AT208508B - Verfahren zur Abscheidung und Reinigung des Antibiotikums Ristocetin - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Abscheidung und Reinigung des Antibiotikums Ristocetin   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abscheidung und Reinigung des Antibiotikums Ristocetin aus dessen Lösungen. 



  Ristocetin ist ein antibiotische Produkt mit bakterizider Wirkung gegen grampositive Organismen und wird durch den Actinomyceten Nocardia lurida gebildet. Das antibiotische Produkt, das bei diesem Verfahren erhalten wird, kann in zwei sehr ähnliche Antibiotika getrennt werden, welche aus der Literatur als Ristocetin A und Ristocetin B bekannt sind. 



  Bisher ist es als notwendig erachtet worden, zur Gewinnung und Reinigung des antibiotischen Produktes Ristocetin das Antibiotikum in einer Ionenaustauschersäule zu adsorbieren und anschliessend das An- tibiotikum zu eluieren, wobei es in reinerer Form erhalten wird. Die Verwendung von Ionenaustauschersäulen ist jedoch überall dort nicht anwendbar, wo die Harze nicht leicht erhältlich sind. Es ist daher in hohem Masse erwünscht, das Verfahren zur Abscheidung und Reinigung des Ristocetins zu vereinfachen und möglichst ohne die Anwendung von Ionenaustauscherharzsäulen das Auslangen zu finden. 



  Die Erfindung zielt darauf ab, die Gewinnung des Ristocetins sowohl aus Kulturfiltraten als auch aus mit Ristocetin angereicherten Lösungen wesentlich zu erleichtern. 



  Es wurde gefunden, dass Ristocetin und dessen Komponenten Ristocetin A und Ristocetin B als Base oder als wasserlösliches Salz mit einem aromatischen Aldehyd, vorzugsweise Salicylaldehyd oder Zimtaldehyd, reagieren, wobei eine definierte, in Wasser sehr wenig lösliche Verbindung erhalten wird, die einer Schiff'schen Base ähnlich ist. 



  Das erfindungsgemässe Verfahren zur Abscheidung und Reinigung des Ristocetinantibiotikums aus dessen Lösungen besteht demgemäss darin, dass man eine wässerige Lösung, die das Ristocetinantibiotikum als Base oder als wasserlösliches Salz, z. B. als Sulfat, enthält, insbesondere eine Lösung mit einem PH- Wert von etwa 7 bis 8 und vorzugsweise 7,5 bis 8. 1, mit einem aromatischen Aldehyd versetzt und dabei das Antibiotikum ausfällt. Als aromatischer Aldehyd wird im Rahmen des erfindungsgem1tssen Verfahrens bevorzugt Salicylaldehyd oder Zimtaldehyd verwendet. Das Reaktionsprodukt scheidet sich im allgemeinen , aus der Lösung riaoh kurzzeitigem Riihren bei Zimmertemperatur ab ; es wird dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40 bis 600 C getrocknet. 



  Aus dem erhaltenen Fällungsprodukt kann man gewünschtenfalls das Antibiotikum in Freiheit setzen, indem man den Aldehydanteil durch Ansäuren wieder abtrennt. Zur Spaltung des Fällungsprodukte ! werden insbesondere Mineralsäuren, Z. B. Schwefelsäure, verwendet. 



  Unter der Bezeichnung"Antibiotikum Ristocetin"ist im Rahmen der Erfindung ein mikrobiologisch aktives Produkt zu verstehen, wie es durch Submersfermeniation des Organismus Nocardia lurida in einem Nährmedium erhalten wird. Der Ausdruck umfasst sowohl Ristocetin A als auch Ristocetin B. 



  In den Beispielen sind verschiedene besondere Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens beschrieben. Die Beispiele erläutern das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip. 



  Beispiel l : Ig Ristocetin A wird in Wasser gelöst, worauf die Lösung mit WaNer auf 100 ml aufgefüllt wird. 10 ml dieser Lösung werden zur Aktivitätsbestimmung zurückgehalten ; (ermittelte Aktivität 902 Einheiten je mg). 90 ml der Lösung werden unter Verwendung von gepulvertem Natriumbicarbonat auf einen PH- Wert von 7, 6 eingestellt. Dann werden 0,5 ml Salicylaldehyd zugesetzt und es wird 1 Stunde   

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 gerührt. Es scheidet sich ein gelber Festkörper ab, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40  C getrocknet wird.

   Dabei werden 0, 88 g eines Reaktionsproduktes mit   einer Aktivität   von 887 Einheiten je mg, einem Wassergehalt von 8,0   %   sowie einem Aschegehalt von 0,05 % erhalten, entsprechend 
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 Reaktionsproduktes, welches theoretisch drei   Salicylaldehydgruppen   je Molekül Ristocetin enthält, werden die folgenden Ergebnisse erhalten : 
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<tb> Berechnet: <SEP> C <SEP> = <SEP> 57 <SEP> % <SEP> H <SEP> =5, <SEP> 90% <SEP> N <SEP> =4, <SEP> 5 <SEP> 0= <SEP> 32,6 <SEP> je
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 57, <SEP> 19 <SEP> % <SEP> H <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 78 <SEP> % <SEP> N <SEP> = <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> = <SEP> 32, <SEP> 540/0. <SEP> 
<tb> 
 



   Das Reaktionsprodukt ist in Polyäthylenglykol, Propylenglykol, wässerigem Aceton, wässerigem Methanol, wässerigem Äthanol, Pyridin, Formamid und in mit Butanol gesättigtem Wasser löslich, in Amylacetat, Äthylacetat, Aceton, Benzol, Diäthylketon, Diäthylcarbonat, Chloroform, Methylenchlorid und Butanol unlöslich. Bei biologischen Tests mit der in   50'1obigem   Methanol gelösten Verbindung zeigte sich eine geringe Reizwirkung auf Gewebe. 



     Beispiel 2 : Ig Ristocetin B wird in Wasser   gelöst und die Lösung auf 100 ml aufgefüllt.   10 ml   
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 90 ml der Lösung werden mit gepulvertem Natriumbicarbonat auf PH 7,6 eingestellt, worauf 0,5 ml Salicylaldehyd zugegeben und das Ganze 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt wird. Der gelbe sich abscheidende Festkörper wird wie in Beispiel 1 angegeben behandelt, wobei eine Ausbeute von 0,84 g erhalten wird. Das Reaktionsprodukt zeigt eine Aktivität von 753 Einheiten je mg und enthält 1, 66 % Wasser und 0,   1 %   Asche. Schmelzpunkt etwa 2500 C (Zers.).

   Bei der chemischen Analyse des Reaktionsproduktes, das theoretisch drei Salicylaldehydgruppen je Molekül enthält, wurden die folgenden Werte erhalten : 
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<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> C=58 <SEP> % <SEP> H=5,7 <SEP> % <SEP> N=5,0 <SEP> % <SEP> O <SEP> = <SEP> 31,3 <SEP> %
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C=58,59 <SEP> % <SEP> H=5,60 <SEP> % <SEP> N=5,1 <SEP> % <SEP> O=30,74%.
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     Beispiel 3 : 91   eines Ristocetin-Kulturfiltrates (Aktivität219 Einheiten je ml) werden mit Natriumbicarbonat auf PH   7,   7 eingestellt und kräftig gerührt, wobei 90 ml Salicylaldehyd zugegeben werden. Das Rühren wird 1, 5 Stunden fortgesetzt. Es werden 400 g Natriumchlorid zugefügt, worauf 1   Stunde weiterge-   rührt wird. Das gelbgefärbte Reaktionsprodukt wird unter Verwendung eines Filtrierhilfsmittels (HYFLO) abfiltriert ; die verbleibende Flüssigkeit zeigt eine Aktivität von 46 Einheiten je ml. Der Filterkuchen wird mit einer geringen Menge Wasser gewaschen und dann in Wasser aufgeschlämmt, worauf mit 6n-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt wird. Die Suspension wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen.

   Bei Prüfung des Filtrates wird festgestellt, dass ein Reaktionsprodukt mit einer Aktivität von 407 Einheiten je mg vorliegt. 



     Beispiel 4 : 14 l   einer klaren und nahezu farblosen Ristocetinsulfatlösung (Aktivität 3900 Einheiten je   ml,   entsprechend einer Aktivität von 455 Einheiten je mg) werden mit gepulvertem Natriumbicarbonat auf PH 7,6 eingestellt. Es werden 57 g Salicylaldehyd zugegeben, worauf 1, 5 Stunden gerührt wird. Der sich abscheidende hellgelbe Festkörper wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 400 C getrocknet. Es werden 50 g eines Reaktionsproduktes mit einer Aktivität von 732 Einheiten je mg erhalten. 



   Beispiel 5: 3g einerRistocetin-Salicylaldehyd-Verbindung (Aktivität 630 Einheiten je mg) werden in 10 ml Wasser suspendiert und mit 1 ml   6n-Schwefelsäure   angesäuert. Die Lösung wird zu 190 ml Aceton gegeben und gerührt. Es wird ein körniges Produkt erhalten, das abfiltriert, in Aceton gewaschen und im 
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 je mg werden in 50 ml Wasser suspendiert und mit 6n-Schwefelsäure auf einen PH-Wert von 2,0 eingestellt. Dann wird der Salicylaldehyd mit Chloroform ausgeschüttelt. Es wird noch zweimal mit Chloroform nachextrahiert, worauf die Chloroform extrakte (insgesamt 24 ml) vereinigt werden. Die Menge des 
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 beträgt 428 mg. 



     Beispiel 7 : 3 l Ristocetinsulfatlösung   (Aktivität 3900 Einheiten je ml, entsprechend 455 Einhei- 

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 ten je mg) werden mit   Natriumhydroxydlösung   auf PH 8, 1 eingestellt. Es werden 10 ml Salicylaldehyd zugesetzt, worauf 1, 5 Stunden gerührt wird. Das Reaktionsprodukt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 600 C getrocknet. Die Ausbeute beträgt 12 g Reaktionsprodukt mit einer Aktivität von 795 Einheiten je mg (Ruckgewinnungsquote = 80, 5   0/0).   



     Bei spie 1 8 : 11 einer wässerigen Ristocetinsulfatlösung   (Aktivität 3900 Einheiten je ml) wird mit gepulvertem Natriumbicarbonat auf PH 7,7 eingestellt. Es werden 10 ml Zimtaldehyd zugesetzt, worauf 1, 5 Stunden gerührt wird. Das sich abscheidende Reaktionsprodukt wird abfiltriert, mit einer geringen Menge Wasser gewaschen und im   Vakuum   bei 400 C getrocknet. Beim biologischen Test mit der schwach 
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 enthält 2,   75 %   Wasser und 0, 06 % Asche. Die Rückgewinnungsquote, bezogen auf Ristocetin-Aktivität, beträgt 92   0/0.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Abscheidung und Reinigung des Antibiotikums Ristocetin aus dessen wässerigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einer Lösung, die das Antibiotikum als Base oder als wasserlösliches Salz enthält, insbesondere aus einer Lösung des Antibiotikums mit einem PH- Wert von etwa 7 bis 8, unter Zusatz eines aromatischen Aldehyds, vorzugsweise Salicylaldehyd oder Zimtaldehyd, das Antibiotikum ausfällt und gegebenenfalls den Aldehydanteil aus dem Fällungsprodukt unter Ansäuern, insbesondere mit einer Mineralsäure, z. B. mit Schwefelsäure, abtrennt.