieron los derivados hidroxi apropiados R7OH. La mezcla de reacción se agitó durante la noche, luego se filtró y se vertió en hielo (aproximadamente 50 g). El producto se filtró, se lavó con agua. Rendimiento: 55-75%. En muchos casos, los productos finales no necesitan purificación adicional.
Procedimiento general para la síntesis de compuestos de Fórmula (Ib)
Figure imgf000032_0003
Se disolvió un compuesto de fórmula (Ia) (0,001 moles) en un disolvente orgánico anhidro adecuado (DMF, 1,5 ml). A esta solución se le añadió TSTU, BOP o PyBOP como reactivo de activación. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 min y luego se añadió la amina apropiada NHR8R9. La mezcla de reacción se agitó durante la noche, se filtró y el exceso del reactivo de activación se inactivó con una solución de TEAB 0,1 M en agua. Los disolventes se evaporaron al vacío y el residuo se purificó por HPLC. Rendimiento: 65-75%.
Ejemplo 1
Ácido 2-[3-(Benzotiazol-2-il)-9-etil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]guinolin-4-il]benzoico (Compuesto I-3)
Figure imgf000032_0004
Se puso ácido sulfúrico (2 ml) en un matraz de fondo redondo, luego se enfrió hasta aproximadamente 0-5°C y se agregaron 0,325 g (1,0 mmoles, 1 eq) de ácido 2-(1-etil-7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-carbonil)benzoico con agitación seguido de la adición de 0,3 g (1,4 mmoles, 1,4 eq) de 2-(benzotiazol-2-il)acetato de etilo. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 30 min y luego se calentó durante 1,5 horas mientras se agitaba a 100°C. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10%) y por LCMS.
La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 0,5 horas y luego se vertió en una mezcla de hielo triturado (aproximadamente 100 g) y acetato de sodio (aproximadamente 5 g). Después de 1 hora, el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad, luego el filtrado se secó al aire. Rendimiento: 0,35 g (0,73 mmoles, 73%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 482,13. Encontrado: (-) 481 (M-1), (+) 483 (M+1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 12,71 (s, 1H), 8,11 - 8,02 (m, 1H), 7,96 (dd, J= 7,4, 1,6 Hz, 1H), 7,56 (tt, J= 7,5, 5,8 Hz, 2H), 7,40 (d, J= 7,2 Hz, 1H), 7,39-7,25 (m, 2H), 7,16 (dd, J= 6,6, 2,1 Hz, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 3,48 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,36 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,65 - 2,55 (m, 2H), 1,79 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 1,15 (t, J = 7,0 Hz, 3H).
Ejemplo 2
Ácido 2-[10-(benzotiazol-2-il)-1,1,7,7-tetrametil-11 -oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ijjquinolina- 9-il]benzoico (Compuesto I-5)
Figure imgf000033_0001
Una mezcla de 0,75 g (1,90 mmoles, 1 eq) de ácido 2-(8-hidroxi-1,1,7,7-tetrametil-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolina-9-carbonil)benzoico y 0,44 g (1,99 mmoles, 1,04 eq) de 2-(benzotiazol-2-il)acetato de etilo se añadió con agitación a ácido sulfúrico concentrado (7 ml) a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C). Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y luego se calentó durante 2,5 horas mientras se agitaba a 120°C. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10%) y por LCMS. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 0,5 horas y luego se vertió en una mezcla de hielo triturado (aproximadamente 50 g) y acetato de sodio (aproximadamente 5 g). Después de 1 hora, el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad y se secó al aire. Rendimiento: 0,58 g (1,05 mmoles, 55%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 550,19. Encontrado: (-) 549 (M-1)
Ejemplo 3
Ácido 2-[3-(benzotiazol-2-il)-7-(etilamino)-6-metil-2-oxo-2H-cromen-4-il]benzoico (Compuesto I-8)
Figure imgf000033_0002
Se puso ácido sulfúrico (5 ml) en un matraz de fondo redondo, luego se enfrió hasta aproximadamente 0-5°C y se agregaron 0,7 g (2,34 mmoles, 1 eq) de ácido 2-(4-(etilamino)-2-hidroxi-5-metilbenzoil)benzoico con agitación seguido de la adición de 0,7 g (3,16 mmoles, 1,35 eq) de 2-(benzotiazol-2-il)acetato de etilo. Esta mezcla de reacción se agitó durante 30 min a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) y luego se calentó durante 1 hora mientras se agitaba a 95°C. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10%) y por LCMS.
La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 0,5 horas y luego se vertió en una mezcla de hielo triturado (aproximadamente 100 g) y acetato de sodio (aproximadamente 5 g). Después de 1 hora, el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad y se secó al aire. Rendimiento: 1,01 g (2,22 mmoles, 95%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 456,11. Encontrado: (-) 455 (M-1), (+) 457 (M+1). 1H RMN (400 MHz, metanol-dt) 58,19 - 8,12 (m, 1H), 7,92 - 7,78 (m, 1H), 7,64 (dd, J= 8,3, 1,1 Hz, 1H), 7,61 - 7,48 (m, 2H), 7,43 - 7,36 (m, 1H), 7,36-7,26 (m, 1H), 7,21 -7,14 (m, 1H), 6,60 (s, 1H), 6,56 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 3,41 - 3,34 (m, 2H), 2,03 (s, 3H), 1,38 - 1,27 (m, 3H).
Ejemplo 4-1
Ácido 2-[10-(benzotiazol-2-il)-11-imino-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il]benzoico (Compuesto -4A)
Figure imgf000034_0001
Se puso ácido sulfúrico (10 mL) en un matraz de fondo redondo y luego se añadió 1 g (2,96 mmoles, 1 eq) de ácido 2-(8-hidroxi-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-carbonil)benzoico con agitación seguido de la adición de 0,57 g (3,26 mmoles, 1,1 eq) de 2-(benzotiazol-2-il)acetonitrilo. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 30 min, luego se calentó durante 1,5 horas mientras se agitaba a 80°C y 1 hora a 90°C. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10%) y por LCMS.
La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 0,5 horas y luego se vertió en una mezcla de hielo triturado (aproximadamente 100 g). Después de 0,5 horas, el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad y se secó al aire. Rendimiento: 0,8 g (1,62 mmoles, 55%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 493,15. Encontrado: (-) 492 (M-1), (+) 494 (M+1).
Ejemplo 4-2
Ácido 2-[10-(benzotiazol-2-il)-11-oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il]benzoico (Compuesto I-4).
Figure imgf000034_0002
Una suspensión de la imina (I-4A) del paso anterior (ejemplo 4-1) y agua (25 ml) se agitó 5 h a 80°C. Al final de este tiempo, el color rojo del material de partida casi desapareció y se desarrolló una fluorescencia muy fuerte. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10%) y por LCMS. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 0,5 horas y luego el producto se filtró y se lavó con agua y se secó al aire. Rendimiento: 0,77 g (1,56 mmoles, 96%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUlS): PM Calculado 494,13. Encontrado: (-) 493 (M-1), (+) 495 (M+1).
Ejemplo 5
Ácido 2-[10-(benzotiazol-2-il)-11-oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il]benzoico (Compuesto I-4)
Figure imgf000034_0003
Se puso ácido sulfúrico (10 mL) en un matraz de fondo redondo y luego se añadió 1 g (2,96 mmoles, 1 eq) de ácido 2-(8-hidroxi-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-carbonil)benzoico con agitación seguido de la adición de 0,57 g (3,26 mmoles, 1,1 eq) de 2-cianometilbenzotiazol. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 30 min y luego se calentó durante 2 horas mientras se agitaba a 95°C. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) y luego se vertió en una mezcla de agua y hielo triturado (aproximadamente 75 g). Esta mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad y se secó al aire. El producto final se usó sin purificación adicional. Rendimiento: 1,09 g (2,21 mmoles, 75%). MS (DUIS): PM Calculado 494,13. Encontrado: (-) 493 (M-1), (+) 495 (M+1).
Ejemplo 6
Ácido 2-[3-(benzotiazol-2-il)-7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il]benzoico (Compuesto I-2)
Figure imgf000035_0001
Se añadió una mezcla de 0,285 g (1,0 mmoles, 1 eq) de ácido 2-[4-(dimetilamino)-2-hidroxibenzoil]benzoico y 0,243 g (1,1 mmoles, 1,1 eq) de 2-(benzotiazol-2-il)acetato de etilo con agitación a ácido sulfúrico (5 mL) a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C). Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se calentó durante 4 horas mientras se agitaba a 100°C. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10%) y por LCMS. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante la noche y luego se vertió en una mezcla de hielo picado con agua (aproximadamente 100 g) y acetato de sodio (aproximadamente 5 g). Después de 1 hora, el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad y se secó al aire. Rendimiento: 0,429 g (0,96 mmoles, 97%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUlS): PM Calculado 442,10. Encontrado: (-) 441 (M-1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 12,70 (s, 1H), 8,14 - 8,04 (m, 1H), 8,04 - 7,94 (m, 1H), 7,58 (h, J = 6,5 Hz, 2H), 7,43 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,40 - 7,29 (m, 2H), 7,19 (dd, J= 7,2, 1,7 Hz, 1H), 6,78 - 6,63 (m, 3H), 3,07 (s, 6H).
Ejemplo 7-1
Ácido 2-[3-(benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il]benzoico (Compuesto I-1).
Figure imgf000035_0002
Se puso ácido sulfúrico (8 ml) en un matraz de fondo redondo, luego se agregaron 0,25 g (0,8 mmoles, 1 eq) de ácido 2-[4-(dietilamino)-2-hidroxibenzoil]benzoico con agitación seguido de adición de 0,14 g (0,8 mmoles, 1 eq) 2-cianometilbenzotiazol. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 30 min y luego se calentó durante 2 horas mientras se agitaba a 95°C. Esta mezcla de reacción se vertió en agua helada (aproximadamente 75 g). En este paso, el intermedio de imina correspondiente (I-1A) se formó y puede aislarse por filtración. En agua o en disolventes orgánicos con presencia de agua y particularmente en condiciones ácidas se puede lograr la hidrólisis adicional del intermedio de imina.
Figure imgf000035_0003
Esta mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y el producto se filtró y se lavó con agua hasta neutralidad y se secó al aire. Rendimiento: 0,33 g (0,7 mmoles, 88%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 470,13. Encontrado: (-) 469 (M-1), (+) 471 (M+1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 512,71 (s, 1H), 8,08 (dt, J = 7,6, 1,7 Hz, 1H), 8,03 - 7,92 (m, 1H), 7,64 - 7,52 (m, 2H), 7,45 - 7,39 (m, 1H), 7,39 - 7,27 (m, 2H), 7,19 (dd, J = 6,9, 2,3 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,69 - 6,61 (m, 2H), 3,47 (q, J = 7,2 Hz, 4H), 1,23 - 1,05 (m, 6H).
Ejemplo 7-2
Ácido 2-(7-(dietilamino)-2-oxo-3-(6-sulfobenzotiazol-2-il)-2H-cromen-4-il)benzoico (Compuesto I-13).
Se puso ácido 2-[3-(benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il]benzoico (Compuesto I-1) (1,3 g, 2,76 mmoles) en un matraz de fondo redondo, se secó a alto vacío y luego se enfrió en un baño de hielo seco con acetona. Se añadió gota a gota ácido sulfúrico fumante (20%, 5,8 ml, 27 mmoles) mientras se agitaba. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, luego se calentó durante 1 hora a 50°C y se disolvió el material de partida. La mezcla de reacción se enfrió y se añadió éter anhidro con precaución. El precipitado hidroscópico blanquecino se separó por filtración y el filtrado se trituró con éter de nuevo y luego con EtOH. Se recogió un precipitado rosa. Rendimiento 1,21 g (80%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 550,09. Encontrado: (-) 549 (M-1), (+) 551 (M+1). 1H RMN (400 MHz, TFA) 58,85 - 8,78 (m, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,57 - 8,45 (m, 2H), 8,26 - 8,15 (m, 2H), 7,94 (s, 1H), 7,67 (d, J= 9,4 Hz, 1H), 7,63 - 7,56 (m, 1H), 7,45 (dd, J = 8,8, 4,5 Hz, 1H), 3,94 (q, J = 7,2 Hz, 4H), 1,38 (t, J = 7,1 Hz, 6H). De acuerdo con el análisis de espectros HPLC y r Mn , este producto consiste principalmente en un isómero.
Ejemplo 7-3
Ácido 2-(7-(dietilamino)-2-oxo-3-(6-clorosulfonilbenzotiazol-2-il)-2H-cromen-4-il)benzoico (compuesto I-14).
Figure imgf000036_0001
Se enfrió ácido clorosulfónico (5 ml, 75 mmoles) en un baño de hielo y el colorante I-1 (1,2 g, 2,55 mmoles) se añadió cuidadosamente con agitación en porciones durante un período de 5 minutos. La mezcla combinada se agitó a temperatura ambiente (~20°C) durante 1,5 horas y luego se calentó a 95-100°C durante 6 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se añadió muy lentamente a aprox. 20 ml de mezcla de agua y hielo. Se separó un sólido de color rojo que se filtró rápidamente y se lavó con agua fría (2 x 30 ml) y se secó al vacío. Rendimiento 1,2 g (83%, 2,11 mmoles). Este compuesto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Ejemplo 7-4
Ácido 2-(7-(dietilamino)-2-oxo-3-(6-aminosulfonilbenzotiazol-2-il)-2H-cromen-4-il)benzoico (compuesto I-15).
Figure imgf000036_0002
Ácido 2-(7-(dietilamino)-2-oxo-3-(6-clorosulfonilbenzotiazol-2-il)-2H-cromen-4-il)benzoico (I-14) (1,2 g, 2,11 mmoles) se añadió cuidadosamente en porciones con agitación a una solución de amoníaco (5 ml, 25%) enfriada en un baño de hielo durante un período de 5 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (~20°C) durante 1 hora y el disolvente se eliminó por destilación a temperatura ambiente al vacío. El compuesto se purificó mediante columna ultrarrápida (gel de sílice, DCM-MeOH como eluyente). Rendimiento 0,34 g (30%, 0,62 mmoles). Este compuesto contiene una pequeña cantidad de otros isómeros y se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 549,10. Encontrado: (-) 548 (M-1), (+) 550 (M+1). 1H RMN (400 MHz, TFA) 58,83-8,73 (m, 1H), 8,62 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,42 (dd, J = 8,9, 1,8 Hz, 1H), 8,24-8,13 (m, 2H), 7,82 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,64-7,52 (m, 2H), 7,38 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,90 (q, J = 7,2 Hz, 4H), 1,37 (t, J = 7,2 Hz, 6H).
Ejemplo 8
2-[3-(Benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il]benzoato de 4-nitrofenilo (compuesto I-1B)
Figure imgf000036_0003
En DMF anhidro (1,5 mL) se disolvieron 94 mg (0,2 mmoles, 1 eq) de ácido 2-[3-(benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il]benzoico (I-1, NR440). A esta solución se añadió diciclohexilcarbodiimida (62 mg, 0,3 mmoles, 1,5 eq). Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se añadió p-nitrofenol (33 mg, 0,24 mmoles, 1,2 eq). La mezcla de reacción se agitó durante la noche y luego se filtró la diciclohexilurea. El disolvente se eliminó por destilación al vacío a temperatura ambiente y el residuo oleoso se vertió en hielo (aproximadamente 5 g). El producto amarillo sólido se separó por filtración y se lavó con agua. Rendimiento: 79 mg (67%, 0,134 mmoles). MS (DUIS): PM Calculado 591,15. Encontrado: (-) 590 (M-1), (+) 592 (M+1).
Ejemplo 9
3-(2-(10-(Benzotiazol-2-il)-11 -oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)-N-(4-(tercbutoxi)-4-oxobutil)benzamido)propano-1 -sulfonato de trietilamonio (Compuesto 1-9A')
Figure imgf000037_0001
El compuesto I-4 (150 mg, 0,3 mmoles, 1 eq) se disolvió en DMA anhidra (1,5 ml). A esta solución se añadió un exceso de trietilamina (1 ml) y tetrafluoroborato de [(1 H-benzotriazol-1-il)oxi]tris(dimetilamino)fosfonio (140 mg, 0,36 mmoles, 1,2 eq) como reactivo de activación. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 min y luego se añadió ácido 3-((3-(terc-butoxi)carbonil)amino)propano-1-sulfónico (140 mg, 0,5 mmoles, 1,6 eq). El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10%) y por LCMS.
La mezcla de reacción se agitó durante la noche, se filtró y el exceso de reactivo de activación se inactivó con una solución de TEAB 0,1 M en agua. Los disolventes se evaporaron al vacío y el residuo se purificó por HPLC. Rendimiento: 180 mg (0,21 mmoles, 69%). MS (DUIS): PM calculado 757,25. Encontrado: (-) 756 (M-1), (+) 758 (M+1) para el compuesto de anión protonado correspondiente I-9A:
Figure imgf000037_0002
Ejemplo 10
4-(2-(10-(Benzotiazol-2-il)-11 -oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)-N-(3-sulfonatopropil)benzamido)butanoato de trietilamonio (Compuesto I-9')
Figure imgf000037_0003
El compuesto I-9A' del paso anterior después de la evaporación de los disolventes (180 mg, 0,21 mmoles) se disolvió en DCM (150 mL) y se añadió ácido trifluoroacético (5 mL). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente durante la noche. El progreso de la reacción de desprotección se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10% como eluyente) y por LCMS. El DCM se eliminó por destilación. El residuo se disolvió en acetonitrilo y se añadió trietilamina (1 ml). El precipitado amarillo se filtró. MS (DUIS): PM Calculado 701,19. Encontrado: (-) 700 (M-1) para el compuesto de anión protonado correspondiente I-9:
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 11
3-(2-(3-(Benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il)-N-(4-(terc-butoxi)-4-oxobutil)benzamido)propano-1-sulfonato de trietilamonio (compuesto I-6A')
Figure imgf000038_0002
Se disolvió ácido 2-(3-(benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il)benzoico (Compuesto I-1) (94 mg, 0,2 mmoles, 1 eq) en DMA anhidra (2 mL). A esta solución se añadió un exceso de N-etil-N,N-diisopropilamina (1 ml). A esta solución se añadió tetrafluoroborato de [(1 H-benzotriazol-1 -il)oxi]tris(dimetilamino)fosfonio (80 mg, 0,21 mmoles, 1,04 eq) como reactivo de activación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente.
El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10% como eluyente). Luego se añadió ácido 3-((3-(terc-butoxi)carbonil)amino)propano-1-sulfónico (70 mg, 0,25 mmoles, 1,25 eq). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, se filtró y el exceso del reactivo de activación se inactivó con una solución de TEAB 0,1 M en agua (3 ml). Los disolventes se evaporaron al vacío y el residuo se purificó por HPLC. Rendimiento: 113 mg (0,136 mmoles, 68%). MS (DUIS): PM Calculado 733,25. Encontrado: (-) 732 (M-1) para el compuesto de anión protonado correspondiente I-6A:
Figure imgf000038_0003
Ejemplo 12
4-(2-(3-(Benzotiazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il)-N-(3-sulfonatopropil)benzamido)butanoato de trietilamonio, (Compuesto 1-6')
Figure imgf000039_0001
El compuesto I-6A' (180 mg, 0,21 mmoles) del paso anterior después de la evaporación de los disolventes se disolvió en DCM (50 mL) y se añadió ácido trifluoroacético (2,5 mL). La mezcla de reacción se dejó con agitación a temperatura ambiente durante la noche. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10% como eluyente). El disolvente se destiló y el residuo se disolvió en acetonitrilo y se añadió trietilamina (1,8 ml). Se eliminaron por destilación el acetonitrilo y el exceso de trietilamina. Al residuo del matraz se añadió éter dietílico anhidro y el producto se formó como un precipitado cristalino amarillo y se separó por filtración. MS (DUIS): PM Calculado 677,19. Encontrado: (-) 676 (M-1) para el ácido I-6:
Figure imgf000039_0002
Ejemplo 13
4-(2-(10-(Benzotiazol-2-il)-11 -oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)benzamido)butanoato de terc-butilo (I-10A)
Figure imgf000039_0003
El compuesto I-4 (97 mg, 0,196 mmoles, 1 eq) se disolvió en DMF anhidra recién destilada (2,5 ml). A esta solución, se añadió exceso de N-etil-N,N-diisopropilamina (0,253 mg, 1,961 mmoles, 10 eq) y tetrafluoroborato de [(1H-benzotriazol-1 -il)oxi]tris(dimetilamino)fosfonio (113 mg, 0,294 mmoles, 1,5 eq) como reactivo de activación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 min y luego se añadió clorhidrato de 4-aminobutanoato de terc-butilo (58 mg, 0,294 mmoles, 1,5 eq). El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10%) y por lCm S.
La mezcla de reacción se agitó durante la noche, se filtró y el exceso de reactivo de activación se inactivó con una solución de TEAB 0,1 M en agua. Los disolventes se evaporaron al vacío y el residuo se purificó por HPLC. Rendimiento: 105 mg (0,165 mmoles, 84%). MS (DUIS): PM Calculado 635,25. Encontrado: (-) 634 (M-1), (+) 636 (M+1).
Ejemplo 14
Ácido 4-(2-(10-(benzotiazol-2-il)-11 -oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)benzamido)butanoico (Compuesto I-10)
Figure imgf000040_0001
El compuesto I-10A (64 mg, 0,1 mmoles) del paso anterior después de la evaporación de los disolventes se disolvió en DCM (25 mL) y se añadió ácido trifluoroacético (3,5 mL). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente durante la noche. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10% como eluyente) y por LCMS. Los disolventes se separaron por destilación. El residuo se disolvió en acetonitrilo y se añadió trietilamina (1 ml). Se eliminaron por destilación el acetonitrilo y el exceso de trietilamina. El residuo en el matraz se secó durante la noche al vacío y luego se sonicó con éster de petróleo (25 ml) durante 1 hora. Se filtró el precipitado amarillo. MS (DUIS): PM Calculado 579,18. Encontrado: (-) 578 (M-1), (+) 580 (M+1).
Ejemplo 15
Ácido 4-(2-10-(benzotiazol-2-il)-11 -oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1 H,5H,11 H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)benzamido)butanoico (Compuesto I-7)
Figure imgf000040_0002
El compuesto 1-1B (180 mg, 0,3 mmoles, 1 eq) se disolvió en DMF anhidra (5 ml) y se añadió dimetilaminopiridina (56 mg, 0,45 mmoles, 1,5 eq). A esta mezcla de reacción se le añadió ácido 4-aminobutanoico (47 mg, 0,45 mmoles, 1,5 eq) y esta mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente durante la noche. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (acetonitrilo-agua, 10% como eluyente) y por LCMS. Los disolventes se eliminaron por destilación al vacío a temperatura ambiente. El residuo se diluyó con agua (25 ml) y el producto se formó como un precipitado amarillo y se separó por filtración. MS (DUIS): PM Calculado 555,18. Encontrado: (-) 554 (M-1), (+) 556 (M+1).
Ejemplo 16
Ácido 2-(3-(5-clorobenzoxazol-2-il)-7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromen-4-il)benzoico (Compuesto I-16)
Figure imgf000040_0003
Mezcla de 0,313 g (1,0 mmoles, 1 eq) de ácido 2-[4-(dietilamino)-2-hidroxibenzoil]benzoico y 0,263 g (1,1 mmoles, 1,1 eq) de 2-(5-clorobenzoxazol-2-il)acetato de etilo se añadió con agitación a ácido sulfúrico (5 ml) a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C). Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se calentó durante 4 horas mientras se agitaba a 100°C. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (DCM-MeOH, 10% como eluyente) y por LCMS. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) durante la noche y luego se vertió en una mezcla de hielo picado con agua (aproximadamente 100 g) y acetato de sodio (aproximadamente 5 g). Después de 1 hora, el producto se filtró y se lavó con agua hasta que la reacción fue neutra (pH de aproximadamente 7) y se secó al aire. Rendimiento: 0,453 g (0,93 mmoles, 93%). El producto final se usó sin purificación adicional. MS (DUIS): PM Calculado 488,11. Encontrado: (-) 487 (M-1).
Ejemplo 17
Procedimiento general para la síntesis de conjugados de nucleótidos totalmente funcionales
Se sintetizaron nuevos conjugados de colorantes y nucleótidos a partir de compuestos (I) o compuestos (V-O) por acoplamiento con derivados de nucleótidos apropiados.
Figure imgf000041_0001
Se añadieron DMA anhidra (2,5 ml), tetrafluoroborato de W,W,W',W'-tetrametil-0-(N-succinimidil)uronio (20 mg, 60 gmoles) y base de Hunig (0,05 ml) a la muestra seca del colorante apropiado (50 gmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Según TLC (acetonitrilo-agua, 10%), la activación normalmente se completaba en 20­ 30 min. Una vez completada la activación, se añadió a la mezcla de reacción la solución de pppC-LN3 como una sal de trietilamonio (55 gmoles) en una mezcla de DMA (0,75 ml) y agua (0,30 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió hasta aproximadamente 4°C con un baño de hielo, luego se añadió una solución de TEAB 0,1 M (5 ml) en agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacción se aplicó a la columna con aproximadamente 25 g de suspensión de resina DEAE Sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y se lavó con TEAB (gradiente de concentración desde 0,1 M hasta 1 M). Las fracciones coloreadas se recogieron y evaporaron, luego se co­ evaporaron de nuevo con agua para eliminar más TEAB y se aspiraron hasta sequedad. A continuación, el residuo se volvió a disolver en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 nm. El producto se purificó por HPLC utilizando una columna de fase inversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento: 60-75%.
Utilizando el procedimiento general descrito anteriormente, se prepararon los siguientes conjugados de nucleótidos:
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 18
En este ejemplo, las propiedades espectrales de varios colorantes fluorescentes descritos en el presente documento y los conjugados de nucleótidos correspondientes se probaron y compararon con colorantes disponibles comercialmente.
La Tabla 1A ilustra las propiedades espectrales de los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento en comparación con algunos colorantes comerciales ejemplares con absorción en la misma región espectral en solución de etanol. Se puede observar que cada uno de los nuevos colorantes fluorescentes de la presente solicitud tiene un desplazamiento de Stokes más largo en comparación con S ta r440sx .
Tabla 1A. Comparación de propiedades espectrales de varios colorantes en solución de EtOH
Figure imgf000043_0002
*Star44üsx - colorante comercial con desplazamiento de Stokes largo
Además, se compararon las propiedades espectrales del colorante I-1 con los colorantes sulfonados I-13 e I-15 en solución de metanol y los resultados se resumieron en la Tabla 1B. Estos datos demuestran que los derivados sulfonados I-13 e I-15 tienen una fluorescencia de 2 a 5 veces más fuerte en solución en comparación con el análogo no sustituido correspondiente I-1. Estos resultados demuestran el uso potencial de los colorantes sulfonados como biomarcadores.
Tabla 1B. Comparación de propiedades espectrales de colorantes sulfonados en solución de metanol
Figure imgf000043_0001
La FIG. 1 ilustra los espectros fluorescentes de los nuevos colorantes fluorescentes de la presente solicitud en comparación con un colorante comercial S ta r44 ü s x que tiene absorción en la misma región espectral (solución en la Mezcla de barrido universal; los colorantes se excitaron a 460 nm). Debido al mayor desplazamiento de Stokes, estos colorantes recientemente desarrollados pueden proporcionar más señal en la región de detección con una mejor separación de la luz de excitación a 460 nm.
La Tabla 2 ilustra las intensidades fluorescentes relativas del nucleótido C marcado con colorantes nuevos en comparación con el nucleótido apropiado marcado con colorante comercial que tiene absorción en la misma región espectral. Muestra que los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento pueden proporcionar un 60-400% más de señal a 570 nm (región de detección) cuando se excitan con luz a 460 nm debido a su mayor fluorescencia y mayor desplazamiento de Stokes.
Tabla 2. Intensidades de fluorescencia relativas del nucleótido C completamente funcional marcado a modo de ejemplo
Figure imgf000043_0003
Asumiendo £ para colorantes I-1, I-6, I-9 y I-1030.000 *£ para Star440sx 22.700
La Tabla 3 ilustra las propiedades espectrales de los nucleótidos C marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento en solución, lo que es coherente con la observación de la Tabla 1 de que la mayoría de los nucleótidos marcados con los colorantes fluorescentes de la presente solicitud tienen un desplazamiento de Stokes más largo en comparación con colorante comercial para la misma región espectral.
Tabla 3. Propiedades espectrales del nucleótido C totalmente funcionalizado marcado a modo de ejemplo en solución
Figure imgf000044_0001
La FIG. 2 ilustra la usabilidad de los nucleótidos C marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento (mostrado en negro) para el análisis de secuenciación. En este ejemplo de secuenciación, se utilizó el método de detección de dos canales. Con respecto a los métodos de dos canales descritos en el presente documento, los ácidos nucleicos se pueden secuenciar utilizando métodos y sistemas descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2013/0079232. En la detección de dos canales, se puede secuenciar un ácido nucleico proporcionando un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal, un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal, un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer y el segundo canal y un cuarto tipo de nucleótido que carece de una etiqueta que no se detecta, o se detecta mínimamente, en ninguno de los canales.
En cada FIG. 2A y 2B, el nucleótido "G" no está marcado y se muestra como la nube inferior izquierda. Hay una mezcla de dos nucleótidos "A" marcados, uno marcado con un colorante derivado de cumarina a 0,5 pM y otro con el derivado de benzopirano I-6 a 1,5 pM, que se muestra como la nube superior derecha. La señal del nucleótido "T" marcado con colorante NR550S0 se indica mediante la nube superior izquierda, y la señal del nucleótido "C" marcado se indica mediante la nube inferior derecha. El eje X muestra la intensidad de la señal de un canal y el eje Y muestra la intensidad de la señal del otro canal. En las FIG. 2A y 2B, el ffC está marcado con I-6 e I-1 respectivamente. Configuraciones del experimento: Instrumento: M15 Ciclo núm.: C-I-6 en C5, C-I-1 en C9, biblioteca de secuenciación: PhiX estándar. Muestra que los conjugados de nucleótido C completamente funcionales marcados con colorantes I-6 e I-1 proporcionó suficientes intensidades de señal y una mejor separación de las nubes.
La FIG. 3 ilustra las intensidades fluorescentes relativas de los nucleótidos C marcados con varios colorantes fluorescentes cuando se excitaron con luz azul (460 nm) o verde (530 nm). Este gráfico de barras muestra la intensidad en bruto de las agrupaciones que han incorporado el colorante indicado. Cada medida se tomó manualmente a Ex460nm y se expuso durante 1 segundo a 60°C. MTS [MiSeq R&D (Test) Software] se usó en M15 para tomar las imágenes y la herramienta de análisis de imágenes Firecrest se usó para extraer los datos de intensidad.
Los resultados muestran que los ffC marcados con los nuevos colorantes fluorescentes descritos en el presente documento proporcionaron una señal hasta un 300% más brillante en comparación con el colorante de Stokes largo comercial para la misma región espectral.
La FIG. 4 ilustra el brillo relativo de los nucleótidos C conjugados marcados con colorante fluorescente nuevo I-6 y comercial cuando se excitaron con luz azul (460 nm) a dos temperaturas diferentes (temperatura ambiente a 22°C y temperatura elevada a 60°C). El ffC marcado con el nuevo colorante fluorescente I-6 proporcionó una señal más brillante en comparación con ffC marcado con el colorante de Stokes largo comercial Star4401s para la misma región espectral a ambas temperaturas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de Fórmula (I) o formas mesómeras del mismo:
Figure imgf000045_0001
en el que cada R1, R2 y R1' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido; alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R se selecciona de -OR7 o -NR8R9;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R8 y R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, carboxialquilo, sulfonatoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, NR10, y Se;
R10 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
m es un número entero seleccionado de 0 a 4; y
n es un número entero seleccionado de 0 a 4; siempre que
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es -NHCH(CH3)CH2OH; entonces X se selecciona de O, S o Se;
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; cada m y n es 0; R es-OH; entonces X se selecciona de S o Se; cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es metilo; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se; y
cuando cada R1, R1' y R2 es H; cada R3 y R4 es etilo; m es 1 y R5 es -S(O2)Et; n es 0; R es -OH u -OEt; entonces X se selecciona de S, NR10 o Se;
en el que el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono; el grupo alquenilo tiene de 2 a 20 átomos de carbono, el grupo alquinilo tiene de 2 a 20 átomos de carbono; y
en el que sustituido significa que un grupo está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C1-C6 , alquenilo C1-C6 , alquinilo C1-C6 , heteroalquilo C1-C6 , carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), carbociclilo-C3-C7-alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros -alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilalquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros alquilo(C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 alquilo (C1-C6) (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), haloalquilo (C1-C6) (p. ej., -CF3), haloalcoxi (C1-C6) (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6 , ariltio, amino, aminoalquilo (C1-C6), nitro, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato y oxo (=O).
2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que X es S u O.
3. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que R es -OR7 o R es -NR8R9.
4. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R7 es H o alquilo.
5. El compuesto según la reivindicación 3, en el que cuando R es -NR8R9 cada R8 y R9 es H o R8 es H y R9 es alquilo o alquilo sustituido o ambos R8 y R9 son alquilo o alquilo sustituido.
6. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada R1, R1' y R2 es H o al menos uno de R1, R1' y R2 es un alquilo.
7. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cada R3 y R4 es un alquilo, o en el que R3 es H y R4 es un alquilo.
8. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido.
9. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido.
10. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido, y en el que R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un heterociclilo de 3 a 7 miembros opcionalmente sustituido.
11. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el heterociclilo contiene un heteroátomo.
12. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que m es 0 o m es 1 y R5 se selecciona de halo, sulfo, aminosulfonilo o haluro de sulfonilo y/o n es 0.
13. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2, seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
14. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto está unido covalentemente a un nucleótido u oligonucleótido a través de C(=O)R, en el que R es -OR7, y en el que R7 es un alquilo sustituido o a través de C(=O)R, en el que R es -NR8R9, y en el que al menos uno de R8 o R9 es un alquilo sustituido.
15. Un método para preparar un compuesto de Fórmula (Ia), que comprende:
hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (IIa)
Figure imgf000048_0002
o (IIb)
Figure imgf000048_0003
con un compuesto de Fórmula (III)
Figure imgf000048_0004
para formar
Figure imgf000048_0005
en el que cada R1, R2 y R1' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R1' juntos y con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
cada R3 y R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, hidróxido de sulfonilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
alternativamente, R1 y R3 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido o heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
alternativamente, R2 y R4 junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo o sistema de anillos seleccionado del grupo que consiste en heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido y heterociclilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido;
R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, alcoxialquilo, amino, aminoalquilo, aminosulfonilo, halo, ciano, hidroxi, hidroxialquilo, heteroalquilo, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, N-amido, nitro, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato, haluro de sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
X se selecciona del grupo que consiste en O, S, NR10, y Se;
R10 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
R” se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo, alquinilo, aminoalquilo, haloalquilo, heteroalquilo, alcoxialquilo, sulfo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido y heterociclilo opcionalmente sustituido;
m es un número entero seleccionado de 0 a 4;
n es un número entero seleccionado de 0 a 4;
en el que el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono; el grupo alquenilo tiene de 2 a 20 átomos de carbono, el grupo alquinilo tiene de 2 a 20 átomos de carbono; y
en el que sustituido significa que un grupo está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C1-C6 , alquenilo C1-C6 , alquinilo C1-C6 , heteroalquilo C1-C6 , carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), carbociclilo-C3-C7-alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 3-10 miembros-alquilo C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilalquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros alquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6 , alcoxi C1-C6 , haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 alquilo (C1-C6) (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), haloalquilo(C1-C6) (p. ej., -CF3), haloalcoxi (C1-C6) (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6 , ariltio, amino, aminoalquilo (C1-C6), nitro, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, sulfino, sulfonato y oxo (=O).
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