DE2609602A1 - Kontinuierliches verfahren zur glukose-isomerisierung - Google Patents
Kontinuierliches verfahren zur glukose-isomerisierungInfo
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Description
Fv '
1b t>i/i/ 1U/ir
NOVO INDUÜTiU A/S, Bagsvaerd/.Dänemark
Kontinuierliches Verfahren zur Glukose-Isomerisierung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose
mit dem Ziel, die Verfahrenskosten zu senken.
Im wesentlichen werden sämtliche bekannten Glukose-Isomerasen
mit Kobalt aktiviert, was die Kosten für die Sirupkonversion wesentlich erhöht, nachdem jedwedes Kobalt, das dem eingesetzten
Glukosesirup zugesetzt wurde,durch verhältnismässig kostspielige Ionenaustauschtechniken aus dem Glukose/Fruktose
Produkt entfernt werden muss.
Ein eingehendes Studium über die Glukose-Isomerase von B.
coagulans (s. Danno et al, Agriculture Biologie Ghem. Vol.
31, No. 3, 1967, S. 284-292) ergab, dass die maximale Aktivität für das Enzym bei einer Kobaltionen-Konzentration im
Glukosesirup annähernd 10~% vorlag, wobei eine etwas höhere
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Konzentration für rohe Enzymaufbereitungen vorgeschlagen wurde. Die nach diesem Studium erschienene Patentliteratur
scheint im allgemeinen von diesen Konzentrationen für die Kobalt erfordernden Enzyme auszugehen, unabhängig von der
Quelle des Mikroorganismus. Da das dem eingesetzten Glukosesirup zugesetzte Kobaltion letztlich aus dem Glukose/Fruktose-Sirup
entfernt werden muss (durch Ionenaustauscher), würde jede nennenswerte Reduzierung der dem eingesetzten Sirup zugesetzten
Kobaltmenge eine wesentliche Senkung der Kosten für die Reinigung des Sirups zur Folge haben.
Es ist auch bekannt, dass die Aktivität von B^ coagulans Enzym
durch den Magnesiumionen-Gehalt des Sirups beeinflusst wird. Tatsächlich wurde dann auch allgemein ein hoher Magnesiumgehalt
in dem Sirup nach dem Stand der Technik zur Anwendung gebracht, z.B. Ί0 M, unabhängig von der Enzymquelle. Bei einer
typischen Ausführung der enzymatischen Isomerisierung von Glukosesirup nach dem Stand der Technik werden Konzentrationen
von 10"5M C0++ und 10"2M Mg++ angewandt.
Die im Zuge der Nachbehandlung durchgeführte Reinigung des
Sirups ist normalerweise darauf angelegt, das Magnesium ebenso wie das Kobalt zu entfernen. Da jedoch Magnesium ein geläufiger
nicht-toxischer Bestandteil von Nahrungsmitteln ist, wird eine unbedingte Abwesenheit von Magnesium nicht verlangt.
Es soll nochmals festgestellt werden, dass jede nennenswerte Reduzierung der verwendeten Kobaltmenge sich in einer deutlichen
Senkung der Verfahrenskosten niederschlägt. Entsprechendes gilt für die Verminderung der eingesetzten Magnesiummenge. Bei
nachfolgend noch im einzelnen beschriebener Erfindung wird überhaupt kein Go eingesetzt, wobei vorzugsweise auch noch
die Magnesiumzugabe wesentlich verringert wird.
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Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird nun die enzymatisch^
Isomerisierung bei einem Glukosesirup mit einex* Konzentration
von 30 - 55 Gew.-% Glukose durchgeführt, der weniger als etwa 10 "n Ca , überhaupt kein Kobalt, weniger als etwa
—2 —4- + +
10 M und vorzugsweise weniger als 5 ϊ 10 M Mg enthält,
wobei die Konversion bei einem pH zwischen 7,8 und 8,6 erfolgt und die gesamte Kontaktzeit zwischen Enzym und Sirup
weniger als 3,5» vorzugsweise weniger als 2 Stunden beträgt.
Vorzugsweise soll hierbei so wenig Magnesium zugesetzt werden, dass eine Ionenaustauschbehandlung nach der Isomerisierung
unterbleiben kann. Die Isomerisierungstemperatur liegt zweckmässig zwischen 60 und 850G, vorzugsweise zwischen 60
und 700G.
Die nachfolgenden Ausführungen dienen der weiteren Erläuterung und Veranschaulichung der Erfindung.
Glukose-Isomerasen von B^- coagulans sind eingehend untersucht
worden, um Enzymaufbereitungen zu erhalten, welche für einen kontinuierlichen industriellen Prozess eine ausreichend
lange Lebenshalbwertszeit und eine hohe Aktivität pro Einheit besassen. Von B. coagulans Zellen gewonnene Glukose-Isomerasen
mit diesen Eigenschaften stehen nunmehr im Stand der Technik zur Verfugung. Bezüglich einer für die Durchführung des erfindungsgemässen
Verfahrens besonders geeigneten teilchenförmigen Enzymaufbereitung wird auf die in der belgischen
Patentschrift No. 832 852 beschriebenen Enzymprodukte verwiesen,
bei denen es sich um unter Einsatz von Glutaraldehyd vernetzte und in nennenswertem Ausmass aufgerissene Mikroorganismuszellen
von B^ coagulans handelt. Vorzugsweise wird
die Enzymaufbereitung aus Zellen hergestellt, welche vor der Reaktion mit Glutaraldehyd homogenisiert wurden.
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B. coa&ulans ist eine nur spärlich definierte Spezies mit
zahlreichen bekannten Varianten. Eine Variante, welche besonders hochwertige Glukose-Isomerase liefert, zeichnet
sich dadurch aus, dass für das Wachstum lediglich anorganische Stickstoffquellen als stickstoffhaltiges Mährmedium
erforderlich sind. Zur näheren Beschreibung dieses Enzyms und seiner Mikroorganismusquelle wird auf die belgische
Patentschrift 809 546 verwiesen.
Es wurde nun gefunden, dass die biochemischen Erfordernisse von immobilisierter B_^_ coagulans Glukose-Isomerase Enzymen
nach Kobalt vollständig befriedigt werden können, ohne dass im Laufe der Isomerisierung eine ergänzende Zugabe von Kobalt
erforderlich wäre. Tatsächlich ergab sich, dass durch Fortlassung von Go aus dem Glukosesirup die Produktivität des
Isomerisierungsprozesses und die Stabilität des Enzyms nicht beeinträchtigt, in einigen Fällen sogar verbessert wurde.
Wie bereits erwähnt wurde, hat sich auch herausgestellt, dass die biochemischen Erfordernisse des Glukose-Isomerase Enzyms
nach Magnesium viel niedriger liegen, als bisher angenommen wurde. Tatsächlich kann eine Zugabe von Mg++ überhaupt vermieden
werden, wenn die Konzentration von Ca++ niedrig ist.
Den Erfordernissen für die Aktivierung von Glukose-Isomerase hinsichtlich Mg++ wird vollauf bei einem pH 7,8 oder darüber
durch weniger als 10 ^ M Mg genügt.
Allerdings wirken Calciumionen in dem Sirup als Inhibitor
und zwar in einem stärkeren Masse als bisher angenommen wurde. Offensichtlich wirkt Mg++ in dem Sirup im wesentlichen
der Ga Inhibierung entgegen. Demnach gestattet ein niedriger Calciumgehalt in dem Sirup eine Verminderung des Magnesiumgehaltes.
Das Mg++/Ca++ Verhältnis im Sirup sollte über
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ί?:1 (bezogen auf molare Basis)., vorzugsweise über 10:1,
jedoch nicht über 500:1 liegen, Tails Mg+V 1O~% liegt.
Die Durchführung einer enzymatisehen Glukose-Isoinerisierungsreaktion
oberhalb eines pH-Werts von etwa pH 8,0 läuft allerdings den üblichen Praktiken der Isomerisierung bei einem
pH unterhalb etwa 8,0 zur Reduzierung der Verfärbung entgegen. Die Entfärbung des Produktsirups, beispielsweise-durch Behandlung
mit aktivierter Kohle, erhöht die Verfahrenskosten. Eine Verminderung der Verfärbung erscheint deshalb wünschenswert.
Leider nimmt jedoch die Geschwindigkeit bzw. Intensität der Verfärbung in dem Glukosesirup mit steigendem pH zu.
Untersuchungen der Neigung zur Verfärbung zeigten, dass die Farbbildung bei allen pH-Werten in irgendeiner Funktion zur
Zeit steht. Hieraus folgt, dass der höheren Verfärbungsgeschwindigkeit bei pH 8,0+dadurch entgegengewirkt werden kann,
dass die Isomerisierung schneller durchgeführt wird. Die Begrenzung der gesamten Verweil- bzw. Kontaktzeit des Glukosesirups
in dem Reaktor für die enzymatische Konversion auf etwa 5»5 Stunden ergibt einen Produktsirup von akzeptabler
Farbe. Wird die Kontaktzeit auf weniger als Stunde gesenkt, dann ist eine Aufhellungsbehandlung des Sirups nicht erforderlich,
wobei die Anwesenheit von Psicose und anderen Nebenprodukten selbst bei einer DünnschichtChromatographie (Sven
Ige Hansen, TLG Methode für die Identifizierung von Mono-Di-
und Trisacchariden, Journal of Chromatography, im Druck)
überhaupt nicht mehr festgestellt werden kann. Die Anwendung der Erfindung bietet folgende Möglichkeiten bzw. Vorteile:
1.) Kein Go wird im Zusammenhang mit der Isomerisierung
zugegeben;
2.) kein Mg braucht im Zusammenhang mit der Isomerisierung zugesetzt zu werden;
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3.) eine Ionenaustauschbehandlung nach der Isomerisierung
zwecks Entfernung schädlicher Ionen ist nicht erforderlich;
4.) das Enzym zeigt eine ausgezeichnete Thermostabilität;
5.) die Produktivität des Prozesses wird verbessert;
6.) der Prozess ist für eine kontinuierliche Säulenoperation gut geeignet; der Druckabfall pro Längeneinheit
der Säule ist niedrig.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht also in der Durchführung
einer Isoaierisiei'ungsbehandlung von Glukose sirup in
kontinuierlicher Arbeitsweise mit einem Sirupeinlass-pH im Bereich von 7>8 - 8,6 und mit einer Kontaktzeit von weniger
als etwa 3>5 Stunden, vorzugsweise weniger als 2 Stunden. Hierbei wird ein Glukosesirup mit einem Glukosegehalt von
30 - 55 Gew.-% in einen Produktsirup umgewandelt, dessen
Fruktoseniveau bei wenigstens 40%, normalerweise etwa 4-5%
liegt. Die Konversionstemperaturen liegen zwischen 60 und 85°C, vorzugsweise 60 bis 700C. Der pH-Bereich von 7»8 - 8,6
in dem eingesetzten Sirup wird durch Zugabe von Alkali (NaOH oder NapGO^) eingestellt. Falls erforderlich findet an
bestimmten Stellen in dem Konversionsreaktor eine erneute Einstellung statt. Der pH-Wert des isomerisierten Austragssirups
ist niedriger als der pH-Wert des Einlassirups. Der pH-Unterschied zwischen dem Einlass und Austrag liegt zwischen
0,2 und 0,6. Die pH-Kontrolle ist für die Durchführung der Erfindung wesentlich. Liegt der pH zu hoch, beispielsweise
über etwa 8,6, dann findet bei längerer Kontaktzeit eine unerwünschte Verfärbung statt. Ist der pH-Wert zu
niedrig, beispielsweise unter 7>6) ist die Zugabe von Co+"1"
für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität erforderlich. Ausser diesen beiden Erscheinungen muss die Änderung der
Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH berücksichtigt werden.
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Das pH-Optimum für das Β_^_ coagularis Enzym liegt um 8,5. Ein
industriell durchgeführtes diskontinuerlich.es bzw. batch-Verfahren
wird normalerweise wegen der Anwendung verhältnismässig niedriger Enzymkonzentrationen bei verlängerten Kontaktzeiten
durchgeführt. Aus diesem Grunde muss der pH niedrig gehalten werden, um eine Farbbildung zu vermeiden und die Enzymaktivität
bei einem solchen pH ist wesentlich niedriger als bei dem optimalen pH. Go++ Zugabe ist erforderlich. Bei einem
kontinuierlichen Verfahren entsprechend der Erfindung kann die Kontaktzeit niedrig und der pH hoch gehalten werden. Die Isomerisierung
kann bei oder in der Nähe des für das Enzym optimalen pH stattfinden. Co++ kann vermieden werden. Demnach
weist das erfindungsgemässe kontinuierliche Verfahren verschiedene Vorteile gegenüber einem batch-Verfahren auf.
Die Menge von Mg , welche dem eingesetzten Sirup zugegeben
-2
wird, liegt, unterhalb etwa 10 M, vorzugsweise unterhalb
wird, liegt, unterhalb etwa 10 M, vorzugsweise unterhalb
—1\ ++
5 x 10 M. Um jedoch ein niedriges Mg -Niveau zu ermöglichen,
muss der Calciumgehalt in dem eingesetzten Sirup auf unterhalb etwa 10 M eingestellt werden, was durch Verwendung von Wasser
mit niedrigem Calciumgehalt für die Herstellung des Sirups oder durch eine geeignete Vorbehandlung de3 Glukosesirups für
die Begrenzung des Galciumgehalts auf unterhalb 2,^x 10"-5M
möglich ist. Ist Calcium zugegen, muss in jedem Falle genügend Magnesium dem Sirup für einen Uher-Ausgleich des in ihm vorhandenen
Calciumgehaltes zugegeben werden und zwar so viel, dass ein Molarverhältnis von Mg++/Ca++ von mehr als 5:1>
vorzugsweise von mehr als 10:1 erreicht wird.
Insgesamt wird der Gehalt von Mg++ und Ca++, falls erforderlich,
durch eine Ionenaustausch-Entfernung von Ca++ aus dem
Glukosesirup eingestellt und in Beziehung zueinander gebracht, um mehr als 10"% Ca++ und 10"2M Mg++ zu vermeiden. Falls der
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Glukosesirup eine niedrigere Konzentration an Ga enthält,
kann die Menge an zugesetztem Mg++ in einem entsprechenden
Verhältnis so verringert werden, dass Mg++:Ca++ in dem
Intervall 5-5OO bei Mg++>
10"^M verbleibt und höher als 5
++ — 3
bei Mg <i 10 "Ή liegt. Demnach enthält der Sirup bei einer
bei Mg <i 10 "Ή liegt. Demnach enthält der Sirup bei einer
vorzugsweisen Ausfuhrungsform der Erfindung weniger als
2,5 χ 10"^M Ca++ und 5 χ 10"4M Mg++.
In der Praxis wird die Erfindung bei GlukoseSirupen angewandt,
die aus einem Stärkehydrolysat gewonnen wurden.Im allgemeinen beginnt die Herstellung des Sirups mit der
Suspendierung der Stärke in Leitungswasser von einiger Härte, so dass einiges an Ca++ anwesend ist.
Die Stärkehydrolyse und die Verzuckerung des Stärkehydrolysats
wird oft auf enzymatischem Wege durchgeführt, wobei Ga aktivierte Enzyme eingesetzt werden. Deshalb liegt im allgemeinen
Ga in den GlukoseSirupen vor (ausser wennder Sirup
im Laboratorium unmittelbar aus kristalliner Dextrose mit deionisiertem Wasser hergestellt wurde), so dass zu beachten
ist, dass der Ca++ Gehalt nicht oberhalb 10"% Ca++ liegt.
Bei dem kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren nach der Erfindung wird die Teilchengrösse der Enzymaufbereitung durch
die Bedingungen (und die Vorrichtung) für die Sirupbehandlung bestimmt. Bei einem Säulenverfahren, dem bei der Durchführung
der Erfindung der Vorzug gegeben wird, werden bevorzugt Teilchen mit mehr als etwa 100 Mikron eingesetzt (weil andernfalls
die Säule zur Verstopfung mit kleineren Partikeln neigt), Niedrig-Bettverfahren (z.B. die Isomerisierung auf einem
Filterpressenreaktor) gestatten den Einsatz jeder Partikelgrösse. Da jedoch die Einheitsaktivität der Enzymaufbereitung
in irgendeiner Weise von der Partikelgrösse abhängt,
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kann die für den Isomerisierungsprozess angewandte Partikelgrösse
einen Faktor für die Wirksamkeit eines bestimmten Verfahrens (oder Vorrichtung) darstellen. Jeüenfalls können
die Enzymaufbereitungen, die in der belgischen Patentschrift 832 852 beschrieben sind, in der gewünschten Partikelgrösse
erhalten werden.
Zum weiteren Verständnis der Erfindung wird auf die nachfolgenden Ausführungsbeispiele Bezug genommen, in denen die
Aktivität des immobilisierten Enzyms in IGIS Einheiten (immobilisierte Glukoseisomerase-Säulenverfahren) gemessen
wird. 1 IGIS wird definiert als die Enzymmenge, welche Glukose zu Fruktose mit einer Anfangsgeschwindigkeit von
1/u/mol/min. unter Standardbedingungen konvertiert, die durch
40 Gew.-% Glukose, pH 8,5 im Einlass, 65°G, 4 χ 10"5M Mg++
und Abwesenheit von Ga+ , sowie einer kontinuierlich gepackten
Bettsäule mit einer Säulengrösse von 2,5cm χ 40cm bestimmt sind.
In den Beispielen wird die Produktivität des Enzyms in einer bestimmten Zeit (Stunden) als die in Kilogramm ausgedrückte
Glukosemenge definiert, die zu einer Mischung von Fruktose und Glukose mit einem Konvertierungsgrad von 0,45 pro kg
Enzym von einer Anfangsaktivität von 100 IGIS/g konvertiert werden kann.
Die eingesetzten Enzymaufbereitungen besassen eine Aktivität zwischen 150 und 250 IGIS pro g. Um die mit Enzymaufbereitungen
verschiedener Aktivität erzielten Ergebnisse zu vergleichen, wurden die Produktivitätswerte auf eine Enzymaktivität
von 100 IGIS/g umgerechnet. In den Beispielen bezieht sich die Kontaktzeit auf eine Enzymaufbereitung mit
einer Aktivität von 100 IGIS/g. So entspricht beispielsweise
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eine Kontaktzeit von 1 Stunde mit einer eine Aktivität von 200 IGIS/g aufweisenden Enzymaufbereitung einer Kontaktzeit
von 2 Stunden bei einer Standardaufbereitung mit einer Aktivität von 100 IGIS/g.
Sämtliche Isomerisierungen wurden als kontinuierliche i'liessreaktionen
auf dichter bzw. kompakter Bettfüllung durchgeführt. Das B^ coagulans Enzym wurde entsprechend Beispiel 2 der
belgischen Patentschrift 832 852 hergestellt. Die Partikelgrösse variierte zwischen 150/U. und 2800/U. Die Enzymaufbereitung
wurde vorher in einem Glukosesirup mit einem Glukosegehalt von 40 Gew-% bei Raumtemperatur während einer Stunde
eingeweicht. Hiernach wurde die eingeweichte Glukose-Isomerase
in verschiedene Säulen mit Wasserummantelung gepackt.
Ein Glukosesirup-Strom mit der Konzentration, dem pH und den anderen in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Parametern
wurde in Aufwärtsrichtung durch das Enzymmaterial durchgesetzt. Die Fliessgeschwindigkeit wurde so eingestellt,
dass in dem Austragssirup eine 45%-ige Konversion vorlag.
Die lineare Fliessgeschwindigkeit lag immer oberhalb 10cm/h (Film-Diffusionsgrenze). Die Ca++ Konzentration in
diesem Beispiel lag unter 2,5 x 10""-3M.
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Temp.,0G | Tabelle | 1A | Go i. |
+-t M |
-Zugabe | Mg i. |
M | -Zugabe | |
Versuch | 60 | Glukose- Konz.i.Gew-% |
pH im Eintrag |
0 | .8 | X | 10"3 | ||
I | 60 | 40% | 8,5 | 3, | 5 | χ 10 | 8 | X | 10"5 |
II | 65 | .40% | 8,5 | 0 | 8 | X | 10"5 | ||
III | 65 | 40% | 8,5 | 3, | 5 | χ 10 | 8 | X | 10"5 |
IV | 65 | 40% | 8,5 | 0 | 8 | X | 10~5 | ||
V | 65 | 40% | 7,6 | 3, | 5 | χ 10~ | 8 | X | 10"^ |
VI | 40% | 7,6 | |||||||
Es wurden Säulen verschiedener Grossen eingesetzt, nämlich von
1,5cm χ 35cm und 5,8cm χ 45cm, wobei das zuerst angegebene Mass
den Durchmesser und das andere Mass die Höhe der Säule angibt. Der Einfachheit halber werden die Säulen nachstehend kurz 60 ml
bzw. 1 1 Säulen angegeben. 9 g Enzym wurden in die 60 ml Säule und 225 g Enzym in die 1 1 Säule gepackt.
Alle Isomerisierungen wurden während 450 Stunden durchgeführt.
Hiernach wurde die Restaktivität bestimmt und die Produktivität pro 100 IGIS/g und die Kontaktzeit pro 100 IGIS/g errechnet. Die
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
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Versuch
Produktivität
Produktivität
II
III
IV
:§ pro 100 IGIS/g 340
315
420
375
395
_VI 410
60ml Restaktivität | 65% | 60% | 52% | 42% | 28% | 41% |
Kontaktzeit pro 100 IGIS/g min |
90-140 | 90-150 | 75-145 | 75-180 | 75-270 | /£-185 |
Produktivität pro 100 IGIS/g |
350 | 320 | 440 | 370 | 400 | 415 |
1 1 Restaktivität | 69% | 59% | 60% | 45% | 44% | 46% |
Kontaktzeit pro 100 IGIS/g min |
90-130 | 90-155 | 75-125 | 75-170 | 75-170. | 75-17C |
Wo in der vorstehenden Tabelle (entsprechendes gil für die nachfolgenden
Tabellen) mehr als ein Wert für die Kontaktzeit angegeben ist, entspricht die erste Zahl dem Anfang des Versuches mit
hoher Aktivität und die letzte Zahl dem Ende des Versuches mit einer etwas niedrigeren Aktivität.
Aus der obigen Tabelle können nachstehende Folgerungen gezogen werden:
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- Λ6 -
1.) Die Produktivität pro 100 IGIS/g und die Reataktivität ist
ohne Go besser als mit Go, wenn der pH au!" dem vorgeschlagenen
Niveau gehalten wird.
2.) Liegt der pH unterhalt) des vorgeschlagenen Niveaus sind die Produktivität pro 100 IGIS/g und die ßestaktivität
mit Go besser al3 ohne Co, jedoch sind die Werte mit Go kleiner als die ohne Co erhaltenen Werte, wenn der pH
innerhalb des vorgeschlagenen Bereichs liegt.
Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt.
Folgende Parameter wurden während der Versuchsserien konstant gehalten:
Glukose-Konz. | 40 Gew.-% |
pH im Eintrag | 8,5 |
Co+"1- Zugabe | keine |
Ca -Konz. | weniger als 2,5 x |
Temperatur | 650G |
Ma gne s i um ζ ugab e | variiert von O - |
0 M
Nach einer Isomerisierungszeit von 450 Stunden wurden die Versuche
unterbrochen. Die Restaktivität wurde bestimmt und die Produktivität pro 100 IGIS/g und die Kontaktzeit pro 100 IGIS/g
wurden errechnet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
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Zugabe, N
Versuch 04x1Q"4 8x10 ^ 4x10~^ 8x1Q
1^ Produktivität
$ pro 100 IGIS/g 400 419 4-24 415 4-20
60 ml fiestaktivität 50% 50% 50% 48% 52%
Kontaktzeit min
pro 100 IGIS/g 75-150 75-150 75-150 75-155 75-1^5
Produktivität
pro 100 IGIS/g 410 435 4-35 4-50 440
1 1 Restaktivität 58% 60% 62% 62% 60%
Kontaktzeit min
pro 100 IGIS/g 75-130 75-125 75-125 72-125 78-125
Aus der Tabelle geht hervor j dass die Zugabe von. Mg++ die Produktivität
pro 100 IGIS/g oder die fiestaktivität nicht beeinflusst.
Isomerisierung mit unterschiedlichen Verhältnissen zwischen ++ und Ga++
Die Isomerisierungen wurden nach der im Beispiel 1 gegebenen
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Beschreibung durchgeführt, i'ünf 60 ml Säulen wurden gleichzeitig
benutzt, eine mit konstanter Mg -Zugabe zu dem eingesetzten Sirup und ohne Ga , und die anderen mit unterschiedlichen Verhältnissen zwischen Mg++ und Ca+f im Glukosesirup.
Folgende Parameter wurden angewandt:
40 Gew.-% Glukose-Konz. (40 Gew.-%)
pH 8,4 im Eintrag (8,4)
650G Temperatur (65°G)
0 M Go++-Zugabe (0 M Go)
variierende Mg++-Zugabe (4 χ 10~% Mg++)
variierende Ga -Zugabe weniger als 2,5 x 10/M
Die Aktivität in der Kontrollsäule (ohne Ga) wurde mit den in den Klammern stehenden Parametern gemessen. Nach 800 Stunden
war die Enzymaktivität in der Kontrollsäule auf 25% der Anfangsaktivität gesunken. Die in der nachfolgenden Tabelle
angegebenen Werte geben die prozentualen Aktivitäten in Bezug auf die Enzymaktivität der Kontrollsäule nach entsprechender
Stundenzahl wieder.
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100 | Std. | Tabelle 3 | Std. | ME -4 2 Ca ^'^ |
Std. | 100 | |
Std. | 94 | 1 | Ca =2'8 | 1 | 100 | 1 | 100 |
1 | 56 | 20 | 100 | 20 | 99 | .20 | 100 |
20 | 60 | 40 | 96 | 60 | 96 | 100 | 89 |
45 | 52 | 60 | 96 | 120 | 89 | 200 | 92 |
70 | 52 | 90 | 94 | 180 | 84 | 240 | 83 |
100 | 120 | 86 | 240 | 81 | 300 | 78 | |
120 | 2=^100 Std. | 135 | 79 | 420 | t 1/2>i000Std | ||
80 | t 1/2=^800 Std. | ||||||
t 1/ | t 1/2=~300 Std. | ||||||
Die oben angegebenen Werte zeigen, dass das Mg /Ca Verhältnis für die Lebensdauer des Enzyms von Bedeutung ist; das Verhältnis
sollte 5 und vorzugsweise 10 überschreiten.
Isomerisierungs-ÄbhänKiKkeit von der Glukosekonzentration in
dem Eintragssirup
Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Folgende Parameter wurden angewendet:
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Glukose-Konz. variierend zwischen 40 u. 50 Gew-%
pH i. Eintrag 8,4
Temperatur 65 0
Co li ich Lu
Mg 0,004 M
Ga weniger als 2,5 x 10"^M
In der nachfolgenden Tabelle sind die Produktivität, die .Restaktivität
und die Kontaktzeit für eine 450-stündige Versuchsdurchführung in 60 ml Säulen angegeben.
Produktivität/100 IGIS/g 430 410 $80
Restaktivität 48% 50% 50%
Kontaktzeit min/100ElS/g 75-150 85-170 95-190
Der Einfluss des pH auf die Aktivität der nach Beispiel 2
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des belgischen Patents 832 852 hergestellten Glukose-Isoiaerase
wurde in einer kontinuierlich betriebenen Fliessäule mit den Abmessungen 2,5cffl x 35cm bestimmt. Die Isomerisierung wurde wie
in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Jede Aktivitätsmessung erfolgte in der nachfolgenden Weise. Dabei wurden 5 Stunden
vorgegeben, damit sich in der Säule das Gleichgewicht einstellt, bevor die Aktivität gemessen wurde. Dann wurde der pH des Eintrags
auf den nächsten Wert geändert, wonach die Säule während weiterer 5 Stunden usw. betrieben wurde. Folgende Parameter
wurden angewandt:
Glukose-Konz. | 40# | zwischen | 5,0 |
pH | variierend | ||
Temperatur | 65°G | ||
Go | nichts | ||
Mg | 0,004 M | 2,5 χ 10 | -5M |
Ga | weniger als | ||
Kontaktzeit | 50 min. | ||
- 9,5
Die relativen prozentualen Aktivitäten ergeben sich aus der nachfolgenden Tabelle, wobei die maximale Aktivität bei 8,5
mit 100 definiert ist:
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 % Aktivität 5 15 45 60 70 85 95 100 95 90
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Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer nach Beispiel 2 der belgischen Patentschrift
832 852 erhaltenen Glukose-Isomerase durchgeführt. Es wurden
sieben Säulen isothermisch bei verschiedenen Temperaturen zwischen 60 und 900C betrieben. Die Anfangsaktivität wurde
ebenso wie die Halbwerts-Lebenszeit, also die Zeit, nach der
die Aktivität auf 50% der Anfangsaktivität abgenommen hat,
bestimmt. Folgende Parameter wurden angewandt:
Glukose-Konz. | 40 Gew-% |
pH | 8,5 |
Temperatur | variabel |
Co | nichts |
Mg | 0,004 M |
Ca | weniger als 2,5 χ 10""-5M |
Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Kontaktzeit(min)
Temp. | % Aktivität Stabilität(Halbwertszeit) pro 100 IGIS/k | 600 Stunden | 90-180 |
600C | 25% | 4-50 Stunden | 75-150 |
65 | 30% | 250 Stunden | 55-110 |
70 | 4-0% | 125 Stunden | 40-80 |
75 | 55% | 60 Stunden | 30-60 |
80 | 70% | 10 Stunden | 25-50 |
85 | 90% | 2 Stunden | 23-45 |
90 | 100% |
6 0 9839/0928
Mit Ausnahme der Enzymaufbereitungen wurde bei den Isomerisierungen
wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren. Im vorliegenden Falle wurden zwei Enzymaufbereitungen eingesetzt,
nämlich die immobilisierten Glukose-Isomerase-Aufbereitungen wie sie in den Beispielen 2 und 3, letzte Alternative, des
belgischen Patents 832 852 beschrieben und mit X bzw. I bezeichnet
sind.
Bevor die Enzymaufbereitungen in die Säulen gepackt wurden, wurden beide klassifiziert. Folgende Parameter wurden angewandt
:
Glukose-Konz. | 40 Gew-% |
pH | 8,0 |
Temperatur | 65°C |
Co | nichts |
Mg | 0,004 M |
Ca | weniger als 2,5 x 10""-3M |
Der Einfluss der Partikelgrösse auf die Aktivität der Aufbereitungen
X und Ϊ ergibt sich aus der nachfolgenden Tabelle:
609839/0 9
Glukose-lsomerase-Aufbereitungen X
Teilchengrösse-Verteilung % Aktivität
150-297/U 100%
297-500/U 98%
500-1OOOyU 97%
1000-141OyU 94%
1410-200OyU 84%
2000-280OyU 80%
75-25OyU 100%
250-354yU 69%
354-50OyU 48%
5OO-7O7yu 39%
707-100OyU 34%
Es wurde gefunden, dass die Stabilität nicht nennenswert von der Partikelgrösse abhängt.Wie aus den vorstehenden Zahlen
hervorgeht wird die Aktivität einiger Aufbereitungen von der Partikelgrösse in stärkerem Masse beeinflusst als es bei
anderen der Fall ist. Es kann keine vollständige Erklärung dafür gegeben werden, weshalb die Aktivität der Aufbereitungen
Z sehr viel weniger von der Partikelgrösse abhängig ist als die Aktivität der Aufbereitungen Y. Es wird jedoch angenommen,
dass diese Beobachtung irgendwie mit der Partikelform zusammenhängt. Es wurde festgestellt, dass die Aufbereitung X hauptsächlich
aus Plättchen, hingegen die Aufbereitung Y im wesent-
609839/0928
liehen aus Kügelchen bestellt. Bei einer gegebenen Partikelgrösse
ist die durchschnittliche Porenlänge in den Plättchen
wesentlich kleiner als bei den Kügelchen, was erklären könnte, dass die Aktivität bei der Aufbereitung Y kleiner ist als bei
derjenigen der Aufbereitung X.
Die Isomerisierungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Sechs Säulen wurden mit unterschiedlichen Enzymmengen gefüllt, um den Konversionsgrad und die Kontaktzeit auf 45%
bzw. 1 Stunde konstant zu halten. Folgende Parameter wurden angewandt:
Glukose-Konz. 45 Gew-%
pH 8,5
Temperatur variabel
Co++ nichts
Mg++ 8 χ 10"4M
Ca++ weniger als 2,5 χ 1O~%
Der Icumsa Color-Index erhöhte sich wie nachstehend für eine
Isomerisierungsdauer von etwa 100 Stunden angegeben:
609839/0 928
Tabelle 8 | ΙΟ5 χ a | |
Temperatur | Icumsa Color-Index | |
60°G | 24 | |
65°G | 25 | |
70°G | 26 | |
750G | 30 | |
800C | 39 | |
85°C | 65 | |
Icumsa Color = ' |
Td χ c
worin a = °^4?0 (optische Dichte)
b = DS in g/ml (Trockensubstanz) c = Länge der Messzelle in cm.
Mit Ausnahme der Enzymaufbereitung wurde die Isomerisierung wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt. Das Enzym wurde nach
Beispiel III, letzte Alternative des belgischen Patents 832 852 durchgeführt. Die Partikelgrösse lag zwischen 15Ο und
500/U. Die angewandten Parameter sind in der nachfolgenden
Tabelle angegeben:
609839/0 928
Säulengrösse
No. der Säulen
60 ml
Abmessungen, Höhe
in cm χ Durchmesser 35 x 1,5 in cm
1 1
45 x 5,8
188 χ
eingesetztes Enzym i.Gramm |
20 | 470 | 23OOO |
Temperatur isothermisch |
65°G | 65°G | 650C |
Glukose-Konz. | 40% | 40% | 40% |
pH i. Eintrag | 8,5 | 8,5 | 8,5 |
Mg Molar | 0,0008 | 0,0008 | 8 χ 10~4 |
Co | nichts | nichts | nichts |
Ca++ | weniger als 2,5 x 10"5M |
weniger als 2,5 χ 10"5M |
weniger als 2,5 x 10"5M |
Gesamtzeit der Isomerisierung in Std. 450
450
450
Folgende Ergebnisse wurden erzielt;
Säulengrösse | 60 ml |
Produktivität/100 IGIS/g |
440 |
ßestaktivität | 50% |
Kontaktzeit/100 IGIS/g (min) |
75-15' |
1 1
420 53%
75-150
455 60%
75-140
609839/0928
26Π9Β02 - 25 -
Aufgrund der obigen Werte scheint es, dass die Durchführung
der Isomerisierung in zunehmend grösserem Massstab ausgehend von der 60 ml Säule ohne Schwierigkeiten und mit im wesentlichen
denselben Werten für Produktivität und Restaktivitäten durchgeführt werden kann.
B09839/Ü928
Claims (8)
1. Kontinuierliches Verfahren zur Isomerisierung von
Glukosesirup zu einer Glukose/Fruktose-Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Glukosesirup mit einem
— 3 ++ Glukosegehalt von 30 - 55 Gew-%, der maximal.10 "TI Ga
—2 ++
und 10 M Mg enthält, wobei das molare Verhältnis
und 10 M Mg enthält, wobei das molare Verhältnis
Mg++:Ca++ zwischen 5 und 500 bei Mg++>10~% und mehr
als 5 bei Mg < 10 M beträgt, durch ein Bett aus vermittels Glutaraldehyd immobilisierter und von B^ coagulans
gewonnener Glukose-Isomerase-Teilchen mit einer Grosse von oberhalb etwa 100 Mikron bei einem Einlass-pH zwischen
7j8 - 8>6, bei Temperaturen zwischen 60 - 85 G
und bei einer Gesamtkontaktzeit von weniger als 3»5 Stunden
geschickt wird, wobei der Sirup mindestens bis zu 40 Gew.-fo i'ruktose bezogen auf den Gehalt an Glukose und
Pruktose isomerisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein von Go + freier Glukosesirup verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
der Ga +-Gehalt auf weniger als etwa 2,5 x 10"-5M und der
Mg -Gehalt auf weniger als 5 x 10 M eingestellt wird,
wobei der Mg++-Gehalt mindestens das 10-fache des Ca++-
Gehalts beträgt.
4-· Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das teilchenförmige Enzym in eine Säule eingefüllt wird.
609839/0928
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An-
.ti!- ' I
Sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die1Kontaktzeit auf
weniger als etwa 2 Stunden eingestellt wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Sirup mit einem Gehalt von 40 - 45 Gew-% Glukose verwendet wird.
7· Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Isomerisierung bei Temperaturen zwischen 60 und 70°C durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche
, dadurch gekennzeichnet, dass einEnzym von einem atypischen Stamm von B^_ coagulans verwendet wird, der lediglich
auf anorganischen Stickstoff enthaltendem Nährmedium Wachstum zeigt.
609839/0928
ORIGINAL INSPECTED
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