DE2609602A1 - Kontinuierliches verfahren zur glukose-isomerisierung - Google Patents

Description

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NOVO INDUÜTiU A/S, Bagsvaerd/.Dänemark

Kontinuierliches Verfahren zur Glukose-Isomerisierung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose mit dem Ziel, die Verfahrenskosten zu senken.

Im wesentlichen werden sämtliche bekannten Glukose-Isomerasen mit Kobalt aktiviert, was die Kosten für die Sirupkonversion wesentlich erhöht, nachdem jedwedes Kobalt, das dem eingesetzten Glukosesirup zugesetzt wurde,durch verhältnismässig kostspielige Ionenaustauschtechniken aus dem Glukose/Fruktose Produkt entfernt werden muss.

Ein eingehendes Studium über die Glukose-Isomerase von B. coagulans (s. Danno et al, Agriculture Biologie Ghem. Vol. 31, No. 3, 1967, S. 284-292) ergab, dass die maximale Aktivität für das Enzym bei einer Kobaltionen-Konzentration im Glukosesirup annähernd 10~% vorlag, wobei eine etwas höhere

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Konzentration für rohe Enzymaufbereitungen vorgeschlagen wurde. Die nach diesem Studium erschienene Patentliteratur scheint im allgemeinen von diesen Konzentrationen für die Kobalt erfordernden Enzyme auszugehen, unabhängig von der Quelle des Mikroorganismus. Da das dem eingesetzten Glukosesirup zugesetzte Kobaltion letztlich aus dem Glukose/Fruktose-Sirup entfernt werden muss (durch Ionenaustauscher), würde jede nennenswerte Reduzierung der dem eingesetzten Sirup zugesetzten Kobaltmenge eine wesentliche Senkung der Kosten für die Reinigung des Sirups zur Folge haben.

Es ist auch bekannt, dass die Aktivität von B^ coagulans Enzym durch den Magnesiumionen-Gehalt des Sirups beeinflusst wird. Tatsächlich wurde dann auch allgemein ein hoher Magnesiumgehalt in dem Sirup nach dem Stand der Technik zur Anwendung gebracht, z.B. Ί0 M, unabhängig von der Enzymquelle. Bei einer typischen Ausführung der enzymatischen Isomerisierung von Glukosesirup nach dem Stand der Technik werden Konzentrationen von 10"⁵M C0⁺⁺ und 10"²M Mg⁺⁺ angewandt.

Die im Zuge der Nachbehandlung durchgeführte Reinigung des Sirups ist normalerweise darauf angelegt, das Magnesium ebenso wie das Kobalt zu entfernen. Da jedoch Magnesium ein geläufiger nicht-toxischer Bestandteil von Nahrungsmitteln ist, wird eine unbedingte Abwesenheit von Magnesium nicht verlangt.

Es soll nochmals festgestellt werden, dass jede nennenswerte Reduzierung der verwendeten Kobaltmenge sich in einer deutlichen Senkung der Verfahrenskosten niederschlägt. Entsprechendes gilt für die Verminderung der eingesetzten Magnesiummenge. Bei nachfolgend noch im einzelnen beschriebener Erfindung wird überhaupt kein Go eingesetzt, wobei vorzugsweise auch noch die Magnesiumzugabe wesentlich verringert wird.

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Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird nun die enzymatisch^ Isomerisierung bei einem Glukosesirup mit einex* Konzentration von 30 - 55 Gew.-% Glukose durchgeführt, der weniger als etwa 10 "n Ca , überhaupt kein Kobalt, weniger als etwa

—2 —4- + +

10 M und vorzugsweise weniger als 5 ϊ 10 M Mg enthält, wobei die Konversion bei einem pH zwischen 7,8 und 8,6 erfolgt und die gesamte Kontaktzeit zwischen Enzym und Sirup weniger als 3,5» vorzugsweise weniger als 2 Stunden beträgt. Vorzugsweise soll hierbei so wenig Magnesium zugesetzt werden, dass eine Ionenaustauschbehandlung nach der Isomerisierung unterbleiben kann. Die Isomerisierungstemperatur liegt zweckmässig zwischen 60 und 85⁰G, vorzugsweise zwischen 60 und 70⁰G.

Die nachfolgenden Ausführungen dienen der weiteren Erläuterung und Veranschaulichung der Erfindung.

Glukose-Isomerasen von B^_- coagulans sind eingehend untersucht worden, um Enzymaufbereitungen zu erhalten, welche für einen kontinuierlichen industriellen Prozess eine ausreichend lange Lebenshalbwertszeit und eine hohe Aktivität pro Einheit besassen. Von B. coagulans Zellen gewonnene Glukose-Isomerasen mit diesen Eigenschaften stehen nunmehr im Stand der Technik zur Verfugung. Bezüglich einer für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens besonders geeigneten teilchenförmigen Enzymaufbereitung wird auf die in der belgischen Patentschrift No. 832 852 beschriebenen Enzymprodukte verwiesen, bei denen es sich um unter Einsatz von Glutaraldehyd vernetzte und in nennenswertem Ausmass aufgerissene Mikroorganismuszellen von B^ coagulans handelt. Vorzugsweise wird die Enzymaufbereitung aus Zellen hergestellt, welche vor der Reaktion mit Glutaraldehyd homogenisiert wurden.

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B. coa&ulans ist eine nur spärlich definierte Spezies mit zahlreichen bekannten Varianten. Eine Variante, welche besonders hochwertige Glukose-Isomerase liefert, zeichnet sich dadurch aus, dass für das Wachstum lediglich anorganische Stickstoffquellen als stickstoffhaltiges Mährmedium erforderlich sind. Zur näheren Beschreibung dieses Enzyms und seiner Mikroorganismusquelle wird auf die belgische Patentschrift 809 546 verwiesen.

Es wurde nun gefunden, dass die biochemischen Erfordernisse von immobilisierter B_^_ coagulans Glukose-Isomerase Enzymen nach Kobalt vollständig befriedigt werden können, ohne dass im Laufe der Isomerisierung eine ergänzende Zugabe von Kobalt erforderlich wäre. Tatsächlich ergab sich, dass durch Fortlassung von Go aus dem Glukosesirup die Produktivität des Isomerisierungsprozesses und die Stabilität des Enzyms nicht beeinträchtigt, in einigen Fällen sogar verbessert wurde.

Wie bereits erwähnt wurde, hat sich auch herausgestellt, dass die biochemischen Erfordernisse des Glukose-Isomerase Enzyms nach Magnesium viel niedriger liegen, als bisher angenommen wurde. Tatsächlich kann eine Zugabe von Mg⁺⁺ überhaupt vermieden werden, wenn die Konzentration von Ca⁺⁺ niedrig ist. Den Erfordernissen für die Aktivierung von Glukose-Isomerase hinsichtlich Mg⁺⁺ wird vollauf bei einem pH 7,8 oder darüber durch weniger als 10 ^ M Mg genügt.

Allerdings wirken Calciumionen in dem Sirup als Inhibitor und zwar in einem stärkeren Masse als bisher angenommen wurde. Offensichtlich wirkt Mg⁺⁺ in dem Sirup im wesentlichen der Ga Inhibierung entgegen. Demnach gestattet ein niedriger Calciumgehalt in dem Sirup eine Verminderung des Magnesiumgehaltes. Das Mg⁺⁺/Ca⁺⁺ Verhältnis im Sirup sollte über

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ί?:1 (bezogen auf molare Basis)., vorzugsweise über 10:1, jedoch nicht über 500:1 liegen, Tails Mg⁺V 1O~% liegt.

Die Durchführung einer enzymatisehen Glukose-Isoinerisierungsreaktion oberhalb eines pH-Werts von etwa pH 8,0 läuft allerdings den üblichen Praktiken der Isomerisierung bei einem pH unterhalb etwa 8,0 zur Reduzierung der Verfärbung entgegen. Die Entfärbung des Produktsirups, beispielsweise-durch Behandlung mit aktivierter Kohle, erhöht die Verfahrenskosten. Eine Verminderung der Verfärbung erscheint deshalb wünschenswert. Leider nimmt jedoch die Geschwindigkeit bzw. Intensität der Verfärbung in dem Glukosesirup mit steigendem pH zu.

Untersuchungen der Neigung zur Verfärbung zeigten, dass die Farbbildung bei allen pH-Werten in irgendeiner Funktion zur Zeit steht. Hieraus folgt, dass der höheren Verfärbungsgeschwindigkeit bei pH 8,0⁺dadurch entgegengewirkt werden kann, dass die Isomerisierung schneller durchgeführt wird. Die Begrenzung der gesamten Verweil- bzw. Kontaktzeit des Glukosesirups in dem Reaktor für die enzymatische Konversion auf etwa 5»5 Stunden ergibt einen Produktsirup von akzeptabler Farbe. Wird die Kontaktzeit auf weniger als Stunde gesenkt, dann ist eine Aufhellungsbehandlung des Sirups nicht erforderlich, wobei die Anwesenheit von Psicose und anderen Nebenprodukten selbst bei einer DünnschichtChromatographie (Sven Ige Hansen, TLG Methode für die Identifizierung von Mono-Di- und Trisacchariden, Journal of Chromatography, im Druck) überhaupt nicht mehr festgestellt werden kann. Die Anwendung der Erfindung bietet folgende Möglichkeiten bzw. Vorteile:

1.) Kein Go wird im Zusammenhang mit der Isomerisierung zugegeben;

2.) kein Mg braucht im Zusammenhang mit der Isomerisierung zugesetzt zu werden;

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3.) eine Ionenaustauschbehandlung nach der Isomerisierung zwecks Entfernung schädlicher Ionen ist nicht erforderlich;

4.) das Enzym zeigt eine ausgezeichnete Thermostabilität; 5.) die Produktivität des Prozesses wird verbessert;

6.) der Prozess ist für eine kontinuierliche Säulenoperation gut geeignet; der Druckabfall pro Längeneinheit der Säule ist niedrig.

Das erfindungsgemässe Verfahren besteht also in der Durchführung einer Isoaierisiei'ungsbehandlung von Glukose sirup in kontinuierlicher Arbeitsweise mit einem Sirupeinlass-pH im Bereich von 7>8 - 8,6 und mit einer Kontaktzeit von weniger als etwa 3>5 Stunden, vorzugsweise weniger als 2 Stunden. Hierbei wird ein Glukosesirup mit einem Glukosegehalt von 30 - 55 Gew.-% in einen Produktsirup umgewandelt, dessen Fruktoseniveau bei wenigstens 40%, normalerweise etwa 4-5% liegt. Die Konversionstemperaturen liegen zwischen 60 und 85°C, vorzugsweise 60 bis 70⁰C. Der pH-Bereich von 7»8 - 8,6 in dem eingesetzten Sirup wird durch Zugabe von Alkali (NaOH oder NapGO^) eingestellt. Falls erforderlich findet an bestimmten Stellen in dem Konversionsreaktor eine erneute Einstellung statt. Der pH-Wert des isomerisierten Austragssirups ist niedriger als der pH-Wert des Einlassirups. Der pH-Unterschied zwischen dem Einlass und Austrag liegt zwischen 0,2 und 0,6. Die pH-Kontrolle ist für die Durchführung der Erfindung wesentlich. Liegt der pH zu hoch, beispielsweise über etwa 8,6, dann findet bei längerer Kontaktzeit eine unerwünschte Verfärbung statt. Ist der pH-Wert zu niedrig, beispielsweise unter 7>6) ist die Zugabe von Co⁺"¹" für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität erforderlich. Ausser diesen beiden Erscheinungen muss die Änderung der Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH berücksichtigt werden.

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Das pH-Optimum für das Β_^_ coagularis Enzym liegt um 8,5. Ein industriell durchgeführtes diskontinuerlich.es bzw. batch-Verfahren wird normalerweise wegen der Anwendung verhältnismässig niedriger Enzymkonzentrationen bei verlängerten Kontaktzeiten durchgeführt. Aus diesem Grunde muss der pH niedrig gehalten werden, um eine Farbbildung zu vermeiden und die Enzymaktivität bei einem solchen pH ist wesentlich niedriger als bei dem optimalen pH. Go⁺⁺ Zugabe ist erforderlich. Bei einem kontinuierlichen Verfahren entsprechend der Erfindung kann die Kontaktzeit niedrig und der pH hoch gehalten werden. Die Isomerisierung kann bei oder in der Nähe des für das Enzym optimalen pH stattfinden. Co⁺⁺ kann vermieden werden. Demnach weist das erfindungsgemässe kontinuierliche Verfahren verschiedene Vorteile gegenüber einem batch-Verfahren auf.

Die Menge von Mg , welche dem eingesetzten Sirup zugegeben

-2
wird, liegt, unterhalb etwa 10 M, vorzugsweise unterhalb

—1\ ++

5 x 10 M. Um jedoch ein niedriges Mg -Niveau zu ermöglichen, muss der Calciumgehalt in dem eingesetzten Sirup auf unterhalb etwa 10 M eingestellt werden, was durch Verwendung von Wasser mit niedrigem Calciumgehalt für die Herstellung des Sirups oder durch eine geeignete Vorbehandlung de3 Glukosesirups für die Begrenzung des Galciumgehalts auf unterhalb 2,^x 10"-⁵M möglich ist. Ist Calcium zugegen, muss in jedem Falle genügend Magnesium dem Sirup für einen Uher-Ausgleich des in ihm vorhandenen Calciumgehaltes zugegeben werden und zwar so viel, dass ein Molarverhältnis von Mg⁺⁺/Ca⁺⁺ von mehr als 5^:1> vorzugsweise von mehr als 10:1 erreicht wird.

Insgesamt wird der Gehalt von Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺, falls erforderlich, durch eine Ionenaustausch-Entfernung von Ca⁺⁺ aus dem Glukosesirup eingestellt und in Beziehung zueinander gebracht, um mehr als 10"% Ca⁺⁺ und 10"²M Mg⁺⁺ zu vermeiden. Falls der

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Glukosesirup eine niedrigere Konzentration an Ga enthält, kann die Menge an zugesetztem Mg⁺⁺ in einem entsprechenden Verhältnis so verringert werden, dass Mg⁺⁺:Ca⁺⁺ in dem Intervall 5-5OO bei Mg⁺⁺> 10"^M verbleibt und höher als 5

++ — 3
bei Mg <i 10 "Ή liegt. Demnach enthält der Sirup bei einer

vorzugsweisen Ausfuhrungsform der Erfindung weniger als 2,5 χ 10"^M Ca⁺⁺ und 5 χ 10"⁴M Mg⁺⁺.

In der Praxis wird die Erfindung bei GlukoseSirupen angewandt, die aus einem Stärkehydrolysat gewonnen wurden.Im allgemeinen beginnt die Herstellung des Sirups mit der Suspendierung der Stärke in Leitungswasser von einiger Härte, so dass einiges an Ca⁺⁺ anwesend ist.

Die Stärkehydrolyse und die Verzuckerung des Stärkehydrolysats wird oft auf enzymatischem Wege durchgeführt, wobei Ga aktivierte Enzyme eingesetzt werden. Deshalb liegt im allgemeinen Ga in den GlukoseSirupen vor (ausser wennder Sirup im Laboratorium unmittelbar aus kristalliner Dextrose mit deionisiertem Wasser hergestellt wurde), so dass zu beachten ist, dass der Ca⁺⁺ Gehalt nicht oberhalb 10"% Ca⁺⁺ liegt.

Bei dem kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren nach der Erfindung wird die Teilchengrösse der Enzymaufbereitung durch die Bedingungen (und die Vorrichtung) für die Sirupbehandlung bestimmt. Bei einem Säulenverfahren, dem bei der Durchführung der Erfindung der Vorzug gegeben wird, werden bevorzugt Teilchen mit mehr als etwa 100 Mikron eingesetzt (weil andernfalls die Säule zur Verstopfung mit kleineren Partikeln neigt), Niedrig-Bettverfahren (z.B. die Isomerisierung auf einem Filterpressenreaktor) gestatten den Einsatz jeder Partikelgrösse. Da jedoch die Einheitsaktivität der Enzymaufbereitung in irgendeiner Weise von der Partikelgrösse abhängt,

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kann die für den Isomerisierungsprozess angewandte Partikelgrösse einen Faktor für die Wirksamkeit eines bestimmten Verfahrens (oder Vorrichtung) darstellen. Jeüenfalls können die Enzymaufbereitungen, die in der belgischen Patentschrift 832 852 beschrieben sind, in der gewünschten Partikelgrösse erhalten werden.

Zum weiteren Verständnis der Erfindung wird auf die nachfolgenden Ausführungsbeispiele Bezug genommen, in denen die Aktivität des immobilisierten Enzyms in IGIS Einheiten (immobilisierte Glukoseisomerase-Säulenverfahren) gemessen wird. 1 IGIS wird definiert als die Enzymmenge, welche Glukose zu Fruktose mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 1/u/mol/min. unter Standardbedingungen konvertiert, die durch 40 Gew.-% Glukose, pH 8,5 im Einlass, 65°G, 4 χ 10"⁵M Mg⁺⁺ und Abwesenheit von Ga⁺ , sowie einer kontinuierlich gepackten Bettsäule mit einer Säulengrösse von 2,5cm χ 40cm bestimmt sind.

In den Beispielen wird die Produktivität des Enzyms in einer bestimmten Zeit (Stunden) als die in Kilogramm ausgedrückte Glukosemenge definiert, die zu einer Mischung von Fruktose und Glukose mit einem Konvertierungsgrad von 0,45 pro kg Enzym von einer Anfangsaktivität von 100 IGIS/g konvertiert werden kann.

Die eingesetzten Enzymaufbereitungen besassen eine Aktivität zwischen 150 und 250 IGIS pro g. Um die mit Enzymaufbereitungen verschiedener Aktivität erzielten Ergebnisse zu vergleichen, wurden die Produktivitätswerte auf eine Enzymaktivität von 100 IGIS/g umgerechnet. In den Beispielen bezieht sich die Kontaktzeit auf eine Enzymaufbereitung mit einer Aktivität von 100 IGIS/g. So entspricht beispielsweise

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eine Kontaktzeit von 1 Stunde mit einer eine Aktivität von 200 IGIS/g aufweisenden Enzymaufbereitung einer Kontaktzeit von 2 Stunden bei einer Standardaufbereitung mit einer Aktivität von 100 IGIS/g.

Beispiel 1 Isomerisierung in Gegenwart und Abwesenheit von Co

Sämtliche Isomerisierungen wurden als kontinuierliche i'liessreaktionen auf dichter bzw. kompakter Bettfüllung durchgeführt. Das B^ coagulans Enzym wurde entsprechend Beispiel 2 der belgischen Patentschrift 832 852 hergestellt. Die Partikelgrösse variierte zwischen 150/U. und 2800/U. Die Enzymaufbereitung wurde vorher in einem Glukosesirup mit einem Glukosegehalt von 40 Gew-% bei Raumtemperatur während einer Stunde eingeweicht. Hiernach wurde die eingeweichte Glukose-Isomerase in verschiedene Säulen mit Wasserummantelung gepackt. Ein Glukosesirup-Strom mit der Konzentration, dem pH und den anderen in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Parametern wurde in Aufwärtsrichtung durch das Enzymmaterial durchgesetzt. Die Fliessgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass in dem Austragssirup eine 45%-ige Konversion vorlag. Die lineare Fliessgeschwindigkeit lag immer oberhalb 10cm/h (Film-Diffusionsgrenze). Die Ca⁺⁺ Konzentration in diesem Beispiel lag unter 2,5 x 10""-³M.

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	Temp.,0G	Tabelle	1A	Go i.	+-t M	-Zugabe	Mg i.	M	-Zugabe
Versuch	60	Glukose- Konz.i.Gew-%	pH im Eintrag			0	.8	X	10"3
I	60	40%	8,5	3,	5	χ 10	8	X	10"5
II	65	.40%	8,5			0	8	X	10"5
III	65	40%	8,5	3,	5	χ 10	8	X	10"5
IV	65	40%	8,5			0	8	X	10~5
V	65	40%	7,6	3,	5	χ 10~	8	X	10"^
VI	40%	7,6

Es wurden Säulen verschiedener Grossen eingesetzt, nämlich von 1,5cm χ 35cm und 5,8cm χ 45cm, wobei das zuerst angegebene Mass den Durchmesser und das andere Mass die Höhe der Säule angibt. Der Einfachheit halber werden die Säulen nachstehend kurz 60 ml bzw. 1 1 Säulen angegeben. 9 g Enzym wurden in die 60 ml Säule und 225 g Enzym in die 1 1 Säule gepackt.

Alle Isomerisierungen wurden während 450 Stunden durchgeführt. Hiernach wurde die Restaktivität bestimmt und die Produktivität pro 100 IGIS/g und die Kontaktzeit pro 100 IGIS/g errechnet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

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Tabelle 1B

Versuch
Produktivität

II

III

IV

:§ pro 100 IGIS/g 340

315

420

375

395

_VI 410

60ml Restaktivität	65%	60%	52%	42%	28%	41%
Kontaktzeit pro 100 IGIS/g min	90-140	90-150	75-145	75-180	75-270	/£-185
Produktivität pro 100 IGIS/g	350	320	440	370	400	415
1 1 Restaktivität	69%	59%	60%	45%	44%	46%
Kontaktzeit pro 100 IGIS/g min	90-130	90-155	75-125	75-170	75-170.	75-17C

Wo in der vorstehenden Tabelle (entsprechendes gil für die nachfolgenden Tabellen) mehr als ein Wert für die Kontaktzeit angegeben ist, entspricht die erste Zahl dem Anfang des Versuches mit hoher Aktivität und die letzte Zahl dem Ende des Versuches mit einer etwas niedrigeren Aktivität.

Aus der obigen Tabelle können nachstehende Folgerungen gezogen werden:

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- Λ6 -

1.) Die Produktivität pro 100 IGIS/g und die Reataktivität ist ohne Go besser als mit Go, wenn der pH au!" dem vorgeschlagenen Niveau gehalten wird.

2.) Liegt der pH unterhalt) des vorgeschlagenen Niveaus sind die Produktivität pro 100 IGIS/g und die ßestaktivität mit Go besser al3 ohne Co, jedoch sind die Werte mit Go kleiner als die ohne Co erhaltenen Werte, wenn der pH innerhalb des vorgeschlagenen Bereichs liegt.

Beispiel 2 Isomerisierung in Gegenwart und Abwesenheit von Mg

Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt. Folgende Parameter wurden während der Versuchsserien konstant gehalten:

Glukose-Konz.	40 Gew.-%
pH im Eintrag	8,5
Co+"1- Zugabe	keine
Ca -Konz.	weniger als 2,5 x
Temperatur	650G
Ma gne s i um ζ ugab e	variiert von O -

0 M

Nach einer Isomerisierungszeit von 450 Stunden wurden die Versuche unterbrochen. Die Restaktivität wurde bestimmt und die Produktivität pro 100 IGIS/g und die Kontaktzeit pro 100 IGIS/g wurden errechnet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

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Tabelle 2

Zugabe, N

Versuch 04x1Q"⁴ 8x10 ^ 4x10~^ 8x1Q

¹^ Produktivität

$ pro 100 IGIS/g 400 419 4-24 415 4-20

60 ml fiestaktivität 50% 50% 50% 48% 52%

Kontaktzeit min

pro 100 IGIS/g 75-150 75-150 75-150 75-155 75-1^5

Produktivität

pro 100 IGIS/g 410 435 4-35 4-50 440

1 1 Restaktivität 58% 60% 62% 62% 60%

Kontaktzeit min

pro 100 IGIS/g 75-130 75-125 75-125 72-125 78-125

Aus der Tabelle geht hervor j dass die Zugabe von. Mg⁺⁺ die Produktivität pro 100 IGIS/g oder die fiestaktivität nicht beeinflusst.

Beispiel 3

Isomerisierung mit unterschiedlichen Verhältnissen zwischen +⁺ und Ga⁺⁺

Die Isomerisierungen wurden nach der im Beispiel 1 gegebenen

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Beschreibung durchgeführt, i'ünf 60 ml Säulen wurden gleichzeitig benutzt, eine mit konstanter Mg -Zugabe zu dem eingesetzten Sirup und ohne Ga , und die anderen mit unterschiedlichen Verhältnissen zwischen Mg⁺⁺ und Ca^+f im Glukosesirup. Folgende Parameter wurden angewandt:

40 Gew.-% Glukose-Konz. (40 Gew.-%)

pH 8,4 im Eintrag (8,4)

65⁰G Temperatur (65°G)

0 M Go⁺⁺-Zugabe (0 M Go)

variierende Mg⁺⁺-Zugabe (4 χ 10~% Mg⁺⁺)

variierende Ga -Zugabe weniger als 2,5 x 10/M

Die Aktivität in der Kontrollsäule (ohne Ga) wurde mit den in den Klammern stehenden Parametern gemessen. Nach 800 Stunden war die Enzymaktivität in der Kontrollsäule auf 25% der Anfangsaktivität gesunken. Die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Werte geben die prozentualen Aktivitäten in Bezug auf die Enzymaktivität der Kontrollsäule nach entsprechender Stundenzahl wieder.

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	100	Std.	Tabelle 3	Std.	ME -4 2 Ca ^'^	Std.	100
Std.	94	1	Ca =2'8	1	100	1	100
1	56	20	100	20	99	.20	100
20	60	40	96	60	96	100	89
45	52	60	96	120	89	200	92
70	52	90	94	180	84	240	83
100		120	86	240	81	300	78
120	2=^100 Std.	135	79			420	t 1/2>i000Std
		80		t 1/2=^800 Std.
t 1/	t 1/2=~300 Std.

Die oben angegebenen Werte zeigen, dass das Mg /Ca Verhältnis für die Lebensdauer des Enzyms von Bedeutung ist; das Verhältnis sollte 5 und vorzugsweise 10 überschreiten.

Beispiel 4

Isomerisierungs-ÄbhänKiKkeit von der Glukosekonzentration in dem Eintragssirup

Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Folgende Parameter wurden angewendet:

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Glukose-Konz. variierend zwischen 40 u. 50 Gew-%

pH i. Eintrag 8,4

Temperatur 65 0

Co li ich Lu

Mg 0,004 M

Ga weniger als 2,5 x 10"^M

In der nachfolgenden Tabelle sind die Produktivität, die .Restaktivität und die Kontaktzeit für eine 450-stündige Versuchsdurchführung in 60 ml Säulen angegeben.

Tabelle 4 Glukose i. Gew-% 40% 45% 50%

Produktivität/100 IGIS/g 430 410 $80

Restaktivität 48% 50% 50%

Kontaktzeit min/100ElS/g 75-150 85-170 95-190

Beispiel 5 Einfluss des pH auf die Aktivität

Der Einfluss des pH auf die Aktivität der nach Beispiel 2

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des belgischen Patents 832 852 hergestellten Glukose-Isoiaerase wurde in einer kontinuierlich betriebenen Fliessäule mit den Abmessungen 2,5^cffl x 35cm bestimmt. Die Isomerisierung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Jede Aktivitätsmessung erfolgte in der nachfolgenden Weise. Dabei wurden 5 Stunden vorgegeben, damit sich in der Säule das Gleichgewicht einstellt, bevor die Aktivität gemessen wurde. Dann wurde der pH des Eintrags auf den nächsten Wert geändert, wonach die Säule während weiterer 5 Stunden usw. betrieben wurde. Folgende Parameter wurden angewandt:

Glukose-Konz.	40#	zwischen	5,0
pH	variierend
Temperatur	65°G
Go	nichts
Mg	0,004 M	2,5 χ 10	-5M
Ga	weniger als
Kontaktzeit	50 min.

- 9,5

Die relativen prozentualen Aktivitäten ergeben sich aus der nachfolgenden Tabelle, wobei die maximale Aktivität bei 8,5 mit 100 definiert ist:

Tabelle 5

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 % Aktivität 5 15 45 60 70 85 95 100 95 90

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Beispiel 6 Einfluss der Temperatur auf Aktivität und Stabilität

Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer nach Beispiel 2 der belgischen Patentschrift 832 852 erhaltenen Glukose-Isomerase durchgeführt. Es wurden sieben Säulen isothermisch bei verschiedenen Temperaturen zwischen 60 und 90⁰C betrieben. Die Anfangsaktivität wurde ebenso wie die Halbwerts-Lebenszeit, also die Zeit, nach der die Aktivität auf 50% der Anfangsaktivität abgenommen hat, bestimmt. Folgende Parameter wurden angewandt:

Glukose-Konz.	40 Gew-%
pH	8,5
Temperatur	variabel
Co	nichts
Mg	0,004 M
Ca	weniger als 2,5 χ 10""-5M

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Kontaktzeit(min)

Temp.	% Aktivität Stabilität(Halbwertszeit) pro 100 IGIS/k	600 Stunden	90-180
600C	25%	4-50 Stunden	75-150
65	30%	250 Stunden	55-110
70	4-0%	125 Stunden	40-80
75	55%	60 Stunden	30-60
80	70%	10 Stunden	25-50
85	90%	2 Stunden	23-45
90	100%

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Beispiel 7 Einfluss der Partikelgrösse auf die Aktivität

Mit Ausnahme der Enzymaufbereitungen wurde bei den Isomerisierungen wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren. Im vorliegenden Falle wurden zwei Enzymaufbereitungen eingesetzt, nämlich die immobilisierten Glukose-Isomerase-Aufbereitungen wie sie in den Beispielen 2 und 3, letzte Alternative, des belgischen Patents 832 852 beschrieben und mit X bzw. I bezeichnet sind.

Bevor die Enzymaufbereitungen in die Säulen gepackt wurden, wurden beide klassifiziert. Folgende Parameter wurden angewandt :

Glukose-Konz.	40 Gew-%
pH	8,0
Temperatur	65°C
Co	nichts
Mg	0,004 M
Ca	weniger als 2,5 x 10""-3M

Der Einfluss der Partikelgrösse auf die Aktivität der Aufbereitungen X und Ϊ ergibt sich aus der nachfolgenden Tabelle:

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Tabelle 7

Glukose-lsomerase-Aufbereitungen X Teilchengrösse-Verteilung % Aktivität

150-297/U 100%

297-500/U 98%

500-1OOOyU 97%

1000-141OyU 94%

1410-200OyU 84%

2000-280OyU 80%

Glukose-Isomerase-Aufbereitungen Ϊ Teilchengrösse-Verteilung % Aktivität

75-25OyU 100%

250-354yU 69%

354-50OyU 48%

5OO-7O7yu 39%

707-100OyU 34%

Es wurde gefunden, dass die Stabilität nicht nennenswert von der Partikelgrösse abhängt.Wie aus den vorstehenden Zahlen hervorgeht wird die Aktivität einiger Aufbereitungen von der Partikelgrösse in stärkerem Masse beeinflusst als es bei anderen der Fall ist. Es kann keine vollständige Erklärung dafür gegeben werden, weshalb die Aktivität der Aufbereitungen Z sehr viel weniger von der Partikelgrösse abhängig ist als die Aktivität der Aufbereitungen Y. Es wird jedoch angenommen, dass diese Beobachtung irgendwie mit der Partikelform zusammenhängt. Es wurde festgestellt, dass die Aufbereitung X hauptsächlich aus Plättchen, hingegen die Aufbereitung Y im wesent-

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liehen aus Kügelchen bestellt. Bei einer gegebenen Partikelgrösse ist die durchschnittliche Porenlänge in den Plättchen wesentlich kleiner als bei den Kügelchen, was erklären könnte, dass die Aktivität bei der Aufbereitung Y kleiner ist als bei derjenigen der Aufbereitung X.

Beispiel 8 Verfärbung

Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Sechs Säulen wurden mit unterschiedlichen Enzymmengen gefüllt, um den Konversionsgrad und die Kontaktzeit auf 45% bzw. 1 Stunde konstant zu halten. Folgende Parameter wurden angewandt:

Glukose-Konz. 45 Gew-%

pH 8,5

Temperatur variabel

Co⁺⁺ nichts

Mg⁺⁺ 8 χ 10"⁴M

Ca⁺⁺ weniger als 2,5 χ 1O~%

Der Icumsa Color-Index erhöhte sich wie nachstehend für eine Isomerisierungsdauer von etwa 100 Stunden angegeben:

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	Tabelle 8	ΙΟ5 χ a
Temperatur	Icumsa Color-Index
60°G	24
65°G	25
70°G	26
750G	30
800C	39
85°C	65
Icumsa Color = '

Td χ c

worin a = °^4?0 (optische Dichte)

b = DS in g/ml (Trockensubstanz) c = Länge der Messzelle in cm.

Beispiel 9 Einfluss der Säulengrösse (Upscaling)

Mit Ausnahme der Enzymaufbereitung wurde die Isomerisierung wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt. Das Enzym wurde nach Beispiel III, letzte Alternative des belgischen Patents 832 852 durchgeführt. Die Partikelgrösse lag zwischen 15Ο und 500/U. Die angewandten Parameter sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

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Tabelle

Säulengrösse

No. der Säulen

60 ml

Abmessungen, Höhe

in cm χ Durchmesser 35 x 1,5 in cm

1 1

45 x 5,8

188 χ

eingesetztes Enzym i.Gramm	20	470	23OOO
Temperatur isothermisch	65°G	65°G	650C
Glukose-Konz.	40%	40%	40%
pH i. Eintrag	8,5	8,5	8,5
Mg Molar	0,0008	0,0008	8 χ 10~4
Co	nichts	nichts	nichts
Ca++	weniger als 2,5 x 10"5M	weniger als 2,5 χ 10"5M	weniger als 2,5 x 10"5M

Gesamtzeit der Isomerisierung in Std. 450

450

450

Folgende Ergebnisse wurden erzielt;

Säulengrösse	60 ml
Produktivität/100 IGIS/g	440
ßestaktivität	50%
Kontaktzeit/100 IGIS/g (min)	75-15'

1 1

420 53%

75-150

455 60%

75-140

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26Π9Β02 - 25 -

Aufgrund der obigen Werte scheint es, dass die Durchführung der Isomerisierung in zunehmend grösserem Massstab ausgehend von der 60 ml Säule ohne Schwierigkeiten und mit im wesentlichen denselben Werten für Produktivität und Restaktivitäten durchgeführt werden kann.

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Claims (8)

Patentansprüche

1. Kontinuierliches Verfahren zur Isomerisierung von Glukosesirup zu einer Glukose/Fruktose-Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Glukosesirup mit einem

— 3 ++ Glukosegehalt von 30 - 55 Gew-%, der maximal.10 "TI Ga

—2 ++
und 10 M Mg enthält, wobei das molare Verhältnis

Mg⁺⁺:Ca⁺⁺ zwischen 5 und 500 bei Mg⁺⁺>10~% und mehr als 5 bei Mg < 10 M beträgt, durch ein Bett aus vermittels Glutaraldehyd immobilisierter und von B^ coagulans gewonnener Glukose-Isomerase-Teilchen mit einer Grosse von oberhalb etwa 100 Mikron bei einem Einlass-pH zwischen 7j8 - 8>6, bei Temperaturen zwischen 60 - 85 G und bei einer Gesamtkontaktzeit von weniger als 3»5 Stunden geschickt wird, wobei der Sirup mindestens bis zu 40 Gew.-fo i'ruktose bezogen auf den Gehalt an Glukose und Pruktose isomerisiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein von Go ⁺ freier Glukosesirup verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

der Ga ⁺-Gehalt auf weniger als etwa 2,5 x 10"-⁵M und der

Mg -Gehalt auf weniger als 5 x 10 M eingestellt wird, wobei der Mg⁺⁺-Gehalt mindestens das 10-fache des Ca⁺⁺- Gehalts beträgt.

4-· Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das teilchenförmige Enzym in eine Säule eingefüllt wird.

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5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An-

.ti!- ' I

Sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die¹Kontaktzeit auf weniger als etwa 2 Stunden eingestellt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Sirup mit einem Gehalt von 40 - 45 Gew-% Glukose verwendet wird.

7· Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomerisierung bei Temperaturen zwischen 60 und 70°C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, dass einEnzym von einem atypischen Stamm von B^_ coagulans verwendet wird, der lediglich auf anorganischen Stickstoff enthaltendem Nährmedium Wachstum zeigt.

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ORIGINAL INSPECTED