DD290778A7 - Verfahren zur erhoehung der stabilitaet von biokatalysatoren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhoehung der Lager-, Temperatur-, mechanischen und chemischen Stabilitaet von Biokatalysatoren, die fuer Wasch- und Reinigungsprozesse sowie fuer biokatalytische Umsetzungen verwendet werden. Die Stabilisierung erfolgt dabei durch Einlagerung in einen lyotropen Fluessigkristall, der auf Basis tensidhaltiger waeszriger Systeme hergestellt und durch eine weitere Wasserzugabe aufgeloest oder dispergiert werden kann.{Biokatalyse; Enzyme; Waschmittel}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Lager·, Temperatur-, mechanischen und chemischen Stabilität von Biokatalysatoren, die für Wasch· und Rolnlgungsprozesse sowie für blokatalytische Umsetzungen verwendet werden.

Charakterisierung der bekannten technischen Losungen

Zur Stabilisierung, d.h. zur Erhaltung der biokatalytlschen Eigenschaften eines Enzyms oder einer enzymangereicherten Kulturflüssigkeit aus einem Fermentations- oder Zellzuchtprozeß, werden In der Literatur/1/ mehrere Verfahrfin beschrieben, die in Abhängigkeit von der jeweiligen Herstellungs- und Applikationstechnologie angewendet werden. Folgende Typen von Verfahren können dabei prinzipiell unterschieden werden:

1) Konzentrierung von Enzymlösungen

2) Präzipitationsvorfahren

3) Zusatz stabilisierender Substanzen

4) Tieftemperaturlagerung

5) Umhüllung des Biomaterials mit stabilisierenden Schichten

Zu den Verfahren vom Typ 1, mit denen im wesentlichen ein Wasserentzug erreicht werden soll, gehören solche Aufarbeitungstechniken wie die Filtration, insbesondere die Ultrafiltration und der Wasserentzug durch Polymergele. Bei Verfahren vom Typ 2 werden die Enzyme in eine feste Form überführt. Hierzu zählen eine Vielzahl von Fällungsverfahren, das Sprühtrocknen und das Gefriertrocknen.

Verfahren vom Typ 1 und 2 sind indirekte Stabilisierungsverfahren. Bei diesen wird eine Stabilisierung durch einen Reinigungsbzw. Aufarbeitungsschritt erreicht. Dieser verursacht in der Regel erhebliche Kosten und Veränderungen der Eigenschaften der Enzyme.

Eine direkte Stabilisierung erfolgt bei Verfahren vom Typ 3 durch den Zusatz von Chemikalien wie Glycerol, Benzoesäure, Salicylsäure, p-Hydroxyben;:oesäureethylester, quarternären Ammoniumverbindungen u. a., die insbesondere den mikrowellen Befall unterbinden. Darüber hinaus ist bekannt, daß die Haltbarkeit von bestimmten Enzympräparaten durch den Zusatz von Sacchariden, Zuckeralkoholen, Salzen oder Ethylenglycol gesteigert werden kann. Für die Formulierung von Waschmitteln wird der Einsatz von Boraten, Perboraten, Alkalimetallsulfiden und Polyolen beschrieben/*)/. Diese Stabilisatoren verursachen in ji Jem Falle hohe Kosten. Darüber hinaus treten durch diese Substanzen oft unerwünschte Nebeneffekte auf. Ihr Einsatz ist generell problematisch, wenn eine bestimmte Produktreinheit gefordert Ist.

Eine Tieftemperaturlagerung vom Typ 4 empfiehlt sich bei einer Vielzahl von Enzymsystemen in flüssiger oder fester Form. Übliche Lagertemperaturen liegen im Bereich von -5⁰C bis -25⁰C. Dies erfordert in jedem Falle die Bereitstellung eines geeigneten Kühlaggregates sowie einer Kühl-Transport-Kette.

Verfahren vom Typ 5, zu denen das Verprillen, das Verkapseln und der Geleinschluß gehören, werden insbesondere im Zusammenhang mit der Herstellung von enzymhaltigen Waschmittelpulvern beschrieben/2/. Hier spielt neben dem Stabilisierungseffekt auch der Aspekt der Vermeidung von möglichen Hautallergien beim Waschmittelanwender eine große Rolle. Diese Verfahren sind aber in jedem Falle äußerst apparate-1, ' _. _lbi yieintensiv.

Für den Schutz des Biokatalysators gegen thermischen, chemischen und mechanischen Streß werden verschiedene Immobilisierungstechniken beschrieben/3/. Diese Verfahren sind in der Regel apparate-, arbeits- und kostenintensiv und verursachen Stofftransportprobleme. Darüber hinaus können die Aktivität und Selektivität des Biokatalysators ungünstig beeinflußt werden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung von lekl t herstellbaren, wäßrigen, biokatalysatorhaltigen Systemen, die einfach handhabbar sind und bei deren Verwendung eine hohe Lagerstabilität oder/und Stabilität des Biokatalysators gegenüber thermischem, chemischem und mechanischem Streß erreicht wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe besteht In einem Stabilisierungsverfahren für Blök' talysatoren In wäßriger Umgebung. Erfindungsgemäß wird eine den Blokatalysator enthaltende wäßrige Lösung mit elnom Tonsld vermischt, daß eine den Biokatalysator stabilisierende lyotrope Mesophase entsteht, die als Aufbewahrungen und/oder Reaktionsmedium dient. Die lyotropen Mesophasen (lyotropen Flüssigkristalle) werdon auf Basis von binären oder pboudoblnären Tonsld/Wassor (Puffor·) Systemen horgestollt, wobei dio Tensidkomponente und die biokatalysatorhaltlge wäßrige Phase einfach mltoinandor gemischt werden. Die lyotropen Meeophasen sind in der Rogel optisch klar und von viskoser, „gelartiger" Konsistenz. Sie können eine lomollaro, kubische oder hexagonale Struktur aufweisen. Als Tenside können kationische, anionische, zwitterionische und nichtionische amphlphlle Substanzen eingesetzt werden. Bezüglich der Biokompatibilität haben sich die nichtionischen Tenside als besonders günstig erwiesen. Hier tritt der Effekt der Enzymdesaktivierung durch Tensid'/Proteln-Wechselwirkung nur sehr wenig In Erscheinung. In Abhängigkeit von der chemischen Struktur des Tonsides können Mesophasen mit stark unterschiedlichem Wassergehalt erzeugt werden.

Durch die Einlagerung in die Mesophase wird der Blokotalysator stabilisiert. Seine Aktivität bleibt über Wochen und Monate auch bei erhöhten Lagertemperaturen erhalten. Das Wachstum von Mikroorganismen ist unter diesen Bedingungen stark gehemmt. Eine noch weitergehende Abschirmung des Systems gegenüber einem Keimbefall kann durch Oberschichten mit einem mit der Mesophase nicht mischbaren Lösungsmittel erreicht werden.

Die Freisetzung des Biokatalysators aus der Mesophase wird durch Wasserzugabe realisiert. In don meisten Fällen wird boi dieser Verahrensweise der Flüssigkristall aufgelöst. In einigen Fällon erfolgt auch eine Dispergierung. Diese Lösungen bzw. Dispersionen stehen im weiteren für biokatalytische Umsetzungen zur Verfügung. Auf dieser Basis lassen sich insbesondere leicht enzymhaltlge Waschmittel mit hoher Enzymaktivität und Stabilität herstellen. Aufgrund der gelartigen Konsistenz dieser Zubereitungen treten hler keine enzymhaltlgen Stäube auf und das Auftroten allergischer Haut- und Lungenreaktionen kann weitgehend vermieden werden.

Darüber hinaus Ist bei der Biotransformation auch eine direkte Zugabe des Substrates zur biokatalysatorhaltigen Mesophase möglich. In diesem Falle erfolgt die biokatalytische Reaktion In der Mesophase. Der Flüssigkristall kann anschließend aufgelöst und die Produkte aufgearbeitet werden. Diese Verfahrenswelse Ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn sich das Substrat in der lyotropen Mesophase besser löst als in Wasser oder/und wenn der Biokatalysator leicht thermisch, chemisch oder mechanisch dosaktiviert wird. In lyotroper Mesophase werden eine Vielzahl von Biokatalysatoren weit weniger mechanisch, chemisch oder thermisch desaktiviert als in wäßriger Lösung. Daraus resultieren höhere Standzeiten des Katalysators. Bei Verwendung von lyotropen Mesophasen zum Einschluß von Enzymen, Zellen oder Zelltailen, die für eine Giotransformation eingesetzt werden, wird darüber hinaus in einfacher Welse die Gefahr eines Keimbefalles verringert, und der Biokatalysator tritt im Prozeß nicht in einer gesundheitsschädigenden Form auf.

Literaturverzeichnis

hl Rutloff. H., Huber, J.,Zickler, F., Mangold, K.H. .Industrielle Ewyme" VEB Fachbuchverlag, Leipzig (1978)121 Bio Tim·« Il (1987) 11

/3/ Sharma, P., BaIIy, F., Messing, R.A., Angew. Chem. 94 (1982) 836-852

141 US Patent Nr.4404115 (1983)

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

4ml einer Lösung von Chymotrypsin (20mg/ml) in Boratpuffer (pH = 8) werden mit 6g Octylphenol-7,5-glycol Jther (Triton 114) gemischt. Es entsteht eine klare Mesophase mit lamellarer Struktur. Dieses System wird parallel zu einer Referenzlösung von Chymotrypsin (13,3mg/ml) In Boratpuffer bei 3O⁰C gelagert. Nach bestimmten Lagerzeiten wird auf folgende Weise die Enzymaktivität bestimmt:

a) Mesophase: 25 mg enzymhaltige Mesophase werden mit 925μΙ Boratpuffer aufgelöst und mit 50 μΙ Get-Leu-Phe-p-NA (10pmol/ml) versetzt. Das freigesetzte p-Nitroanilin wird spektralphotometrisch bei 410nm verfolgt.

b) Puffer: An Stelle von 25mg Mesophase werden 25 μΙ Enzymlösung verwendet, die dann wie unter a) beschrieben analysiert werden.

Ein experimenteller Vergleich beider Systeme zeigte, daß die Aktivität im Puffersystem nach 10 Stunden auf 0,7% der Ausgangsaktivität abgesunken war, im flüssigkristallinen System jedoch auch nach 150 Stunden Lagerung bei 30"C noch eine Chymotrypsinrestaktivität von 50% des Ausgangswertes <>»:ogen auf Puffersystem) vorhanden war.

Beispiel 2

Es wird verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, an Stelle einer wäßrigen Chymotrypsinlösung wird aber eine wäßrige Lösung von Thoimitaso eingesetzt. Die Bestimmung der Hydrolyseaktivität muß in diesem Falle mit Succ-AlaAla-Ala-pNA als Substrat ausgeführt werden. In einer derartigen Enzymzubereitung wurde selbst nach einer Lagerzeit von 3 Monaten bei 20°C noch eine Restaktivität von 85% bezogen auf die Ausgangsaktivität festgestellt.

Beispiel 3

Es werden 60g Octylphenol-7,5-glycolether mit 40 ml einer Dispersion von Arthrobacter simplex ATCC 6946 in tris-Puffer (0,6 mg Trockenmasse/ml; pH = 7,0) versetzt. Nach leichtem Rühren entsteht eine lamellare flüssigkristalline Phase. In diese wird soviel Hydrocortison eingerührt, bis eine Substratkonzentration von 1 mg/ml erreicht ist. Nach 40 min Reaktionszeit wird die Mesophase durch Zugabe von 150ml Wasser aufgelöst. Das entstehende Prednisolon kann mit Chloroform extrahiert worden. Ein quantitativer Nachweis kann mit HPLC erfolgen. (Kaul, R., Adlercreutz, P., Mattiasson, B. (1986) Biotechnol. Bioeng. 28, 1432-1437). Bei diesem Verfahren werden Umsätze bis zu 95% erreicht.

Beispiel 4

10ml Hexaethylenglycoldodecylether werden mit 10ml einer wäßrigen Dispersion, die 1 g Saccaromyces cerovlslae, 1 g Glucose, 10mg Kaliumdlhydrogenphosphat, 10mg Magnesiumsulfat enthält, versetzt. Nach kurzem Rühren entsteht eine flüssigkristalline Phase. Zu dieser werden 500 μΙ ß-Ketodecansäurediethylester zugegeben. Das System wird 3 Stunden bei 3O⁰C mit 150 rpm gerührt. Durch Zugabo von 100ml Wasser wird der Flüssigkristall aufgelöst und der gebildete ß-Hydoxydecaneäurediethylester wird in 50ml Ether aufgenommen und dünnschlchtchromatographisch auf Silufol mit Hexan/ Essigester (4/1) als Laufmittel nachgewiesen. Die Reduktion erfolgt weitgehend stereospezifisch, wobei ein Enatiomerenexzeß der R-Form von etwa 85% erreicht wird.

Beispiel S

Es worden 0,5ml Celloclast 1,4 (NOVO) in 1,5ml Phosphatpuffer (pH ° 6,0) gelöst. Diese Lösung wird mit 2ml Hexaethylenglycoltetradecylether vermischt. Es entsteht eine klare flüssigkristalline Phase. Dieses System wird parallel zu einer Lösung von Celluclast in Phosphatpuffor (0,5 ml/3,5 ml) bei 25⁰C gelagert. Nach bestimmten Lagerzeiten wird auf folgende Weise die Enzymaktivität bestimmt:

a) Mesophase: 200mg der Meoophase wurden in 2ml Phosphatpuffer gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2 ml einer Dispersion von mikrokristalliner Zellulose CP40 in Phosphatpuffer gegeben. Die Lösung wurde bei 30⁰C eine Stunde inkubiert und die entstandene Glucose wurde mit Hilfe der Glucose-Peroxidase-Reaktion (Fermognostbesteck VEB Feinchemie Sebnitz) bestimmt.

b) Puffer: Es wird verfahren wie unter a) beschrieben. An Stelle von 200 mg Mesophase werden aber 100 μΙ der Celloclast-Lösung eingesetzt.

Ein experimenteller Vergleich beider Systeme zeigte, daß die Aktivität im Puffersystem nach 4 Tagen auf etwa 15% der Ausgangsaktivität abgesunken war, beim flüssigkristallinen System jedoch auch nach 3 Wochen Lagerung noch eine Restaktivität von etwa 75% des Ausgangswertes zu verzeichnen war.

Claims (3)

1. Verfahren zur Erhöhung der Lager-, Temperatur-, mechanischen und chemischen Stabilität von Biokatalysatoren, insbesondere von Waschmittolproteasen, -lipasen, -cellulasen oder von anderen enzymhaltlgen Systemen sowie von pro- und eukarlotischen Zellen, mit dem Ziel, ein Aufbewahrungs- und/oder Reaktionsmedium für den Biokatalysator zu schaffen, gekennzeichnet dadurch, daß eine den Biokatalysdtor enthaltende wäßrige Lösung so mit einem Tensid vermischt wird, daß eine stabilisierende lyotrope Mesophase entsteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Tenside nichtionische Amphiphile eingesetzt werden.

3. Verfahren zur Biokatalyse mittels stabilisierter Biokatalysatoren, gekennzeichnet dadurch, daß die Biokatalyse in einer aus wäßriger Enzymlösung und Tensid gebildeten lyotropen Mesophase erfolgt, wobei die Substrate direkt zur biokatalysatorhaltigen Mosophase zugegeben werden und die Produktaufarbeitung nach Wasserzusatz aus der wäßrigen Lösung oder Dispersion vorgenommen wird.