DE3941353A1

DE3941353A1 - Verfahren zur erhoehung der stabilitaet von biokatalysatoren

Info

Publication number: DE3941353A1
Application number: DE3941353A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Rer Nat Miethe; Harald Dr Sc Nat Voss; Ronald Dipl Chem Gruber; Dieter Frense
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-12
Publication date: 1990-07-05
Also published as: DD290778A7

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Lager-, Temperatur-, mechanischen und chemischen Stabilität von Biokatalysatoren, die für Wasch- und Reinigungsprozesse sowie für biokatalytische Umsetzungen verwendet werden.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Zur Stabilisierung d. h. zur Erhaltung der biokatalytischen Eigenschaften eines Enzyms oder einer enzymangereicherten Kulturflüssigkeit aus einem Fermentations- oder Zellzuchtprozeß, werden in der Literatur /1/ mehrere Verfahren beschrieben, die in Abhängigkeit von der jeweiligen Herstellungs- und Applikationstechnologie angewendet werden. Folgende Typen von Verfahren können dabei prinzipiell unterschieden werden:

1. Konzentrierung von Enzymlösungen
2. Präzipitationsverfahren
3. Zusatz stabilisierender Substanzen
4. Tieftemperaturlagerung
5. Umhüllung des Biomaterials mit stabilisierenden Schichten

Zu den Verfahren vom Typ 1 mit denen im wesentlichen ein Wasserentzug erreicht werden soll, gehören solche Aufarbeitungstechniken wie die Filtration insbesondere die Ultrafiltraton und der Wasserentzug durch Polymergele.

Bei Verfahren vom Typ 2 werden die Enzyme in eine feste Form überführt. Hierzu zählen eine Vielzahl von Fällungsverfahren, das Sprühtrocknen und das Gefriertrocknen.

Verfahren vom Typ 1 und 2 sind indirekte Stabilisierungsverfahren. Bei diesen wird eine Stabilisierung durch einen Reinigungs- bzw. Aufarbeitungsschritt erreicht. Dieser verursacht in der Regel erhebliche Kosten und Veränderungen der Eigenschaften der Enzyme.

Eine direkte Stabilisierung erfolgt bei Verfahren vom Typ 3 durch den Zusatz von Chemikalien wie Glycerol, Benzoesäure, Salicylsäure, p-Hydroxybenzoesäureethylester, quarternären Ammoniumverbindungen u. a., die insbesondere der mikrobiellen Befall unterbinden. Darüber hinaus ist bekannt, daß die Haltbarkeit von bestimmten Enzympräparaten durch den Zusatz von Sacchariden, Zuckeralkoholen, Salzen oder Ethylenglycol gesteigert werden kann. Für die Formulierung von Waschmitteln wird der Einsatz von Boraten, Perboraten, Alkalimetallsulfiden und Polyolen beschrieben /4/. Diese Stabilisatoren verursachen in jedem Falle hohe Kosten. Darüber hinaus treten durch diese Substanzen oft unerwünschte Nebeneffekte auf. Ihr Einsatz ist generell problematisch, wenn eine bestimmte Produktreinheit gefordert ist.

Eine Tieftemperaturlagerung von Typ 4 empfiehlt sich bei einer Vielzahl von Enzymsystemen in flüssiger oder fester Form. Übliche Lagertemperaturen liegen im Bereich von -5°C bis -25°C. Dies erfordert in jedem Falle die Bereitstellung eines geeigneten Kühlaggregates sowie einer Kühl-Transport-Kette.

Verfahren vom Typ 5, zu denen das Verprillen, das Verkapseln und der Geleinschluß gehören, werden insbesondere in Zusammenhang mit der Herstellung von enzymhaltigen Waschmittelpulvern beschrieben /2/. Hier spielt neben dem Stabilisierungseffekt auch der Aspekt der Vermeidung von möglichen Hautallergien beim Waschmittelanwender eine große Rolle. Diese Verfahren sind aber in jedem Falle äußerst apparate- und energieintensiv.

Für den Schutz des Biokatalysators gegen thermischen, chemischen und mechanischen Streß werden verschiedene Immobilisierungstechniken beschrieben /3/. Diese Verfahren sind in der Regel apparate-, arbeits- und kostenintensiv und verursachen Stofftransportprobleme. Darüber hinaus kann die Aktivität und Selektivität des Biokatalysators ungünstig beeinflußt werden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung von leicht herstellbaren, wäßrigen, biokatalysatorhaltigen Systemen, die einfach handhabbar sind und bei deren Verwendung eine hohe Lagerstabilität oder/und Stabilität des Biokatalysators gegenüber thermischem, chemischen und mechanischen Streß erreicht wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe besteht einem Stabilisierungsverfahren für Biokatalysatoren in wäßriger Umgebung. Erfindungsgemäß wird eine den Biokatalysator enthaltende wäßrige Lösung mit einem Tensid vermischt, wodurch eine den Biokatalysator stabilisierende lyotrope Mesophase entsteht, die als Aufbewahrungs- und/oder Reaktionsmedium dient. Die lyotropen Mesophasen (lyotropen Flüssigkristalle) werden auf Basis von binären oder pseudobinären Tensid/Wasser (Puffer)-Systemen hergestellt, wobei die Tensidkomponente und die biokatalysatorhaltige wäßrige Phase einfach miteinander gemischt werden.

Die lyotropen Mesophasen sind in der Regel optisch klar und von viskoser "gelartiger" Konsistenz. Sie können eine lamellare, kubische oder hexagonale Struktur aufweisen. Als Tenside können kationische, anionische, zwitterionische und nichtionische amphiphile Substanzen eingesetzt werden. Bezüglich der Biokompatibilität haben sich die nichtionischen Tenside als besonders günstig erwiesen. Hier tritt der Effekt der Enzymdesaktivierung durch Tensid/Protein-Wechselwirkung nur sehr wenig in Erscheinung. In Abhängigkeit von der chemischen Struktur des Tensides können Mesophasen mit stark unterschiedlichem Wassergehalt erzeugt werden.

Durch die Einlagerung in die Mesophase wird der Biokatalysator stabilisiert. Seine Aktivität bleibt über Wochen und Monate auch bei erhöhten Lagertemperaturen erhalten. Das Wachstum von Mikroorganismen ist unter diesen Bedingungen stark gehemmt. Eine noch weitergehende Abschirmung des Systems gegenüber einem Keimbefall kann durch Überschichten mit einem mit der Mesophase nichtmischbaren Lösungsmittel erreicht werden.

Die Freisetzung des Biokatalysators aus der Mesophase wird durch Wasserzugabe realisiert. In den meisten Fällen wird bei dieser Verfahrensweise der Flüssigkristall aufgelöst. In einigen Fällen erfolgt auch eine Dispergierung. Diese Lösungen bzw. Dispersionen stehen im Weiteren für biokatalytische Umsetzungen zur Verfügung. Auf dieser Basis lassen sich insbesondere leicht enzymhaltige Waschmittel mit hoher Enzymaktivität und Stabilität herstellen. Aufgrund der gelartige Konsistenz dieser Zubereitungen treten hier keine enzymhaltigen Stäube auf und das Auftreten allergischer Haut- und Lungenreaktionen kann weitgehend vermieden werden.

Darüber hinaus ist bei der Biotransformation auch eine direkte Zugabe des Substrates zur biokatalysatorhaltigen Mesophase möglich. In diesem Falle erfolgt die biokatalytische Reaktion in der Mesophase. Der Flüssigkristall kann anschließend aufgelöst und die Produkte aufgearbeitet werden. Diese Verfahrensweise ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn sich das Substrat in der lyotropen Mesophase besser löst als in Wasser oder/und wenn der Biokatalysator leicht thermisch, chemisch oder mechanisch desaktiviert wird. In lyotroper Mesophase werden eine Vielzahl von Biokatalysatoren weit weniger mechanisch, chemisch oder thermisch desaktiviert als in wäßriger Lösung. Daraus resultieren höhere Standzeiten des Katalysators.

Bei Verwendung von lyotropen Mesophasen zum Einschluß von Enzymen, Zellen oder Zellteilen die für eine Biotransformation eingesetzt werden wird darüber hinaus in einfacher Weise die Gefahr eines Keimbefalles verringert und der Biokatalysator tritt im Prozeß nicht in einer gesundheitsschädigenden Form auf.

Literaturverzeichnis

/1/ Rutloff, H., Huber, J., Zickler, F., Mangold, K. H. "Industrielle Enzyme" VEB Fachbuchverlag Leipzig (1978)
/2/ Bio Times II (1987) 11
/3/ Sharma, P., Baily, F., Messing, R. A., Angew. Chem. 94 (1982) 836-852
/4/ US Patent 44 04 115 (1983)

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

4 ml einer Lösung von Chymotrypsin (20 mg/ml) in Boratpuffer (pH = 8) werden mit 6 g Octylphenol-7,5-glycolether (Triton 114) gemischt. Es entsteht eine klare Mesophase mit lamellarer Struktur. Dieses System wird parallel zu einer Referenzlösung von Chymotrypsin (13,3 mg/ml) in Boratpuffer bei 30°C gelagert. Nach bestimmten Lagerzeiten wird auf folgende Weise die Enzymaktivität bestimmt:

a) Mesophase: 25 mg enzymhaltige Mesophase werden mit 925 yl Boratpuffer aufgelöst und mit 50 yl Get-Leu-Phe-p-NA (10 ymol/ml) versetzt. Das freigesetzte p-Nitroanilin wird spektralphotometrisch bei 410 nm verfolgt.
b) Puffer: An Stelle von 25 mg Mesophase werden 25 yl Enzymlösung verwendet, die dann wie unter a) beschrieben analysiert werden.

Ein experimenteller Vergleich beider Systeme zeigte, daß die Aktivität im Puffersystem nach 10 Stunden auf 0,7% der Ausgangsaktivität abgesunken war, im flüssigkristallinen System jedoch auch nach 150 Stunden Lagerung bei 30°C noch eine Chymotrypsinrestaktivität von 50% des Ausgangswertes (bezogen auf Puffersystem) vorhanden war.

Beispiel 2

Es wird verfahren wie in Beispiel 1 in Punkt b) beschrieben an Stelle einer wäßrigen Chymotrypsinlösung wird aber eine wäßrige Lösung von Thermitase eingesetzt. Die Bestimmung der Hydrolyseaktivität muß in diesem Falle mit xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-pna als Substrat ausgeführt werden. In einer derartigen Enzymzubereitung wurde selbst nach einer Lagerzeit von 8 Monaten bei 20°C noch eine Restaktivität von 85% bezogen auf die Ausgangsaktivität festgestellt werden.

Beispiel 3

Es werden 60 g Octylphenol-7,5-glycolether mit 40 ml einer Dispersion von Arthrobacter simplex ATCC 6946 in tris-Puffer (0,6 mg Trockenmasse/ml; pH = 7,0) versetzt. Nach leichtem Rühren entsteht eine lamellare flüssigkristalline Phase. In diese wird soviel Hydrocortison eingerührt, bis eine Substratkonzentration von 1 mg/ml erreicht ist. Nach 40 min Reaktionszeit wird die Mesophase durch Zugabe von 150 ml Wasser aufgelöst. Das entstehende Prednisolon kann mit Chloroform extrahiert werden. Ein quantitativer Nachweis kann mit HPLC erfolgen (Kaul, R., Adlercreutz, P., Mattiasson, B. (1986) Biotechnol. Bioeng. 28, 1432-1437). Bei diesem Verfahren werden Umsätze bis zu 95% erreicht.

Beispiel 4

10 ml Hexaethylenglycoldodecylether werden mit 10 ml einer wäßrigen Disperson, die 1 g Saccaromyces cerevisiae, 1 g Glucose, 10 mg Kaliumdihydrogenphosphat, 10 mg Magnesiumsulphat enthält, versetzt. Nach kurzem Rühren entsteht eine flüssigkristalline Phase. Zu dieser werden 500 ul b-Ketodecansäurediethylester zugegeben. Das System wird 3 Stunden bei 30°C mit 150 rpm gerührt. Durch Zugabe von 100 ml Wasser wird der Flüssigkristall aufgelöst und der gebildete β-Hydroxydecansäurediethylester wird in 50 ml Ether aufgenommen und dünnschichtchromatographisch auf Silufol mit Hexan/Essigester (4/1) als Laufmittel nachgewiesen. Die Reduction erfolgt weitgehend stereospezifisch wobei ein Enatiomerenexzeß der R-Form von etwa 85% erreicht wird.

Beispiel 5

Es werden 0,5 ml Celloclast 1.4 (NOVO) in 1,5 ml Phosphatpuffer (pH = 6,0) gelöst. Diese Lösung wird mit 2 ml Hexaethylenglycoltetradecylether vermischt. Es entsteht eine klare flüssigkristalline Phase. Dieses System wird parallel zu einer Lösung von Celluclast in Phosphatpuffer (0,5 ml/3,5 ml) bei 25°C gelagert. Nach bestimmten Lagerzeiten wird auf folgende Weise die Enzymaktivität bestimmt:

a) Mesophase: 200 mg der Mesophase wurden in 2 ml Phosphatpuffer gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2 ml einer Dispersion von mikrokristalliner Zellulose CP 40 in Phosphatpuffer gegeben. Die Lösung wurde bei 30°C eine Stunde inkubiert und die entstandene Glucose wurde mit Hilfe der Glucose-Peroxidase-Reaktion (Fermognostbesteck VEB Feinchemie Sebnitz) bestimmt.
b) Puffer: Es wird verfahren wie unter a) beschrieben. An Stelle von 200 mg Mesophase werden aber 100 ul der Cellolcast-Lösung eingesetzt.

Ein experimenteller Vergleich beider Systeme zeigte, daß die Aktivität im Puffersystem nach 4 Tagen auf etwa 15% der Ausgangsaktivität abgesunken war, beim flüssigkristallinen System jedoch auch nach 3 Wochen Lagerung noch eine Restaktivität von etwa 75% des Ausgangswertes zu verzeichnen war.

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung der Lager-, Temperatur-, mechanischen und chemischen Stabilität von Biokatalysatoren, gekennzeichnet dadurch, daß eine den Biokatalysator enthaltende wäßrige Lösung mit einem Tensid vermischt wird, wodurch eine den Biokatalysator stabilisierende lyotrope Mesophase entsteht, die als Aufbewahrungs- und/oder Reaktionsmedium dient.

2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der in der Mesophase solubilisierte Biokatalysator durch Wasser zugabe in eine wäßrige Lösung oder Dispersion überführt wird und eine Nutzung der biokatalytischen Eigenschaften in dieser Form erfolgt.

3. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Substrate direkt zur biokatalysatorhaltigen Mesophase zugegeben werden, die Biokatalyse in lyotroper Mesophase erfolgt und die Produktaufarbeitung nach Wasserzusatz aus der wäßrigen Lösung oder Dispersion vorgenommen wird.

4. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß Proteasen, Lipasen, Zellulasen oder andere zu Reinigungs- und Waschzwecken geeignete Enzyme oder enzymhaltige Systeme eingesetzt werden.

5. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Biokatalysatoren pro- oder eukariotische Zellen eingesetzt werden.

6. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Tenside nichtionische Amphiphile eingesetzt werden.