DE2303872A1 - Verfahren zur herstellung von fructose sowie fructose und glucose enthaltendem sirup - Google Patents

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Dr. F. Zumsteln son. Dr. t£. Assmann Dr. R. Koenfgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumstein Jun.

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Case 541 12/10/ka

SNAM PROGETTI S.p.A., Mailand/Italien

Verfahren zur Herstellung von Fructose sowie Fructose und Glucose

enthaltendem Sirup.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fructose und Fructose- und Glucose-Sirups, die die gleiche Zusammensetzung wie Invertzucker haben.

Insbesondere arbeitet das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung von gereinigten und in Fasergefügen bzw. Filamentstrukturen perl- bzw. kugelförmig eingeschlossenen Glucoseisomerasen.

Verfahren zur Isomerisierung von Glucose und Fructose sind bekannt. Sie bestehen im wesentlichen aus zwei Typen: chemische und enzymatische Isomerisierung.

Die erste Methode besteht darin, die zu isomerisierenden Zucker mit einem alkalischen Katalysator zu behandeln; jedoch werden mit

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dieser Methode geringe Ausbeuten erhalten, wegen der Bildung von Sekundärprodukten aufgrund der Instabilität der Zucker in einer alkalischen Umgebung.

Die enzymatische Isomerisierung wird unter Verwendung roher GIucoseisomerase als ein Enzym oder direkt als eine Mikroorganismenkultur durchgeführt. In beiden Fällen liegt jedoch eine geringe Aktivität wegen des geringen Reinheitsgrades des verwendeten Enzyms vor und es ist daher nötig, bei höheren Temperaturen zu arbeiten, wodurch eine Bräunung der erhaltenen Zuckerlösung erfolgt. Die Raffination der Zurckerlösung mit entfärbenden Erden bringt einen beträchtlichen wirtschaftlichen und technologischen Aufwand mit sich. Außerdem können die Zellen lediglich in einer sehr begrenzten Häufigkeit verwendet werden.

Es sollte möglich sein, eine gesteigerte enzymatische Aktivität durch ein kostspieliges Reinigungsverfahren zu erzielen; jedoch würde dies das Isomerisierungs verfahre η nicht durchführbar machen, da bei lediglich einmaliger Anwendung des Enzyms sein Reaktionsprodukt später entfernt wird.

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die enzymatische Isomerisierung mit einer hohen Aktivität mit einem Enzym in einer beträchtlich aktiven Form durchzuführen, die ein Arbeiten mit gesteigerten Umsätzen und bei niedrigen Temperaturen ermöglicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Anwendung von in Fasergefügen bzw. Filamentstrukturen kugel- bzw. perlförmig eingeschlossener G-lucoseisomerase. Diese Methode besitzt hinsichtlich der Enzyme den Vorteil, daß das gleiche Enzym unbeschränkt oft verwendet werden kann, wobei das Enzym seine bestimmte katalytische Wirkung ausübt und fest an seinem faserförmigen Träger verankert bleibt, der es umhüllt und wobei der Kontakt mit dem Substrat durch eine sehr dünne Membran erfolgt, die es von seiner Umgebung trennt.

Ein derartiges Verfahren erlaubt die Verwendung eines Enzyms mit einem hohen Reinheitsgrad, da das Enzym, wenn es einmal in das

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Fasergefüge eingeschlossen ist, mehrmals verwendet werden kann und daher die Reinigungskosten beträchtlich vermindert sind.

Weiter liegt der Vorteil vor, daß die Verunreinigung des erhaltenen Reaktionsprodukts völlig ausgeschlossen wird, da das Enzym in den Hohlräumen im Inneren des Fasergefüges bleibt.

Das verwendete Fasergefüge (Faserstruktur) und die Methode, das Enzym perlschnurartig einzuschließen, sind in der italienischen · Patentschrift 836 462 (deutsche Off enlegungs schrift 1 932 <f26) beschrieben, - wonach Fasern mit kugel- bzw. perlförmig eingeschlossenen Enzymen hergestellt werden können, ausgehend von den Polymerlösungen in denen dispergierte enzyraatische Präparate in der Form von sehr kleinen Tröpfchen in der Größenordnung von Emulsionen dispergiert werden können. Die so erhaltene Emulsion kann naß oder trocken versponnen werden, so daß man eine Faser erhält, die im Inneren kleine innere Öffnungen enthält, in denen die Enzyme angeordnet sind, die von der Umgebung durch eine sehr dünne Membran abgetrennt werden, die das Austreten des Enzyms und den Verlust in der Reaktionsmasse verhindert, die jedoch die Ausübung der katalytischen Wirkung des Enzyms gestattet.

Die Polymeren, die in nützlicher Weise für die Herstellung von Snzymfasern verwendet werden können, müssen in Lösung bei einer Temperatur bestehen können, die mit der Stabilität des Enzyms in einem Lösungsmittel vereinbar ist und müssen im wesentlichen mit dem Lösungsmittel mischbar sein, in dem das Enzym gelöst oder dispergiert ist. _t

Das Lösungsmittel für diese Polymeren darf die Stabilität des Enzyms nicht beeinträchtigen und darf keine desaktivierende Wirkung auf das Enzym ausüben. Weiterhin muß beim Naßverspinnen das Ausfällmittel mit dem Polymer-Lösungsmittel mischbar sein und die gleichen Eigenschaften wie das vorstehend erwähnte Lösungsmittel aufweisen.-

Einige der Polymeren, in die die Enzyme kugel- bzw. perlförmig

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eingeschlossen werden können, sind im folgendenden aufgeführt: veresterte Zellulosepolymere, Nitrate, Polyolefine, Polymere und Copolymere, die aus Acry!nitrilen, Acrylaten, Methacrylaten, Vinylestern, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Styrol erhalten werden und ferner Polyamide, Polyvinylbutyral und ähnliche Verbindungen. Die Verwendung von veresterten Zellulosepolymeren bietet für das erfindungsgemäße Verfahren beträchtliche Vorteile.

• Heben den Vorteilen, die sich durch die Anwendung der üblichen enzymatisehen Isomerisierung ergeben, bietet die Erfindung bemerkenswerte Verbesserungen.

/ Die Wirkungsdauer des kugelförmig umhüllten Enzyms ist gut und es ist daher möglich, es in einer unbeschränkten Häufigkeit zu verwenden, was sich positiv auf die Wirtschaftlichkeit auswirkt. Bei der anhaltenden Dauer der Aktivität ist es möglich, ein enzymatischem Präparat von äußerster Reinheit perlschnurförmig anzuordnen, ohne daß die Reinigungskosten das Verfahren wesentlich belasten wurden. Hierdurch wird, es möglich, sehr aktive Pasern zu erhalten, die kurze Arbeitszeiten bei Temperaturen und pH-Werten, bei denen die Zersetzung der Zucker vermieden wird, ermöglichen, wobei auf diese Weise fast farblose Endlösungen unter beträchtlicher Einsparung an Entfärbungskohle erhalten werden. Außerdem verteilt sich das enzymatische Protein nicht in dem Reaktionsmedium und verunreinigt das Produkt nicht. Ein anderer großer Vorteil liegt in der Möglichkeit einer kontinuierlichen Arbeitsweise, durch die der Betrieb deutlich vereinfacht wird und die Möglichkeit besteht, das Verfahren zu steuern. Durch ungefähre Regulierung des Durchflusses, der Pasermenge und ihrer Enzymkonzentration ist es möglich, die Isomerisierung mit einer gewünschten Strömungsgeschwindigkeit durchzuführen. Das hier beschriebene Verfahren kann ansatzweise durchgeführt werden, wobei der Enzym-Substrat-Kontakt während der Zeit erfolgt , die erforderlich ist, um den gewünschten Isomerisierungsgi?ad zu erreichen. Der isomerisierte Sirup kann daher entfernt v/erden und durch einen neuen Sirup ersetzt werden, wobei die gleiche Enzymfaser nochmals verwendet wird.

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Das Enzym, das kugelförmig umhüllt werden soll, kann aus einem geeigneten Mikroben-Rohmaterial extrahiert werden. Es kann als roher Extrakt durch mechanisches Brechen oder durch Zellauflösung kugelförmig umhüllt werden oder es kann nach üblichen Methoden zur Reinigung des Proteins gereinigt werden.

Die Temperatur bei der das Isomerisierungsverfahren durchgeführt wird, variiert zwischen 30 und 7O°G und beträgt vorzugsweise 40 bis 45⁰C; der pH-Wert variiert zwischen 5,0 und 9,0, vorzugsweise wird bei etwa 7*0 gearbeitet.

Die Isomerisierungslösung kann eine gepufferte Glucoselösung in Wasser von vorzugsweise 50 $ (Gew./Gew.) sein, die geringere Dosierungen von Mg⁺⁺ und Co⁺⁺ enthält oder sie kann aus einer Glucoselösung bereitet sein, die durch Einwirkung von Glucoamylase auf Stärke erhalten wurde.

Andere Methoden sind aus den folgenden Beispielen ersichtlich, die lediglich zur besseren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen sollen. .

Beispieli

Zur Bildung der kugelförmigen Umhüllung wurde eine Wasser-Glyzerin-Lösung (72:25) von Glucose-Isomerase, die aus Streptomycinzellen durch Auflösung (Lysis) und fortlaufende Ausfällung mit Aceton erhalten wurde, hergestellt, die die folgenden Charakteristika aufwies: Aktivität 364· Einheiten/ml (eine Einheit ist die Enzyramenge, die 1 mg Fructose aus einer 0,5ω Glucoselösung bei pH 7,0 in 1 Stunde bei 45°G erzeugt), Protein 22 mg/ml.

20 g Zellulosetriacetat (Pluka) wurden unter Rühren in 266 g Methylenchlorid gelöst. 40 g der enzymatischen Lösung wurden'zu der Polymerlösung gefügt und die Emulsion der 2 Phasen durch heftiges Rühren bei O⁰G während 30 Minuten erleichtert. Die Emulsion wurde in einen Schmelztopf ausgegossen und bei -6 C gehalten und unter Druck mit Stickstoff gesponnen.

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Der Faden wurde in Toluol bei Raumtemperatur ausgefällt und auf Spulen aufgewickelt. Er wurde im Vakuum bei O⁰C so lange getrocknet als es notwenig war, die organischen Lösungsmittel zu entfernen.

2,8 g der so erhaltenen Paser, was etwa 1,4 g des trockenen Polymeren entsprach, wurden mit O,05m-Phosphatpuffer bei pH 7,0 gewaschen, um das adsorbierte Enzym zu entfernen und nach und nach in 25 ml einer wäßrigen lösung eingebracht, die die folgende Zusammensetzung aufwiese Glucose 60 $ (Gew./YoI); CoCIp. 10 m ; MgCl₂.5 x 10~⁵ m.

Die Lösung wurde bei 45 C gerührt und der pH-Wert konstant durch Zusatz von HaQH bei 7,0 gehalten. Nach 24 Stunden konnte eine 45,5 $-ige Isomerisierung polarimetrisch bestimmt werden. Die isomerisierte Lösung wurde entfernt und die gleiche Faser mit einer frischen Glucoselösung für einen neuen Isomerisierungszyclus in Kontakt gebracht. Nach 6-tägigem Betrieb betrug die Isomerisierung nach 24 Stunden 41 $, nach 12 Tagen 28,7 % und nach 18 Tagen 26,5 i°. Der Arbeitsgang wurde 45 Tage durchgeführt.

Ein Teil des isomerisierten· Sirups wurde zur Abtrennung der Fructose verwendet, mit einer vorausgehenden Deionlsierung durch Ionenaustauscherharz und fortlaufende Ausfällung der Fructose mit CaI-zium bei einem alkalischen pH-Wert.

Beispiel 2

25 g der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten perlschnurförmigen Faser mit Glucoseisomerase wurden als parallele Fasern in eine Glassäule (1,3 x 40 cm), die thermostatisch auf 45⁰C gehalten wurde, eingebracht. Eine Lösung aus einem Phosphatpuffer

vom pH 7,0, 0,05 m Glucose 60 #, CoCl₀.6H_o0.10"⁴" m , MgCl_Q.5x —3 - c. c. C

10 m , wurde durch eine peristalitische Pumpe vom Boden her zum oberen Ende mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 7 ml/Std. gepumpt. Der Ausfluß wies eine Isomerisierung von 40 ^ auf.

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Beispiel 3

10 g Amyloglucosidasen, Diazympulver (Miles) wurden in 50 ml entionisiertem Wasser suspendiert und 20 Minuten gerührt, um die Auflösung des aktiven Proteins zu begünstigen. Die Lösung wurde zur Entfernung des unlöslichen Trägers und des Filterkuehens filtriert. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vermischt und im Vakuum bei 25⁰C konzentriert, bis ein endgültiges Volumen von 20 ml erreicht war.

20 ml Glucoseisomerase (364 Einheiten/ml; Protein 22 mg/ml) wurden zu der so erhaltenen Lösung gefügt. Die vermischten Lösungen der Grlucoseisomerasen und Amyloglucosidasen wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode in 40 g Zellulosetriacetat periförmig eingelagert.

20 g der erhaltenen Faser wurden in parallelen Fäden in eine Glassäule (2,5 x 40 cm) die thermostatisch auf 45°C gehalten wurde, eingebracht. Eine Lösung von 35 $ (Gew./Vol.) Maisstärke, die vorher mit oc-Amylase verflüssigt worden war . mit Kobalt- und Magnesiumsalzen (Mg⁺⁺ 5 x 10 m , Co⁺⁺10 m. ) wurde in einem geschlossenen Zyclus mittels einer peristaltischen Pumpe zirkuliert.

Während die Lösung über den enzymatischen Katalysator zurückgeführt wurde, wordurch eine gleichzeitige Hydrolyse von Dextrin und Glucose und eine Glucose-und Fructose-Isomerisierung erhalten wurde, wurde sie durch einen Kolben geleitet, in dem der pH-Wert kontrolliert und auf 6,5 gehalten wurde. Die Recyclisierung der Lösung wurde fortgesetzt, um eine Stabilisierung des optischen Drehwertes zu erreichen (~ 72 Stunden). Eine zu diesem Zeitpunkt durchgeführte Analyse ergab eine Glucosekonzentration von 191 mg/ml und von 129 mg/ml Fructose; den Rest bildeten Disaccharide und Obligosaccharide. Der gleiche Arbeitsgang wurde mit der gleichen Faserprobe-15 Tage wiederholt, ohne daß ein nennenswerter Abfall der Aktivität auftrat.

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Claims (6)

1. Patentansprüche

   (T) Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von α-Glucose zur Herstellung von Fructose und Sirups, die Glucose und Fructose enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym, das auf katalytische Weise die Isomerisierung bewirkt, eine perl- bzw. kugelförmig in einem Fasergefüge eingeschlossene Glucoseisomerase ist,
2. 2. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Fructose und Glucose- und Fructose-Sirups gemäß Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen bei Temperaturen zwischen 30° und 7O⁰C, vorzugsweise zwischen 40 und 45⁰C durchgeführt werden.
3. 3. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Fructose und Glucose- und Fructose-Sirups gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Reaktionsmediums zwischen 5 und 9 und vorzugsweise bei etwa 7 liegt.
4. 4. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Fructose und Glucose- und Fructose-Sirups gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu isomerisierende Glucoselösung geringe Mengen an Mg⁺⁺ und Co⁺⁺ Ionen enthält.
5. 5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Faserstruktur perlförmig angeordnete verwendete Enzym aus Glucoseisomerasen mit einem hohem Reinheitsgrad zusammengesetzt ist.
6. 6. Verfahren gemäß einem der-vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Poly-a-glucoside zur Herstellung von Fructose und Glucose enthaltenden Sirups mit bioenzymatischen faserartigen Präparaten behandelt werden, die Amyloglucosidasen und Glucoseisomerasen enthalten.

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