DE2832577C2

DE2832577C2 - Enzymatisches Mittel für die Isomerisierung von Glucose zu Lävulose

Info

Publication number: DE2832577C2
Application number: DE2832577A
Authority: DE
Inventors: Albert Bouniot; Michel Melle Guertineau; Guy Lartigau
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1977-07-27
Filing date: 1978-07-25
Publication date: 1982-09-16
Also published as: ES472067A1; IT7826193A0; JPS5444089A; BE869281A; GB2001654B; DK147108C; NL7807934A; DD137248A5; IE781508L; DK333278A; DE2832577A1; DK147108B; GB2001654A; JPS5819273B2; IE47038B1; ES479617A1; IT1097349B

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 genannte Mittel und das im Patentanspruch 6 angegebene Verfahren zur Herstellung dieses Mittels. Die Ansprüche 2 bis 5 und 7 bis 9 beinhalten Ausgestaltungen der Erfindung.

Die Verwendung von Glucoseisomerase für die Isomerisierung von Glucose zu Lävulose ist allgemein bekannt. Allgemein verwendet man immobilisierte Glucoseisomerase. um in technischem Maßstabe gute Ergebnisse zu erzielen und vor allem um kontinuierlich arbeiten zu können. Dieses Enzym wird von verschiedenen Mikroorganismen erzeugt Man kann es entweder aus der Nährlösung extrahieren und gegebenenfalls reinigen oder unmittelbar die aus der Nährlösung abgetrennten Zellen verwenden, die das Enzym enthalten; diese Verfahrensweise ist weniger umständlich.

Man hat bereits zahlreiche Verfahren untersucht, um Enzyme allgemein und Glucoseisomerase insbesondere zu immobilisieren. Hierzu kann das Enzym auf mineralischen (anorganischen) Trägern absorbiert werden, beispielsweise auf Aktivkohle oder auf verschiedenen Erdalkalicarbonaten oder Erdalkalioxiden. Gemäß der FR-PS 22 01341 wird die Glucoseisomerase auf basischem Magnesiumcarbonat absorbiert. Diese Verfahrensweise läßt sich aber nur auf extracellular Glucoseisomerase anwenden.

Es wurde weiterhin versucht, die Enzyme oder die Zellen, welche die Enzyme enthalten, mit semipermeab-Ien polymeren Stoffen zu umhüllen, bzw. sie darin einzubetten, beispielsweise in Polyamide oder Cellulosederivate. Die dabei erhaltenen Massen können dann zu Filmen. Folien. Fasern oder Teilchen (Granulat) verarbeitet werden (FR-PS 1306640. 20 16 102 und 21 ~>9 105).

Es ist weiterhin bekannt, Zellen, welche das Enzym enthalten, in ausgeflockte Polyelekv/olyte einzubetten (FR PS 21 45 486) und die mechanische Festigkeit der hierbei enthaltenen Massen durch Zugabe von mineralischen Magnesium-, Calcium . Eisen- und Manganverbin düngen zu erhohen (FRPS 22 15 966).

Zwar enthält man mit Hilfe dieser verschiedenen Verfahren Mittel mit einer zufriedenstellenden An fangs-F.nzymaktivität oder mit einer guten Abriebfestig keit; diese Verfahren bringen aber nichts im Hinblick auf eine Verbesserung der Lebensdauer der Präparate hinsichtlich der enzymatischen Aktivität. Diese Lebensdauer beträgt allgemein nicht mehr als 2 Wochen,

Andererseits weiß man, daß die üblicherweise Verwendeten Glucoseisomerasen nur dann gute Ergeb* nisse liefern, wenn in dem Sirup der Glucose, die isomerisiert werden soll, Magnesiumionen sowie gegebenenfalls in geringer Menge Köbaltionen vorhanden sind. Dies bedeutet, daß der erhaltene Lävulosesirup mit Ionenaustauschern enlminefalisiert bzw, entsalzt wer··

den muQ, wodurch sich die Herstellungskosten für die Lävulose (Fruchtzucker, Fructose) erhöhen.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes enzymatisches Mitte! auf der Basis von intracellulärer Glucoseisomerase zur Verfugung zu stellen, das sich durch eine verlängerte Lebensdauer auszeichnet und bei dessen Verwendung nur wenig oder überhaupt keine Magnesiumionen im Glucosesirup vorhanden sind und auch keine Kobaltionen zum Glucosesirup zugesetzt werden müssen. ι ο

Die Aufgabe wird bei einem Mittel gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Plättchen oder Fäden zusätzlich mindestens 5 bis 100Gew.-°/o, bezogen auf die trockenen Mikroorganismenzellen, einer Magnesiumverbindung enthalten, die je Liter Wasser 1 bis 50 mg Magnesiumionen freisetzt oder abgibt

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung enthalten die Plättchen oder Fäden außerdem eine Kobaltverbindunp die je Liter Wasser 1 bis 20 mg Kobaltionen freibe M oder abgibt:

Die in Wasser wenig löslichen Magnesiumverbindungen werden vorzugsweise unter folgenden Verbindungen ausgewählt: Magnesiumoxid, Magnesiumphosphat, basisches Magnesiumcarbonat oder deren Gemische, beispielsweise technische Gemische wie Magnesiumhydroxycarbonat Insbesondere das dre<basische (neutrale) Magnesiumphosphat wird gerne verwendet. Auch das Magnesiumhydroxid eignet sich gut als entsprechende Magnesiumverbindung.

Als in Wasser wenig lösliche Kobaltverbindungen werden vorzugsweioe Verbindungen des zweiwertigen Kobalts verwendet wie Kotalt-II-h droxid, Kobalt-II-carbonat, Kobalt-1l-orthophosf hat und/oder Kobalt-II-oxalat.

Diese Verbindungen, hier auch als Füllstoffe bezeichnet, haben nicht nur die Aufgabe, die Mittel zu beschweren, sondern auch das Enzym zu adsorbieren und die ihm notwendigen Magnesium- und Kobaltionen zur Verfügung zu stellen.

Derartige Füllstoffe im Sinne der erfindungsgemäß eingesetzten Magnesium- und gegebenenfalls Kobaltverbindungen sind auch Kationenaustauscherharze mit Sulfonsäuregruppen, die mit Mg*⁺ oder Mg'*- + Co* *-Ionen abgesättigt sind und die bei einer Temperatur von etwa 50°C luftgetrockent und dann zu Teilchen mit Durchmesser < 0,25 mm vermählen wurden. Derartige sulfonsaure Harze werden in der Literatur vielfach beschrieben (Ion exchange Technology F. C. Nachod. Jack Schubert Academic Press. New York 1956).

Die Mikroorganismen, deren Zellen in den erfindungsgemäßen Mitteln verwendet werden, sind solche Organismen, die eine Glucoseisomerase erzeugen, deren en/ymatische Wirkung in Gegenwart von Magnesiumionen und Kobaltionen manifest wird. Hier/u gehören beispielsweise Aerobacter cloacae, die Arthrobacter-Arten. Bacillus coagulans. Lactobacillus brevis, Sireptomyces sp. (echinates, flavovirens. achromogenes, albus, olivaceus, olivochromogenes, violaceoniger, bikiniensis, Venezuelas, etc.), Aetinoplanes missouriensis usw. Günstig ist der Mikroorganismus Sireptomyces phaeochromogenes.

Zur Herstellung der Plättchen oder Fäden wird als Celluloseester am besten Cellulosediacetat oder ein technisches Gemisch aus Cellulosediacetat Und Triacetat verwendet, wie sie auch zur Herstellung von Collodium eingesetzt werden.

Der Celluloseester, als Feststoff gerechnet, macht zweckmäßig etwa 50 Gew,-°/o aus, bezogen auf die getrockneten Mikroorganismuszellen.

Die Magnesiumverbindung sowie gegebenenfalls Kob3ltverbindung macht am besten etwa 50Gew.-% aus, bezogen auf die getrockneten Ze'len, Dabei kann der Anteil der Kobaltverbindung bis zu 50 Gew.-% der Summe aus Magnesium- und Kobaltverbindung ausmachen.

Wenn die maximale Menge an Magnesium- und gegebenenfalls Kobaltverbindung sowie Celluloseester die oben angegebenen Grenzen übersteigt, wird die enzymatische Aktivität des Mittels beeinträchtigt Wird andererseits zu wenig Celluloseester verwendet, so erhält man ein Produkt, das schlecht zusammenhält

Nachfolgend werden die günstigsten Anteilsbereiche für Zellen von Mikroorganismen, Celluloseester und Füllstoff angegeben. Die Gewichtsverhältnisse zwischen den verschiedenen Komponenten des enzymatischen Mittels beziehen sich jeweils auf den Feststoff bzw. die Trockenmasse:

40 bis 60 Gew.-°/o Zellen von Mikroorganismen

20 bis 30 Gew.-% Celluloseester

20 bis 30 Gew.-% Füllstoff in Form von 15 bis 20 Gew.-% Magnesiu-nverbindung und 5 bis 10Gew.-°/o Kobaltverbindung.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels wird in der Weise verfahren, daß man die Zellen des Mikroorganismus von dem Substrat, auf dem sie sich entwickelt haben, abtrennt, die erhaltene Aufschlämmung bis zu einem Feststoffgehalt von 20 bis 95% einengt, mit 5 bis 100%. bezogen auf das Zellengewicht, eines Füllstoffes vermengt, der aus 50 bis 100% einer Magnesiumverbindung, die je Liter Wasser I bis 50 mg Magnesiumioren freisetzt oder abgibt, sowie 0 bis 50% einer Kobaltverbindung, die je Liter Wasser 1 bis 20 mg Kobaltionen freisetzt oder abgibt, bestehe, daß man dem erhaltenen Gemisch den Celluloseester zusetzt in einer Menge von 25 bis 100%. bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen, sowie in Form eines Sols mit einer Konzentration von 5 bis 20% in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, worauf man ein Lösungsmittel zusetzt in einer Menge, die gleich ist dem Gewicht der getrockneten Zellen oder bis zum lOfachen dieses Gewichtes beträgt sowie soviel Wasser, daß die im Endgemisch enthaltene Menge Wasser das 0.6- bis 8fache des Gewichtes des Celluloseester ausmacht, wobei das Gewichtsverhältnis von Wasser zu Lösungsmittel im Endprodukt <0.2 ist. und das erhaltene pastenartige Gemisch verformt und langsam bei einer Temperatur von 15 bis 30°C trocknet.

Die Zellen werden vor dem Abzentrifugieren einer Wärmebehandlung unterworfen, um die Zellenmasse ru sterilisieren und gewisse andere unerwünschte Enzyme wie die Proteasen, die hitzeempfindlicher sind als Glucoseisomerase. ?u zerstören. Die dann erhaltene Aufschlämmung wird am besten auf einen Feststoffgehalt yon etwa 30% getrocknet

_i Die zugesetzte Menge Füllstoff aus Magnesiumverbindung und gegebenenfalls Kobaltverbindung und der Anteil an Celluloseester, beispielsweise dem oben erwähnten technischen Gemisch aus Cellulosed!- und 'triacetat, machen zweckmäßig jeweils 50% des Gesamtgewichtes der Zellen aus.
, Das Celluloseester! enthält am besten etwa 10%

Celluloseester in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, zweckmäßig in Aceton.

Vorteilhafterweise wird das gleiche Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel, das zur Herstellung des Celluloseestersols verwendet wurde, zugesetzt, um dem Endgemisch die für die Formgebung gewünschte oder notwendige Konsistenz zu verleihen. Der Wasseranteil im Endgemisch macht am besten etwa das 3fache des Gewichtes <ies eingesetzten Celluloseester aus, unter Berücksichtigung der Feuchtigkeit bzw. des Wassergehaltes der Zellen.

Die Grenzen für die Anteilsmengen an Wasser, Lösungsmittel und Celluloseester bedingen die Eigenschaften des Endproduktes: mit zu wenig Wasser wird ein nicht ausreichend poröses Gefüge und infolgedessen eine schlechte Austauscherkapazität erhalten; mit zu viel Wasser oder zu wenig Lösungsmittel weist das Endprodukt nicht die ausreichende Kohäsion auf und hält das Enzym schlecht zurück.

Wenn die Wände der enzymhaltigen Zellen für das Enzym stark durchlässig geworden sind, wie dies je nach den angewandten Bedingungen der Γ-.üchtung des Mikroorganismus, der nachfolgenden Wärmebehandlung oder Abtrennung häufig der Fall ist, werden die Zellen am besten einer leichten Behandlung mit Glutaraldehyd unterworfen, die am Ende der Wachstumsstufe erfolgen kann oder mit der Zellenaufschlämrnung vorgenommen wird, zweckmäßig bereits in Gegenwart des Celluloseester, jedoch vor Einbringen des Füllstoffs: diese wird dann zuletzt zugegeben. Die Behandlung kann jedoch auch, wie weiter unten gezeigt, noch nach der Verformung des Gemisches vorgenommen werden. Die Behandlung erfolgt mit 0,5 bis 6% Glutaraldehyd. am besten mit etwa 3% Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen. Zweckmäßig sollen die Zellen innig mit dem Glutaraldehyd gemischt werden und etwa 10 Minuten bis zu einer Stunde bei 10 bis 30⁰C reagieren.

Schließlich enthält die fließfähige Paste, die gegebenenfalls lit Hilfe eines Propeller- oder Turbinenrührers homogenisiert worden ist. die Zellen, den Füllstoff, den Celluloseester, Wasser. Lösungsmittel sowie gegebenenfalls Glutaraldehyd.

Diese Paste kann in dünner Schicht (1 bis 3 mm Stärke) ausgebreitet und bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C an der Luft getrocknet werden. Nach etwa einer Stunde, wenn die Folie noch nicht brüchig ist, kann man sie in kleine Stücke von einigen mm Kantenlänge zerschneiden. Nach dem Ablösen der Paste von der Unterlage wird weit«.; getrocknet und darauf geachtet, daß die Brüchig-Phase nicht erreicht wird.

FaIk gewünscht, kaiin die Glutaraldehydbehandlung in diesem Stadium der Herstellung vorgenommen werden, mittels Eintauchen der Plättchen in eine wäßrige Glutaraldenydlösung.

Darauf kann das erhaltene Produkt zum Isomerisieren von Gluco<.clösungen eingesetzt werden.

Die Plättchenform stellt eine zweckmäßige Ausführungsform des Mittels dar. Man kann aber die erhaltene Paste auch auf beliebig geeignete andere Weise Verformen, insbesondere mittels Strangpressen oder Extrudieren, wenn Fäden anstelle von Plättchen erwünscht sind. Die Fäden werüen, bevor sie gegebenenfalls durch und durch getrocknet werden, unmitte!» bar nach dem Strangpressen an der Oberfläche koaguliert, entweder mit einem Heißluflstrom öder durch Eintauchen ir Wasser während einiger Minuten. Die Plättchen und die Fäden können entweder trocken oder suspendiert in einer Flüssigkeit, am besten in Wasser, dem ein geeignetes Antiseptikum (Konservierungsmittel), beispielsweise Formol bzw. Formaldehyd, zugesetzt worden ist, aufbewahrt werden.
Das erfindungsgemäße Mittel zeichnet sich durch zahlreiche Vorteile aus, vor allem dadurch, daß es für eine kontinuierliche Arbeitsweise in einer Kolonne geeignet ist.

Die mechanische Festigkeit des erfindungsgemäßen Mittels ist ausgezeichnet, selbst nach sehr langer Gebrauchszeit Der Druckabfall beim Durchgang der Lösung, weiche isomerisiert werden soll, durch die Kolonne ist sehr gering und in der Zeit konstant

Die Lebensdauer des Mittels ist sehr gut Die Halbwertszeit bezüglich der Aktivität, d. h. die Zeitspanne, nach der die Aktivität des Präparates um die Hälfte abgenommen hat, übersteigt leicht 1000 Stunden. Außerdem erfolgt der Aktivitätsverlust außerordentlich allmählich und regelmäßig.

Die mittlere Geschwindigkeit f^r>r die Produktion an Lävulose je Gewichtseinheit ist gu<

Den Lösungen, die isomerisieri werden sollen, brauchen keine Magnesium- oder Kobaltionen in Form löslicher Salze zugegeben werden; die als Füllstoff zugegebene Magnesium- und gegebenenfalls Kobaltveroindung reicht aus, um das Enzym zu aktivierea Auf jeden Fall übersteigt die Menge der Magnesiumionen in dem erhaltenen Lävulosesirup nicht den Wert von 10 mg/1, was im Hinblick auf Lebensmittelreinheit vollkommen zulässig ist. Der Kobaltgehalt macht maximal 1 mg/1 aus. Infolge dieser sehr geringen Konzentrationen an Magnesium- und Kobaltionen brauchen keine langwierigen und kostspieligen Reinigungsmaßnahmen vorgenommen zu werden: der isomerisierte Sirup ist außerdem frei von Verunreinigungen oder Begleitstoffen.

Das erfindungsgemäße Mittel für die Isomerisierung

von Glucose kann folgendermaßen eingesetzt werden:

Die Plättchen oder sehr kurzen Fäden werden in ein senkrechtes Zylinderrohr gegeben, beispielsweise aus Glas, das mit einem Mantel umgeben ist und durch umlaufendes Wasser bei einer Temperatur von 50 bis 75^C, vorzugsweise etwa 60⁰C gehalten wird. Diese Säule wird am besten von oben, mit einer wäßrigen Glucoselösung beschickt. dere" Konzentration 60Gew.% nicht übersteigt und zweckmäßig bei etwa 45Gew.-% liegt. Das enzymatische Mittel wird von dieser Flüssigkeit bedeckt. Zuvor wird der pH-Wert der zugespeisten Lösung auf 8 bis 9, am besten etwa 8.5 eingestellt, beispielsweise mit Natronlauge. Zweckmäßigerweise wirii die Zulaufgeschwindigkeit so eingestellt, daß ein während des gesamten Arbeitsgunges konstanter Umwanaiungsgrad der Glucose erzielt wird. Line gute Rentabilität wird erreicht, wenn dieser Umwandlungsgrad allgemein im Bereich vori 40 bis 50%, am besten bei etwa 42% liegt. Dies bedeutet, daß die Zulaufgeschwindigkeit allmählich gedrosselt wird, in dem Maße, in dem die Aktivität des Mittels abnimmt. Die austretend Lösung enthält allgemein 2 bis 10 mg

Magnesiumionen/I und niemals mehr als 1 mg Kobaltionen/l.

Der pH^Wert braucht im Verlauf des Aroehsganges nicht erneut eingestellt zu Werden- Der pH'Weft der austretenden Lösung liegt bei etwa 7,5.

In den aUstfe ipnden isomerisierten Lösungen beobachtet man keine anormale Färbung oder Verfärbung, äußer innerhalb der ersten Betriebssiunden. Um dies zu beheben, kann während dieser allerersten Betriebsstun-

dc die Einspeisungsgeschwindigkeit der Glticoselösung erhöht werden, so daß die Säule damit gewaschen wird. Bei normalen Betrieb bleibt die Zunahme der Verfärbung der Lösung zwischen Eintritt und Austritt ausderSäule unterhalb 20 APHA (ASTM D 1209-54).

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung. Die entstandene Lävulose wurde quanlitativ colorimeirisch mit Anlhron bestimmt, mit Bezug auf Lösungen mit bekannten Gehall (Halhool und Kleinbert — Analytical Biochemistry, 50, S. 337— ι« 343.1972).

Die in F./g angegebene enzymatische Aktivität bezeichnet die Anzahl der Mikromolc Lävulose. in 1 Minute bei pH 7.5 und bei 60"C entstanden sind.

Beispiel I

Es wurde eine Aufschlämmung mit 16% Feststoff verwendet, die beim Zentrifugieren des Inhaltes eines Produktionskesscls für Streptomyces phaechromogenes erhalten worden war. Die Aktivität der Zellen betrug λ. 150 E/g Feststoff (Trockenmasse). Die Aufschlämmung wurde in einem belüfteten Trockenschrank bei 35 bis 40" C stehengelassen, bis man eine Paste mit 30% Feststoff erhielt. 52 g dieser Paste wurden mit 1.1g Magnesiumhydroxycarbonal vermischt und dann mit .''· 69 ml einer Lösung aus Cellulose in Aceton (100 g/l) versetzt. Dann wurden 60 ml Aceton zugegeben und das ganze mit einem Propellerrührer (11 000 UpM) während einiger Minuten homogenisiert. Die Aufschlämmung bzw. Paste wurde auf Glasplatten ausgebreitet in ω einer Schichtdicke von 2 bis 3 mm mit Hilfe der Vorrichtung zur Herstellung von Platten für die Dünnschichtchromatographie. Nach 2stündigem Trocknen an der Luft wurden die Schichten zu kleinen Plättchen mit Kantenlänge 3 bis 5 mm zerschnitten. Die Plättchen wurden von der Unterlage abgelöst und fertig getrocknet bis zu einem Feststoffgehalt von 80 bis 90%. Das fertige enzymatische Mittel setzte sich wie folgt zusammen (die Prozentangaben beziehen sich auf den Feststoffgehalt): w

66% Zellen von Mikroorganismen
4.7% Magnesiumhydroxycarbonat
293% Celluloseacetat.

Die gemessene Aktivität dieser Plättchen betrug « 52 E/g; dies entsprach einer Ausbeute bezüglich der Fixierung von etwa 50%.

25 g dieses enzymatischen Mittels wurden in ein senkrechtes zylindrisches Glasrohr mit Durchmesser 25 mm gegeben, das mit einem Mantel ausgestattet war. durch den Wasser von 60 bis 61° C umlief. Die so vorbereitete Säule wurde mit einer Glucoselösung. Konzentration 450 g/1, gefüllt, bis das enzymatische Mittel vollständig von der Lösung bedeckt war. Der pH-Wert der Glucoselösung wurde auf 8,5 bis 8.7 eingestellt mit Hilfe von Natronlauge. Die Zulaufgeschwindigkeit wurde so einreguliert, daß der Umwandlungsgrad konstant bei 42% blieb. Zu Beginn betrug die Einspeisungsgeschwindigkeit bzw. -menge 65 ml/h. Nach 900 h wurde sie um die Hälfte verringert and nach 2200 h auf ¹A des ursprünglichen Betrages. Die mittlere Produktion an Lävulose betrug zu diesem Zeitpunkt 480 kg/kg eingesetztes enzymatisches MitteL

Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesiumionen sank im Verlauf des Arbeitsganges von 10 auf

Der pH-Wert der austretenden Lösung betrug etwa 73-

Das mechanische Verhalten bzw. die mechanische Festigkeit des Mittels blieb unverändert und der Druckabfall lag unterhalb 1 cm Wasser/m.

Beispiel 2

Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt mil der Abwandlung, daß anstelle von Magnesiumhydroxycarbonat 2,2 g dreibasisches (neutrales) Magnesiumphosphat [Mgj(PO4)},8 H2O] eingesetzt Wurden und daß die verwendeten Zellen eine doppelt so hohe enzymalischc Aktivität je Gewichtseinheil Feststoff aufwiesen wie in Beispiel 1. Das fertige enzymatische Mittel setzte sich wie folgt zusammen (Prozentangaben bezogen auf Festsioffgewichi):

63% Zellen von Mikroorganismen
9% Magnesiumphosphat
28% Cellulose.

Das Mittel wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Die Zulaufgeschwindigkeil der Glucoselösung zu Beginn betrug 65 ml/h, wurde nach 1300 h auf die Hälfte und nach 1700 h auf V₄ verringert. Der Geahll der austretenden Lösung an Magnesiumionen lag in der gleichen Größenordnung wie im vorangegangenen Beispiel.

Beispiel 3

Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt mit der Abwandlung, daß als Füllstoff 1,1 g Magnesiumhydroxycarbonat und 1,1 g Kobalt-II-carbonat (CoCOj) eingesetzt wurden. Man erhielt ein enzymatisches Mittel folgender Zusammensetzung (% bezogen auf Feststoffgewicht):

63% Zellen von Mikroorganismen

4,5% Magnesiumhydroxycarbonat

43% Kobalt-II-carbonat
28% Celluloseacetat.

Das Mittel wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 75 ml/h, wurde nach 1000 h auf die Hälfte und nach 2250 h auf V« verringert.

Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesiumionen sank im Verlauf des Arbeilsganges von 9 auf 2 ml/I. Der Gehalt an Kobahionen blieb unterhalb 0,9 mg/1.

Versuch A

Zum Vergleich wurden Plättchen wie in Beispiel ! beschrieben hergestellt, ausgehend von der gleichen Aufschlämmung, jedoch ohne Zusatz von (anorganischem) Füllstoff.

Die fertigen Plättchen wurden in einen Rohrreaktor gegeben. Die Plättchen ließen sich schlecht schichten bzw. aufschütten, da sie dazu neigten, in der Zuckerlösung zu schwimmen. Die Speiselösung enihie.'t kein Magnesium. Um einen pH-Wert von 7.5 bei Austritt sicherzustellen, mußte der pH-Wert der einspeisenden Lösung auf 9 bis 93 eingestellt werden. Ass diese»! Grande war die austretende Lösung etwas verfärbt Um einen Umwandlungsgrad von 42% zu erreichen, mußte die Zulaufgeschwindigkeit zu Beginn

auf 30 ml/h für eine Lösurfg einhaltend 450 g/1 Glucose begrenzt werden. Nach lOOstühdigem Betrieb lag die ^laufgeschwindigkeit unterhalb 15 ml/h.

Beispiel 4

Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel bv<£hriebcn hergestellt mit der Abwandlung, daß ansVelle von Magnesiumhydroxycarbonat 2,2 g dreibasisches Magnesiumphosphat wie in Beispiel 2 sowie 1,1 g Kobalt-11-carbonat (CoCOO zugegeij'in wurden und daß die verwendeten Zellen eine doppelt so hohe Aktivität je Gewichtseinheit Trockenmasse aufwiesen, wie die Zellen des Beispiels I

Das fertige enzymatische Mittel setzte sich wie folgt zusammen (% bezogen auf Gewicht der Trockenmn«! se):

tn^Q/n 7e||pn unn Mikmnronnismen

8.5% neutrales Magnesiumphosphat
4.2% Kobaltli-carbonat
26.8% Celluloseacetat.

Das Mittel wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 65 ml/h, nach 1500 h die Hälfte und nach 1900 h ein Viertel.

Der Magnesium- und Kobaltgehalt der austretenden Lösung lag in der gleichen Größenordnung wie in Beispiel 3.

Et e i s ρ i e I 5

25 g plättchenförmnges enzymalisches Mittel gemäß Beispiel 3 wurden mil Wasser, das 0,5 g Glutaraldehyd enthielt, vollständig bedeckt und 30 min bei 20⁰C so belassen.

Darauf wurden die Plättchen abgeschleudert und das erhaltene Mittel für die Isomerisierung von Glucose eingesetzt, unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1. Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung zu Beginn betrag 45 ml/h und nach 1500 h die Hälfte hiervon.

Der Gehalt der austretenden Lösung an Magnesium- und Kobaltionen lag in der gleichen Größenordnung wie in Beispiel 3.

ΕΊ e i s ρ i e I 6

In den Kessel für die Züchtung von Streptomyces phaeochromogenes wurden am Ende der Produktionsstufe 6 g Glutaraldehyd je 100 g Trockenmasse zugegeben. Man ließ das ganze 1 h bei pH T5125" C in Berührung miteinander. Dann wurden die Zellen abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt bzw. verarbeitet Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 77 ml/h, war nach Π 00 h auf die Hälfte gefallen und nach 1600 h auf ein Viertel verringert

Der Gehalt der Lösung an Magnesium- und Kobaltionen lag in der gleichen Größenordnung wie in den vorangegangenen Beispielen.

Versuch B

Es wurde ein enzymatisches Mittel in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, jedoch ohne Zusatz von Füllstoff, jedoch mit Zugabe von 0,5 g Glutaraldehyd (in Form der handelsüblichen wäßrigen 25%igen Lösung) beim Vermischen der Celluloseacetatlösung mit der Zellenaufschlämmung. 25 g des fertigen ebenso beim Zirkulierenlassen der Lösung, da die Plättchen zum Schwimmen neigten.

Die Zulaufgeschwindigkeit der Glucoselösung betrug zu Beginn 48 ml/h, war nach 1500 h auf die Hälfte verringert und nach 2300 h auf ein Viertel.

Die Produktion an Lavulose betrag 560 kg/kg enzymatisches Mittel. Die austretende Lösung enthielt jedoch 100 mg/1 Magnesiumionen und mußte infolgedessen zusätzlich mit Ionenaustauschern gereinigt ·" werden.

Beispiel 7

In gleicher Weise wie in Beispiel I wurde eine Zellenaufschlämmung mit 50% Feststoffgehalt herge-

!"»stellt, deren Aktivität 25OE-Vg betrug. 100 g dieser Aufschlämmung wurden mit 13 g neutralem Magnesiumphosphat gemäß Beispiel 2. mit 125 ml einer Celluloseacctatlösung enthaltend 100 g/l sowie mit fin ml Aretnn vermischt. Das ganze wurde homogeni-

:<> siert und in den Zylinder einer Schmierpresse mit 2 mm weiter Öffnung gegeben. Der austretende Strang wurde in einem Behälter, der 21 Wasser von 25°C enthielt, aufgefangen. Die F.xtrudate blieben 2 min im Wasser, wurden dann abgeschleudert oder grob getrocknet und

_'> zum Fertigtrocknen in den belüfteten Ofenschrank von 35⁰C gegeben. Sobald sie brechbar geworden waren, was bei einem Feststoffgehalt von 85 bis 90% eintrat, wurden sie grob zerkleinert, zu Stäbchen von 3 bis 8 mm Länge und folgender Zusammensetzung (%. bezogen

so auf das Gewicht der Trockenmasse):

54% Zellen von Mikroorganismen
23,5% neutrales Magnesiumphosphat
22,5% Celluloseacetat.

Der Aktivitätstest ergab, daß sie eine Aktivität von 85 E/g aufwiesen: dies entsprach einer Ausbeute hinsichtlich der Fixierung von 70%.
25 g dieser Stäbchen wurden in ein Rohr für Langzeitversuche gegeben. Bei einer Zulaufgeschwindigkeit der magnesiumfreien Glucoselösung (450 g/l) zu Beginn von 120mI/h erhielt man einen Umwandlungsgrad zu Lavulose von 42%. Nach 600stündigem Betrieb betrug die Zulaufgeschwindigkeit noch 60 ml/h.

■is Die Gesamtproduktion an Lävoluse betrug anschließend 525 kg/kg eingesetzte Stäbchen bei einer mittleren Produktionsgeschwindigkeit von 15 kg/Tag.

Beispiel 8

Es wurde ein enzymatisches Mittel wie in Beispiel 7 hergestellt mit der Abwandlung, daß als Füllstoff 10 g neutrales Magnesiumphosphat gemäß Beispiel 2 sowie 3 g Kobaltcarbonat C0CO3 zugegeben wurden. Die erhaltenen Extrudate mit einem Feststoffgehalt von 85 bis 90% wurden zu 1 bis 8 mm langen Stäbchen zerkleinert, die folgende Zusammensetzung aufwiesen (% bezogen auf Gewicht der Trockenmasse):

54% Zellen von Mikroorganismen
18,1 % neutrales Magnesiumphosphat
5,4% Kobaltcarbonat
224% Celluloseacetat

Der Aktivitätstest ergab eine Aktivität von 100 E/g, entsprechend einer Ausbeute der Fixierung von 90%.
25 g dieser Extrudate oder Stäbchen wurden in ein

;i

Rohr für Langzeitversuche gegeben und dem Rohr 120 ml Glucoselösung/h. enthaltend 450 g/l, zugeführt; diese Glucoselösung enthielt keine Kobaltionen, aber Mittels wurden zum Isoinerisieren von Glucose unter den Bedingungen des Beispiels I eingesetzt; die Glucoselösung enthielt 450 g/l und wurde mit 1.23 g/l Magnesiumsulfat. MgSO₄ · 7 HjO versetzt. Beim Aufgeben in die Säu'g traten gewisse Schwierigkeiten auf. 10 mg Magnesiüinionen in Form des Phosphats je kg Lösung. Der Umwandlungsgrad betrug 42%. Nach 950stündigem Betrieb lag der Umwandlungsgrad immer noch bei 42% bei einer Zulaufgeschwindigkeit von 60 ml/h. Die Gesamtproduktion betrug 865 kg Lävulose je kg eingesetzte Stäbchen bei einer mittleren Geschwindigkeit von 14 kg/Tag, wenn die Produktion unterbrochen wurde, sobald 25% der ursprünglichen Zulaufgeschwindigkeit unter Aufrechterhaltung des ursprünglichen Umwandlungsgrades von 42% erreicht worden waren. Der ausfließende Sirup enthielt 10 mg Magnesiumionen je I isomerisierte Lösung sowie 0.8 mg Kobaltioncn je I Lusung.

Beispiel 9

Es wurde ein cnzymalisches Mitte! analog Beispiele hergestellt, jedoch ohn<; Zusatz von Kobaltverbindung.

Zur Isomerisierung der Glucoselösung wurden 25 g Extrudate eingesetzt, unter den Bedingungen des Beispiels 8. Die Zulaufgeschwindigkeit zu Beginn betrug 115 ml/h.

Nach öOOstündigem Betrieb lag die Zulaufgeschwindigkeit bei 58 ml/h für einen Umwandlungsgrad von 42%.

Nach 1300 h erreichte man 25% der ursprünglichen Zulaufgeschwindigkeit unter Beibehaltung des Umwandlungsgrades von 42%.

Die Gesamtproduktion an Lävulose betrug 620 kg/kg eingesetzte Stäbchen bei einer mittleren Geschwindigkeit von Q UaJTaa

Claims

Patentansprüche:

1. Enzymatisches Mittel für die Isomerisierung von Glucose zu Lävulose in Form von Plättchen oder Fäden aus Celluloseester, in die Zellen eines Mikroorganismus eingeschlossen sind, welcher die Glucoseisomerase für die Isomerisierung der Glucose zu Lävulose enthält, wobei der Celluloseester, gerechnet als Feststoff, 25 bis 100 Gew.-%, bezogen auf die getrockneten Mikroorganismenzellen, aus- ι ο macht, dadurch gekennzeichnet, daß die Plättchen oder Fäden zusätzlich mindestens 5 bis 100 Gew.-%, bezogen auf die trockenen Mikroorganismenzellen, einer Magnesiumverbindung enthalten, die je Liter Wasser 1 bis 50 mg Magnesiumionen '5 freisetzt oder abgibt

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Plättchen oder Fäden zusätzlich eine Kobaltverbindung enthalten, die je Liter Wasser 1 bis 20 mg Kobaltionen freisetzt oder abgibt.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnesiumverbindung Magnesiumoxid, Magnesiumphosphat oder basisches Magnesiumcarbonat oder ein Gemisch dieser Verbindung ist.

4. Mittel nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kobaltverbindung Kobaltllhydroxid. Kobalt-II-carbonat, Kobalt-II-orthophosphat oder Kobalt-II-oxalat ist.

5. Mittel nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß es als Magnesiumverbindung oder als Magnesium- und Kobaltverbindung einen getrockneten und vermahlenen Kationenaustau-Sfher mit Sulfonsäuregruppen, die mit Magnesiumionen oder mit Magnesiumionen und Kobalt-II- 3S ionen abgesättigt sind, enthält.

6. Verfahren zur Herstellung des enzymatischen Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des Mikroorganismus von dem Substrat, auf dem sie sich entwickelt "to haben, abtrennt, die erhaltene Aufschlämmung bis zu einem Feststoffgehalt von 20 bis 95% einengt, mit 5 bis 100%. bezogen auf das Zellengewicht, eines Füllstoffes vermengt, der aus 50 bis 100% einer Magnesiumverbindung, die je Liter Wasser t bis ⁴S 50 mg Magnesiumionen freisetzt oder abgibt, sowie 0 bis 50% einer Kobaltverbindung, die je Liter Wasser I bis 20 mg Kobaltionen freisetzt oder abgibt, besteht, daß man dem erhaltenen Gemisch den Celluloseester zusetzt in einer Menge von 25 bis 100%. bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen, sowie in Form eines Sols mit einer Konzentration von 5 bis 20% in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, worauf man ein Lösungsmittel zusetzt in einer Menge, die gleich ist dem ^5S Gewicht der getrockneten Zellen oder bis zum lOfachen dieses Gewichtes beträgt sowie soviel Wasser, daß die im F.ndgemisch enthaltene Menge Wasser das O.b- bis 8fache des Gewichtes des C elluloscesters ausmacht, wobei das Gewichtsver- &° hälinis von Wasser zu Lösungsmittel im Endprodukt <0,2 ist, und das erhaltene pastenartige Gemisch verformt und langsam bei einer Temperatür von 15 bis 30° C trocknet.

7. Verfahren mich Anspruch 6, dadurch gekenn' zeichne), daß matt die Zellen zusätzlich mit Glutafaldehyd behandelt.

8; Verfahren nach AnsDfudi6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das pastenartige Gemisch auf einer Platte in einer Schichtstärke von 1 bis 3 mm ausbreitet, teilweise trocknet, zu Plättchen zerschneidet und fertig trocknet.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die pastenförmige Masse extrudiert, die Oberfläche der Extrudate mit Hilfe von Heißluft oder mittels Eintauchen in Wasser koaguliert und fertig trocknet.