DE2832577A1 - Enzymatische mittel fuer die isomerisierung von glucose zu laevulose - Google Patents
Enzymatische mittel fuer die isomerisierung von glucose zu laevuloseInfo
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Description
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TEUiTOK (OKIt) ISO 20 Sl
TKi.iis Π 2·Ι 070
TKF.KCillAM M Π ϊ
I1Hf)TKCT]MTKNT
1A-51 159
Anmelder: RHÖNE-POULENC INDUSTRIES 22, Avenue Montaigne, 75 Paris
Frankreich
Titel: Enzymatische Mittel für die Isomerisierung von Glucose zu Lävulose
80988B/0901
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1A-51 159 Anm.: Rh6ne-Poulenc Ind,
Die Erfindung bezieht sich auf enzymatische Mittel auf der
Basis von Glucoseisomerase und ihre Verwendung für die Isomerisierung von Glucose zu Lävulose.
Die Verwendung von Glucoseisomerase für die Isomerisierung von Glucose zu Lävulose ist allgemein bekannt. Allgemein verwendet
man immobilisierte Glucoseisomerase, um in technischem Maßstabe gute Ergebnisse zu erzielen und vor allem um kontinuierlich
arbeiten zu können. Dieses Enzym wird von verschiedenen Mikroorganismen erzeugt. Man kann es entweder aus der
Nährlösung extrahieren und gegebenenfalls reinigen oder unmittelbar die aus der Nährlösung abgetrennten Zellen verwenden,
die das Enzym· enthalten; diese Verfahrensweise ist weniger umständlich.
Man hat bereits zahlreiche Verfahren untersucht, um Enzyme allgemein und Glucoseisomerase insbesondere zu immobilisieren.
Hierzu kann das Enzym auf mineralischen (anorganischen) Trägern absorbiert werden, beispielsweise auf Aktivkohle oder auf verschiedenen
Erdalkalicarbonaten oder Erdalkalioxiden. Gemäß der FR-PS 2 201 341 wird die Glucoseisomerase auf basischem MagnesiuiTicarbonat
absorbiert. Diese Verfahrensweise läßt sich aber nur auf extracelluläre Glucoseisomerase anwenden.
Es wurde weiterhin versucht, die Enzyme oder die Zellen, welche die Enzyme enthalten, mit semipermeablen polymeren Stoffen
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zu umhüllen, bzw. sie darin einzubetten, beispielsweise in Polyamide
oder Cellulosederivate. Die dabei erhaltenen Massen können dann zu Filmen, Folien, Fasern oder Teilchen (Granulat) verarbeitet
werden (FR-PSen 1 306 640, 2 016 102 und 2 169 105).
Es ist weiterhin bekannt, Zellen, welche das Enzym enthalten, in ausgeflockte Polyelektrolyte einzubetten (FR-PS 2 145 486)
und die mechanische Festigkeit der hierbei erhaltenen Massen durch Zugabe von mineralischen Magnesium-, Calcium-, Eisen-
und Manganverbindungen zu erhöhen (FR-PS 2 295 966).
erhält man mit Hilfe dieser verschiedenen Verfahren Mittel mit einer zufriedenstellenden Anfangs-Enzymaktivität oder mit
einer guten Abriebfestigkeit; diese Verfahren bringen aber nichts im Hinblick auf eine Verbesserung der Lebensdauer der
Präparate hinsichtlich der enzymatischen Aktivität. Diese Lebensdauer beträgt allgemein nicht mehr als 2 Wochen.
Andererseits weiß man, daß die üblicherweise verwendeten GIucoseisomerasen
nur dann gute Ergebnisse liefern, wenn in dem Sirup der Glucose, die isomerisiert werden soll, Magnesiumionen
sowie gegebenenfalls in geringer Menge Kobaltionen vorhanden sind. Dies bedeutet, daß der erhaltene Lävulosesirup mit Ionenaustauschern
entmineralisiert bzw. entsalzt werden muß, wodurch sich die Herstellungskosten für die Lävulose (Fruchtzucker,
Fructose) erhöhen.
Es wurde nun gefunden, daß man enzymatische Mittel auf der Basis
von intracellulärer Glucoseisomerase herstellen kann, die sich durch eine verlängerte Lebensdauer auszeichnen und bei
deren Verwendung nur wenig oder überhaupt keine Magnesiumionen im Glucosesirup*und auch keine Kobaltionen zum Glucosesirup
zugesetzt werden müssen, wenn man die Zellen von Mikroorganismen, die die Glucoseisomerase enthalten, in Plättchen oder
Fäden bzw. Fasern aus Celluloseestern einschließt, die als Füllstoff mindestens eine in Wasser wenig lösliche Magnesiumverbindung
sowie gegebenenfalls eine in Wasser wenig lösliche Kobaltverbindung enthalten.
* , , . 809886/0901
^vorhanden sein - 3 -
.f.
In Wasser wenig lösliche bzw. schwer lösliche Magnesiumverbindungen
im Sinne der Beschreibung sind solche Magnesiumverbindungen, die je Liter Wasser 1 mg bis höchstens 50 mg Magnesiumionen freisetzen.
In Wasser wenig lösliche bzw. schwer lösliche Kobaltverbindungen
im Sinne der Beschreibung sind solche Kobaltverbindungen, die je Liter Wasser 1 mg bis höchstens 20 mg Kobaltionen freisetzen,
oder abgeben.
Die Mikroorganismen, deren Zellen in den erfindungsgemäßen Mitteln
verwendet werden, sind solche Organismen, die eine Glucoseisomerase erzeugen, deren enzymatische Wirkung in Gegenwart von
Magnesiumionen und Kobaltionen manifest wird. Hierzu gehören beispielsweise Aerobacter cloacae, die Arthrobacter-Arten,
Bacillus coagulans, Lactobacillus brevis, Streptomyces sp. (echinates, flavovirens, achromogenes, albus, olivaceus, olivochromogenes,
violaceoniger, bikiniensis, venezuelae, etc.), Actinoplanes missouriensis usw).Bevorzugt wird der Mikroorganismus Streptomyces phaeochromogenes.
Zur Herstellung der Plättchen oder Fasern bzw. Fäden werden
vorzugsweise Cellulosediacetat und ein technisches Gemisch aus Cellulosediacetat und Triacetat verwendet, wie sie auch zur
Herstellung von Collodium eingesetzt werden.
Der Füllstoff auf Basis Magnesium wird vorzugsweise unter folgenden
Verbindungen ausgewählt: Magnesiumoxid, Magnesiumhydroxid, Magnesiumphosphat, basisches Magnesiumcarbonat oder deren Gemische,
beispielsweise technische Gemische wie Magnesiumhydroxycarbonat. Bevorzugt wird das dreibasische (neutrale) Magnesiumphosphat.
Als Füllstoff auf Basis Kobalt werden vorzugsweise Verbindungen des zweiwertigen Kobaltes verwendet wie Kobalt-II-hydroxid,
Kobalt-Il-carbonat, Kobalt-II-orthophosphat und/oder Kobalt-Il-oxalat.
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Diese Füllstoffe haben nicht nur die Aufgabe die Mittel zu beschweren,
sondern auch das Enzym zu adsorbieren und die ihm notwendigen Magnesium- und Kobaltionen zur Verfügung zu stellen.
Man kann als derartige Füllstoffe im Sinne von unlöslichen Magnesium-
und gegebenenfalls Kobaltverbindungen auch Katiorienaustauscherharze
verwenden mit Sulfonsäuregruppen, die mit Mg oder Mg + Co -Ionen abgesättigt sind, bei einer Temperatur
von etwa 50°C luftgetrocknet und dann zu Teilchen mit Durchmesser < 0,25 mm vermählen wurden o Derartige sulfonsaure Harze
werden in der Literatur vielfach beschrieben (lon exchange Technology F„C. Nachod. Jack Schubert Academic Press, New-York
1956).
Die erfindungsgemäßen enzymatischen Mittel setzen sich somit zusammen aus Zellen eines Mikroorganismus, welche die Glucoseisomerase
enthalten, einem Celluloseester und einem Füllstoff, in nachfolgend definierten Mengen bzw. Mengenverhältnissen.
Der Celluloseester kann, gerechnet als Feststoff, 25 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise etwa 50 Gew.-%, bezogen auf die getrockneten
Mikroorganismuszellen ausmachen»
Der ebenfalls als Feststoff (Trockenmasse) gerechnete Kill stoff
kann 5 bis 100 Gew.-#, vorzugsweise etwa 50 Gew.-jS ausmachen,
bezogen auf die getrockneten Zellen. Die Anteilsmengen der Magnesiumverbindung und der Kobaltverbindung im Füllstoff insgesamt
können im Bereich von 50 bis 100 Gew.-% und von 0 bis 50 Gew.-% der Gesamtcharge liegen.
Die maximalen Mengen an Charge (Füllstoff) und Celluloseester können die oben angegebenen Grenzen übersteigen, jedoch
dann zu Lasten der enzymatischen Aktivität des insgesamt erhaltenen Mittels. Wird andererseits zu wenig Ester verwendet,
so erhält man ein Produkt mit mangelnder Kohäsion, d.h. das schlecht zusammenhält.
Nachfolgend werden die bevorzugten Anteilsbereiche für Zellen von Mikroorganismen, Celluloseester und Charge bzw. Füllstoff
-γ-
angegeben. Die Gewichtsverhältnisse zwischen den verschiedenen Komponenten der enzymatisehen Mittel beziehen sich jeweils auf
den Feststoff bzw. die Trockenmasse:
40 bis 60 Gew.-% Zellen von Mikroorganismen 20 bis 30 Gew.-% Celluloseester
20 bis 30 Gew.-% Füllstoff in Form von 15 bis 20 Gew.-% Magnesiumverbindung
und 5 bis 10 Gew.-% Kobaltverbindung.
Die erfindungsgemäßen Mittel werden vorteilhafterweise folgendermaßen
hergestellt:
wurden
Die Zellen von dem Substrat, auf dem sie gewachsen sind, abzentrifugiert, nachdem man sie einer Wärmebehandlung unterworfen hat, durch die u.a. die Zellenmasse sterilisiert wurde und gewisse, andere unerwünschte Enzyme wie die Proteasen, die hitzeempfindlicher sind als Glucoseisomerase, zerstört wurden. Anschließend wird die erhaltene Aufschlämmung oder Suspension getrocknet, bis sie einen Feststoffgehalt von 20 bis 95 % (vorzugsweise etwa 30 %) aufweist.
Die Zellen von dem Substrat, auf dem sie gewachsen sind, abzentrifugiert, nachdem man sie einer Wärmebehandlung unterworfen hat, durch die u.a. die Zellenmasse sterilisiert wurde und gewisse, andere unerwünschte Enzyme wie die Proteasen, die hitzeempfindlicher sind als Glucoseisomerase, zerstört wurden. Anschließend wird die erhaltene Aufschlämmung oder Suspension getrocknet, bis sie einen Feststoffgehalt von 20 bis 95 % (vorzugsweise etwa 30 %) aufweist.
Diese Aufschlämmung wird mit dem Füllstoff aus Magnesiumverbindung
und gegebenenfalls Kobaltverbindung vermischt, wobei die Anteilsmenge des Füllstoffes so berechnet wird, daß dieser 5
bis 100 %, vorzugsweise 50 % des Gesamtgewichtes der Zellen
ausmacht.
Zu dem erhaltenen Gemisch wird der Celluloseester gegeben, beispielsweise das· oben erwähnte technische Gemisch aus Cellulosedi-
und -triacetat und zwar in einem Verhältnis von 25 bis 100 %, vorzugsweise etwa 50 %, bezogen auf das Gewicht der
trockenen Zellen, sowie in Form eines 5 bis 20 %igen, vorzugsweise
etwa 10 %igen Sols in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise in Aceton.
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Zu diesem Celluloseester enthaltenden Gemisch wird nun ein Gemisch
aus Wasser und Lösungsmittel gegeben, wie es zur Herstellung des Celluloseestersols verwendet wurde, um den Endgemisch
die für die Formgebung gewünschte oder notwendige Konsistenz zu verleihen. Die Lösungsmittelmenge, die zugesetzt wird, kann
das ein- bis zehnfache des Gewichtes der eingesetzten trocknen Zellen ausmachen.
Das zuvor mit dem Lösungsmittel vermischte Wasser macht soviel aus, daß unter Berücksichtigung der Feuchtigkeit bzw. des Wassergehaltes
der Zellen das im Endgemisch enthaltene Wasser das 0,6 bis 8-fache, vorzugsweise etwa das 3-fache des Gewichtes
des eingesetzten Celluloseester ausmacht. Außerdem nuß das Gewichtsverhältnis
von Wasser zu Lösungsmittel im Endgemisch < 0,2 sein.
Diese Grenzen für die Anteilsmengen an Wasser, Lösungsmittel und Celluloseester bedingen die Eigenschaften des Endproduktes:
mit zu wenig Wasser wird ein zu wenig poröses Gefüge erhalten und infolgedessen eine schlechte Austauscherkapazität; mit zu
viel Wasser oder zu wenig Lösungsmittel weist das Endprodukt nicht die ausreichende Kohäsion auf und hält das Enzym schlecht
zurück.
Die oben aufgeführte Reihenfolge der Arbeitsschritte muß nicht unbedingt eingehalten werden; die kann nach Bedarf zur Erleichterung
der Fabrikation abgeändert werden.
Wenn, wie dies häufig der Fall ist, bei der Herstellung der enzymhaltigen Zellen die Zellwände stark durchlässig geworden
sind für das Enzym (je nach den angewandten Bedingungen der Züchtung des Mikroorganismus, der nachfolgenden Wärmebehandlung
oder Abtrennung ) werden die Zellen vorzugsweise einer leichten Behandlung mit Glutaraldehyd unterworfen. Diese Behandlung
kann am Ende der Züchtung bzw. Wachsturnsstufe erfolgen
oder mit der Zellenaufschlämmung vorgenommen werden, vorzugsweise
bereits in Gegenwart des Celluloseester, Jedoch vor Einbringen der Charge bzw. der Füllstoffe (diese werden
dann zuletzt zugegeben); die Behandlung kann jedoch auch,
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wie weiter unten gezeigt, noch nach der Formgebung des Gemisches vorgenommen werden. Werden die Zellen oder die Aufschlämmung
aus Zellen und Ester mit Glutaraldehyd behandelt, so werden hierzu 0,5 bis 6 %, vorzugsweise etwa 3 % Glutaraldehyd eingesetzt,
bezogen auf das Trockengewicht der Zellen. Vorzugsweise sollen die Zellen innig mit dem Glutaraldehyd gemischt werden
und etwa 10 min bis zu 1 h bei 10 bis 300C reagieren.
Schließlich enthält die fließfähige Paste, die gegebenenfalls mit Hilfe eines Propeller- oder Turbinenrührers homogenisiert
worden ist, die Zellen, den Füllstoff, den Celluloseester, Wasser,
Lösungsmittel sowie gegebenenfalls Glutaraldehyd.
Diese Paste kann in dünner Schicht (1 bis 3 mm Stärke) ausgebreitet
und bei einer Temperatur von 15 bis 300C an der Luft
getrocknet werden. Nach etwa 1 h, wenn die Folie noch nicht
brüchig ist, kann man sie in kleine Stücke von ehigen mm Kantenlänge
zerschneiden. Nach dem Ablösen der Paste (von der Unterlage) wird weiter getrocknet und darauf geachtet, daß
die Brüchig-Phase nicht erreicht wird.
Falls gewünscht, kann in diesem Stadium der Herstellung die
Glutaraldehydbehandlung vorgenommen werden, mittels Eintauchen in eine wäßrige Lösung dieses Stoffes.
Darauf kann das erhaltene Produkt zum Isomerisieren von Glucoselösungen
eingesetzt werden.
Die Herstellung der Plättchen aus Celluloseester beladen bzw. gefüllt-mit Magnesium- und Kobaltverbindungen, die zudem die
Glucoseisomerase in intracellulärer Form enthalten (d.h. eingeschlossen in Zellen) wie oben beschrieben, stellt eine bevorzugte
Ausführungsform der Erfindung dar. Man kann aber die wie oben erhaltene Paste auch auf beliebig geeignete andere
Weise verformen, insbesondere mittels Strangpressen oder Extrudieren, wenn Fäden oder Fasern anstelle von Plättchen erwünscht
sind. Die Fasern oder Fäden werden bevor sie gege-
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benenfalls durch und durch getrocknet werden, unmittelbar nach
dem Strangpressen an der Oberfläche koaguliert, entweder mit einem Heißluftstrom oder durch Eintauchen in Wasser während
einiger Minuten. Die Plättchen und die Filamente können entweder trocken aufbewahrt werden oder suspendiert in einer Flüssigkeit,
vorzugsweise in Wasser, dem ein geeignetes Antiseptikum (Konservierungsmittel) beispielsweise Formol bzw. Formaldehyd
zugesetzt worden ist.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Plättchen und Filamente zeichnen
sich durch zahlreiche Vorteile aus, vor allem dadurch, daß sie für kontinuierliche Anwendung in einer Kolonne geeignet sind.
Die mechanische Festigkeit der erfindungsgemäßen Produkte ist ausgezeichnet, selbst nach sehr langer Gebrauchszeit. Der Druckabfall
beim Durchgang der Lösung, welche isomerisiert werden soll, durch die Kolonne ist sehr gering und in der Zeit beständig.
Die Lebensdauer dieser Präparate ist sehr gut. Die Halbwertszeit bezüglich der Aktivität, d.h. die Zeitspanne, nach der
die Aktivität des Präparates, um die Hälfte abgenommen hat, übersteigt
leicht 1000 h. Außerdem erfolgt der Aktivitätsverlust außerordentlich allmählich und regelmäßig.
Die mittlere.Geschwindigkeit für die Produktion an Lävulose
,je Gewichtseinheit ist gut.
Den Lösungen, die isomerisiert werden sollen, brauchen keine Magnesium- oder Kobaltionen in Form löslicher Salze zugegeben
werden; das als Charge bzw. Füllstoff zugegebene Magnesium und Kobalt reicht aus, um das Enzym zu aktivieren. Es können jedoch
in einigen Fällen den Lösungen, die isomerisiert werden sollen,
zusätzlich noch bis zu 10 mg Magnesiumionen je 1 Lösung zugesetzt werden. Auf jeden Fall übersteigt die Menge der Magnesiumionen
in dem erhaltenen Lävulosesirup nicht den Wert von 10 mg/1,
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" · 43;
was im Hinblick auf Lebensmittelreinheit vollkommen zulässig ist. Der Kobaltgehalt macht maximal 1 mg/l aus. Infolge dieser
sehr geringen Gehalte oder Konzentrationen an Magnesium- und
Kobaltiorien brauchen keine langwierigen und kostspieligen Reinigungsmaßnahmen
vorgenommen zu werden; der isomerisierte Sirup ist außerdem frei von Verunreinigungen oder Begleitstoffen.
Die erfindungsgemäß hergestellten Präparate für die Isomerisierung
von Glucose können folgendermaßen verwendet werden:
Die einzelnen enzyraatischen Mittel, Plättchen oder sehr kurze
Fäden bzwο Fasern, werden in ein senkrechtes Zylinderrohr gegeben,
beispielsweise ,aus Glas, das mit einem Mantel umgeben ist und durch umlaufendes Wasser bei einer Temperatur von 50
bis 750C, vorzugsweise etwa 60°C gehalten wird. In dieses Zylinderrohr
bzw. diese Säule wird vorzugsweise von oben eine wäßrige Glucoselösung gegeben, deren Konzentration 60 Gew.-% nicht übersteigt
und vorzugsweise bei etwa 45 Gew.-?6 liegt. Die enzymatischen Mittel werden von dieser Flüssigkeit bedeckt. Zuvor wird
der pH-Wert der zugespeisten Lösung auf 8 bis 9» vorzugsweise etwa 8,5 eingestellt, beispielsweise mit Natronlauge. Vorteilhafterweise
wird die Zulaufgeschwindigkeit so eingestellt, daß ein während des gesamten Arbeitsganges konstanter Umwandlungsgrad der Glucose erzielt wird. Eine gute Rentabilität wird erreicht, wenn dieser Umwandlungsgrad allgemein im Bereich von
40 bis 50 %, vorzugsweise bei etwa 42 % liegt. Dies bedeutet,
da3 die Zulaufgeschwindigkeit allmählich gedrosselt wird, in dem Maße, in dem die Aktivität des Mittels abnimmt.
Wie bereits angegeben ist es unnütz, die einzuspeisende Glucoselösung
mit Kobaltionen zu versetzen und Magnesiumionen brauchen nicht zugegeben werden, jedoch kann ein Zusatz bis zu 10mg/l
Lösung wünschenswert sein·. Die austretende Lösung enthält allgemein 2 bis 10 mg/1 Magnesiumionen und niemals mehr als 1 mg/l
Kobaltionen.
- 10 80988 6/0901
Es ist auch nicht notwendig, im Verlauf des Arbeitsganges den pH-Wert erneut einzustellen» Der pH-Wert der austretenden Lösung
liegt bei etwa 7f5.
In den austretenden isomerisierten Lösungen beobachtet man keine anormale Färbung oder Verfärbung, außer innerhalb der ersten
Betriebsstunden. Um dies zu beheben, kann während dieser aller-
die
ersten Betriebsstunde Einspeisungsgeschwindigkeit der Glucoselösung erhöht werden^ so daß die Kolonne oder Säule damit gewaschen wird. Bei normalem Betrieb bleibt die Zunahme der Verfärbung der Lösung zwischen Eintritt und Austritt aus der Säule unterhalb 20 APHA (ASTM D 1209-54).
ersten Betriebsstunde Einspeisungsgeschwindigkeit der Glucoselösung erhöht werden^ so daß die Kolonne oder Säule damit gewaschen wird. Bei normalem Betrieb bleibt die Zunahme der Verfärbung der Lösung zwischen Eintritt und Austritt aus der Säule unterhalb 20 APHA (ASTM D 1209-54).
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Die entstandene Lävulose wurde quantitativ colorimetrisch mit Anthron bestimmt, mit Bezug auf Lösungen mit bekanntem
Gehalt (Halhool und Kleinbert - Analytical Biochemistry, 50, S. 337-343, 1972).
Die in E/g angegebene enzymatische Aktivität bezeichnet die Anzahl
Mikromole Lävulose, die in 1 Minute bei pH 7,5 und bei 600C entstanden sind.
Beispiel 1 ·
Es wurde eine Aufschlämmung mit 16 % Feststoff verwendet, die
beim Zentrifugieren des Inhaltes eines Produktionskessels für Streptomyces phaechromogenes erhalten worden war. Die Aktivität
der Zellen betrug 150 E/g Feststoff (Trockenmasse). Die Aufschlämmung wurde in einem belüfteten Trockenschrank bei 35 bis
400C stehengelassen, bis man eine Paste mit 30 % Feststoff erhielt.
52 g dieser Paste wurden mit 1,1 g Magnesiumhydroxycarbonat vermischt und dann mit 69 ml einer Lösung aus Cellulose in
Aceton (100 g/l) versetzt. Dann wurden 60 ml Aceton zugegeben und das ganze mit einem Propellerrührer (11 000 UpM) während
einiger Minuten homogenisiert. Die Aufschlämmung bzw. Paste wurde auf Glasplatten ausgebreitet in einer Schichtdicke von
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• AS-
2 bis 3 mm mit Hilfe der Vorrichtung zur Herstellung von Platten
für die Dünnscliichtchromatographie „ Nach 2stündigem Trocknen an
der Luft wurden die Schichten zu kleinen Plättchen mit Kantenlänge
3 bis 5 mm zerschnitten. Die Plättchen wurden von der Unterlage abgelöst und fertig getrocknet bis zu einem Feststoffgehalt
von 80 bis 90 %. Das fertige enzymatische Mittel setzte sich
wie folgt zusammen (die Prozentangaben beziehen sich auf den Feststoffgehalt):
66 % Zellen von Mikroorganismen
4,7 % Magnesiumhydroxycarbonat
29,3 % Celluloseacetat.
4,7 % Magnesiumhydroxycarbonat
29,3 % Celluloseacetat.
Die gemessene Aktivität dieser Plättchen betrug 52 E/g; dies entsprach einer Ausbeute bezüglich der Fixierung von etwa 50 %,
25 g dieses enzymatischen Mittels wurden in ein senkrechtes
zylindrisches Glasrohr mit Durchmesser 25 mm gegeben, das mit einem Mantel ausgestattet war, durch den Wasser von 60 bis 610C
umlief. Die so vorbereitete Säule wurde mit einer Glucoselösung, Konzentration 450 g/l gefüllt, bis das enzymatische Mittel vollständig
von der Lösung bedeckt war. Der pH-Wert der Glucoselösung wurde auf 8,5 bis 8,7 eingestellt mit Hilfe von Natronlauge.
Die Zulaufgeschwindigkeit wurde so einreguliert, daß der Umwändlungsgrad konstant bei 42 % blieb. Zu Beginn betrug die
Einspeisungsgeschwindigkeit bzw. -menge 65 ml/h. Nach 900 h wurde sie um die Halfte■verringert und nach 2200 h auf 1/4 des ursprünglichen
Betrages. Die mittlere Produktion an Lävulose betrug zu diesem Zeitpunkt 480kg/kg eingesetztes enzymatisches
Mittel.
Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesiumionen sank im Verlauf des Arbeitsganges von 10 auf 2 mg/l.
Der pH-Wert der austretenden Lösung betrug etwa 7,5.
- 1.2 809886/0901
Das mechanische Verhalten bzw. die mechanische Festigkeit des Mittels blieb unverändert und der Druckabfall lag unterhalb
1 cm Wasser/m.
Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt mit der Abwandlung, daß anstelle von Magnesiumhydroxycarbonat
2,2 g dreibasisches (neutrales) Magnesiumphosphat /Mg,(PO^)2*8H2O7 eingesetzt wurden und daß die verwendeten Zellen
eine doppelt so hohe enzymatische Aktivität Je Gewichtseinheit Feststoff aufwiesen wie in Beispiel 1. Das fertige enzymatische
Mittel setzte sich wie folgt zusammen (Proζentangaben bezogen
auf Feststoffgewicht):
63 % Zellen von Mikroorganismen · 9 % Magnesiumphosphat
28 % Cellulose.
28 % Cellulose.
Das Mittel wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung zu Beginn betrug 65 ml/h,
wurde nach 1300 h auf die Hälfte und nach 1700 h auf 1/4 verringert. Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesiumionen lag
in der gleichen Größenordnung v/ie im vorangegangenen Beispiel.
Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel 1 beschrieben
hergestellt mit der Abwandlung, daß als Füllstoff 1,1 g Magnesiumhydroxycarbonat
und 1,1 g Kobalt-II-carbonat (CoCO^) eingesetzt
wurden. Man erhielt ein enzymatisches Mittel folgender Zusammensetzung (% bezogen auf Feststoffgewicht):
63 % Zellen von Mikroorganismen
4,5 % Magnesiumhydroxycarbonat
4,5 % Kobalt-II-carbonat
28 % Celluloseacetat.
4,5 % Magnesiumhydroxycarbonat
4,5 % Kobalt-II-carbonat
28 % Celluloseacetat.
Das Mittel wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 75 ml/h,
wurde nach 1000 h auf die Hälfte und nach 2250 h auf 1/4 verrin-
eert- 809886/0901
- 13 -
Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesiumionen sank im
Verlauf des Arbeitsganges von 9 auf 2 ml/l. Der Gehalt an Kobaltionen
blieb unterhalb 0,9 mg/l.
Versuch A
Zum Vergleich wurden Plättchen wie in Beispiel 1 beschrieben
hergestellt, ausgehend von der gleichen Aufschlämmung, jedoch
ohne Zusatz von (anorganischem) Füllstoff.
Die fertigen Plättchen wurden in einen Rohrreaktor gegeben. Die Plättchen ließen sich schlecht schichten bzw. aufschütten,
da sie dazu neigten, in der Zuckerlösung zu schwimmen. Die Speiselösung enthielt kein Magnesium. Um einen pH-Wert von
7,5 bei Austritt sicherzustellen, mußte der pH-Wert der einspeisenden Lösung auf -9 bis 9,3 eingestellt werden. Aus diesem
Grunde war die austretende Lösung etwas verfärbt. Um einen Umwandlungsgrad von 42 % zu erreichen^* mußte die ZuI auf geschwindigkeit
zu Beginn auf 30 ml/h für eine Lösung enthaltend 450 g/l Glucose Γ Nach lOOstündigem Betrieb lag die Zulaufgeschwindigkeit
unterhalb 15 ml/h.
Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel beschrieben hergestellt mit der Abwandlung, daß anstelle von Magnesiumhydroxycarbonat
2,2 g dreibasisches Magnesiumphosphat wie in Beispiel 2 sowie 1,1 g Kobalt-II-carbonat (CoCO,) zugegeben wurden
und daß die verwendeten Zellen eine doppelt so hohe Aktivität je Gewichtseinheit Trockenmasse aufwiesen, wie die Zellen des
Beispiel 1.
Das fertige enzymatische Mittel setzte sich wie folgt zusammen
{% bezogen auf Gewicht der Trockenmasse):
60,5 % Zellen von Mikroorganismen
8,5 % neutrales Magnesiumphosphat 4,2 % Kobalt-II-carbonat
26,8 % Celluloseacetat.
8,5 % neutrales Magnesiumphosphat 4,2 % Kobalt-II-carbonat
26,8 % Celluloseacetat.
- 14 ♦begrenzt werden.
809886/0901
Das Mittel wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet,, Die
Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 65 ml/hj
nach 1500 h die Hälfte und nach 1900 h ein Viertel.
Der Magnesium- und Kobaltgehalt der austretenden Lösung lag in der gleichen Größenordnung wie in Beispiel J>o
25 g plättchenförmiges enzymatisches Mittel gemäß Beispiel 3 wurden mit Wasserρ das 0,5 g Glutaraldehyd enthielt, vollständig
bedeckt und 30 min bei 200C so belassen.
Darauf wurden die Plättchen abgeschleudert und das erhaltene Mittel für die Isomerisierung von Glucose eingesetzt, unter den
gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1. Die ZuIaufgeschwindigkeit
der Glucoselösung zu Beginn betrug 45 ml/h und nach 1500 h die Hälfte hiervon.
Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesium- und Kobaltionen lag in der gleichen Größenordnung wie in Beispiel 3.
In den Kessel für die Züchtung von Streptomyces phaeochromogenes wurden am Ende der Produktsionsstufe 6 g Glutaraldehyd je 100 g
Trockenmasse zugegeben. Man ließ das ganze 1 h bei pH 7,5/25 C in Berührung miteinander. Dann wurden die Zellen abzentrifugiert
und wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt bzw. verarbeitet. Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu
Beginn 77 ml/h, war nach 1100 h auf die Hälfte gefallen und nach 1600 h auf ein Viertel verringert.
Der Gehalt der Lösung an Magnesium- und Kobaltionen lag in der gleichen Größenordnung wie in den vorangegangenen Beispielen.
Versuch B
Es wurde ein enzymatisches Mittel in gleicher Weise wie in Beispiel
1 beschrieben hergestellt, jedoch ohne Zusatz von Füll-
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stoff, jedoch mit Zugabe von 0,5 g Glutaraldehyd (in Form der handelsüblichen wäßrigen 25 ?6igen Lösung) beim Vermischen der
Celluloseacetatlösung mit der Zellenaufschlämmung. 25 g des
fertigen Mittels wurden zum Isomerisieren von Glucose unter den Bedingungen des Beispiels 1 eingesetzt; die Glucoselösung
enthielt 450 g/l und wurde mit 1,23 g/l Magnesiumsulfat, MgSO^.
7HpO versetzt. Beim Aufgeben in die Säule traten gewisse Schwierigkeiten
auf, ebenso beim Zirkulierenlassen der Lösung, da die Plättchen zum Schwimmen neigten.
Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 48 ml/h, war nach 1500 h auf die Hälfte verringert und nach
2300 h auf ein. Viertel.
Die Produktion an Lävulose betrug 560 kg/kg enzymatisches Mittel.
Die austretende Lösung enthielt jedoch 100 mg/1 Magnesiumionen und mußte infolgedessen zusätzlich mit Ionenaustauschern
gereinigt werden.
In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde eine Zellenaufschlämmung
mit 30 % Peststoffgehalt hergestellt, deren Aktivität
250 E/g betrug. 100 g dieser Aufschlämmung wurden mit 13 g neutralem Magnesiumphosphat gemäß Beispiel 2, mit 125 ml einer
Celluloseacetatlösung enthaltend 100 g/l sowie mit 60 ml Aceton vermischt. Das ganze wurde homogenisiert und in den Zylinder
einer Schmierpresse mit 2 mm weiter Öffnung gegeben. Der austretende Strang wurde in einem Behälter, der 2 1 Wasser von
25°C enthielt, aufgefangen. Die Extrudate blieben 2 min im Wasser, wurden dann abgeschleudert oder grob getrocknet und zum
Fertigtrocknen in den belüfteten Ofenschrank von 35°C gegeben. Sobald sie brechbar geworden waren, was bei einem Feststoffgehalt
von 85 bis 90 % eintrat, wurden sie grob zerkleinert, zu Stäbchen von 3 bis 8 mm Länge und folgender Zusammensetzung
(%, bezogen auf das Gewicht der Trockenmasse):
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54 % Zellen von Mikroorganismen
23,5 % neutrales Magnesiumphosphat
22,5 % Celluloseacetat.
23,5 % neutrales Magnesiumphosphat
22,5 % Celluloseacetat.
Der Aktivitätstest ergab, daß sie eine Aktivität von 85 E/g aufwiesen;
dies entsprach einer Ausbeute hinsichtlich der Fixierung von 70 %.
25 g dieser Stäbchen wurden in ein Rohr für Langzeitversuche gegeben.
Bei einer Zulaufgeschwindigkeit der niagnesiumfreien GIucoselösung
(450 g/l) zu Beginn von 120 ml/h erhielt man einen Umwandlungsgrad zu Lävulose von 42 %. Nach 600stündigem Betrieb
betrug die Zulaufgeschwindigkeit noch 60 ml/h.
Die Gesamtproduktion an Lävulose betrug abschließend 525 kg/kg eingesetzte Stäbchen bei einer mittleren Produktionsgeschwindigkeit
von 15 kg/Tag.
Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel 7 hergestellt
mit der Abwandlung, daß als Füllstoff 10 g neutrales Magnesiumphosphat gemäß Beispiel 2 sowie 3 g Kobaltcarbonat CoCO^ zugegeben
wurden. Die erhaltenen Extrudate mit einem Feststoffgehalt von 85 bis 90 % wurden zu 1 bis 8 mm langen Stäbchen zerkleinert,
die folgende Zusammensetzung aufwiesen {% bezogen auf Gewicht
der Trockenmasse):
54 % Zellen von Mikroorganismen
18,1 % neutrales Magnesiumphosphat
5,4 % Kobaltcarbonat
22,5 % Celluloseacetat.
18,1 % neutrales Magnesiumphosphat
5,4 % Kobaltcarbonat
22,5 % Celluloseacetat.
Der Aktivitätstest ergab eine Aktivität von 100 E/g, entsprechend einer Ausbeute der Fixierung von 90 %.
25 g dieser Extrudate oder Stäbchen wurden in ein Rohr für Langzeitversuche gegeben und dem Rohr 120 ml/h Glucoselösung
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enthaltend 450 g/l zugeführt; diese Glucoselösung enthielt keine
Kobaltionen, aber 10 mg Magnesiumionen in Form des Phosphats
je kg Lösung. Der Umwandlungsgrad betrug 42. %. Nach 95Ostündigem
Betrieb lag der Umwandlungsgrad immer noch bei 42 % bei einer Zulaufgeschwindigkeit von 60 ml/h. Die Gesamtproduktion
betrug 865 kg Lävulose je kg eingesetzte Stäbchen bei einer
mittleren Geschwindigkeit von 14 kg/Tag, wenn die Produktion unterbrochen wurde, sobald 25 % der ursprünglichen Zulaufgeschwindigkeit
unter Aufrechterhaltung des ursprünglichen Umwandlungsgrades von 42 % erreicht worden waren. Der ausfließende
Sirup enthielt 10 mg Magnesiumionen je 1 isomerisierte Lösung sowie 0,8 mg Kobaltionen je 1 Lösung.
Es wurde ein enzymatisches Mittel analog Beispiel 8 hergestellt,
jedoch ohne Zusatz von Kobaltverbindung.
Zur Isomerisierung der Glucoselösung wurden 25 g Bxtrudate eingesetzt,
unter den Bedingungen des Beispiels 8. Die Zulaufgeschwindigkeit zu Beginn betrug 115 ml/h.
Nach öOQstündigem Betrieb lag die Zulaufgeschwindigkeit bei
58 ml/h für einen Umwandlungsgrad von 42 ?£.
Nach 1300 h erreichte man 25 % der ursprünglichen Zulaufgeschwindigkeit
unter Beibehaltung des Umwandlungsgrades von 42 %,
Die Gesamtproduktion an Lävulose betrug 620 kg/kg eingesetzte Stäbchen, bei einer mittleren Geschwindigkeit von 9 kg/Tag.
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Claims (14)
1. Enzymatisehe Mittel für die Isomerisierung von Glucose
zu Lävulose in Form von Plättchen oder Fäden aus Celluloseester, in die Zellen eines Mikroorganismus eingeschlossen
sind, welcher die Glucoseisomerase für die Isomerisierung der Glucose zu Lävulose enthält, dadurch gekenn
zeichnet
daß die Plättchen oder Fäden zusätzlich
mindestens eine in Wasser wenig lösliche Magnesiumverbindung
enthalten.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Plättchen oder Fäden zusätzlich eine in Wasser wenig lösliche Kobaltverbindung enthalten. .
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Celluloseester in den Plättchen
oder Fäden Cellulosediacetat oder ein technisches Gemisch aus Cellulosediacetat und Cellulosetriacetat sind.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch g e kennzeichnet
, daß sie als Zellen, welche Glucoseisomerase enthalten, die Zellen von Mikroorganismen aus der
Gruppe Aerobacter cloacae, Arthrobacter, Bacillus coagulans, Lactobacillus brevis, Streptomyces sp. ( phaeochromogenes,
echinatus, flavovirens, achromogenes, albus, olivaceus,
olivochromogenes, violaceoniger, bikiniensis, venezuelae) und Actinoplanes missouriensis enthalten.
8 0 9 8 8 6/0901
ORDINAL !MSPECTS)
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß sie als in Wasser wenig lösliche
Magnesiumverbindung Magnesiumoxid, Magnesiumphosphat, basisches
Magnesiumcarbonat einzeln oder im Gemisch miteinander enthalten.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß sie als in Wasser wenig lösliche
Kobaltverbindung Kobalt-II-hydroxid9 Kobalt-II-carbonat, Kobalt-II-orthophosphat
oder Kobalt-II-oxalat enthalten.
7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß sie einen getrockneten und vermahlenen
Kationenaustauscher mit SuIfonsäuregruppen, die mit
Magnesiumionen oder mit Magnesiumionen und Kobalt-II-ionen abgesättigt
sind, enthalten.
8. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Anteilsmengen der Magnesiumverbindung
und der Kobaltverbindung 50 bis 100 % sowie 0 bis 50 Gew.-% der Summe beider Verbindungen betragen«
9ο Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß sie, bezogen auf das Trockengewicht
der Zellen von Mikroorganismen, welche Glucoseisomerase enthalten, 25 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise etwa 50 Gew.-%
Celluloseester gerechnet als Feststoff und 5 bis 100 %, vorzugsweise
etwa 50 % Magnesiumverbindung und gegebenenfalls Kobaltverbindung
enthalten.
10. Verfahren zur Herstellung der enzymatischen Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9„ dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen des Mikroorganismus von dem Substrat, auf dem sie sich entwickelt haben, abtrennt, die erhaltene
Aufschlämmung bis zu einem Feststoffgehalt von 20 bis 95 %t insbesondere von etwa 30 % einengt, mit 5 bis 100 %f
insbesondere etwa 50 %, bezogen auf das Zellengewicht, eines
Füllstoffes vermengt, der aus 50 bis 100 % schwerlöslicher
Magnesiumverbindung sowie 0 bis 50 % schwerlöslicher Kobaltverbindung besteht, daß man dem erhaltenen Gemisch den Celluloseester
zusetzt in einer Menge von 25 bis 100 %, vorzugsweise etwa 50 %, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen
sowie in Form eines Sols mit einer Konzentration von 5 bis 20 %, vorzugsweise von etwa 10 % in einem mit Wasser mischbaren
Lösungsmittel, insbesondere in Aceton, worauf man ein Lösungsmittel zusetzt in einer Menge, die gleich ist dem Gewicht
der getrockneten Zellen oder bis zum 10-fachen dieses Gewichtes beträgt sowie soviel Wasser, daß die im Endgemisch
enthaltene Menge Wasser das 0,6- bis 8-fache, insbesondere etwa 3-fache des Gewichtes des Celluloseester ausmacht,' wobei
das Gewichtsverhältnis von Wasser zu Lösungsmittel im Endprodukt <
0,2 ist, und das erhaltene pastenartige Gemisch verformt und langsam bei einer Temperatur von 15 bis 300C
trocknet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß man die Zellen zusätzlich mit Glutaraldehyd
behandelte
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß man das pastenartige Gemisch auf einer
Platte in einer Schichtstärke von 1 bis 3 mm ausbreitet, teilweise
trocknet, zu Plättchen zerschneidet und fertig trocknet.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die pastenförmige Masse extrudiert,
die Oberfläche der Extrudate mit Hilfe von Heißluft oder mittels Eintauchen in Wasser koaguliert und fertig trocknet.
14. Verwendung der Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Isomerisieren von Glucose in Form ihrer wäßrigen Lösung
mit einer Konzentration nicht über 60 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 45 %, die gegebenenfalls 2 bis 10 mg/l Magnesiumionen
enthält, bei einem pH-Wert von 8 bis 9, vorzugsweise von 8,5
on 50 bis 750C,
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und einer Temperatur von 50 bis 75°C, vorzugsweise von 60°C.
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