WO2001034787A2 - Verwendung nichtionogener tenside zur durchführung enzymatischer reaktionen - Google Patents

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WO2001034787A2
WO2001034787A2 PCT/EP2000/011018 EP0011018W WO0134787A2 WO 2001034787 A2 WO2001034787 A2 WO 2001034787A2 EP 0011018 W EP0011018 W EP 0011018W WO 0134787 A2 WO0134787 A2 WO 0134787A2
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nonionic surfactant
tween
surfactant
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Roger Blum
Rüdiger HUHN
Rüdiger BRUST
Jörg SOSSINKA
Gerd Hoffmeier
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Eppendorf Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Definitions

  • the present invention relates inter alia to the use of non-ionic surfactants for carrying out enzymatic reactions and methods for dosing enzyme solutions in which a loss of enzyme activity is avoided.
  • the invention further relates to enzyme solutions containing surfactant and to the use thereof.
  • Biochemical reagents offer a variety of enzymes for a wide variety of applications, and these enzymes are generally sold in the form of stabilized solutions that contain different amounts of additives from supplier to supplier, e.g. Bovine serum albumin (BSA) or surfactants can contain.
  • BSA Bovine serum albumin
  • surfactants can contain.
  • the object is achieved in that the enzymes are metered in the presence of a certain minimum amount of nonionic surfactants.
  • the invention is based on the knowledge that when dosing enzymes in high dilutions (1: 500 or more) and / or using the above-mentioned microdosing system, a certain minimum content of nonionic surfactant in the enzyme solution or in the reaction solution is required in order to denature the Prevent enzyme and the associated loss of activity. It has been shown that enzyme solutions with at least 0.2% (w / v) surfactant, preferably at least 0.4% (w / v) surfactant, achieve the object on which the invention is based. The necessary minimum content of surfactant in (restriction) enzyme solutions is generally higher than that of commercially available enzyme solutions.
  • the present invention thus relates to the use of nonionic surfactants (see above) for carrying out an enzymatic reaction in which enzyme is metered in at a dilution of 1: 500 or more and / or with the aid of the microdosing system according to DE 197 37 173 A1, in which either the enzyme solution with nonionic surfactant in a proportion of at least 0.2% (w / v) (preferably 0.4% or more) or the reaction buffer with nonionic surfactant in a proportion of more than 0.0001% ( w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v).
  • a surfactant-containing enzyme solution which has a content of at least 0.2% (w / v) (preferably 0.4% or more) non-ionic surfactant.
  • the enzymes are restriction enzymes, but thermostable enzymes can also be considered, such as, for example, polymerases, in particular Taq polymerase, pfu polymerase and Vent DNA polymerase.
  • the nonionic surfactant is preferably derived from the Group consisting of 4- (1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) phenol
  • Triton X-100 benzyltriethylammonium hydroxide
  • Triton B benzyltriethylammonium hydroxide
  • Nonidet P40 ethylphenol-polyethylene glycol ether
  • polyoxyethylene derivatives of fatty acid esters with sugar alcohols such as polysorbate; Tween ".
  • SspI or valley are 0.2% (w / v) Tritron "X-100 as well as polymerases with 0.5% (w / v) Tween® 20, Triton ® X-100 or Nonidet P40 ®.
  • Enzyme solutions with a content of at least 1% (w / v), but in particular of at least 2% (w / v) nonionic surfactants are preferred.
  • the enzyme solutions according to the invention surprisingly have the advantage that they can be metered in at a dilution ratio of 1: 500 or more to a substrate-containing reaction solution, without the enzyme being inactivated or denatured and thus a loss of enzyme activity.
  • the enzyme solutions can be used in an equally advantageous manner for dosing with the aid of the microdosing system according to DE 197 37 173 AI.
  • the present invention therefore further relates to a method for carrying out an enzymatic reaction, in which an enzyme solution is diluted at least 1: 500 (ie in a dilution of 1: 500 or in a higher dilution, such as 1: 1000) Add substrate solution using an enzyme solution containing at least 0.2% (w / v), preferably at least 0.4% (w / v) nonionic surfactant, solutions from Ddel, EcoRI, Notl, Pvul, Sspl or Thal with 0.2% (w / v) (Triton ® X-100) and solutions from
  • the invention further relates to a method for dosing enzyme solutions with the aid of the microdosing system according to DE 197 37 173 AI, in which one uses the above-mentioned enzyme solutions.
  • reaction buffers with a content of more than 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), nonionic surfactant (or the use of nonionic surfactants as such) for carrying out an enzymatic reaction in which enzyme is added to the reaction buffer in a dilution of 1: 500 or more and / or with the aid of the microdosing system according to DE 197 37 173 A1 is neither disclosed in the prior art still suggested.
  • the invention thus furthermore relates to the use of a reaction buffer which contains at least 0.0001% (w / v), preferably at least 0.02% (w / v) and particularly preferably at least 0.04% (w / v), nonionic surfactant contains, to carry out an enzymatic reaction in which enzyme (see above) is added in a dilution of at least 1: 500 and / or with the aid of the microdosing system according to DE 197 37 173 AI.
  • a method for carrying out an enzymatic reaction in which a Enzyme solution in a dilution of 1: 500 or in a higher dilution (for example 1: 1000) is added to a substrate solution or a reaction buffer which contains more than 0.0001% (w / v), in particular at least 0.02% (w / v) and particularly preferably contains at least 0.04% (w / v), nonionic surfactant (see above).
  • Polyoxyethylene derivatives of fatty acid esters with sugar alcohols, such as polysorbate (Tween) are particularly preferred.
  • the enzyme can be dosed using conventional techniques or with the aid of the microdosing system according to DE 197 37 173 AI. It is of course also possible to dose a surfactant-containing enzyme solution to a surfactant-containing substrate solution (reaction buffer).
  • the present invention further relates to a (substrate-free) reaction buffer which contains at least 0.04% (w / v) nonionic surfactant, preferably polyoxyethylene derivatives of fatty acid esters with sugar alcohols, such as, for example, polysorbate
  • the enzyme is almost completely destroyed.
  • Lane 1-10 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 minutes
  • Fig. 2 1 ul enzyme solution EcoRI + 9 ul dilution solution
  • the substrate is broken down at the expected speed.
  • the substrate degrades at a satisfactory rate, but more slowly.
  • the substrate is broken down even faster than in experiment 2 (FIG. 2).
  • the substrate is broken down at the expected speed.
  • Fig. 6 1 ul EcoRI and 499 ul reaction buffer containing R * S
  • the substrate is broken down at least as quickly as in the experiment according to FIG. 5.
  • Tween (R) 20 so that enzyme solutions with the following Tween (F> content are formed. 1 ⁇ l of these dilutions in 499 ⁇ l reaction buffer containing 10 ⁇ g ⁇ -DNA.
  • Lane 1 + 2 EcoRI with 10% Tween 20 (as above). Termination after 20 and 60 minutes.
  • Lane 3 + 4 EcoRI with 2% Tween ® 20 (as above). Termination after 20 and 60 minutes.
  • Lane 5 + 6 EcoRI with 0.5% Tween 20. Termination after 20 and 60 minutes.
  • Lane 7 + 8 EcoRI with 0.1% Tween 20. Termination after 20 and 60 minutes.
  • Fig. 8 EcoRI mixed with different amounts of Triton® X-100, so that enzyme solutions with the following
  • Triton (R) content arise. 1 ⁇ l each of these dilutions in 499 ⁇ l reaction buffer containing 10 ⁇ g ⁇ -DNA.
  • Lane 1 + 2 EcoRI with 10% Triton® X-100. Termination after 20 and 60 minutes. Lane 3 + 4 EcoRI with 2% Triton X-100. Termination after 20 and 60 minutes.
  • Lane 5 + 6 EcoRI with 0.5% Triton " X-100 termination after 20 and 60 minutes.
  • Lane 9 + 10 EcoRI without Triton X-100 termination after 20 and 60 minutes.
  • Triton X-100 also enables the reaction, but must be used in a higher concentration than Tween ".
  • Lane 1 - 5 EcoRI dosed in reaction buffer containing 0.02% Tween ® 20, normal digestion of ⁇ -DNA. Termination after 20, 30, 40, 60 minutes.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft u.a. die Verwendung nichtionogener Tenside zur Durchführung enzymatischer Reaktionen sowie Verfahren zur Dosierung von Enzymlösungen, bei denen ein Verlust von Enzymaktivität vermieden wird. Die Erfindung betrifft ferner Tensid-haltige Enzymlösungen sowie deren Verwendung.

Description

Verwendung nichtionoqener Tenside zur Durchführung enzymatischer Reaktionen
Die vorliegende Erfindung betrifft u.a. die Verwendung nichtiono- gener Tenside zur Durchführung enzymatischer Reaktionen sowie Verfahren zur Dosierung von Enzymlosungen, bei denen ein Verlust von Enzymaktivität vermieden wird. Die Erfindung betrifft ferner Tensid-haltige Enzymlosungen und sowie deren Verwendung.
Hersteller biochemischer Reagenzien bieten eine Vielzahl von Enzymen für die unterschiedlichsten Anwendungs zwecke an, wobei diese Enzyme allgemein in Form stabilisierter Lösungen vertrieben werden, die von Anbieter zu Anbieter unterschiedliche Mengen an Zusätzen wie z.B. Bovines Serum Albumin (BSA) oder Tenside enthalten können.
Es hat sich nunmehr gezeigt, daß die kommerziell erhältlichen Enzymlosungen in manchen Anwendungsbereichen nicht ohne weiteres in dieser Form einsetzbar sind. So wurde zum Beispiel festgestellt, daß beim Dosieren von Enzymlosungen zu einem Substrat- haltigen Reaktionspuffer in hohen Verdünnungen (1 : 500, 1 : 1000 oder mehr) ein beträchtlicher Teil an Enzymaktivität verlorengeht, was zu einer Verlangsamung der Enzymreaktion führt. Häufig wird das Enzym vollständig inaktiviert, und es erfolgt keine Umsetzung. Ferner können die derzeit erhältlichen Enzymlosungen ebenfalls nicht mit dem Mikrodosiersystem der DE 197 37 173 AI dosiert werden, da es wegen der hohen Geschwindigkeit des Konzentrationsausgleichs zwischen Enzympuffer und Reaktionspuffer im Enzymmolekül zu teilweise beträchtlichen Aktivitätsverlusten bzw. zur Enzym-Denaturierung kommt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Dosierung von Enzymen in hohen Verdünnungen oder unter Verwendung des obengenannten Mikrodosiersystems zur Verfügung zu stellen, bei dem Verluste der Enzymaktivität ganz oder zumindest weitgehend vermieden werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Enzyme in Gegenwart einer bestimmten Mindestmenge nichtionoge- ner Tenside dosiert.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bei Dosierung von Enzymen in hohen Verdünnungen (1 : 500 oder mehr) und/oder unter Verwendung des obengenannten Mikrodosiersystems ein bestimmter Mindestgehalt an nichtionogenem Tensid in der Enzymlösung oder in der Reaktionslösung erforderlich ist, um ein Denaturieren des Enzyms und den damit einhergehenden Aktivitätsverlust zu verhindern. Es hat sich gezeigt, daß Enzymlosungen mit mindestens 0,2 % (w/v) Tensid, vorzugsweise mindestens 0,4 % (w/v) Tensid, die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe lösen. Der notwendige Mindestgehalt an Tensid liegt bei ( Restriktions- ) Enzymlosungen in der Regel über demjenigen kommerziell erhältlicher Enzymlosungen. Lediglich in einigen wenigen Fällen werden von einzelnen Herstellern bereits jetzt Enzymlosungen vertrieben (wie z.B. Ddel, EcoRl, Pvul, Sspl oder Thal von Gibco oder Notl von Stratagene), die für die genannten Zwecke ausreichende Tensidmengen enthalten. Andere Hersteller bieten diese Enzyme jedoch in der Regel mit voneinander abweichenden und für die Dosierung in hohen Verdünnungen oder unter Verwendung des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI unzureichenden Tensidgehalten an. Ein Zusammenhang zwischen einer bestimmten Mindest-Tensidmenge in der Enzymlösung und/oder dem verwendeten Reaktionspuffer und der Vermeidung einer Enzymdenaturierung bzw. eines Aktivitäts- verlusts des Enzyms wurde im Stand der Technik für die genannten Anwendungen bislang nicht erkannt. Nichtionogene Tenside werden daher bislang in variierenden Mengen bei der kommerziellen Herstellung von Enzymlosungen verwendet und dienen lediglich der Verbesserung der Enzym-Löslichkeit (vgl. Ulimann - Enzyklopädie der Technischen Chemie, Band 10, "Enzyme" ) .
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung nichtionogener Tenside (s.o.) zur Durchführung einer enzymati- schen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI zudosiert, bei der man vor der Reaktion entweder die Enzymlösung mit nichtionogenem Tensid in einem Anteil von mindestens 0,2 % (w/v) (vorzugsweise 0,4 % oder mehr) oder den Reaktionspuffer mit nichtionogenem Tensid in einem Anteil von mehr als 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v) , versetzt .
Gemäß einem Teilaspekt der Erfindung wird eine Tensid-haltige Enzymlösung zur Verfügung gestellt, die einen Gehalt von mindestens 0,2 % (w/v) (vorzugsweise 0,4 % oder mehr) nichtionogenem Tensid aufweist. Gemäß einer besonderen Aus führungs form handelt es sich bei den Enzymen um Restriktionsenzyme, es kommen aber auch thermostabile Enzyme in Betracht, wie z.B. Polymerasen, insbesondere Taq-Poly erase, pfu-Polymerase und Vent-DNA- Polymerase. Das nichtionogene Tensid wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus 4- ( 1 , 1 , 3 , 3-Tetramethylbutyl )phenol
(R) (R)
(Triton X-100), Benzyltri ethylammoniumhydroxid (Triton B), Ethylphenol-Polyethylenglykolether (Nonidet P40) oder Poly- oxyethylenderivaten von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen (wie zum Beispiel Polysorbat; Tween") , ausgewählt. Erfindungsgemäß ausgenommen sind Lösungen von Ddel, EcoRl, Notl, Pvul,
(R)
Sspl oder Thal mit 0,2 % (w/v) Tritron" X-100 sowie Polymerasen mit 0,5 % (w/v) Tween®20, Triton®X-100 oder Nonidet® P40. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Enzymlosungen mit einem Gehalt von mindestens 1 % (w/v), insbesondere aber von mindestens 2 % (w/v) nichtionogenen Tensiden bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Enzymlosungen weisen überraschenderweise den Vorteil auf, daß sie in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 oder mehr zu einer Substrat-haltigen Reaktionslösung zudosiert werden können, ohne daß es zu einer Inaktivierung bzw. Denaturierung des Enzyms und damit zu einem Verlust an Enzymaktivität kommt. Die Enzymlosungen können in ebenso vorteilhafter Weise zum Dosieren mit Hilfe des Mikrodosiersy- stems gemäß DE 197 37 173 AI verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 (d.h. in einer Verdünnung von 1 : 500 oder in einer höheren Verdünnung, wie z.B. 1 : 1000) zu einer Substratlösung hinzugibt, indem man eine Enzymlösung verwendet, die mindestens 0,2 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,4 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, wobei Lösungen von Ddel, EcoRl, Notl, Pvul, Sspl oder Thal mit 0,2 % (w/v) (Triton® X-100) und Lösungen von
(r?l (R)
Polymerasen mit 0,5 % (w/v) Tween 20, Triton~X-100 oder Nonidet P40 ausgenommen sind.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Dosieren von Enzymlosungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI, bei dem man die oben genannten Enzymlosungen einsetzt .
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnene Erkenntnis, daß sich Enzyme beim Dosieren in einem Verdünnungsverhältnis von mindestens 1 : 500 und/oder mit dem o.g. Mikrodosiersystem auch dadurch stabilisieren lassen, daß man dem Reaktionspuffer (anstelle der Enzymlösung), d.h. der Substrat-haltigen Reaktionslösung, nichtionogenes Tensid zugibt (s.o.), ist insofern von großer praktischer Bedeutung, als im Stand der Technik viele Enzymlosungen vertrieben werden ohne Angabe, wie ein Denaturieren oder ein Aktivitätsverlust z.B. beim Dosieren des Enzyms in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 oder mehr vermieden werden kann. Andererseits werden Reaktionspuffern zum Teil Tenside zugesetzt, wobei in diesen Fällen von den lösungsvermittelnden Eigenschaften der Tenside Gebrauch gemacht wird (s.o.). Die Verwendung von Reaktionspuffern mit einem Gehalt von mehr als 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenem Tensid (bzw. die Verwendung nichtionogener Tenside als solches) zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von 1 : 500 oder mehr und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI zum Reaktionspuffer zudosiert, ist im Stand der Technik weder offenbart noch nahegelegt.
Gegenstand der Erfindung ist somit ferner die Verwendung eines Reaktionspuffers, der mindestens 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym (s.o.) in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI zudosiert.
Erfindungsgemäß eingeschlossen ist auch ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von 1 : 500 oder in einer höheren Verdünnung (z.B. 1 : 1000) zu einer Substratlösung bzw. einem Reaktionspuffer zugibt, der mehr als 0,0001 % (w/v), insbesondere mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenes Tensid (s.o.) enthält. Polyoxyethylenderivate von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen, wie zum Beispiel Polysorbat (Tween ), sind besonders bevorzugt. Die Dosierung des Enzyms kann mit konventionellen Techniken oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI erfolgen. Es ist selbstverständlich auch möglich, eine Tensid- haltige Enzymlösung zu einer Tensid-haltigen Substratlösung ( Reaktionspuffer ) zu dosieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen (Substrat- freien) Reaktionspuffer, der mindestens 0,04 % (w/v) nichtionogenes Tensid, vorzugsweise Polyoxyethylenderivate von Fettsäureestern mit Zuckeralkoholen wie zum Beispiel Polysorbat
(Tween ), enthalt.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben.
BEISPIELE
Mit Hilfe des Restriktionsenzyms EcoRl wurden anhand einer Dosierung im Verdünnungsverhältnis 1 : 500 enzymatische Reaktionen mit λDNA durchgeführt, wobei EcoRl in der Lage ist, die λDNA in fünf Fragmente zu zerlegen, die gelelektrophoretisch aufgetrennt und mit herkömmlichen Methoden nachgewiesen werden können.
Die mit verschiedenen Anteilen an nichtionogenen Tensiden (entweder als Zusatz zur Enzymlösung oder als Zusatz zum Reaktionspuffer) erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend anhand der Figuren 1 bis 9 dargestellt, wobei die Reaktionsbedingungen jeweils in der Legende zu den Figuren angegeben sind. Fig. 1: 1 μl Enzymlösung EcoRl (10 U/μl) in 499 μl Reaktionspuffer (Tris-HCl 50 mM, MgCl2, 10 mM, NaCl 100 mM, Dithioerythritol 1 mM, pH 7 , 5 bei 37 °C), enthaltend 10 μg λ-DNA.
Das Enzym wird nahezu vollständig zerstört.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion: Bahn 1 - 10 = 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 Minuten
Fig. 2: 1 μl Enzymlösung EcoRl + 9 μl Verdünnungslösung
(Tris-HCl 20 mM, KCl 500 mM, EDTA 1 mM, Dithioery- thritol 1 mM, Thesit 0,05 %, Glycerin 50 %) in
490 μl Reaktionspuffer (s.o.), enthaltend 10 μg λ- DNA.
Das Substrat wird in zu erwartender Geschwindig- keit abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion: Bahn 1 - 10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 60 Minuten
Fig. 3: 1 μl Enzymlösung + Gemisch aus 490 μl Reaktionspuffer + 9 μl Verdünnungslösung, Gemisch enthält 10 μg λ-DNA.
Das Substrat wird in befriedigender Geschwindigkeit, jedoch langsamer abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion: Bahn 1 - 10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 60 Minuten (RJ
Fig. 4: 1 μl EcoRl mit 10 % Tween 20 + Gemisch aus 490 μl Reaktionspuffer + 9 μl Verdünnungslösung, Gemisch enthält 10 μg λ-DNA.
Das Substrat wird noch schneller als in Versuch 2 (Fig. 2) abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion: Bahn 1 - 10 = 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 60 Minuten
Fig. 5: 1 μl EcoRl mit 10 % Tween 20 + und 499 μl Reak- tionspuffer, enthaltend 10 μg λ-DNA (ähnlich dem in Fig. 4 dargestellten Versuch, jedoch ohne Verdünnungspuffer) .
Das Substrat wird in zu erwartender Geschwindig- keit abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion: Bahn 1 - 10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,
120 Minuten
Fig. 6: 1 μl EcoRl und 499 μl Reaktionspuffer, enthaltend R*S
0,02 % Tween und 10 μg λ-DNA.
Das Substrat wird mindestens ebenso schnell wie bei dem Versuch gemäß Fig. 5 abgebaut.
Zeitpunkt des Abbruchs der Reaktion: Bahn 1 - 10 = 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 Minuten Fig. 7: EcoRl, gemischt mit verschiedenen Mengen
Tween (R) 20, so daß Enzymlosungen mit folgendem Tween (F>-Gehalt entstehen. Je 1 μl dieser Verdünnungen in 499 μl Reaktionspuffer enthaltend 10 μg λ- DNA.
Bahn 1+2: EcoRl mit 10 % Tween 20 (wie oben) . Abbruch nach 20 und 60 Minuten .
Bahn 3+4: EcoRl mit 2 % Tween® 20 (wie oben) . Abbruch nach 20 und 60 Minuten .
Bahn 5+6: EcoRl mit 0,5 % Tween 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 7+8: EcoRl mit 0,1 % Tween 20. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 9+10: EcoRl ohne Tween 20. Abbruch nach
20 und 60 Minuten.
Deutlich ist zu erkennen, daß noch geringe Mengen Tween ® 20 (0,1 %) in der Enzymlösung die Reaktion ermöglichen.
Fig. 8: EcoRl, gemischt mit verschiedenen Mengen Tri- ton ® X-100, so daß Enzymlosungen mit folgendem
Triton (R)-Gehalt entstehen. Je 1 μl dieser Verdünnungen in 499 μl Reaktionspuffer enthaltend 10 μg λ-DNA.
Bahn 1+2: EcoRl mit 10 % Triton® X-100. Abbruch nach 20 und 60 Minuten. Bahn 3+4 EcoRl mit 2 % Triton X-100. Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
(R)
Bahn 5+6: EcoRl mit 0,5 % Triton" X-100 Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 7+8 EcoRl mit 0,1 % Triton® X-100 Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
Bahn 9+10: EcoRl ohne Triton X-100 Abbruch nach 20 und 60 Minuten.
(R)
Deutlich ist zu erkennen, daß Triton X-100 die Reaktion zwar auch ermöglicht, jedoch in höherer Konzentration angewendet werden muß als Tween" .
Fig. 9 Denaturierungshemmende Wirkung von Tween 20.
Daß Tween ®' in erster Linie die Denaturierung des Enzyms verhindert, zeigen folgende Versuche:
Bahn 1 - 5: EcoRl in Reaktionspuffer dosiert, der 0,02 % Tween® 20 enthält, normaler Verdau von λ-DNA. Abbruch nach 20, 30, 40, 60 Minuten.
Bahn 6 - 10 EcoRl in Reaktionspuffer dosiert,
(R) dem 0,02 % Tween 20 erst 20 Sekunden danach zugegeben wurde. Zeiten wie Bahn 1 - 5. Die Aktivität des Enzyms ist bereits deutlich vermindert. Bahn 11 - 15: Zugabe von Tween® 20 20 Minuten später, Aktivität von EcoRl nahezu Null .
Bahn 16 20 Ohne Zugabe von Tween ®" 20.
Nach diesem Versuch verbessert Tween ® 20 nicht die
Wirkung des Enzyms, sondern verhindert ein Denaturieren .

Claims

Patentansprüche
1. Tensid-haltige Enzymlösung, dadurch gekennzeichnet , daß das Tensid aus der Gruppe nichtionogener Tenside ausgewählt ist und die Lösung einen Gehalt von mindestens 0,2 % (w/v) Tensid aufweist, wobei eine Lösung von Ddel, EcoRl, Notl, Pvul, Sspl oder Thal mit 0,2 %
(w/v) (Triton (R) X-100) und eine Lösung einer Polymerase
(K") S) fS| mit 0,5 % (w/v) Tween 20, Triton~X-100 oder Nonidet" P40 ausgenommen ist.
2. Enzymlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 1 % (w/v) nichtionogenes Tensid enthält .
3. Enzymlösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 2 % nichtionogenes Tensid enthält.
4. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Restriktionsenzym ist .
5. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein thermostabiles Enzym ist .
6. Enzymlösung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine DNA-Polymerase aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent- DNA-Polymerase ausgewählt ist.
7. Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe bestehend aus Triton -X-100, Tween und Noni- det®P40 ausgewählt ist.
8. Verwendung einer Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zudosiert.
9. Verwendung einer Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI zudosiert.
10. Reaktionspuffer zur Durchführung enzymatischer Reaktionen, bei denen man Enzym in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 und/oder mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI zudosiert, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält .
11. Reaktionspuffer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens 0,04 % (w/v) nichtionogenes Tensid enthält.
12. Reaktionspuffer nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der
Gruppe bestehend aus Triton -X-100, Tween" und Noni- det ®P40 ausgewählt ist.
13. Verwendung eines Reaktionspuffers , der mindestens 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zudosiert.
14. Verwendung eines Reaktionspuffers, der mindestens 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält, zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man Enzym mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 173 AI zudosiert.
15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe
(R) (R^ (R> bestehend aus Triton -X-100, Tween und Nonidet P40 ausgewählt ist.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym für die enzymatische Reaktion ein Restriktionsenzym ist.
17. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein thermostabiles Enzym ist.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine DNA-Polymerase aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, pfu-Polymerase und Vent- DNA-Polymerase ausgewählt ist.
19. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zu einer Substratlösung hinzugibt, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung eine Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 ist.
20. Verfahren zum Dosieren von Enzymlosungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 137 AI, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung eine Enzymlösung nach den Ansprüchen 1 bis 7 ist.
21. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei der man eine Enzymlösung in einer Verdünnung von mindestens 1 : 500 zu einem Substrat-haltigen Reaktionspuffer hinzugibt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Reaktionspuffer verwendet, der mindestens 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält.
22. Verfahren zum Dosieren von Enzymlosungen mit Hilfe des Mikrodosiersystems gemäß DE 197 37 137 AI, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Reaktionspuffer verwendet, der mindestens 0,0001 % (w/v), vorzugsweise mindestens 0,02 % (w/v) und besonders bevorzugt mindestens 0,04 % (w/v), nichtionogenes Tensid enthält.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtionogene Tensid aus der Gruppe
(R) (R) (R) bestehend aus Triton -X-100, Tween und Nonidet P40 ausgewählt ist.
24. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Restriktionsenzym ist .
25. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein thermostabiles Enzym ist .
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase , pfu-Polymerase und Vent-DNA-Polymerase ausgewählt ist.
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