DE2415310B2 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von l-aepfelsaeure - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Äpfelsäure aus Fumarsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Lösungen von Fumarsäuresalzen mit Faser- bzw. Filamentstrukturen, die Fumarase in Form von sehr kleinen Tröpfchen von Emulsionsgröße umhüllen, in Kontakt bringt.

Das Enzym Fumarase, das aus verschiedenen Quellen extrahiert wird, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren als Katalysator in heterogener Form verwendet, da es in Faserstrukturen eingeschlossen ist, aus denen das Enzym nicht entweichen kann, während es sich in Kontakt mit dem Substrat befindet.

In der Nahrungsmittelindustrie besteht ein Interesse an organischen Säuren, wie Zitronensäure oder Weinsäure, zur Verwendung als saure Substanzen. Kürzlich wurde auch die Eignung von Apfelsäure für den vorstehenden Zweck untersucht. Obwohl die Verwendung von racemischen Verbindungen bekannt war, ist es offensichtlich, daß die Verwendung des natürlichen Isomeren, d. h. der L-Äpfelsäure, die in großer Menge im menschlichen Körper als Zwischenprodukt der meisten wichtigen metabolischen Cyclen hergestellt wird, eine größere Sicherheit, insbesondere auf dem Gebiet der Babynahrungsmittel liefert. Zur Äpfelsäureherstellung wurden viele Verfahren vorgeichlagen. So gibt es einerseits die chemischen Synthesemethoden, die racemische Verbindungen mit den vorstehenden Nachteilen liefern, darüber hinaus enthält die durch synthetische Methoden hergestellte Apfelsäure immer Maleinsäure als Verunreinigung, die mittels teurer Verfahren auf Grund ihrer hohen toxischen Eigenschaften entfernt werden muß. Andere Methoden stellen die mikrobiologischen Methoden dar, die jedoch, selbst wenn sie den Vorteil haben, das natürliche Laevoprodukt zu liefern, teuer und aufwendig sind; darüber hinaus sind tatsächlich die Konservierung des mikrobiologiischen Stammes bzw. des Bakterienstammes, die Fermentation unter Verwendung teurer und großer Anlagen sowie die Verwendung des Ausgangsmaterials, von Druckluft und Dampf weitere Nachteile der vorstehenden Methoden. Darüber hinaus bringt die Abtrennung der Apfelsäure aus dem Fermentationsmedium einige Schwierigkeilten auf Grund der Tatsache mit sich, daß das Produkt zusammen mit verschiedenen Verunreinigungen vorliegt.

Aus der kanadischen Patentschrift 6 27 019 ist eine enzymatische Methode unter Verwendung des löslichen Enzyms bekannt. Diese Methode weist jedoch verschiedene Nachteile auf: Die Verschmutzung des Endprodukts, die Notwendigkeit, das Enzym zu inaktivieren, die Verwendung von großen Enzymmengen, das lediglich einmal verwendet wird und daher die Kosten des Verfahrens stark belasten würde.

Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Durchführung der enzynatischen Hydratisierung von Fumarsäure zu L-Äpfelsäure auf sehr einfachem Wege. Die Einheit bzw. Vorrichtung besteht aus einer einfachen Säule; das feststehende bzw. festsitzende und unbewegliche Enzym kann mehrfach erneut verwendet werden und verunreinigt das Produkt nicht; letzteres kann leicht aus der Reaktionsmischung abgetrennt werden.

Die Faserstrukturen, die verwendet werden können. und das Medium zur Umhüllung des Enzyms sind in der italienischen Patentschrift 8 36 462 bzw. der deutschen Patentschrift 19 32 426 beschrieben, wonach die das Enzym einschließenden bzw. umhüllenden Fasern aus Polymerlösungen hergestellt werden können, die dazu geeignet sind, Fasern zu ergeben, in denen Enzympräparate in Form von sehr kleinen Tröpfchen von Emulsionsgröße dispergiert sind.

Die auf solchem Wege erhaltene Emulsion kann naß oder trocken zur Bildung einer Faser versponnen werden, die in ihrem Inneren sehr kleine Höhlungen aufweist, in denen sich die Enzyme befinden, die von der äußeren Umgebung durch eine sehr dünne Membrane getrennt sind, die das Enzym daran hindert, auszutreten und in das Reaktionsmedium hineinzudispergieren. wohingegen es dem Enzym möglich ist, seine katalytische Wirksamkeit auszuüben.

Unter den Polymeren, die das Enzym einschließen bzw. erhalten können, können folgende genannt werden: Veresterte und nitrierte Zellulosepolymere. Polyolefine, Acrylnitrilpolymere und -copolymere, Acrylat, Methacrylat, Vinylester, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Styrolpolymere sowie Polyamide oder Polyvinylbutyral.

Mit den auf solche Weise erhaltenen enzymatischen Fasern, die in eine Säule eingebracht werden, ist es möglich. Fumarsäure in L-Äpfelsäure durch ein kontinuierliches Verfahren umzuwandeln, das leicht automatisiert werden kann.

Eine Pumpe beschickt die Natriumfumaratlösung (mit einer Konzentration im Bereich von 0,1 und 1,2 Mol/Liter und bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 9,0) in eine Kolonne, die den Katalysator enthält. Je nach den Fluß- und Temperaturbedingungen wird in dem ausfließenden Strom eine Konzentration von L-Äpfelsäure erhalten, die meistens den Wert des thermodynamischen Gleichgewichts erreicht.

Aus dem Abstrom wird die nicht umgesetzte Fumarsäure durch Ansäuern entfernt und recyclisiert. Die L-Äpfelsäure kann nach verschiedenen Methoden entweder im kristallinen reinen Zustand oder im konzentrierten, sirupartigen Zustand gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel i

10 g Zellulosetriacetat wurden unter Rühren in 140 g Methylenchlorid gelöst.

Die Enzymlösung wurde durch Auflösen von Fumarase (extrahiert aus Hausschweinen) in einer Konzentration von 20 mg Protein pro ml in einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 hergestellt. 10 ml der Enzymlösung wurden zu der organischen Triacetatlösung gefügt und die Emulsion aus zwei Phasen wurde

durch heftiges Rühren bei 0°C während 30 Minuten in die Wege geleitet.

Die Emulsion wurde in eine Spinndüse gegossen und unter Stickstoffdruck gesponnen. Der Faden bzw. die Faser wurde in Toluol bei Raumtemperatur koaguliert und auf einer Garnspule gesammelt Die erhaltene Faser wurde im Vakuum zu Entfernung der organischen Lösungsmittel getrocknet.

Eine Probe von 2 g Faser wurde nach Waschen mit Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 in 50 m! einer lOm-Lösung von Natriumfumarat getaucht. Die Mischung wurde bei einer gesteuerten Temperatur von 25°C gerührt. Nach 90 Minuten wurden in der Reaktionsmischung 20,5% der Ausgangsfumarsäure festgestellt, der Rest (79,5%) -var in L-Äpfelsäure umgewandelt.

Die gleiche Faser behielt 40% ihrer Ausgangsaktivität nach 10 aufeinanderfolgenden Benutzungen bei.

Beispiel 2

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Nach der gleichen Arbeitsweise wie im Beispiel 1 beschrieben wurde ein rohes Enzympräparat von Fumarase, das aus Mikrobenzellen von Paracolobactrum aerogenaides erhalten wurde, in Zellulosetriacetatfasern eingearbeitet.

450 g nasse Zellen, die durch übliche Methoden durch aerobe Fermentation erhalten worden waren, wurden einer Ultraschalleinwirkung während 20 Minuten unterzogen; die Nucleinsäuren wurden mit MnCb entfernt und das Enzym wurde mit Ammoniumsulfatlö- y> sung mit einer Konzentration von 40 bis 60% der Sättigung ausgefällt. Die Ausfällung wurde erneut in einem O.Olm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die Lösung enthielt 49 mg Protein pro ml und wies eine Aktivität von 45 Einheiten/ml auf (die Aktivitätseinheit ist die Menge Enzym, die 1 μΜοΙ in 1 Minute bei 25°C umwandelt). 100 ml dieser Lösung wurden gemäß Beispiel 1 in Fasern eingeschlossen.

Eine Probe von 85 g Fasern wurde in eine Säule (65 χ 3 cm), die thermostatisch auf 25° C gehalten wurde, eingebracht; vom Boden zum Kopf der Säule wurde eine O,5m-Natriumfumaratlösung in einem Phosphatpuffer mit einer Flußgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde eingeleitet.

In dem Abstrom betrug die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure 54%. Nach 35 Tagen kontinuierlicher Verwendung der gleichen Faser fiel die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure auf 38% ab.

Beispiel 3

Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde ein rohes, enzymatisches Präparat von Fumarase, erhalten aus Mikrobenzellen von Pseudomonos sp., in Zellulosetriacetatfasern eingeschlossen. 315 g nasse Zellen, die durch übliche aerobe Fermentationstauchmethoden erhalten worden waren, wurden der Einwirkung von Ultraschallwellen während 20 Minuten unterzogen; die Nucleinsäuren wurden mittels Protaminsulfat entfernt und das Enzym wurde mit 30 bis 60% des Sättigungswertes von Ammoniumsulfat ausgefällt. Der Niederschlag, der das Enzym enthält, wurde in einem O.lm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst.

Die Lösung enthielt 61,5 mg Proteine pro ml und wies eine Aktivität entsprechend 80 Einheiten/ml auf (die Aktivitätseinheit ist die Menge Enzym, die 1 μΜοΙ Substrat in einer Minute bei 25° C umwandelt). 100 ml dieser Enzymlösung wurden in Fasern gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 eingeschlossen.

Eine Probe von 70 g der Fasern wurde in eine Säule (60 χ 3 cm) gefüllt, die bei 25²C thermostatisch gehalten wurde.

Eine 0,5m-Natriumfumaratlösung in einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 wurde vom Boden zum Kopf der Säule mit einer Flußgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde geleitet. In dem Abstrom betrug die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure 60%. Die Reaktion, die die enzymatischen Fasern enthielt, wurde kontinuierlich während 60 Tagen ohne merklichen Aktivitätsverlust verwendet. Aus der Reaktionsmischung wurde die Fumarsäure durch Ansäuern entfernt und recyclisiert wobei man eine 90%ige Wiedergewinnung erzielte.

Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum auf sirupartige Konsistenz konzentriert und die anorganischen Salze wurden hieraus entfernt. Die L-Äpfelsäure wurde mit Alkohol extrahiert und durch Zusatz von Chloroform ausgefällt. Die L-Äpfelsäure wies eine Reinheit von 100% auf; die Ausbeute betrug 60%.

Beispiel 4

Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurde eine enzymatische Lösung, die aus Mikrobenzellen von Pseudomonas sp. erhalten worden war, in Zellulosetriacetatfasern eingeschlossen.

500 g nasse Zellen, die aus einer aeroben Tauchfermentation erhalten worden waren, wurden der Einwirkung von Ultraschall während 20 Minuten unterzogen; die Nucleinsäuren wurden mit MnCb entfernt; die Proteinlösung wurde 10 Minuten auf 50°C erwärmt; das Enzym wurde mit Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 40% ausgefällt Der Niederschlag wurde in einem O.Olm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 8 löslich gemacht

Die Lösung enthielt 60 mg/ml Proteine und eine Aktivität entsprechend 150 Einheiten/ml. 50 ml dieser Lösung wurden in Zellulosetriacetat gemäß den vorstehenden Ausführungen eingeschlossen.

Eine Faserprobe von 80 g wurde in eine Säule (60 χ 3 cm) eingebracht, die thermostatisch auf 25⁰C gehalten wurde. Vom Boden der Säule wurde eine 0,5m-Lösung von Ammoniumfumarat im Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einer Flußgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde eingeführt.

Im Abstrom betrug die Umwandlung von Fumarsäure in L-Äpfelsäure 75%.

Beispiel 5

Eine enzymatische Lösung, erhalten aus Pseudomonas sp.-Mikrobenzellen, wurde gemäß den Ausführungen von Beispiel 2 in Zellulosetriacetat eingeschlossen.

Eine aus 80 g einer derartigen Faser bestehende Probe wurde in eine Säule (60 χ 3 cm) eingebracht, die thermostatisch auf 25⁰C gehalten wurde. Vom Boden der Säule wurde eine Lösung zum Kopf der Säule geleitet, die aus 0,06m-Calciumfumarat im Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 bestand; die Flußgeschwindigkeit betrug 50 ml/Stunde. In dem Abstrom wurde eine L-Äpfelsäuremenge bestimmt, die einer 70%igen Umwandlung von Fumarsäure entsprach.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Äpfelsäure aus Fumarsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man Lösungen von Fumarsäuresalzen mit Faser- bzw. Filamentstrukturen, die Fumarase in Form von sehr kleinen Tröpfchen von Emulsionsgröße umhüllen, in Kontakt bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Fumarase umhüllende Faser aus Zellulosetriacetatpolymeren besteht.