KR20030002010A

KR20030002010A - 물-혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를이용한 엔케팔린 제조방법

Info

Publication number: KR20030002010A
Application number: KR1020010037901A
Authority: KR
Inventors: 이영상
Original assignee: 이영상; (주)엔조믹스
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2003-01-08

Abstract

본 발명은 물-혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를 이용한 엔케팔린 제조방법에 관한 것으로, 미수유기용매에서 단백질 가수분해 역반응을 통해 키모트립신과 테르모리신을 사용하여 류신-엔케팔린 합성 전구체인 트리펩티드와 디펩티드를 각각 합성한 후, 상기 두 기질로부터 파파인을 사용하여 펜타펩티드인 엔케팔린을 제조하는 본 발명 방법은 통상의 화학적 합성법에 비해 입체특이성 및 위치 특이성이 매우 높고, 보호기 필요성이 현저히 낮을뿐만 아니라, 부산물은 전혀 없고 라세미체 생산의 문제가 전혀 없는 장점이 있는 등 활성있는 엔케팔린 합성에 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

물- 혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를 이용한 엔케팔린 제조방법{Protease-catalyzed synthesis of enkephalin in organic aqueous monophasic system}

본 발명은 물-혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를 이용한 엔케팔린 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미수유기용매에서 단백질 가수 분해 역반응을 통해 키모트립신과 테르모리신을 사용하여 류신-엔케팔린 합성 전구체인 트리펩티드와 디펩티드를 각각 합성한 후, 상기 두 기질로부터 파파인을 사용하여 펜타펩티드인 엔케팔린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

1937년에 Bergmann, Fraenkel-Conrat에 의해 펩티드 합성이 최초로 수행된 이후로 단백질분해 효소를 이용한 가수분해 역반응은 화학적인 펩티드 생산 대체수단으로 그동안 많은 연구가 진행되어 왔다(Oka, T. and Morihara, K. (1978), Peptide bond synthesis catalyzed by α -chymotrypsin,J. Biochem.,84: 1277-1283.). 단백질 분해효소의 역반응에 의한 펩티드 합성 연구 초기에는 생체내의 단백질합성 기작을 밝히기 위한 방법으로 시도되었으며, 생체내 단백질 생합성에 대한 기작이 알려지게 된 이후로는 관심이 줄어들었다. 그러나 1970년대 후반 이 후 생리활성을 지닌 많은 종류의 작은 펩티드들이 알려지면서 산업적인 가치가 있는 효소적 펩이드 합성에 대한 새로운 관심이 증가되기 시작하였다(Kullmann, W. (1980), Protease as catalysts for enzymatic syntheses of opioid peptides,J. Biol. chem.,255: 8234-8238.).

최근들어 실험실 수준 및 산업적 수준에서 유기 합성 반응에 효소를 이용하려는 노력이 진행되고 있으며(Whitesides, G. M. and Wong, C. -H. (1985), Enzymes as catalyst in synthetic organic chemistry.Angew Chem Int. Ed. Engl.,24: 617-638. ; Chen, C.-S. and Sih, C. S. (1989), General aspects and optimization of enantioselective biocatalysis in organic solvents : The useof lipases,Angew Chem Int. Ed. Engl.,28: 695-707. ; Davies, H. G., Green, R. H., Kelly, P. R. and Roberts, S. M. (1989),Biotransformation in preparative organic chemistry.Academic press. ; Jakubkr, H. D., Kuhl, P. and Knecke, A. (1985), Basic principles of protease-catalyzed peptide bond formation,Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,24: 452-454.), 특히 높은 순도의 생리활성 펩티드에 대한 수요가 늘어남에 따라 좀더 효과적인 합성방법이 요구되고 있는 실정이다.

현재 화학적 합성법과 재조합 DNA를 이용한 방법이 여러 가지 응용적인 측면에서 유리한 방법이지만 많은 단점 또한 존재한다. 화학적 합성법은 특이적인 고도의 선택적 반응이 어려워 이성질체나 기타 부산물이 생성될 뿐만 아니라 곁사슬 보호 및 제거, 합성단계에서 중간산물의 분리정제와 같은 부수적인 과정이 필요할 뿐만 아니라, 수율 또한 낮은 실정이다. 재조합 DNA를 이용하는 방법은 미생물 배양에 상당한 에너지와 기질이 필요하며 페기물처리 문제 또한 발생하며, 배양액은 순수배양이 필요하여 잡균이나 파아지 혼입을 방지할 수 있어야 하고 생산 전 단계에 여러 단계의 종균 배양단계가 필요하며 많은 종류의 성분을 함유하고 있어 반응 종료 후에 목적하는 생산물을 분리정제하는데도 곤란한 문제가 있어 제한적인 사용만이 가능하다. 그렇기 때문에, 위치선택적, 입체선택적이며 이성질화가 필요 없고 곁사슬 보호기가 거의 필요하지 않는 효소 합성법을 위에 열거한 방법들과 병행하여 사용하거나 단독으로 사용할 경우 화학적 합성법이나 재조합 DNA를 이용한 방법 에 비해 우수한 결과를 나타낼 수 있다. 즉, 효소적 합성은 온화한 조건에서 다른부반응이나 라세미체의 생산없이 빠른 속도 및 높은 생산수율로 합성할 수 있다는 장점을 가지고 있다(Nakanish, K. and Matsuno, R. (1986), Kinetics of enzymatic synthesis of peptides in aqueous/organic biphasic systems. Thermolysin-catalyzed synthesis of N-(benzyloxy -carbonyl)-L-phenylalanyl-L-phenylalanine methylester.Eur. J. Biochem.,161: 533-540.).

일반적으로 단백질 가수분해효소의 반응에 있어서 펩티드 결합의 분해가 열역학적으로 유리한 반응으로 진행되기 때문에 우리가 원하는 펩티드를 단백질 가수분해 효소를 사용하여 합성하기 위해서는 펩티드가 형성이 되도록 인위적으로 평형에 조절을 가해야만 한다. 카펜터(Carpenter, F. H. (1959), The free energy change in hydrolytic reactions: The non-ionized compound conventionJ. Am. Chem. Soc., 82:1111-1112.)에 따르면 펩티드 결합 형성의 열역학적인 장벽은 거의 대부분이 양성자 양이온을 가지는 α -아미노기로부터 음이온을 가지는 α -카르복실기로의 전달에 필요한 에너지에서 기인하며, 펩티드 합성 속도를 증가시키기 위해서는 에너지의 장벽을 낮추는 방법들이 연구되어야 한다고 하였는 바 그 예로써 현재, 단백질 가수분해 효소 반응의 평형을 이동시키기 위한 방법으로 반응계의 환경을 변화시키는 방법이 많이 연구되어지고 있다. 즉, 유기용매의 첨가, 물-유기용매 이상계(biphasic system)에서의 반응, 반응물은 가용성이고 생성물은 불용성을 나타내도록 디자인하는 방법 등이 그 대표적인 예라고 할 수 있다.

효소반응에 있어서 효소의 촉매 활성과 안정성을 유지하기 위해 주안을 두어야 할 것 중의 하나가 용매의 선택이며, 용매로서 물은 절대적으로 필요하다. 왜냐하면 물은 대부분의 비공유결합 즉, 수소 결합, 소수성 결합, Van der Waals 상호작용에 관여하여 효소의 본래 활성을 띄는 구조를 유지하도록 할 뿐만 아니라 효소에 유동성을 부과하여 기질과의 결합을 쉽게 하기 때문이다(Frank, F. (1972), Water I : The physics and physical chemistry of water, Plenum Press. USA.; Frank. F. (1972), Water I : Water in crystalline hydrates aqueous solutions of simple nonelectrolytes. Plenum Press. USA.). 효소를 이용한 펩티드 합성에 있어서 반응물과 생성물의 용해도는 반응의 방향에 영향을 미치며 이상적인 반응계인 물로부터 수용성 유기용매와 물-유기용매 이상계를 거쳐 단일계의 유기용매까지 효소의 촉매 활성을 위해서는 극소량의 물이 필요하다. 친환경적인 측면에서 볼때 물이 가장 좋은 용매지만 많은 반응물들이 물에 잘 녹지 않기 때문에 물에 녹는 반응물과 생성물의 반응에 대해서만 1차적으로 적용이 가능하며 부차적으로 물에 녹을 수 있는 보호기를 부착한 반응물을 사용해야 한다. 이러한 물에서의 펩티드 합성 반응의 단점으로 인해 다양한 반응계들이 제안되어지고 있는데 크게 유기용매의 사용과 반응계에서 차지하는 물의 농도를 줄이는 두 가지 방향으로 진행되고 있는 것이다. 유기용매를 사용할 경우 소수성 물질의 용해도가 증가하게 되어 생성물의 전환이 용이하게 될 뿐만 아니라 가수분해 반응도 억제 될 수 있는 장점이 있다(Itoh, T., Takagi, Y., Murakami, T., Hiyama, Y. and Tsnknbe, H. (1996), Crown ethers as regulators of enzym -atic reactions :Enhanced reaction rate and enantioselectivity in lipase-catalyzed hydrolysis of 2-cyano-1-methylethyl acetate.J. Org. Chem.,61: 2158-2163.; Kitaguchi, H. andKlibanov, A. H. (1989) , Enzymatic peptide synthesis via segment condensation in the presence of water mimic.J. Am. Chem. Soc., 111:9272-9273.). 그러나, 유기용매 사용의 단점으로는 유기용매가 효소에 대한 경쟁적 저해제로 작용하여 효소 내의 극성기들간의 정전기적 상호작용이 수용액에 비해 달라질 수 있고, 유기용매와의 직접적 접촉에 의해 효소가 형태적 변화를 일으킬 수 있을 뿐만 아니라 유기용매 하에서 기질-효소간의 소수성 상호작용이 감소하여 효소반응의 활성을 떨어뜨릴 수 있다. 이와 같은 효소 구조와 효소-기질간 반응의 변화로 인해 효소의 활성이나 기질특이성이 달라질 수 있는 단점 또한 존재한다(Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1984), Enzymatic catalysis in organic media at 100℃.Science., 224:1249-1251. ; Nagashima, T., Watanabe, A. and Kise, H. (1992), Peptide synthesis by protease in organic solvents: Medium effect on substrate specificity.Enzyme Microb. Technol.,14:842-847. ; Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1986), Substrate specificity of enzymes in organic solvents vs. water is reversed. J. Am. Chem. Soc.,108:2767-2768.; Klivanov, A. M. (1997), Why are you enzymes less active in organic solvents than in the water?Trands. Biotechnol., 15:97-101. ; Jakubke, H.-D. (1995),Enzyme catalysis in organic chemistry(Drauz, K. and Waldmann, H. eds), VCH Verlageschesellschaft mbH; Weinheim, pp, 443-458. ; Kasche, V., Michaelis, G. and Galunsky, B. (1991), Binding of organic solvent molecules influence the P'1-P'2 stereo-and sequence-specificity of α -chymotrypsin in kinetically controlled peptidesynthesis.Biotechnology Letters., 13(2): 75-80. ; Nakanish, K. and Matsuno, R. (1986), Kinetics of enzymatic synthesis of peptides in aqueous/organic biphasic systems. Thermolysin-catalyzed synthesis of N-(benzyloxy -carbonyl)-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanine methyl ester.Eur. J. Biochem.,161:533-540.; Nakanishi, K., Kimura, Y. and Matsuno, R. (1986), Kinetics and equilibrium of enzymatic synthesis of peptides in aqueous/organic biphasic systems. Thermolysin-catalyzed synthesis of N-(benzyloxycarbonyl)-L-aspartyl-L-phenylala -nine-phenylalanine methyl ester.Eur. J. Biochem.,161:541-549.).

유기 용매를 첨가하는 반응계로는 수용성 유기용매를 첨가한 단일계(organic-aqueous monophasic system), 물-비혼합성 유기용매를 사용한 이상계(biphasic system), 유기용매만을 사용한 유기용매 단일계(monophasic organic solvent system) 등이 있다. 유기용매 단일계(monophasic organic solvent system)는 유기용매의 첨가외에 특별한 조작이 필요없으며, 효소반응에 필요한 극소량의 물만 존재하는 상태에서 반응이 일어나기 때문에 가수분해를 억제할 수 있으며 기질이나 생성물의 용해도로 인한 문제점이 발생하지 않는다. 하지만 효소활성의 저해와 입체선택성과 위치선택성의 변화를 가져오며 생성물의 분리가 어렵다는 단점을 갖고 있는 관계로 현재는 고정화 효소와 화학적, 유전적 조작을 거친 효소를 사용하는 방법으로 응용되고 있다. 물-비혼합성 유기용매를 사용한 이상계(biphasic system)는 반응물이 유기 용매층에 녹아있기 때문에 효소반응은 유기용매층과 물층간의 물질이동에 의해 이동된 기질만이 참여하게 된다. 이로 인해 많은 양의 효소가 사용 되어야함과 동시에 낮은 반응 속도를 나타낸다. 하지만 효소 활성 저하를 막을 수 있으며 생성물이 유기용매층으로 녹아 들어가기 때문에 손쉽게 반응물을 분리해 낼 수 있는 장점이 있다. 수용성 유기용매를 첨가한 단일계(organic-aqueous monophasic system)는 평형 지배 방법의 적용을 받는 반응계로 물-혼합성 유기용매는 친핵체의 아미노그룹의 pK값에는 거의 영향을 주지 않지만 아실기 공여체의 카르복시그룹의 산성도를 감소시켜서 아실기 공여체와 친핵체간의 ΔpK값을 감소시켜 반응을 증진시킨다. Kasch에 의하면, 단일계나 이상계에서 유기용매는 효소반응속도에 직접적 혹은 간접적으로 영향을 미친다고 하였는데, 간접적 효과로는 반응물과 생성물의 분배, 화학적 평형의 이동, 물질 전환 효과로 설명될 수 있으며, 직접적 효과로는 유기용매가 효소의 소환경, 특히 활성부위에 직접적인 영향을 주는 것으로써 극성용매에 의한 탈수(water stripping)효과를 예로 들 수 있다.

이러한 유기용매 첨가에 의한 방법은 현재 지질 전환이나 펩티드 합성에서 많이 이용되고 있다(Martinek, K., Semenov, A. N. and Berezin, I. V. (1981), Enzymatic synthesis in biphasic aqueous-organic systems. I. chemical equilibrium shift.Biochem. Biophys. Acta., 658:90-101. ; Martinek, K. and Semenov, A. N. (1981), Enzymatic synthesis in biphasic aqueous-organic systems.Ⅱ. shift of ionic equilibria.Biochem. Biophys. Acta., 658:90-101.). 지난 수 년간 펩티드 합성시 소량의 혼합성(water-miscible) 유기용매 (Alam, M. N., Tadasa, K., Maeda, T. and Kayahara, H. (1997), Kinetics of inhibition of thermolysin-catalyzed peptide synthesis by alcohols in aqueousorganic one-phase system.Biotechnol. Lett., 19(6):563-568. ; Alam, M. N., Tadasa, K., Maeda, T. and Kayahara, H. (1997), Correlation of inhibition of thermolysin by water-miscible alcoholic solvents with their physicochemical parameters and the status of monoalcoholic character of water in the peptide synthesis of Z-Phe-PheOMe in water organic one-phase reaction system.Biotechnol. Lett., 19(11):1129-1133. ; Kunugi, S. and Yoshida, M. (1996), Kinetics of a thermolysin-catalyzed peptide formation reaction in acetonitrile-water.Bull. Chem. Soc. Jpn., 69:805-809.) 혹은 불혼합성(water -immiscible) 유기용매(Nakanish, K., Kimura, Y. and Matsuno, R. (1986), Design of proteinase-catalyzed synthesis of oligopeptides in an aqueous-organic biphasic systems.Bio/technol.,4:452-454. ; Kimura, Y., Nakanish, K. and Matsuno, R. (1990), Enzymatic synthesis of the precursor of Leu-enkephalin in water-immiscible organic solvent systems.Enzyme Microb. Technol., 2:272-280. ; Kullmann, W. (1979), Enzymatic synthesis of Leu- and Met-enkephalin.Biochem. Biophys. Res. Comm.,91(2): 693-698. ; Ye, Y. H., Tian, G. L., Xing, G. W., Dai, D. C., Chen, G., and Li, C. X. (1998), Enzymatic synthesis of N-protected Leu-enkephalin and some oligopeptides in organic solvents.Tetrahedron.,54:12585-12596. ; Xing, G. W., Tian, G. L. and Ye, Y. H. (1998), Influence of reaction condition on synthesis of sweetener precursors catalyzed by thermolysin in tert.-amyl alcohol.J. peptide Res., 52:300-304.) 첨가에 의한 연구가 많이 이루어졌는데, 이들은 알파-카복실 그룹(α -carboxyl group)의 산성도를 낮추어 펩티드 결합 형성시 필요한 활성과 자유에너지를 낮춤으로써 생성물쪽으로 평형을 이동시킨다(Carpenter, F. H. (1960), The free energy change in hydrolytic reactions : The non-ionized compound convention.J. Am. Chem. Soc.,82:1111-1122. ; Halling, P. J. (1990), Solvents selection for biocatalysis in mainly organic systems : Predictions of effects on equilibrium position.Biotechnol. Bioeng., 35:691-701.).

한편, 아편 수용체의 작용과 특성이 명백하게 밝혀진 후 수용체에 대한 생체내 내인성 리간드를 찾는 연구가 활발히 진행되어졌다(Chang, K. J. (1984),Opioid receptors : Multiplicity and sequence of ligand-receptor interactions. In P. M. The Receptors(Vol. 1). Academic Press, Orlando, pp. 1-81. ; Martin, W. R. (1984), Pharmacology of opioids.Phamacol. Rev.,35: 283-323. ; Snyder, S. H. and Mattysse, S. (1975), Opiate receptor mechanisms.Neurosci. Res. program B. 166.). 뇌 자체가 매우 특이한 수용체에 작용하는 분자를 합성해야 한다고 보고 1978년 Hughes등이 뇌에서 두가지 내인성 아편 펜타펩티드인 류신-엔케팔린(leucine-enkephalin)과 메티오닌-엔케팔린(methionine-enkephalin)을 분리하였으며(Hughes, J., Smith, T. W., Kosterlitz, H. W., Fothergill, L. A., Morgen, B. A. and Morris, H. R. (1978), Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate against activity.Nature., 258:577-579.), 엔케팔린이 발견된 이래, 다른 내인성 아편 펩티드(endogenous-opioid peptides)도 많이 발견되었다(표 1).

이처럼 5개의 아미노산으로 구성된 간단한 구조를 갖는 주요 내인성 아편 펩티드는 쿨맨(Kullmann, W. (1979), Enzymatic synthesis of Leu- and Met-enkephalin. Biochem. Biophys. Res.Commun.,91: 693-698.; Kullmann, W. (1980), Protease as catalysts for enzyme synthesis of opioid peptides.J. Biol. Chem., 255: 8234-8238.; Kullmann, W. (1981), Protease-mediated peptide bond formation on some unexpected outcomes during enzymatic synthesis of Leu-enkephalin.J. Biol. Chem.,256: 1301-1304.)과 Wong(49. Wong, C.-H., Chen, S-T. and Wang, K.-T. (1979), Enzymatic synthesis of opioid peptides,Biochem. Biophys. Acta., 576: 247-249. )등에 의해 단백질 분해효소를 이용한 합성반응이 처음 시도된 이후 이를 합성하려는 노력이 계속되어 오고 있다(Kimura, Y., Nakanish, K. and Matsuno, R. (1990), Enzymatic synthesis of the precursor of Leu-enkephalin in water-immiscible organic solvent systems.Enzyme Microb. Technol., 12: 272-280.; Ye, Y. H., Tain, G. L., Xing, G. W., Dai, D. C.,Chen, G. and Li, C. X. (1998), Enzymatic synthesis of N-protected Leu-enkephalin and some oligopeptide in organic solvents.Tetrahedron., 54: 12585-12596.; Degerbeck, F., Fransson, B., Grehn, L. and Ragnarsson, U. (1955), Synthesis of¹⁵N-labelled Leu-enkephalins.Acta Chem. Scand., 49:149-151.; Gill, I. and Vulfson, E. N. (1992), Facile enzymatic synthesis of N-acyl-enkephalin amides.J. Chem. Soc. Perkin. Trans., 1:667-668.).

현재까지 단백질 가수분해 효소 역반응을 이용한 엔케팔린 합성에 있어서 특정한 조건에 있어서의 N-보호된 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드와 Phe-LeuOEt 디펩드 합성에 대한 개별적인 연구는 있었으나 상기 트리펩티드 및 디펩티드 두 기질을 사용하고 파파인을 촉매로 이용하여 펜타펩티드 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OEt을 합성하는 효소적 방법에 대한 연구는 아직 없는 실정이다.

본 발명자는 류신-엔케팔린의 전구체인 N-보호된 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드와 Phe-LeuOEt 디펩티드를 적절히 조절된 물-유기용매 단일계에서 높은 수율로 합성하고, 류신-엔케팔린 전구체인 상기 트리펩티드 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂와 디펩티드 Phe-LeuOEt 두 기질로부터 파파인을 사용하여 물-혼합성 유기용매 단일계내에서 펜타펩티드인 엔케팔린을 합성하고, pH 및 온도별로 반응조건을 달리하여 각각의 수율을 종래의 개별적인 펩티드 합성과 비교해 보고 본 발명 방법이 매우 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 물-유기용매 단일상에서 단백질 분해효소를 이용하여 단백질 가수분해 반응의 역반응을 통해 아미노산 기질로부터 펜타펩티드인 엔케팔린을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 잇점들은 하기 본 발명의 구성에 의해 보다 명확히 이해될 것이다. 이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 ODS 컬럼을 이용한 트리펩티드 Z-Tyr-Gly-Gly-NH₂의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 2는 EMI MS를 이용한 Z-Tyr-Gly-Gly-NH₂의 분석결과를 나타낸다.

도 3은 ODS 컬럼을 이용한 디펩티드 Z-Phe-LeuOEt의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 4는 ODS 컬럼을 이용한 PheleuOEt의 크로마토그램을 나타낸다.

도 5는 NMR 스펙트로메터로 분석한 Phe-LeuOEt의 NMR 피크를 나타낸다.

도 6은 pH에 따른 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt 합성 수율을 나타낸다.

도 7은 온도에 따른 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuoEt 합성 수율을 나타낸다.

상기 목적은 물-유기용매 단일상에서 단백질 분해효소를 이용하여 단백질 가수분해 반응의 역반응을 통해 펜타펩티드인 엔케팔린을 제조함으로써 달성되었다.

본 발명은 여러가지 단백질 분해효소를 이용하여 미수유기용매 상에서 펩티드 가수분해 역반응인 펩티드 합성반응을 수행하여 내인성 아편 펩티드인 엔케팔린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 여기서 미수유기용매라 함은, 일반적으로 효소 반응은 과잉의 물 속에 있는 효소에 의해 일어나는 반응이나, 유기용매를 사용하여 반응계 내 물의 양을 감소시킴으로써 생산성이 비약적으로 향상시킬 수가 있는데, 이와 같이 미량의 수분이 존재하는 유기용매를 미수유기용매라 한다.

일반적으로 수용액 상태에서 가수분해 반응을 촉매하는 단백질 가수분해 효소들은 이러한 물이 미수유기용매에서 오히려 그 역반응을 진행시켜 펩티드 결합분해보다는 합성 쪽으로 반응이 일어날 수 있다. 이와 같은 미수유기용매에서 효소를 이용하여 펩티드를 합성하는 방법은 화학적 합성법에 비해 입체특이성 및 위치 특이성이 매우 높고, 보호기 필요성이 현저히 낮고 반응 출발물질의 순도가 그렇게 높을 필요가 없을 뿐만 아니라 부산물은 거의 없고 라세미체 생산의 문제가 전혀없는 장점이 있다. 이러한 펩티드 합성에 이용될 수 있는 효소는 하기 표 2 와 같이 여러가지 종류가 있으며 그 분해부위 특이성을 이용하여 적절한 펩티드 합성에 사용할 수 있다.

*. 여기서, X는 불특정의 아미노산 또는 펩티드 잔기를 의미한다.

예컨대, 트립신은 아르기닌(Arg)이나 리신(Lys) 잔기에 있는 카르보닐기의 펩티드만을 특별히 가수분해한다. 즉, 트립신은 Arg이나 Lys의 C-쪽을 가수분해하여 Arg이나 Lys을 C-말단에 가지고 있는 일련의 펩티드 단편들을 생성하게 된다. 또한, 키모트립신은 방향족 아미노산인 트립토판, 티로신, 페닐알라닌의 카르복시기에 의해 형성되는 펩티드 결합을 가수분해하는데 강력한 선호도를 나타낸다. 생리적인 조건에서 이러한 트립신, 키모트립신 등에 의해 촉매되는 반응의 평형은 가수분해 쪽으로 진행된다. 이러한 반응평형을 펩티드 합성 쪽으로 이끌기 위해서는 한가지 반응 기질을 과량 이용하든가, 불수용성 유도체 형성에 의해 산물을 제거하든지 아니면 물-물과 혼합되지 않는 유기용매를 사용하여 유기상으로 산물이 추출되게 하거나, 또는 물과 혼합되는 유기용매를 첨가하여 반응계의 수분활성도를 낮추는 방법에 의해 펩티드를 합성할 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에 있어서, 물-유기용매 단일상에서 이러한 펩티드 합성은 α -키모트립신, 테르모리신 및 파파인을 이용하여 이루어진다. 키모트립신은 N-보호된 Tyr와 Gly-GlyNH₂와의 펩티드 결합 형성으로 트리펩티드를 합성하는데 이용되고, 테르모리신은 N-보호된 Phe와 LeuOEt간의 디펩티드 합성에 이용되며, 파파인은 상기 합성된 트리펩티드와 디펩티드 간의 펩티드 결합을 특이적으로 촉매하여 펜타펩티드인 엔케팔인을 합성하는데 이용되어진다.

이와 같이 가수분해 역반응은 물과 혼합되는 유기용매 농도를 높이든가 소량의 물만 용해되는 유기용매를 사용함으로써 펩티드 가수분해효소에 의한 미수 유기용매상에서의 펩디드 합성반응을 유도할 수 있다. 이러한 촉매 반응에 사용되는 주요한 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 에틸렌 글리세롤, 아세톤, 아세토니트릴 등의 물과 혼합되는 유기용매; 프로필알코올, 부틸알코올, 아밀알코올 등의 알코올류, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트 등의 에스터류, 알킬 할라이드, 케톤류, 에터류 등의 물과 혼합하지 않는 유기용매; 및 헥산, 헵탄, 옥탄등의 지방족 탄화수소, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소, 시클로헥산 등의 고리형지방족 탄화수소 등과 같은 물에 녹지 않는 유기용매 등이 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서 단백질 가수분해효소를 이용한 펩디드 합성은 물과 혼합되는 유기용매인 에틸 아세테이트를 사용함으로써 이루어진다. 이러한 유기용매 사용은 효소를 유리 상태로 또는 고정화 상태로 반응에 이용시 적절히 취사 선택함으로써 반응수율을 현저히 증가시키는데 주요한 고려사항이 된다.

한편, 용액상 펩티드 합성에 있어서, 부 반응을 방지하기 위하여 아미노말단은 친핵체로 작용하지 않도록 보호되어야 한다. 유리 아미노산을 벤질 클로로포메이트로 처리해 주면 우레탄 혹은 카바메이트 에스터를 형성하는데 이러한 보호기는 당업계에 공지되어 오랫동안 사용되어 왔으며 여러가지 이름을 가지고 있는데 그것은 벤질옥시카르보닐(benzyloxycarbony)기, 카보벤즈옥시(carbobenzoxy, Cbz)기 혹은 그냥 간단히 Z기라고도 부른다. 본 발명의 바람직한 한 실시에에 있어서 트리펩티드 형성에 이용되는 Tyr과 디펩티드 합성에 이용되는 Phe는 이러한 Z기로 아미노기가 보호된 형태를 사용하고 있다. 한편, 용액상 합성의 중간단계 및 마지막단계에서 완성된 펩티드의 N 말단을 탈보호 시키는 것이 또한 중요하다. 생성물의 N-말단 아마이드 결합은 다른 펩티드의 결합의 파괴 없이 절단되어야 한다. 벤질옥시카보닐기는 부분적으로는 아미드이고 또 부분적으로는 벤질에스터이므로 펩티드 결합을 깨뜨리지 않는 약한 조건 하에서 가수소분해(H2, Pd)가 일어나기 때문에 N-말단을 보호하는데는 벤질옥시카르보닐기를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 N-말단 보호는 당업계에 공지된 것처럼 t-부틸옥시카보닐기 또는 Boc(t-Boc)를 사용할 수도 있다. Boc기는 벤질기 대신 t-부틸기를 갖는 점을 제외하고는 상기 Z와 비슷한데 다른 t-부틸기와 같이 Boc 보호기는 산성 조건 하에서 쉽게 가수분해되는 특징이 있다.

본 발명의 엔케팔린 제조방법은 N-보호된 트리펩티드 Z-Tyr-Gly-GlyNH₃를 합성하는 단계; N-보호된 디펩티드 Z-Phe-LeuOEt을 합성하는 단계; 상기 합성된 디펩티드 보호기 Z를 제거하는 단계; 및 상기 트리펩티드와 디펩티드 기질로부터 펜타펩티드인 엔케팔린을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명 엔케팔린 제조방법을 보다 설명하면 설명하면 다음과 같다.

(1) 제1단계 : 트리펩티드 Z-Tyr-Gly-GlyNH₃의 합성

Z-Tyr + Gly-GlyNH₂↔ Z-Tyr-Gly-GlyNH₂+ H₂O

본 단계에서는 α -키모트립신을 사용하여 두 기질인 Z-Tyr과 Gly-GlyNH₂로부터 트리펩티드인 Z-Tyr-Gly-GlyNH₃를 합성한다. 상기 합성반응에서 생성물의 수율을 최대화하기 위한 가장 적합한 조건은 pH 8.0, 30℃, α =10(α =V_유기용매/V_완충용액; 에틸아세테이트 사용)이며, 이 때의 수율은 대략 92.0%이다. 상기 반응 수행 후 상기 트리펩티드 기질을 다음 단계의 이를 기질로 사용하기 위해서 용해도 차이에 의한 정제법, 원심분리기를 이용한 침전법, 여과지를 이용한 정제법을 사용하여 정제할 수 있다. 특히, 본 발명 반응조건에서 본 단계에서 합성되는 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드 생성물은 24시간 후 백색의 결정 상태로 침전이 되어 유기용매층과 완충용액층에 걸쳐 존재하여 분리 정제가 용이하다.

(2) 제2단계 : 디펩티드 Z-Phe-LeuOEt

Z-Phe + LeuOEt ↔ Z-Phe-Leu-OEt + H₂O

본 단계에서는 테르모리신(thermolysin)을 사용하여 Z-Phe과 LeuOEt 두 기질로부터 디펩티드인 Z-Phe-LeuOEt를 제조한다. 합성하는 반응에 있어서 생성물의 수율을 최대화하기 위한 가장 적합한 조건은 PH 7.0, 40℃, α =0이고 이때, 대략 수율은 95.0%이다. 이를 기질로 사용하기 위해서 용해도 차이에 의한 정제법, 원심분리기를 이용한 침전법, 여과지를 이용한 정제법을 사용하여 정제할 수 있다.

(3) 제3단계 : 디펩티드 보호기의 제거

Z-Phe-LeuOEt + H₂O → Phe-LeuOEt + Z

본 단계에서는 Z-Phe-LeuOEt 다이펩티드에 결합 되어있는 Z 그룹을 제거한다. Z 그룹이 제거된 디펩티드는 다음 단계의 펜타펩티드 합성에 기질로 이용된다, Z 그룹의 제거에 있어서, 예컨대 Z 그룹으로 많이 이용되는 CBZ기(benzyloxy carbonyl group)는 HBr/AcOH 방법과 팔라디움 블랙/수소(palladium black/H₂) 방법에 의해 제거될 수 있는데 본 발명의 바람직한 한 실시예에 있어서 팔라디움 블랙/수소 방법을 이용하여 Z-Phe-Leu-OEt다이펩티드에 결합 되어있는 CBZ기를 톨루엔 형태로 제거하는 방법이 제공된다.

(4) 제4단계 : 펜타펩티드의 합성

Z-Tyr-Gly-GlyNH2 + Phe-LeuOEt ↔ Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt + H₂O

본 단계에서는 파파인을 사용하여 전 단계에서 합성된 트리펩티드와 디펩티드로부터 펜타펩티드를 합성한다. 파파인을 사용한 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt의 합성에 있어서 pH와 온도의 영향에 대한 펜타펩티드 합성 반응시 30℃, pH 6.5,에서24시간동안 반응시켰을때 대략 87%로 가장 높은 수율을 나타낸다. 반응 마지박 산물로부토 N-보호기는 상기 설명한 가수소분해 방법에 의해 제거된다.

본 발명과 같은 방법으로 합성된 엔케팔린은 천연의 엔케팔린과 구조가 동일할 뿐만 아니라 동일한 작용효과를 나타낸다. 따라서 합성된 류신-엔케팔린을 사용하여 관절염, 신경장애증 등에 수반되는 심한 고통을 완화시킬 수가 있다. 그리고, 체내에서 합성되는 물질이기 때문에 습관성이 생기지 않는 장점이 있어 현재 몰핀의 사용에 의해 일어날 수 있는 여러 가지 부작용을 줄일 수 있으며, 또한 엔케팔린은 포유동물의 동면에도 깊은 관여를 하여 외부의 온도에 따라 3℃까지 온도를 낮추어 겨울잠을 잘 수 있도록 하게 하여 저온수술법에 응용할 수 있으며, 이식용 장기의 세포가 손상됨이 없이 오래동안 보존할 수 있는 보관용 용액으로서 사용할 수도 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시에를 통하여 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정된 것은 아니다.

실시예

제1단계 : 키모트립신을 이용한 Z-Tyr-Gly-GlyNH ₂ 의 합성과 정제

N-(benzyloxy-carbonyl)-L-tyrosine(Z-Tyr)과 L-glycylglycineamide acetate (Gly-GlyNH₂)를 기질로 α -키모트립신을 이용하여 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드를 합성하였다. Z-Tyr과 Gly-Gly-NH₂를 합성하기 위해 사용한 α-키모트립신[EC3.4.21.1]은 Sigma Chemical Co. St. Louis, USA로부터 구입하였으며, 더 이상의 정제과정 없이 사용하였다. 기질로 사용된 N-(benzyloxycarbonyl)-L-tyrosine과 L-glycylglycine-amide·acetate는 Bachem Feinchemikalien AG로부터 구입하여 사용하였다. 유기용매로 쓰이는 에틸 아세테이트(ethyl acetate)는 Showa Chemical Inc. tokyo, Japan으로부터 특급시약으로 구입하여 사용하였다. 합성반응은 pH 8.0(0.25 M Tris/HCl 완충용액), 30℃, α =10 (유기용매 : 완충용액의 부피비 즉, 유기용매가 10일 때 완충용액은 1이 되는 부피의 비를 말한다.)에서 수행하였다. 이때 α -키모트립신 효소의 농도는 100 μM의 농도를 사용하였으며, Z-Tyr은 10 mM, GlyGlyNH₂는 50 mM의 농도에서 반응하였다. Z-Tyr은 에틸아세테이트에 녹여서 사용하였으며 Gly-GlyNH₂는 완충용액에 녹인 후 5 N NaOH를 이용하여 pH 8.0으로 조정하였다. 효소는 pH를 맞춘 완충용액에 미리 녹여, 기질을 녹인 반응용액에 효소용액을 가해 반응을 시작하였다. 반응온도는 30℃이었으며, 반응용액은 자석교반기를 이용하여 균일하게 반응시켰고, 반응의 온도를 일정하게 유지하기 위해 물중탕(water bath)을 이용하였다.

24시간이 지나면 침전물이 생기는데 원심분리기를 이용하여 가라앉은 침전물을 용해도 차이에 의해서 정제하였다. 용매 ethyl acetate를 넣어 원심분리기로 3회 반복하여 침전물을 씻어주고, 0.25 M Tris/HCl 완충용액을 넣어 원심분리기로 3회 반복하여 침전물을 씻어준다. 그리고 3차 증류수를 넣어 원심분리기로 5회 반복하여 침전물을 씻어준다. 최종 생성물은 거름종이를 사용하여 여과한 후 3차증류수로 반복해서 씻어준다. 생성된 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드를 상온에서 건조시킨다. Z-Tyr을기준으로 했을때 수율은 30℃에서 약 92.0%의 수율을 나타내었다.

생성물을 40% 아세토니트릴에 인산을 첨가하여 반응을 종료시킨 후 HPLC분석을 통해 순도를 측정하였다 정제된 생성물 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드는 ESI(Electro Spray Ionization) MASS로 확인하였다. Z-Tyr-Gly-GlyNH₂를 ODS 컬럼(YMC, Inc. U.S.A)을 이용하여 HPLC(Specta SYSTEM P1000 pump, Spectra100 absorbance detector)로 분리하여 정제한 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다. 전개용매는 acetonitrile/water(55:45;v/v)의 혼합액으로, 혼합액은 인산으로 pH2.5로 맞추어 사용하였다. 검출은 254 nm에서 하였으며, 흐름속도는 0.6 ml/min으로 분석하였다. 정제한 후 펩티드의 순도는 99.5%이었다.

제2단계 : 테르모라이신을 이용한 Z-Phe-LeuOEt의 효소적 합성과 정제

테르모리신(Thermolysin; Sigma Chemical Co. St. Louis, USA) 효소를 이용하여 기질인 N-(benzyloxycarbonyl)-L-phenylalanine(Z-Phe)과 LeuOEt(L-leucine ethyl ester)로부터 디펩티드인 Z-Phe-LeuOEt를 합성하였다. 기질로 사용된 Z-Phe 과 LeuOEt는 Sigma Chemical Co. St. Louis, USA 로부터 구입하여 사용하였다.

합성반응은 0.25 M Tris/HCl 완충용액으로 5 mM CaCl₂를 함유하며, 에틸 아세테이트로 포화시킨 완충용액에서 수행하였다. 이때 효소의 농도는 5.0 μM의 농도를 사용하였으며, Z-Phe은 20 mM의 농도에서 LeuOEt는 40 mM의 일정한 농도에서 반응시켰다. 기질을 녹인 후 반응용액의 pH는 6 N HCl과 5 N NaOH를 이용하여 7.0으로 맞추어 주었다. 효소는 pH를 맞춘 완충용액에 미리 녹여, 기질을 녹인 반응용액에 효소용액을 가해 반응을 시작하였다. 반응의 부피는 총 20 ml이었으며, 반응용액은 자석교반기를 이용하여 균일하게 반응시켰고, 반응의 온도는 40℃로 물중탕을 이용하여 일정하게 유지시켰다. 24시간동안 반응시킨 후 침전물을 원심분리기를 이용하여 Tris/HCl 완충용액으로 3회 반복하여 씻어준다. 3차 증류수를 넣어 원심분리기로 5회 반복하여 침전물을 씻어준다.최종생성물을 거름종이를 사용하여 여과한 후 3차 증류수로 반복해서 씻어준다. 만들어진 생성물 Z-Phe-LeuOEt 다이펩티드를 상온에서 건조시킨다. 생성물을 100% 아세토니트릴로 희석하여 종료시켰으며 HPLC 분석을 통해 순도를 측정하였다. 반응시료 Z-Phe-LeuOEt는 상기한 HPLC system으로 분석하였으며, column은 ODS column(YMC, Inc. U.S.A)을 사용하였고, 전개용매는 acetonitrile/water (65:35;v/v)의 혼합액으로, 혼합액은 인산으로 pH 2.5로 맞추어 사용하였다. 검출은 220 nm에서 하였으며, 흐름속도는 0.5 ml/min으로하여 분석하였다. peak의 면적은 TSP사의 Datajet를 이용하여 구하였으며, 표준농도의 product 용액으로부터 얻은 정량곡선(calibration curve)을 이용하여 정량하였다.

테르모라이신을 촉매로 한 Z-Phe-LeuOEt 디펩티드 합성에 있어서 6시간 후 생성물은 백색의 결정 상태로 침전이 되어 존재하였으며, Z-Phe을기준으로 했을 때 Z-Phe이 감소하는 양에 따라서 Z-Phe-LeuOEt 디펩티드가 증가되어 생성되었으며, 이때의 수율은 40℃에서 95.0%이상의 수율을 보였다. Z-Phe-LeuOEt를 ODS 컬럼(YMC, Inc. U.S.A)을 이용하여 HPLC로 70% 아세토니트릴로 분리하여 정제한 결과는 도 3에 나타내었다. 정제한 후 펩티드의 순도는 99.5%이었으며 순도의 확인은 Protein Research Foundation(Osaka, Japan)으로부터 공급받은 Z-Phe-LeuOEt과 비교하여 확인하였다.

제3단계 : Z-Phe-LeuOEt에서의 CBZ 그룹의 제거

반응물 Z-Phe-LeuOEt 2 g을 메탄올 50 ml에 녹인 후 10% 팔라디움 블랙(palladium black)0.4 g을 첨가한다. 수소풍선이 달린 three-way cock를 이용하여 진공 펌프에서 반응용기를 수소분위기 상태로 만들어주고 이를 상온에서 5시간동안 자석교반기 위에서 균일하게 반응시켰다. 얇은 막 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography)를 이용하여 반응이 완결된 것을 확인한 다음 반응용액을 셀라이트(celite)가 충전된 글래스필터에 통과시켜 팔라디움 블랙을 제거하였다. 팔라디움은 Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, USA 에서 구입하여 사용하였으며, 하기 methylene chloride는 대정화금 주식회사에서 구입하여 사용하였다. 여과액을 감압한 상태에서 농축하여 생성된 잔여물을 실리카 젤이 충전된 컬럼 크로마토그래피(전개용매;methylenechloride:methanol=10:1)를 사용하여 원하는 생성물 Phe-LeuOEt를 수득하였다.

H₂, pd-C/MeOH

CBZ-NHR -------------------NH₂R

정제된 생성물 Phe-LeuOEt는 NMR Spectrometer mercury 300MHZ Varian을 이용하여 확인하였다. CBZ기를 제거한 후 생성물 Phe-LeuOEt 디펩티드의 확인은HPLC(도 4)와 NMR Spectrometer mercury 300MHZ varian을 이용하여 확인하였다(도 5). Phe-LeuOEt 디펩티드의 분자구조를 보면 분자 주변에 있는 수소의 총 갯수는 23개이다. NMR Spectrometer mercury 300MHZ에 분석되어 나타난 Phe-LeuOEt다이펩티드의 수소의 총 갯수도 23개로 나타나 CBZ기를 제거한 Phe-LeuOEt다이펩티드와 일치함을 보여 동일한 물질임을 확인할 수 있었다.

제4단계 : 파파인을 이용한 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt의 효소적 합성과 정제

파파인을 이용한 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt 펜타펩티드 합성반응은 pH 6.5, 30℃, α =0 (유기용매 : 완충용액의 부피비 즉,유기용매가 0일 때 완충용액은 자연수가 되는 부피의 비를 말한다.) 이때, 용매는 0.05M Mes/NaOH 완충용액을 에틸아세테이트로 포화시킨 완충용액에 아세토니트릴을 가하여 반응시켰다. 파파인 [EC3.4.22.2]은 Sigma Chemical Co. St. Louis, USA 로부터 구입하였으며, 더 이상의 정제과정없이 사용하였다. 기질로 사용된 Z-tyrosine-glycine-glycine-NH₂와 phenylalanine-leucine ethyl ester는 상기 전 단계에 의해 직접 효소를 이용하여 합성한 것을 정제하여 사용하였다. 각 기질의 농도는 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂는 10mM, Phe-LeuOEt는 20mM의 농도에서 반응하였으며 이때 효소의 농도는 50μM의 농도를 사용하였다. 반응시료 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt는 상기한 HPLC system으로 분석하였으며, column은 ODS column(YMC, Inc. U.S.A)을 사용하였고, 전개용매는 acetonitrile/water (35:65;v/v)의 혼합액으로, 혼합액은 인산으로 pH 2.5로 맞추어 사용하였다. 검출은 254 nm에서 하였으며, 흐름속도는 0.7 ml/min으로 하여 분석하였다.

기질을 녹이기 전 반응용액의 pH는 6N HCl과 5N NaOH를 이용하여 반응시킬 pH(glass electrode, Corning 240 medel)로 맞추어 주었다. 효소는 기질을 녹인 반응용액에 효소를 직접 가해 반응을 시작하였다. 반응의 부피는 총 5ml이었으며, 반응용액은 자석교반기를 이용하여 균일하게 반응시켰고, 반응의 온도는 물중탕을 이용하여 일정하게 유지시켰다. 일정시간 간격으로 반응물을 샘플링하여 HPLC로 분석하였다. 반응은 아세토니트릴과 인산으로 희석하여 반응을 종료시켰으며, 이를 HPLC분석을 위한 샘플로 이용하였다. PH에 대한 의존성을 확인하기 위한 반응에서는 pH 4.5-6.5구간에서 0.05 M Mes/NaOH 완충용액을 이용하였으며, 온도에 대한 의존성을 확인하기 위한 반응에서는 20-40℃ 구간에서 물중탕을 이용하였고, 다른 조건은 동일하게 하였다. 수율은 24시간 반응후 생성된 생성물의 양과 초기 기질 양을 비교하여 구하였다.

(1) 실험예 1 : Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt의 합성에 있어서의 PH의 영향

파파인을 촉매로 이용한 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt 펜타펩티드 합성반응의 pH의 영향에 대한 실험은 3℃에서 pH 4.5-6.5까지의 범위에서 실시하였으며 메스/수산화 나트륨(Mes/NaOH)완충용액을 사용하였다. 다른 조건은 앞서의 실험과 동일하게 하였다. 실험시 기질을 녹이기 전 메스/수산화 나트륨(Mes/NaOH)완충용액의 초기 pH를 조절한 후 기질을 녹여 실험을 하였다. 파파인(papain)을 촉매로 이용한 Z-Tyr-Gly -Gly-Phe-LeuOEt 펜타펩티드 합성에 있어서 24시간 후 생성물은 완충용액층과 유기용매층에 용해된 상태로 존재하였다. Z-Tyr-Gly-GlyNH₂트리펩티드를 기준으로 했을 때 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂가 감소하는 양에 비례하여 Z-Tyr-Gly -Gly-Phe-LeuOEt펜타펩티드가 증가되어 생성된다고 보고 수율을 계산하였다. 파파인의 가수분해 반응의 최적 pH는 6.0으로 알려져 있다. 도 6에서 볼 수 있듯이 Z-Tyr-Gly -Gly-Phe-LeuOEt펜타펩티드의 합성반응의 경우 수율은 30℃에서 반응시켰을 경우, pH가 6.5에서 87.0%로서 최고의 수율을 나타내었다.

(2) 실험예 2 : Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt의 합성에 있어서의 온도의 영향

파파인을 촉매로 한 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt 펜타펩티드합성 반응의 온도에 대한 영향은 PH 6.5, α =0을 기준으로 20-40℃의 범위에서 수행하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이 온도가 30℃일 때 수율이 일정하게 증가하는 경향을 보이고 있으며 10시간 반응 후 에는 동일 시간 대비 각 온도에 대하여 가장 높은 수율을 보이고 있다. 수율의 계산은 Z-Tyr-Gly -GlyNH₂트리펩티드를 기준으로 하였으며 Z-Tyr-Gly-Gly-NH₂트리펩티드가 감소하는 양 만큼 Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt 펜타펩티드가 합성되어진다. 이때의 수율은 87.0%였다. 그러나, 20℃에서 반응시켰을 때 반응시간 1시간 전 까지는 74.0%의 수율로 동일 시간 대비 각 온도에 대하여 가장 높은 수율을 보이고 있지만 시간이 지남에 따라 수율이 급격하게 감소하는 경향을 보여주었다.

이상 설명한 바와 같이, 미수유기용매에서 단백질 가수분해효소를 이용하여엔케팔린을 합성하는 본 발명 방법은 통상의 화학적 합성법이 각 아미노산 첨가가 여러단계를 포함하고 합성과정에 중간산물을 회수하여야 하며 라세미체 형성 등과 같은 이성질화 부반응이 일어나는 등의 단점이 있는데 비해, 입체특이성 및 위치 특이성이 매우 높고, 보호기 필요성이 현저히 낮을뿐만 아니라, 부산물은 전혀 없고 라세미체 생산의 문제가 전혀 없는 장점이 있어 활성있는 엔케팔린 합성에 매우 뛰어난 효과가 있다.

Claims

미수 유기용매 중에서 파파인을 사용하여 N-보호된 Z-Tyr-Gly-GlyNH₂와 Phe-LeuOEt를 단백질 가수분해 역반응을 통해 하기 반응식과 같이 펜타펩티드인 엔케팔린을 제조하는 방법.

Z-Tyr-Gly-Gly + Phe-LeuOEt → Z-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuOEt + H₂O

상기 식에서, Z는 N-보호기로서 benzyloxy carbonyl group을 의미한다.
제1항에 있어서, 상기 역반응이 30℃, pH 6.5에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 상기 펜타펩티드 합성의 전단계로 하기 반응식과 같이 (a) 트리펩티드 Z-Tyr-Gly-GlyNH₃를 합성하는 단계; (b) 디펩티드 Z-Phe-LeuOEt를 합성하는 단계; 및 (c) 가수소분해에 의해 상기 (b) 단계로부터 제조된 디펩티드의 N-보호기를 제거하여 Phe-LeuOEt를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) Z-Tyr + Gly-GlyNH₂↔ Z-Tyr-Gly-GlyNH₂+ H₂O;

(b) Z-Phe + LeuOEt ↔ Z-Phe-Leu-OEt + H₂O;

(c) Z-Phe-LeuOEt + H₂O ↔ Phe-LeuOEt + Z
제3항에 있어서, 상기 (a) 단계의 반응이 pH 8.0, 30℃, α =10(α =V_유기용매/V_완충용액; 에틸아세테이트 사용)에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 (b)단계의 반응이 pH 7.0, 40℃에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.