DE69815342T2

DE69815342T2 - Sulfonatfreie cyaninfarbstoffe zur markierung von nukleosiden und nukleotiden

Info

Publication number: DE69815342T2
Application number: DE69815342T
Authority: DE
Inventors: K. Charles BRUSH; D. Ned REIMER
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-16
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2018-06-17
Also published as: ATE242260T1; CA2294979A1; WO1998058942A1; EP0989990B1; US5986086A; JP2002507203A; DE69815342D1; EP0989990A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Cyaninfarbstoffe sind in der Literatur über viele Jahre hauptsächlich für photographische Zwecke beschrieben worden (Hamer, "Cyanine Dyes and Related Compounds", Interscience Publ., 1964, S. 86–350; Sturmer et al., "Sensitizing and Desensitizing Dyes", Special Topics in Heterocyclic Chemistry, Ch., 8: 194–197 (1977)). In den letzten Jahren haben Forscher von den ausgezeichneten Fluoreszenzeigenschaften der Carbocyanine zur Markierung biologischer Moleküle Gebrauch gemacht. Anfängliche Anstrengungen wurden durch den hohen Untergrund und/oder die Fluzoreszenzabschwächung durchkreuzt, wenn die Farbstoffe an Proteine konjugiert wurden. Die hydrophobe Natur der Farbstoffe veranlasste sie sich in wässrigen Medien oder an den hydrophilen Bereichen von Proteinen anzulagern. Demzufolge waren die in der früheren Literatur beschriebenen Farbstoffe nicht für die Markierung geeignete.
Waggoner et al.: Southwick, Ernst, Tauriello, Parker, Mujumdar, Mujumdar Clever und Waggoner, "Cyanine Dye Labeling Reagents-Carbomethylindocyanine Succinimidyl Esters", Cytometry, 11: 418–430 (1990); Yu, Ernst, Wagner und Waggoner, "Sensitive Detection of RNAs in Single Cells by Flow Cytometry", Nuc. Acids Res., 20: 83–88 (1992) Galbraith, Wagner, Chao, Abaza, Ernst, Nederlof, Hartsock, Waggoner, Cytometry, 12: 579–596 (1991); Ernst, Gupta, Mujumdar und Waggoner, Cytometry, 10: 3–10 (1989); Mujumdar, Ernst, Mujumdar, Lewis und Waggoner, "Cyanine Dye Labeling Reagents, – Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters", Bioconjugate Chem., 4: 105–111 (19893); Mujumdar, Mujumdar, Grant und Waggoner, "Cyanine Dye Labeling Reagents (e) Indocyanine Succinimidyl Esters", Bioconjugate Chem., 7: 356–362 (19996); Southwick. und Waggoner, US-A 4,981,977; 1/91; Waggoner et al., US-A 5,268,486, 12/93; US-A 5,486,616, 1/96; US-A 5,569,587, 10/96 und US-A 5,569,766, 10/96 legten die Verwendung von sulfonierten Derivaten von Carbocyaninen zur Markierung biologischer Moleküle offen. Es wurde gefunden, dass die Sulfonatgruppe wegen der Abstoßung der negativen Ladungen zwischen den Molekülen als Aggregationsverhinderungsrnittel wirk sam ist. In einigen der zitierten Offenlegungen von Waggoner wurde die Wichtigkeit der Sulfonatgruppe für die Neuartigkeit und Wirksamkeit der Farbstoffderivate, welche Nucleinsäuren enthielten, unterstrichen.
US-A 5,556,959 legt die Verwendung von Carbocyaninphosphoramiditen zur Markierung synthetischer Oligonucleotide offen. Aufgrund der Beschränkungen der zur Synthese von DNA verwendeten automatisierten Systeme, mussten die Amidite in einem aprotischen organischen Lösungsmittel löslich sein. Sulfonierte Carbocyanine sind in den für die Nucleotidsynthese am besten geeigneten Lösungsmitteln unlöslich. Den in US-A 5,556,959 beschriebenen Farbstoffamiditen fehlten daher die Sulfonatgruppen. Versuche haben gezeigt, dass die Amidite in geeigneten Lösungsmitteln wie Acetonitril und Dichlormethan löslich waren und die Oligonucleotide in hoher Ausbeute markierten. Die Farbstoffamidite und Zwischenprodukte können leicht und wirksam synthetisiert und gereinigt werden.
Mit Indikatorgruppen markierte Nucleosidtriphosphate (NTPs) sind seit vielen Jahren in Gebrauch (US-A 5,047,519 (9/91), Hobbs und Cucozza; US-A 5,151,507 (2/92), Hobbs und Trainor; US-A 5,242,796 (9/93), Prober et al.; US-A 5,332,666 (7/94), Prober et al.; US-A 5,558,991 (9/96), Trainor; US-A 4,828,979 (5/89), Klevan et al.; PCT WO 95/047747, Mühlegger et al.; PCT/EP 92/01756, Ansorge et al.; US-A 4,711,955 (21287), Ward et al.; US-A 5,328,824 (7/94), Ward et al.; US-A 5,449,767 (9/95), Ward et al.; US-A 5,476,928 / 12/95), Ward et al. und US-A 5,241,060 (8/93), Engelhart et al.). Über mit sulfonierten Carbocyaninen markierte NTPs wurde in der wissenschaftlichen Literatur berichtet (Yu, Chao, Patek, Mujumdar, Mujumdar und Waggoner, "Cyanine Dye dUTP Analogs for Enzymatic Labeling of DNA-Probes", Nuc. Acids Res. 22: 32226–3232 (1994)) und diese sind im Handel erhältlich (Amersham Life Science Catalogue, 1996). Die Synthese sulfonierter Cyanine ist jedoch ein schwieriges Verfahren und die Reinheit der zur Markierung verwendeten Farbstoffzwischenstufen schwankt. Die empfohlene Lagerdauer ist kurz. Reagenzien zur Markierung sind daher ebenso wie die davon abgeleiteten markierten NTPs teuer. WO 96 / 22298 gibt ein Verfahren und eine Zusammensetzung zur Stabilisierung markierter Nucleosidtriphosphate an, wovon berichtet wird, dass es schädliche Abbauprodukte, welche die Anwendungen der markierten Nucleotide stören, vermeidet. Die Markierungssubstanz kann ein sulfoniertes Carbocyanin sein.
Auf dem Gebiet der Molekularbiologie wird ein nichtsulfonierter Cyaninfarbstoff benötigt, der an ein Nucleotid gebunden ist.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemische Verbindung der folgenden Formel:
worin R¹ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Alkyl, Aralkyl und substituiertem Alkyl. Bevorzugte R¹ Substitutionen schließen, jedoch ohne Beschränkung darauf, OR^–, COOR^–, NR²R², SR² ein, worin R² am meisten bevorzugt H, eine entfernbare Schutzgruppe oder eine niedrige Alkylgruppe ist. R³ ist H, PO₃ ^–2, P₂O₆ ^–3, P₃O₉ ^–4, α-Thiophosphate wie PSO₂ ^–2, P₂SO₅ ^–3, P₃SO₈ ^–4, und αBH₃ ^–Phosphate, wie P(BH₃)O₂ ^–2, P₂(BH₃)O₅ ^–3, P₃(BH₃)O₈ ^–4. R⁴ ist aus der Gruppe gewählt, bestehend aus H, niedrigem Alkyl, Acyl und (CH₂)_PCOO(CH₂)_qCH₃, worin p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. R⁵ ist aus der Gruppe gewählt, bestehend aus H, C₁-C₄-Alkyl, Acyl, (CH₂)_pCOO(CH₂)_qCH₃, worin p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und , q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. R⁴ oder R⁵ können auch 5,6-, 6,7- oder 7,8-Butadienyl sein (und auf diese Weise einen zweiten kondensierten aromatischen Ring bilden). r ist 1, 2 oder 3 und X und Y sind O, S, C(R⁶)₂, N(R⁶) (worin R⁶ vorzugsweise CH₃ oder ein niedriges Alkyl ist). Die R³-O-Zucker-Base ist ein Nucleosid oder Nucleotid.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Nucleotid oder Nucleosid bereitzustellen, das an einen nicht-sulfonierten Cyaninfarbstoff gebunden ist.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ein Nucleosid oder Nucleotid bereitzustellen, das an einen Fluoreszenzindikator gebunden ist.
Andere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich werden, nachdem man die Spezifikation, Ansprüche und Zeichnungen der vorliegenden Erfindung überprüft hat.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Ansichten der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines an ein Nucleosid gelinkten Cyaninfarbstoffs, ausgehend von einem Amidit-Synthesezwischenprodukt.
2 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines an ein Nucleosid gelinkten Cyaninfarbstoffs.
3 ist eine Darstellung von Indodicarbocyanin (IDC)-dCTP.
4 ist eine Darstellung alternativer Linker.
5 ist eine Darstellung der allgemeinen Formel gemäß der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
worin
R¹ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Alkyl, Aralkyl und substituierten Alkylketten. Die Substitutionen sind bevorzugt OR², COOR², NR²R², SR², worin R² vorzugsweise H, eine entfernbare Schutzgruppe wie Trityl oder Acetyl oder eine niedere Alkylgruppe (n = 1 – 4) ist. In den nachstehenden Beispielen beschreiben wir eine erfindungsgemäße Verbindung, worin R¹ (CH₃)₃OH ist. Andere bevorzugte R¹-Gruppen sind (CH₂)₅COOH, (CH₂)₃NH₂ und C₂H₅.
R³ ist entweder H, PO₃ ^–2, P₂O₆ ^–3, P3O₉ ^–4, α-Thiophosphate wie PSO₂ ^–2, P₂SO₅ ^–3 P₃SO₈ ^–4, und αBH₃ ^–Phosphate wie P(BH₃)O₂ ^–2, P₂(BH₃)O₅ ^–3 oder P₃(BH₃)O₈ ^–4.
R⁴ ist aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus H, niederem Alkyl, Acyl und (CH₂)_pCOO(CH₂)_qCH₃, worin p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. R⁵ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus H, niederem Alkyl, Acyl, (CH₂)_pCOO(CH₂)_qCH₃, worin p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. R⁴ oder R⁵ können auch 5,6-, 6,7- oder 7,8-Butadienyl sein (und auf diese Weise einen zweiten kondensierten aromatischen Ring bilden). r ist 1, 2 oder 3 und X und Y sind O, S, C(R⁶)₂, N(R⁶), worin R⁶ vorzugsweise C₁-C₄-Alkyl ist, wie CH₂CH₃.
"Linker" ist eine Kombination aus Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefelatomen in einer Kette, welche den Farbstoff über N¹ an eine Stellung an der Base bindet. Der Linker kann Amid-, Ester-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Ether-, Sulfid- oder Disulfidbindungen enthalten. Die Stellung an der Base kann C⁵ oder C⁶ von Uracil, C6 von Thymidin, N⁴, C⁵ oder C⁶ von Cytosin, N², N⁷ oder C⁸ von Guanin N², C⁷ oder C⁸ von 7-Deazaguanin, C⁸ von Hypoxanthin, C⁷ oder C⁸ von 7-Deazahypoxanthin, N⁶ oder C⁸ von Adenin, oder N⁶, C⁷ oder C⁸ von 7-Deazaadenin. Bevorzugte Linker sind nachstehend in den Beispielen aufgeführt (zum Beispiel Propyl-O-PO₂-O-hexyl, Propyl-O₂C-ethyl-CO, Propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl und Propyl-O₂C-ethyl-propinyl) sowie in 4. Bevorzugte Linker haben eine Länge zwischen 3 und 25 Atomen.
Base, Zucker und R³ vereinigen sich unter Billdung von Nucleotiden und Nucleosiden, welche dem Fachmann bekannt sind.
"Base" kann Uracil, Thymin, Cytosin, Guanin, 7-Deazaguanin, Hypoxanthin, 7-Deazahypoxanthin, Adenin oder 7-Deazaadenin, 2,6-Diaminopurin oder eine andere Stickstoff-heterocyclische Base sein, wie jene in Johnson, Zhang und Bergstrom, "The synthesis and stability of oligodeoxyribonucleotides containing deoxyadenosin mimic 1-(2'-deoxy-β-D-ribofuranosyl)rinidazole-4-carboxamide", Nuc. Acids Res. 25: 559–567 (1997) und den darin beschriebenen Literaturstellen.
"Zucker" kann Ribosyl, 2'-Deoxyribosyl, 3'-Deoxyribosyl oder 2',3'-Dideoxyribosyl oder 2'-Oxabutyl sein, wobei der Zucker vorzugsweise an N¹ der Pyrimidine und N⁹ der Purine und Deazapurine gebunden ist.
"R³-O-Zucker-Base" zeigt an, dass die R³-Gruppe bevorzugt an den 5'-Sauerstoff des Zuckers gebunden ist. Im Falle des 2'-Oxybutyl"Zuckers", gibt es keinen 5'-Sauerstoff und die R³-Gruppe wäre mit dem 4'-Sauerstoff verknüpft.
Die nachstehenden Beispiele legen bevorzugte Syntheseverfahren für die erfindungsgemäße Verbindung offen.
Im Allgemeinen kann die Synthese der Verbindungen wie folgt beschrieben werden:
Das aromatische quaternäre Ammoniumsalz wird durch Alkylierung eines 2-Methylindolenins, Benzoxazols oder Benzothiazols oder eines verwandten Benzoderivats hergestellt. Das Alkylierungsmittel enthält eine (geschützte) funktionelle Gruppe die weiter derivatisiert werden kann. Zwei Moleküle des resultierenden quaternären Salzes werden mit einem Molekül eines geschützten ungesättigten Dialdehyds kondensiert, um ein symmetrisches Cyanin zu liefern. Alternativ wird ein Molekül mit einem Dianil eines ungesättigten Dialdehyds kondensiert. Das Produkt wird dann mit einem unterschiedlichen aromatischen quaternären Ammoniumsalz kondensiert um ein unsymmetrisches Cyanin zu liefern.
Die funktionelle Gruppe am Alkyherungsmittel wird dann abgespalten (sofern nötig) und derivatisiert, um eine aktivierte Gruppe zu liefern, die in der Lage ist, mit einer Gruppe am Nucleosidtriphosphat zu reagieren. Auf dem Fachgebiet sind viele Verfahren bekannt, die angewendet werden können, um dies zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Markierung von Nucleinsäuren. Hierzu würde man vorzugsweise die vorstehend beschriebene Verbindung in die Nucleinsäurekette auf die gleiche Weise einführen, wie man andere Nucleotide einführt. In einer am meisten bevorzugten Form der Erfindung würde man dann die Nucleinsäuresequenz des markierten Nucleinsäuremoleküls bestimmen
Beispiele
im Allgemeinen
Die nachstehend beschriebenen Reaktionsschemata gelten ganz allgemein für verschiedene verfahrensgemäß hergestellte Verbindungen. "NTP" bezeichnet ein Nucleosid oder Nucleosidmono-, -di- oder -triphosphat, das über eine Aminogruppe an den Linker und den Farbstoff gebunden ist. Alle synthetisierten Beispiele sind Triphosphate, da sie die am schwierigsten herzustellenden, aber die nützlichsten Verbindungen sind. Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet.
Tabelle 1
Verbindungendie nach dem in 2 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden schließ enein:
Es erfolgte eine spektroskopische Untersuchung im sichtbaren Bereich, um zu bestimmen, ob die hydrophoben Farbstoffe in wässriger Lösung aggregieren. Je größer die Schulter bei kurzer Wellenlänge ist, eine umso stärkere Aggregation erfolgt. Die Konzentration von Indotricarbocyanin-ddATP, einem der am stärksten hydrohoben Farbstoff-Nucleosid-Konjugate, wurde über einen Bereich von 0,6 bis 80 μM variiert. Es wurde das Verhältnis von 744 nm : 682 nm beobachtet (das Wellenlängenmaximum zur kurzen Wellenlänge der Schulter des ITC-Spektums). Die Schwankung betrug ungefähr ±5% über den gesamten Bereich, verglichen mit dem Verhältnis bei einer mittleren Absorption von A₇₄₄ = 0,578 : A₆₈₂ = 0,202, was auf eine sehr geringe, wenn überhaupt eine, Aggregation hinweist.
Experimentelles
Beispiel 1
(5, r = 2, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff-(propyl-O-PO₂-O-hexyl)-Base; Zucker = Deoxyribosyl; Base = Adenin-N⁶) 1-3"-(N⁶-Hexyldeoxyadenosin, 5'-O-Triphosphat)propyl)phosphat)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin.
(β-Cyanoethyl)
(1-(3'''-(1'''-Propyl))-1'-(3'-(1''-(p-methoxytrityl)oxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin)(6-N-trifluoracetylaminohexyl)phosphat
Das Mono-MMTr-Zwischenprodukt zur Herstellung des entsprechenden Amidits (1,13 g, 0,0045 Mol) wurde mit 6-N-Trifluoracetylaminohexyl-(β-cyanothyl-N,Ndiisopropylamino-phosphoramidit (1,4 g, 0,0065 Mol) und 0,4 g (0,0056 Mol) Tetrazol (in 2 ml trockenem Acetonitril) in 7 ml trockenem Dichlormethan behandelt. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt und dann mit 10 ml 0,35 M Iod in einem Gemisch aus Pyridin, Wasser und Collidin behandelt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan verdünnt und mit wässrigem Bicarbonat und Salzlösung extrahiert. Die Lösung wurde getrocknet und eingedampft, um einen vollkommen geschützten Phosphortriester zu hinterlassen.
(1-(3'''-(1'''-Propel)-1'-(3''-oxypropyl))--3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin) (6-N-aminohexyl)phosphat
Der Triester wurde in 50 ml Ethanol gelöst, dem 150 ml 3 : 1 conc. Ammoniak/-Ethanol zugesetzt wurden. Nach zwei Stunden bei 60°C waren die TFA- und Cyanoethylschutzgruppen entfernt worden. Die Lösungsmittel wurden abgedampft und der Rückstand binnen einer Stunde in 50 ml 7% Trichloressigsäure gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde durch Extraktion mit wässrigem Bicarbonat neutralisiert, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde chromatographisch an einer C-18 NovaPak Säule mit einem 15 min Gradienten mit 40–100% Acetonitril in Triethylammoniumacetat, 0,1 M, pH 7,0, R_f = 7,8 min, gereinigt. Das isolierte Material wies das erwartete UV/VIS-Spektrum auf; λ = 648 nm.
(1-(3'''-(1'''-Propel)-1'-(3''-oxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin) (6-amiaohexyl N⁶-deoxyadenosin, 5'-O-triphosphat)phosphat
Der obige, Aminohexyl-derivatisierte Farbstoff wurde in 500 μl 0,1 M Natriumborat, pH 9,2, gelöst. Hierzu wurde 6-Clorpurin-9-(1'-β-deoxyribosid-5'-O-triphosphat) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei 60°C gerührt, wonach die HPLC-Analyse (C-18, 0–70%Acetonitril/TEAA) einen hohen Prozentsatz des Produkts auswies. Der Hauptpeak wurde mittels präparativer HPLC, 10–50% Acetonitril/0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, bei einen 40 min Gradienten isoliert. Er wurde zweimal mittels präparativer C-18 HPLC, 15–40% Acetonitril/0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, bei einen 40 min Gradienten auf eine Reinheit von >99% nachgereinigt. Das Produkt wurde mithilfe einer C-18 Kartusche entsalzt und in wässriger Lösung gelagert. Das UV/VIS-Spektrum zeigte die erwarteten Peaks bei 648 nm für den Farbstoff und 268 nm für ein N⁶-derivatisiertes Adenin.
Das Material wurde mit Cy5-29^TM-dATP verglichen, das durch Umsetzung eines im Handel erhaltenen Cy5-29^TM-OSu (NHS-Ester) mit N⁶-Aminohexyl-dATPP hergestellt wurde. Die UV/VIS-Spektren waren identisch und die durch automatische Sequenzanalyse auf einem ALFexpress (Pharmacia Biotech) erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse zeigen, dass kein Unterschied zwischen der Reaktion des hier beschriebenen, nicht-sulfonierten Materials und dem Cy5-29^TM-markierten Material besteht, das zwei sulfonierte Gruppen trägt.
Beispiel 2
(5, r = 2, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff-(propyl-O₂C-ethyl-CO)-Base; Zucker = Deoxyribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-(N⁴-6-Amidohexyldeoxyldeoxycytidin, 5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin) (Vgl. 3)
(1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure))-1'-(3''-(1''-p-methoxytrityl)oxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin)
Das Mono-MMTr-Zwischenprodukt für die Herstellung des Amidits (1 g, 0,00128 Mol) wurde in 10 ml Pyridin gelöst und mit 0,384 g (0,004 Mol) Bernsteinsäureanhydrid und 0,11 g 4-Dimethylaminopyridin (0,0058 Mol) behandelt. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 4 Stunden gerührt. Der Fortgang wurde durch C-18 HPLC an einer 3 μm Säule bei 80% Acetonitril/TEAA bei isocratischer Arbeitsweise und Nachweis bei 648 nm überwacht. Nach Zugabe von 1 ml Wasser wurde die Reaktion zur Trockne eingedampft. Der Rückstrand wurde in Dichlormethan gelöst und mit wässrigem Bicarbonat und Salzlösung extrahiert. Nach dem Trocknen wurde die organische Schicht zur Trockene eingedampft.
(1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure))-1'-(3''-(1''-hydroxyproppl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin)
Das Material aus der vorangehenden Umsetzung wurde in 30 ml 80% Eisessig in Wasser gelöst. Nach fünf Stunden bei Umgebungstemperatur war die Tritylabspaltung vollständig, ohne dass Hydrolyse des Bensteinsäureesters erfolgte. Der Fortgang wurde durch C-18 HPLC an einer 3 μm Säule bei 50% Acetonitril/TEAA während 1 Minute isocratischer Arbeitsweise, dann auf 100% Acetonitril in 10 Minuten und Nachweis bei 648 nm überwacht. Die Lösung wurde eingedampft und der Rückstand in Dichlormethan gelöst, dreimal mit wässrigem Bicarbonat und Salzlösung extrahiert. Die Lösung wurde getrocknet und zu einem blauen Pulver eingedampft.
(1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure, N-Hydroxybernsteinsäureester))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'- tetramethyl-indodicarbocyanin)
Der trockene Feststoff wurde in 10 ml Dichlormethan gelöst, gefolgt von 0,5 ml Pyridin und 0,81 g (∼3 Äq.) O-Trifluoracetyl-N-hydroxybernsteinsäureimid. Die durch C-18 HPLC an einer 3 μm Säule bei 50% Acetonitril/TEAA während 1 Minute bei isocratischer Arbeitsweise, dann bei 100% Acetonitril in 10 Minuten und Nachweis bei 648 nm überwachte Reaktion, war in 5 Minuten beendet. Zu 30 ml wurde Dichlormethan zugegeben, die Lösung dreimal mit Wasser extrahiert, getrocknet und eingedampft.
1-3''-(N⁴-6-Amidohexyldeoxycytidin-5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin
N⁴-(6-Aminohexyl)-dCTP wurde in 0,3 ml 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9.4, gelöst. Hierzu wurden 200 μl DMF zugesetzt, gefolgt von 100 μl DMF, das 10 mg Aminolinker-Farbstoff enthielt. Der pH-Wert wurde auf 9,4 zurückgestellt. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 1,5 Stunden gerührt, wonach eine lonenaustausch HPLC Analyse (5–050% B in A während 30 Minuten; A = 0,005 M Natriumphosphat, pH 7,5 mit 20% Acetonitril; B = A+ 1 M NaCl) einen hohen Prozentsatz an Produkt bei ∼6 Minuten zeigte.
Der Hauptpeak wurde mit C-18 HPLC, 5% während 2 Minuten, anschließend 5-60% Acetonitril 0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, bei einen 40 Minuten Gradienten nachgereinigt. Er wurde zweimal mittels präparativer HPLC, 15–40% Acetonitril/0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, bei einen 40 min Gradienten auf eine Reinheit von >99% nachgereinigt. Das Produkt wurde mithilfe einer C-18 Kartusche entsalzt und in wässriger Lösung gelagert. Das UV/VIS-Spektrum zeigte die erwarteten Peaks bei 648 nm für den Farbstoff und 276 nm für ein N⁴-derivatisiertes Cytosin.
Das Material wurde mit Cy5-29^TM-dCTP verglichen, das durch Umsetzung eines im Handel erhaltenen Cy5-29^TM-OSu (NHS-Ester) mit N⁴-Aminohexyl-dCTP hergestellt wurde. Die UV/VIS-Spektren waren identisch und die durch automatische Sequenzanalyse auf einem ALFexpress (Pharmacia Biotech) erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse zeigen, dass kein Unterschied zwischen der Reaktion des hier beschriebenen, nicht-sulfonierten Materials und dem Cy5-29^TM-markierten Material besteht, das zwei sulfonierte Gruppen trägt.
Beispiel 3
(5, r = 2, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff (propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Ribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-(N⁴-6-Amidohexylcptidin,5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodicarbocyanin)
N⁴-(6-Aminohexyl)-CTP (10 mg), hergestellt aus Diaminohexan und CTP durch Bisulfitkatalyse, wurde in 200 μl Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, gelöst. Es wurden 10 mg Indodicarbocyanin-NHS-ester (vgl. 2, X = C(CH₃)₂, r = 2) in 50 μl DMF zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,5 eingestellt und die Reaktion 2 Stunden ablaufen lassen. Das Produkt wurde mittels C-18 NovaPak HPCL isoliert (A = 0,05 M Ammoniumphospohat, pH 7,5, B = Acetonitril: 5% B während 2 Minuten, 5–60% B während 40 Minuten). Die geeigneten Peaks wurden vereinigt und über eine C-18 Kartusche entsalzt. Das UV/VIS-Spektrum wies die erwarteten Peaks bei 646 nm für den Farbstoff und bei 276 nm für ein N⁴-derivatisierte Cytosin auf.
Beispiel 4
(5, r = 2, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff (propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Dideoxyribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-(N⁴-6-Amidohexyl-2,3-dideoxycytidin,5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indodiarbocyanin)
N⁴-(6-Aminohexyl)-ddCTP, hergestellt aus Diaminohexan und 2',3'-Dideoxy-CTP durch Bisulfitkatalyse (14 μmol), wurde in 1000 μl 0,05 Mol Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, gelöst. Es wurden 8 mg Indodicarbocyanin-NHS-ester (vgl. 2, X = C(CH₃)₂, r = 2) in 150 μl DMF und 150 μl Wasser zugegeben. Der pH-Wert wurde auf.9,3 eingestellt und die Reaktion 1 Stunde ablaufen lassen. Das Produkt wurde mittels C-18 NovaPak HPCL isoliert (A = 0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, B = Acetonitril: 70% B während 40 Minuten). Die geeigneten Peaks wurden vereinigt und über eine C-18 Kartusche entsalzt. Das UV/VIS-Spektrum wies die erwarteten Peaks bei 646 nm für den Farbstoff und bei 276 nm für ein N⁴-derivatisierte Cytosin auf. Ausbeute: 59% bei 646 nm absorbierendes Material, gemäß HPLC-Analyse. Das Material wurde mittels einer DNA-Polymerase unter Kettenverlängerung in einen Standardsequenzversuch eingeführt.
Beispiel 5
(5, r = 3, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff (propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Dideoxyribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-(N⁴-6-Amidohexyl-2,3-dideoxycytidin,5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indotricarbocyanin)
1',1''-Bis-(3''-(1- hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyliadotricarbocyanin)
1-((3'-(1'-Acetoxypropyl))-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliniumiodid (2 g) und 0,71 g Glutacondialdehyddianil wurden in einem Gemisch aus 40 ml Essigsäureanhydrid, 10 ml Eisessig und 1 g Kaliumacetat gelöst. Die Lösung wurde 20 Minuten am Rückfluss gekocht, wonach das Verhältnis von A₇₄₀ zu A₂₈₀ anzeigte, dass die Umsetzung vollständig war. Die Lösungsmittel wurden verdampft und der Rückstand in Dichlormethan gelöst, dreimal mit wässrigem Bicarbonat und einmal mit Salzlösung extrahiert, und eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Methanol gelöst und 100 ml 4M HCl zugegeben. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt, um die Hydrolyse des Essigesters zu vervollständigen. Die Lösungsmittel wurden verdampft und der Rückstand in Dichlormethan gelöst, dreimal mit wässrigem Bicarbonat und einmal mit Salzlösung extrahiert, und eingedampft. Die HPLC bestätigte die Umwandlung zur Titelverbindung, verglichen mit dem Diacetyl. UV/VIS: λ_max = 744 nm Maximum
(1-(3'''-(1'''-Propyloxyberasteinsäure))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanin
1',1''-Bis-(3''-(1-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanin)(0,5g) wurde zweimal gemeinsam mit trockenem Pyridin abgedampft, in 10 ml Pyridin gelöst und mit 65 mg (1 Äq.) Bernsteinsäureanhydrid und 0,055 g 4-Dimethylaminopyridin behandelt. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 4 Stunden gerührt. Der Fortschritt wurde durch C-18 HPLC an einer 4 μm Säule bei 60% Acetonitril/TEAA, isocratisch, überwacht. Nach Zugabe von 1 ml Wasser wurde die Reaktion zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Dichlormethan gelöst, mit Wasser extrahiert und getrocknet. Nach der Trocknung wurde die organische Schicht zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10% Acetonitril in 1 M TEAA, pH 7, gelöst und mit einer präparativen HPLC an einer NovaPak C-18 Kartusche mit einem Gradienten von 0–70% Acetonitril/0,1 M TEAA, pH 7, gereinigt. Ausbeute: 30 mg.
(1-(3'''-(1'''-propyloxyberasteiasäure,N-Hydroxybernsteiasäureimidester))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'- tetramethylindotricarbocyanin)
(1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure)-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanin) wurde durch zweimaliges gemeinsames Abdampfen mit Pyridin getrocknet, dann in 1 ml trockenem Dichlormethan und 0,05 ml Pyridin gelöst. Es wurde O-Trifluoracetyl-N-hydroxybernsteinsäureimid (0,025 g) zugesetzt und die Reaktion gerührt. Die durch C-18 HPLC an einer 4 μm Säule bei einem Gradienten von 0–75% Acetonitril/TEAA bei 648 nm überwachte Reaktion war in 5 Minuten abgeschlossen. Zu 30 ml wurde Dichlormethan zugegeben und die Lösung dreimal mit Wasser extrahiert, getrocknet und eingedampft. UV/VIS: λ_max = 744 nm; Ausbeute 34 mg bei 80% Reinheit.
1-3''-((N⁴-6-Amidohexyl-2',3'-dideoxycytidin, 5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indotricarbocyanin)
N⁴-(6-Aminohexyl)-ddCTP, hergestellt aus Diaminohexan und 2',3'-Dideoxy-CTP durch Bisulfitkatalyse (6 mg, 10 μmol), wurde in 700 μl Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, gelöst. Es wurden 5 mg Indotricarbocyanin-NHS-ester (vgl. 2, X = C(CH₃)2, r = 3) in 100 μl DMF und 100 μl zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,3 eingestellt und die Reaktion 45 Minute4n ablaufen lassen. Das Produkt wurde mittels C-18 NovaPak HPCL isoliert (A = 0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, B = Acetonitril: 0% B bis 70% B während 40 Minuten. Die geeigneten Peaks wurden vereinigt und über eine C-18 Kartusche entsalzt. Das UV/VIS-Spektrum wies die erwarteten Peaks bei 744 nm für den Farbstoff und bei 274 nm für ein N⁴-derivatisiertes Cytosin auf. Das Material wurde mittels einer DNA-Polymerase unter Kettenverlängerung in einen Standardsequenzversuch eingeführt.
Beispiel 6
(5, r = 3, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff-(propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Deoxyribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-((N⁴-6-Amidohexyl-2'-deoxycytidin,5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indotricarbocyanin)(Vgl. 3)
N⁴-(6-Aminohexyl)-dCTP, hergestellt aus Diaminohexan und 2'-Deoxy-CTP durch Bisulfitkatalyse (1 mg), wurde in 1000 μl 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9, 5, gelöst. Es wurden 1 mg Indotricarbocyanin-NHS-ester (vgl. 2, X = C(CH₃)₂, r = 3) in 50 μl DMF und 50 μl Wasser zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,3 eingestellt und die Reaktion 45 Minuten ablaufen lassen. Das Produkt wurde mittels NovaPak C-18 HPCL isoliert (A = 0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, B = Acetonitril: 0% B bis 70% B während 40 Minuten). Die geeigneten Peaks wurden vereinigt und über eine C-18 Kartusche entsalzt. Das UV/VIS-Spektrum wies die erwarteten Peaks bei 744 nm für den Farbstoff und bei 274 nm für ein N⁴-derivatisierte Cytosin auf. Ausbeute: 50% des bei 744 nm absorbierenden Materials ist nach HPLC-Analyse Produkt.
Beispiel 7
(5, r = 3, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff (propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Dideoxyribosyl; Base = Adenin-N⁶)
1-3''-((N⁶-6-pmidohexyl-2',3'-dideoxyadenosin, 5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyliadotricarbocyanin)
N⁶-(6-Aminohexyl)-ddATP, hergestellt aus Diaminohexan und 6-Chlorpurin-2',3'dideoxyribosid-5'-O-triphosphat (10 μmol), wurde in 500 μl 0,08 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, gelöst. Es wurden 3 mg Indotricarbocyanin-NHS-ester ( 3, X = C(CH₃)₂, r = 3) in 75 μl DMF und 75 μl Wasser zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,3 eingestellt und die Reaktion 2 Stunden ablaufen lassen. Das Produkt wurde mittels NovaPak C-18 HPCL isoliert (A = 0,05 M Ammoniumphosphat, pH 7,2, B = Acetonitril: 0% B bis 70% B während 40 Minuten). Die geeigneten Peaks wurden vereinigt, das Acetonitril abgedampft und das Produkt in Ammoniumphosphatlösung gelagert. Das UV/VIS-Spektrum wies die erwarteten Peaks bei 746 _nm für den Farbstoff und bei 271 nm für ein N⁶-substituiertes Adenin auf. Ausbeute: 48 μmol.
Beispiel 8
(5, r = 1, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff-(propyl-O₂C-ethyl-CONH-propinyl)-Base; Zucker = Dideoxyribosyl; Base = 7-Deazaguanin-C⁷)
1-3''-((7-(3-Amidopropinyl-2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin, 5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyliadomonoarbocyanin)
(1-(3'''-(1'''-propyloxybernsteiasäure))-1'-(3''-(1''-(p-methoxytrityl)oxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyl-indomonocarbocyanin)
Das Mono-MMTr-Zwischenprodukt aus der Herstellung des IMC-Amidits (0,2 g) wurde zweimal gemeinsam mit Pyridin abgedampft, in 2 ml Pyridin gelöst und mit 0,077 g Bernsteinsäureanhydrid und 0,022 g 4-Dimethylaminopyridin behandelt. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 2 Stunden gerührt. Der Fortgang wurde durch C-18 HPLC an einer 3 μm Säule bei 60% Acetonitril/TEAA bei isocratischer Arbeitsweise überwacht. Nach Zugabe von 0,2 ml Wasser würde die Reaktion zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und mit wässrigem Bicarbonat und Salzlösung extrahiert. Nach dem Trocknen wurde die organische Schicht zur Trockene eingedampft. UV/VIS: λ_max = 550 nm.
(1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethylindomonoarbocyanin)
Das Material aus der vorangehenden Reaktion wurde in 10 ml 80% Essigsäure in Wasser gelöst. Nach drei Stunden bei Umgebungstemperatur war die Trytilabspaltung ohne Hydrolyse des Bernsteinsäureesters abgeschlossen. Der Fortgang wurde durch C-18 HPLC überwacht. Die Lösung wurde eingedampft und der Rückstand in Dichlormethan gelöst, dreimal mit wässrigem Bicarbonat und Salzlösung extrahiert. Die Lösung wurde getrocknet und eingedampft. Ausbeute: 130 mg. UV/VIS: λ_max = 550 nm.
(1-(3'''-(1'''-propyloxybernsteiasäure, N-hydroxyberasteinsäureimidester))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetra-methylindomonoarbocyanin)
Der trockene Feststoff wurde zweimal gemeinsam mit Pyridin eingedampft und in 2 ml trockenem Dichlormethan gelöst, gefolgt von 0,1 ml Pyridin und 0,2 g (∼3 Äq.) O-Trifluoracetyl-N-hydroxysuccinimid. Die mit C-18 HPLC überwachte Reaktion war nach 5 Minuten beendet. Es wurde Dichlormethan zugegeben und die Lösung dreimal mit Wasser extrahiert, getrocknet und eingedampft. Die HPLC-Analyse (10-90% Acetonitril in 0,2 M TEAA, pH 7) zeigte, das das Material etwa 85% rein war. Ausbeute: 180 mg, UV/VIS: λ_max = 550 nm.
1-3''-((7-(3-Amidopropinyl-2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin, 5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethylindomonocarbocyanin)
7-(3-Aminopropinyl)-7-deaza-2',3'-ddGTP (0,25 μmol), erhalten von NEN/DuPont, wurde in 0,1 M wässrigem Cabonatpuffer, pH 9,5) gelöst. Es wurde (1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure, N-hydroxybernsteinsäureimidester))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetra-methylindomonoarbocyanin) (1 mg) in jeweils 50 μl DMF und Wasser zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,2 eingestellt. Nach einer Stunde wurde die Reaktion durch Zugabe von NaH₂PO₄ auf pH 6,7 abgebrochen. Das Produkt wurde an C-18 HPLC mit Acetonitril und Ammoniumphosphatlösung, pH 6, gereinigt. Ausbeute: 29 nmol. UV/VIS: λ_max = 550 nm.
Beispiel 9
(5, r = 1, X = C(CH₃)₂, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff-(propyl-OaC-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Deoxyribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-((N⁴-(6-Amidohexyl-2'-deoxycytidin,5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl) 1'-(3'''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethyliadomonocarbocyanin)
N⁴-(6-Aminohexyl)-dCTP (1 mg), hergestellt aus Diaminohexan und 2'-Deoxy-CTP durch Bisulfitkatalyse, wurde in 0,1 M wässrigem Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, gelöst. Es wurde (1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure, N-hydroxybernsteinsäureimidester))-1'-(3''-(1''-hydroxypropyl))-3,3,3',3'-tetramethylindomonoarbocyanin) (1 mg) in jeweils 50 μl DMF und Wasser zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,2 eingestellt. Nach 1 Stunde wurde die Anwesenheit des Produkts durch HPLC-Vergleich mit ähnlichen Verbindungen bestätigt. UV/VIS: λ_max = 550 nm.
Beispiel 10
(5, r = 1, X = 0, R⁴ = R⁵ = H, R = (CH₂)₃OH, R³ = 5'-O-Triphosphat, Linker = Farbstoff (propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl)-Base; Zucker = Dideoxyribosyl; Base = Cytosin-N⁴)
1-3''-((N⁴-6-Amidohexyl-2',3'-dideoxycytidin,5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxyproppl))-benzoxazolmonocarbocyanin)
1'-((3'-(1'-Acetopropyl))-benzoxazoliumiodid
2-Methylbenzoxazol (7,0 g, 0,053 Mol) und 13,2 g (0,03 Mol) 3-Iodpropylacetat wurden zusammen 16 Stunden auf 100–110°C erwärmt. Die Mischung wurde durch Digerieren in Ethylacetat zu einem körnchenförmigen Pulver kristallisiert. Es wurde abfiltriert und durch Waschen mit Ether getrocknet. Ausbeute: 15,1 g.
1,1''-Bis-(3''-(1-acetoxypropyl))-beazoxazolmonocarbocyanin
1-((3'-Acetoxypropyl))-benzoxazoliumiodid (5 g, 0,014 Mol) und 4,5 g Triethylorthoformiat wurden in 100 ml trockenem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde 3 Stunden am Rückfluss gekocht. Die Lösungsmittel wurden abgedampft und der Rückstand aus Ethylacetat umkristallisiert. Ausbeute: 4,9 g, UV/VIS: λ_max = 484 nm.
(1'-(3''-(1''-Acetoxyproppl)-1''-(3'''-(1'''-hydroxypropyl))-benzoxazolmonocarbocyanin
1'-((3'-(1'-Acetoxypropyl))-benzoxazoliumiodid (1 g) wurde 1 Stunde in einem Gemisch aus 20 ml 4 N HCl und 20 ml Methanol gerührt und dann im Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und mit Wasser extrahiert. Das Wasser wurde seinerseits dreimal mit Dichlormethan extrahieri. Die organischen Schichten wurden vereinigt, getrocknet und eingedampft. Das Material wurde durch präparative C-18 HPLC an einer 25 × 200 mm NovaPak Kartusche unter Verwendung eines 10–65% Acetonitril/TEAA-Gradienten gereinigt. Die mit dem Monoacetylderivat angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft.
(1'-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteinsäure)-1''-(3'''-(1'''-acetoxypropyl))-beazoxazol-monocarbocyanin
Das Monoacetylderivat (175 mg) wurde durch dreimaliges gemeinsames Abdampfen mit Acetonitril getrocknet und in 1 ml trockenem Pyridin gelöst. Es wurden Bernsteinsäureanhydrid und DMAP zugegeben und die Reaktion lief 2 Stunden. Die Reaktion wurde mit 1 ml Wasser abgebrochen und das Produkt durch präparative C-18 HPLC an einer 25 × 200 mm NovaPak Kartusche unter Verwendung eines 0-80% Acetonitril/TEAA-Gradienten gereinigt. Ausbeute: 22 mg.
(1-(3'''-(1'''-Propyloxybernsteiasäure, N-hydroxybernsteinsäureimidester))-1'-(3'''-(1'''-acetoxypropyl))-benzoxazolmonoarbocyanin
Das Bernsteinsäurederivat (22 mg) wurde durch dreimaliges gemeinsames Abdampfen mit trockenem Pyridin getrocknet und in 1 ml trockenem Dichlormethan mit 50 μl trockenem Pyridin gelöst. Es wurde O-Trifluoracetyl-N-hydroxybernsteinsäureimid (100 mg) zugegeben. Nach 5 Minuten wurde die Reaktion mit 5 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit Wasser extrahiert. Das Dichlormethan wurde getrocknet und verdampft, um 20 mg aktivierten Ester zu liefern.
1-3''-((N₄-6-Amidohexyl-2',3'-dideoxycytidin, 5'-O-Triphosphat)-succinoyloxypropyl)-1'-(3'''-hydroxypropyl))-benzoxazolmonocarbocyanin)
Der aktivierte Ester (2 mg) wurde in 200 μl 50% DMF/Wasser und 4 μmol 6-Aminohexyl-ddCTP in 500 μl 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9, zugegeben. Nach 45 Minuten wurde die Reaktion abgebrochen. Das Produkt durch C-18 HPLC (3,9 × 150 mm, NovaPak, 0–75% Acetonitril/Ammoniumphosphat, pH 6) gereinigt. Ausbeute: 584 nmol. UV/VIS 484, 272 nm.
Das Material wurde mittels einer DNA-Polymerase unter Kettenverlängerung in einen Standardsequenzversuch eingeführt.

Claims

Chemische Verbindung der folgenden Formel:
worin: R¹ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Alkyl, Aralkyl und Alkyl, substituiert mit OR², COOR², NR²R² und SR², worin R² H, eine entfernbare Schutzgruppe oder eine C₁-C₄-Alkylgruppe ist; R³ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus H, PO₃ ^–2, P₂O₆ ^–3, P₃O₉ ^–4, α-Thiophosphaten; und αBH₃-Phosphaten; R⁴ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus H, C₁-C₄-Alkyl, Acyl, (CH₂)_pCOO(CH₂)_qCH₃, worin p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, und 5,6-; 6,7- oder 7,8-Butadienyl; R⁵ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus H, C₁-C₄-Alkyl, Acyl, (CH₂)_PCOO(CH₂)_qCH₃, worin p eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, und 5,6-; 6,7- oder 7,8-Butadienyl; r 1, 2 oder 3 ist; X oder Y aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus O, S, C(R⁶)₂, N(R⁶), worin R⁶ C₁-C₄-Alkyl ist; und R⁹-O-Zucker-Base ein Nucleosid oder Nucleotid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ (CH₂)₃OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus (CH₂)₅COOH, (CH₂)₃NH₂ und C₂H₅.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R3 aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus PO₃ ^–2, P₂O₆ ^–3- Und P₃O₉ ^–4.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Linker aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Propyl-O-PO₂-O-hexyl, Propyl-O₂C-ethyl-CO, Propyl-O₂C-ethyl-CONH-hexyl und Propyl-O₂C-ethyl-CONH-propinyl.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Linker eine Länge zwischen 3 und 25 Atomen besitzt.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei X und Y C(CH₃)₂ sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das durch R³-O-Zucker-Base gebildete Nucleosid oder Nucleotid aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus IDC-rCTP, IDC-dCTP, IDC-ddCTP, ITC-ddCTP, ITC-ddATP, IDC-dATP, IMC-c7-ddGTP und OMC-ddCTP.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R³ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus PSO₂ ^–2, P₂SO₅ ^–3 und P₃SO₈ ^–4.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R³ aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus P(BH₃)O₂ ^–2, P₂(BH₃)O₅ ^–3 und P₃(BH₃)O₈ ^–4.
Verfahren zum Markieren eines Nucleinsäuremoleküls, umfassend den Schritt des Einführens der Verbindung nach Anspruch 1 in eine Nucleinsäurekette.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend weiterhin den Schritt des Bestimmens der Nucleinsäuresequenz des Moleküls.