DE2415310C3 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Äpfelsäure - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-ÄpfelsäureInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
enzymatischen Herstellung von L-Äpfelsäure aus Fumarsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
Lösungen von Fumarsäuresalzen mit Faser- bzw. Filamentstrukturen, die Fumarase in Form von sehr
kleinen Tröpfchen von Emulsionsgröße umhüllen, in Kontakt bringt.
Das Enzym Fumarase, das aus verschiedenen Quellen extrahiert wird, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren
als Katalysator in heterogener Form verwendet da es in Faserstrukturen eingeschlossen ist, aus denen das
Enzym nicht entweichen kann, während es sich in Kontakt mit dem Substrat befindet.
In der Nahrungsmittelindustrie besteht ein Interesse an organischen !säuren, wie Zitronensäure oder
Weinsäure, zur Verwendung als saure Substanzen. Kürzlich wurde auch die Eignung von Apfelsäure für
den vorstehenden Zweck untersucht. Obwohl die Verwendung von racemischen Verbindungen bekannt
war, ist es offensichtlich, daß die Verwendung des natürlichen Isomeren, d. h. der L-Äpfelsäure, die in
großer Menge im menschlichen Körper als Zwischenprodukt der meisten wichtigen metabolischen Cyclen
hergestellt wird, eine größere Sicherheit insbesondere auf dem Gebiet der Babynahrungsmittel liefert. Zur
Äpfelsäureherstellung wurden viele Verfahren vorgeschlagen. So gibt es einerseits die chemischen
Synthesemethoden, die racemische Verbindungen mit den vorstehenden Nachteilen liefern, darüber hinaus
enthält die durch synthetische Methoden hergestellte Apfelsäure immer Maleinsäure als Verunreinigung, die
mittels teurer Verfahren auf Grund ihrer hohen toxischen Eigenschaften entfernt werden muß. Andere
Methoden stellen die mikrobiologischen Methoden dar, die jedoch, selbst wenn sie den Vorteil haben, das
natürliche Laevoprodukt zu liefern, teuer und aufwendig sind; darüber hinaus sind tatsächlich die Konservierung
des mikrobiologischen Stammes bzw. des Bakterienstammes, die Fermentation unter Verwendung teurer
und großer Anlagen sowie die Verwendung des Ausgangsmaterials, von Druckluft und Dampf weitere
Nachteile der vorstehenden Methoden. Darüber hinaus bringt die Abtrennung der Apfelsäure aus dem
Fermentationsmedium einige Schwierigkeiten auf Grund der Tatsache mit sich, daß das Produkt
zusammen mit verschiedenen Verunreinigungen vorliegt.
Aus der kanadischen Patentschrift 6 27 019 ist eine enzymatische Methode unter Verwendung des löslichen
Enzyms bekannt. Diese Methode weist jedoch verschiedene Nachteile auf: Die Verschmutzung des Endprodukts,
die Notwendigkeit, das Enzym zu inaktivieren, die Verwendung von großen Enzymmengen, das lediglich
einmal verwendet wird und daher die Kosten des Verfahrens stark belasten würde.
Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Durchführung der enzymatischen Hydratisierung
von Fumarsäure zu L-Apfelsäure auf sehr einfachem Wege. Die Einheit bzw. Vorrichtung besteht
aus einer einfachen Säule; das feststehende bzw. festsitzende und unbewegliche Enzym kann mehrfach
erneut verwendet werden und verunreinig» das Produkt nicht; letzteres kann leicht aus der Reaktionsmischung
abgetrennt werden. _
Die Faserstrukturen, die verwendet werden können,
und das Medium zur Umhüllung des Enzyms sind in der italienischen Patentschrift 8 36462 bzw. der deutschen
Patentschrift 19 32 426 beschrieben, wonach die das Enzym einschließenden bzw. umhüllenden Fasern aus
Polymerlösungen hergestellt werden können, die dazu geeignet sind. Fasern zu ergeben, in denen Enzympräparate
in Form von sehr kleinen Tröpfchen von Emulsionsgröße dispergiert sind.
Die auf solchem Wege erhaltene Emulsion kann naß oder trocken zur Bildung einer Faser versponnen
werden die in ihrem Inneren sehr kleine Höhlungen aufweist in denen sich die Enzyme befinden, die von der
äußeren Umgebung durch eine sehr dünne Membrane getrennt sind, die das Enzym daran hindert auszutreten
und in das Reaktionsmedium hineinzudispergieren, wohingegen es dem Enzym möglich ist, seine katalytische
Wirksamkeit auszuüben.
Unter den Polymeren, die das Enzym einschließen bzw erhalten können, können folgende genannt
werden: Veresterte und nitrierte Zellulosepolymere, Polyolefine Acrylnitrilpolymere und -copolymere,
Acrylat Methacrylat Vinylester, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Styrolpolymere sowie Polyamide oder
Polyvinylbutyral. .
Mit den auf solche Weise erhaltenen enzymatischen Fasern, die in eine Säule eingebracht werden, ist es
möglich, Fumarsäure in L-Äpfelsäure durch em kontinuierliches Verfahren umzuwandeln, das leicht
automatisiert werden kann.
Eine Pumpe beschickt die Natriumfumaratlösung (mit einer Konzentration im Bereich von 0,1 und 1,2
Mol/Liter und bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 9,0) in eine Kolonne, die den Katalysator enthält. Je nach
den Fluß- und Temperaturbedingungen wird in dem ausfließenden Strom eine Konzentration von L-Apfelsäure
erhalten, die meistens den Wert des thermodynamischen Gleichgewichts erreicht.
Aus dem Abstrom wird die nicht umgesetzte Fumarsäure durch Ansäuern entfernt und recyclisiert.
Die L-Äpfelsäure kann nach verschiedenen Methoden entweder im kristallinen reinen Zustand oder im
konzentrierten, sirupartigen Zustand gewonnen wer·
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
10 g Zellulosetriacetat wurden unter Rühren in 140 g Methylenchlorid gelöst.
Die Enzymlösung wurde durch Auflösen von Fumarase (extrahiert aus Hausschweinen) in einer
Konzentration von 20 mg Protein pro ml in einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 hergestellt. 10 ml der
Enzymlösung wurden zu der organischen Triacetatlösung gefügt und die Emulsion aus zwei Phasen wurde
durch heftiges Rühren bei O0C während 30 Minuten in
die Wege geleitet
Die Emulsion wurde in eine Spinndüse gegossen und unter Stickstoffdruck gesponnen. Der Faden bzw. die
Faser wurde in Toluol bei Raumtemperatur koaguliert und auf einer Garnspule gesammelt Die erhaltene Faser
wurde im Vakuum zu Entfernung der organischen Lösungsmittel getrocknet
Eine Probe von 2 g Faser wurde nach Waschen mit Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 in 50 mi einer
lOm-Lösung von Natriumfumarat getaucht Die Mischung
wurde bei einer gesteuerten Temperatur von 25° C gerührt Nach 90 Minuten wurden in der
Reaktionsmischung 203% der Ausgangsfumarsäure
festgestellt der Rest (79,5%) war in L-Äpfelsäure umgewandelt
Die gleiche Faser behielt 40% ihrer Ausgangsaktivität nach 10 aufeinanderfolgenden Benutzungen bei.
20
Nach der gleichen Arbeitsweise wie im Beispiel 1 beschrieben wurde ein rohes Enzympräparat von
Fumarase, das aus Mikrobenzellen von Paracolobactrum aerogenaides erhalten wurde, in Zellulosetriacetatfasern
eingearbeitet
450 g nasse Zellen, die durch übliche Methoden durch
aerobe Fermentation erhalten worden waren, wurden einer Ultraschalleinwirkung während 20 Minuten
unterzogen; die Nucleinsäuren wurden mit MnCb entfernt und das Enzym wurde mit Ammoniumsulfatlösung
mit einer Konzentration von 40 bis 60% der Sättigung ausgefällt Die Ausfällung wurde erneut in
einem O.Olm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die Lösung enthielt 49 mg Protein pro ml und wies eine
Aktivität von 45 Einheiten/ml auf (die Aktivitätseinheit ist die Menge Enzym, die 1 μΜοΙ in 1 Minute bei 25° C
umwandelt). 100 ml dieser Lösung wurden gemäß Beispiel 1 in Fasern eingeschlossen.
Eine Probe von 85 g Fasern wurde in eine Säule (65 χ 3 cm), die thermostatisch auf 25° C gehalten wurde,
eingebracht; vom Boden zum Kopf der Säule wurde eine O,5m-Natriumfumaratlösung in einem Phosphatpuffer
mit einer Flußgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde eingeleitet.
In dem Abstrom betrug die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure 54%. Nach 35 Tagen
kontinuierlicher Verwendung der gleichen Faser fiel die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure auf 38%
ab.
Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde ein rohes, enzymatisches Präparat von Fumarase, erhalten
aus Mikrobenzellen von Pseudomonos sp, in Zellulosetriacetatfasern
eingeschlossen. 315 g nasse Zellen, die durch übliche aerobe Fermentationstauchmethoden
erhalten worden waren, wurden der Einwirkung von Ultraschallwellen während 20 Minuten unterzogen; die
Nucleinsäuren wurden mittels Protaminsulfat entfernt und das Enzym wurde mit 30 bis 60% des Sättigungswertes
von Ammoniumsulfat ausgefällt Der Niederschlag, der das Enzym enthält, wurde in einem
0,1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst.
Die Lösung enthielt 61,5 mg Proteine pro ml und wies eine Aktivität entsprechend 80 Einheiten/ml auf (die
Aktivitätseinheit ist die Menge Enzym, die 1 μΜοΙ
Substrat in einer Minute bei 25° C umwandelt). 100 ml dieser Enzymlösung wurden in Fasern gemäß der
Arbeitsweise von Beispiel 1 eingeschlossen.
Eine Probe von 70 g der Fasern wurde in eine Säule (60 χ 3 cm) gefüllt die bei 25° C thermostatisch gehalten
wurde.
Eine O,5m-Natriumfumaratlösung in einem Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 wurde vom Boden zum Kopf der Säule mit einer Flußgeschwindigkeit von 50
ml/Stunde geleitet In dem Abstrom betrug die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure 60%.
Die Reaktion, die die enzymatischen Fasern enthielt, wurde kontinuierlich während 60 Tagen ohne merklichen
Aktivitätsverlust verwendet Aus der Reaktionsmischung wurde die Fumarsäure durch Ansäuern entfernt
und recyclisiert wobei man eine 90%ige Wiedergewinnung erzielte.
Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum auf sirupartige Konsistenz konzentriert und die anorganischen
Salze wurden hieraus entfernt Die L-Äpfelsäure wurde mit Alkohol extrahiert und durch Zusatz von
Chloroform ausgefällt. Die L-Äpfelsäure wies eine Reinheit von 100% auf; die Ausbeute betrug 60%.
Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurde eine enzymatische Lösung, die aus Mikrobenzellen
von Pseudomonas sp. erhalten worden war, in Zellulosetriacetatfasern eingeschlossen.
500 g nasse Zellen, die aus einer aeroben Tauchfermentation erhalten worden waren, wurden der Einwirkung
von Ultraschall während 20 Minuten unterzogen; die Nucleinsäuren wurden mit MnCb entfernt; die
Proteinlösung wurde 10 Minuten auf 500C erwärmt; das Enzym wurde mit Ammoniumsulfat in einer Konzentration
von 40% ausgefällt. Der Niederschlag wurde in einem O.Olm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 8 löslich
gemacht.
Die Lösung enthielt 60 mg/ml Proteine und eine Aktivität entsprechend 150 Einheiten/ml. 50 ml dieser
Lösung wurden in Zellulosetriacetat gemäß den vorstehenden Ausführungen eingeschlossen.
Eine Faserprobe von 80 g wurde in eine Säule (60 χ 3 cm) eingebracht, die thermostatisch auf 25° C
gehalten wurde. Vom Boden der Säule wurde eine O,5m-Lösung von Ammoniumfumarat im Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 mit einer Flußgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde eingeführt.
Im Abstrom betrug die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure 75%.
Eine enzymatische Lösung, erhalten aus Pseudomonas sp.-Mikrobenzellen, wurde gemäß den Ausführungen
von Beispiel 2 in Zellulosetriacetat eingeschlossen.
Eine aus 80 g einer derartigen Faser bestehende Probe wurde in eine Säule (60 χ 3 cm) eingebracht, die
thermostatisch auf 25°C gehalten wurde. Vom Boden der Säule wurde eine Lösung zum Kopf der Säule
geleitet, die aus O,06m-Calciumfumarat im Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 bestand; die Flußgeschwindigkeit betrug 50 ml/Stunde. In dem Abstrom wurde eine
L-Äpfelsäuremenge bestimmt, die einer 70%igen Umwandlung von-Fumarsäure entsprach.
Claims (2)
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Äpfelsäure aus Fumarsäure, dadurch gekennzeichnet,
daß man Lösungen von Fumarsäuresalzen mit Faser- bzw. Filamentstrukturen, die
Fumarase in Form von sehr kleinen Tröpfchen von Emulsionsgröße umhüllen, in Kontakt bringt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die die Fumarase umhüllende Faser aus Zellulosetriacetatpolymeren besteht.
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