DE2833644C2

DE2833644C2 - Glucose-isomerase in Form einer Zellmasse in getrockneter Teilchenform, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2833644C2
Application number: DE2833644A
Authority: DE
Inventors: William Ridgewood N.J. Carasik; Keith Vaerloese Gibson; Tage Kjaer Herlev Nielsen; geb. Jensen Lena Elisabeth Kokkedal Zittan
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1977-08-23
Filing date: 1978-08-01
Publication date: 1985-07-11
Also published as: SE465369B; DE2833644A1; AT364879B; DK147236C; NL187584C; ATA611178A; SE7808865L; NL187584B; NL7808495A; CA1100065A; FR2401170B1; IT1174334B; AU515471B2; ES472735A1; AU3833878A; JPS5444092A; IT7850815A0; FR2401170A1; DK147236B; JPS5856639B2

Description

Die Erfindung betrifft die Glucose-Isomerase In Form einer Zellmasse In getrockneter Tellchenform. wie sie mit dem Patentanspruch 1 definiert Ist, ferner die Herstellung dieser Glucose-Isomerase gemäß den Ansprüchen 4 und 5 und die Verwendung dieser Glucose-Isomerase, wie sie Im Anspruch 6 angegeben Ist. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestallungen der Glucose-Isomerase nach Anspruch 1.

Eine grundlegende Schwierigkeit auf diesem Fachgebiet besteht darin, daß es schien, daß das Enzym Glucose-Isomerase die Anwesenheit von Kobalt-Ionen Im Sirup erforderte, wobei jedoch Kobalt weitverbreitet als toxlsehe Substanz angesehen wird und daher der In dem Produkt Isosirup vorhandene Kobaltgehalt beispielsweise durch Ionenaustausch des Isoslrup-Produkts auf das Niveau von Teilen pro Billion verringert werden muß. Die Anmelderin und Ihre Mitarbeiter haben daher bisher versucht, die Verfahrensbedingungen so einzustellen, daß in dem Beschickungs-Sirup für Zwecke der Enzymaktlvlerung keine Kobalt-Ionen vorhanden sein müssen. Hierzu wird beispielsweise auf die US-PS 40 25 389 hingewiesen.

Kürzlich wurde gefunden, daß Elsen Glucose-Isomerase-Enzyme aktivleren kann. Es wurde empfohlen, geringe Mengen eines Elsensalzes In den Beschlckungs-Slrup für Enzymaktivierungszwecke einzubringen. Es sei jedoch festgestellt, daß Standard-Sirups häufig geringe Menge an Elsen In löslicher Form enthalten.

Trotzdem ist die Einbringung eines löslichen Elsensalzes In den Glucoseslrup-Beschlckungsstrom leichter in der Theorie zu empfehlen, als in die Praxis umzusetzen. Einerseits muß derjenige, der mit dem Glucose-Isomerlsierungssystem arbeitet, über große chemische Erfahrung verfügen, und das System selbst sollte hohen Ansprüchen gerecht sein Das Elsensalz muß In den Glucoseslrup eingemessen werden. Die chemische Analyse des Glucosesirups, der In den Isomerislerungsreaktor eintritt, auf seinen Elsengehalt muß periodisch durchgeführt werden, auch wenn dies nur als Überprü'ung der zufriedenstellenden Arbeitsweise der Meßvorrichtung geschieht Da andererseits die Blndungskapazltäi des Enzyms für Elsen entweder vernachlässigbar oder äußerst gering Ist. so Ist es wahrscheinlich, daß der Sättigungspunkt während eines langen Isomerlslerungsverfahrensansatzes erreicht wird In jedem Falle beginnt an einem bestimmten Punkt des Verfahrens Elsen In den Produktstrom auszutreten. Die Anwesenhell von Elsen In dem Produkt kann zu einer t'arbblldung In einem derartigen Ausmaß führen, daß deren Entfernung notwendig wird, beispielsweise durch Ionenaustausch, wodurch sich die Reinigungskosten erhöhen würden Insgesamt gesehen. Ist der Zusatz von F.lsensal/cn zum Glucoseslrup ungünstig

Ziel der vorliegenden Erfindung Ist die Bereitstellung eines Enzymprodukts, In das Elsen eingearbeitet Ist, was Im allgemeinen vorteilhafter Ist. Insbesondere wenn das Elsen wahrend der Gebrauchsdauer des Enzymprodukts festgehalten wird und so stark gebunden bleibt, daß praktisch kein Elsenverlust während der Anwendung des Enzyms auftritt

Die Erfindung betrifft somit Glucose-Isomerase In Form einer Zellmasse In getrockneter TeHchenform, die dadurch gekennzeichnet Ist, daß In sie 0,05 bis 2,0 Gew.-% an Elsen, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zellmasse, In Form eines nichttoxischen, wasserlöslichen Elsensalzes eingearbeitet sind.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Glucose-Isomerase, das dadurch gekennzeichnet Ist, daß man In die Glucose-Isomerase In Form einer Zellmasse 0,05 bis 2,0 Gew.-96 an Elsen, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zellmasse, in Form eines nichttoxischen, wasserlöslichen Elsensalzes einarbeitet. In eine Tellchenform überführt und trocknet.

Eine Abänderung des Verfahrens Ist dadurch gekennzeichnet, daß man In die Glucose-Isomerase In Form einer Zellmasse, die durch Umsetzung eines Zellkonzentrats von mindestens teilweise gebrochenen Zellen von Mikroorganismen, das von 0 bis 75% Intakte Zellen und einen Gehalt an Trockensubstanz von 3 bis 30 Gew.-Si/Volumen enthält, mit 0,0i bis 1,0 Gewlchlstcll Glularaldehyd je Gewlchlstell Trockensubstanz Im Konzentrat

In Form elues zusammenhängenden, festen Produkts und anschließende Entwässerung und Formung des Glucose-Isomerase-Produkts hergestellt worden 1st, 0,05 bis 2,0 Gew.-« an Elsen, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zellmasse, In Form eines nichttoxischen, wasserlöslichen Eisensalzes einarbeitet, in eine Teilchenform überführt und trocknet.

Dieses Zellkonzentrat Ist In der GB-PS 15 16 704 und der LS-PS 39 80 521 eingehender beschrieben.

Durch die Erfindung wird es möglich, ein teilchenförmlges; Produkt zu schaffen, das zur Quellung in Zuckerlösung vor seiner Anwendung zur Isomerisierung geeignet 1st.

In der Praxis stellt die Verwendung von Elsen als aktivierendes Metall in Glucose-Isomerase-Präparaten einen beträchtlichen Fortschritt dar, da Elsen In geringen Mengen als nicht-toxisches Material angesehen wird. Das zugesetzte Elsensalz kann selbstverständlich eine für Nahrungsmittel geeignete Qualität aufweisen. Dementsprechend besteht keine Gefahr mehr, daß toxische Substanzen In dem erhaltenen Sirup zurückbleiben. Einige wenige Teile pro Million an Elsensalz In dem Produkt sind zuL^slg.

Die Glucose-Isomerase 1st ein Intrazelluläres Enzym, das aus Mikroorganismus-Zellen nicht isoliert werden muß, um ein aktives Enzymprodukt zu ergeben (vgl. beispielsweise die US-PS 38 21 086, 37 79 869 und 39 80 521). Alle diese Präparate verwenden die Mikroorganismus-Zelle, im ganzen oder gebrochenen Zustand, !5 als Basis für das Glucose-Isomerase-Produkt. Die hler verwendeten Ausdrücke »Form einer Zellmasse«, »Zellmassenpräparat« said »Zellmasse In Teilchenform« werden zur Definition von Formen, Präparaten und Teilchen verwendet, die aus der Substanz der Mikroorganismen-Zeilen zusammen mit organischen Reagentien, wie beispielsweise Glutaraldehyd, Proteinen oder agglomerierenden Mitteln, beispielsweise Polyelektrolyten, erhalten, geformt oder in anderer Welse hergestellt werden. Auf Gewichtsbasis stellt der Gehalt eines Zellmassenpräparats an Glucose-Isomerase normalerweise einen sehr geringen Bruchteil des Gesamtpräparats dar.

Es wurde nunmehr gefunden, daß Zeilmassenpräparate von Glucose-Isomerase wesentliche Anteile an Elsen binden könne:n und darüber hinaus relativ wenig des Eisens durch ausgedehnten Kontakt mit Glucose- und Glucose-Fructose-Slrups verlorengeht. Die In die Zeilmassenpräparate elnarbeitbaie Elsenmenge überschreitet die Aktivierungserfordernisse für die Glucose-Isomerase stark.

Insbesondere können nicht-toxische wasserlösliche Salze des Eisens In fester Form In die Zellmassenpräparate während deren Bildung eingemischt werden, beispielsweise unmittelbar vor dem Strangpressen bzw. vor der Extrusion einer 1 llchenform. Die Salze könnten auch unter geeigneten Umständen als konzentrierte wäßrige Lösung eingebracht werden.

Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase enthält vorzugsweise 0,2 bis 0,5 Gew.-%, insbesondere 0,2 bis 0,25 Gew-% an Elsen.

In allen Fällen geht, wenn das Elsen einmal In das Zellmajisenpräparat In einer Menge von 0,05 bis 2.0 Gew.-96, auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zellmasse bezogen, eingearbeitet Ist, wenig oder überhaupt kein Eisen In den Sirup während der Verwendbarkettsdauer des Präparats für die Zwecke der Glucose-Isomerlslerung verloren. Tatsächlich kann das Eisen enthaltende Enzympräparat Elsen aus dem Sirup abstrelfpn. Beispielswelse kann ein Sirup, der In den Isomerlslerungsreaktor mit 4 TpM (Teilen pro Million) an Elsen eintritt, £in Isomerlslerungsreaktor mit einem Elsengehalt unter 1 TpM Elsen verlassen.

In der Praxis hat es sich gezeigt, daß eine Verbesserung der Leistungsfähigkeit und/oder Stabilität der Glucose-Isomerase auftreten kann, wenn auch andere feste Bestandteile In das Enzympräparat eingemischt werden. Insbesondere hat das ursprüngliche Absinken des pH-Wert, das während eines Zeitraums von 1 bis 2 Tagen nach Beschicken der Säule mit frischem Enzym auftritt, zu einigen Problemen geführt. Eine Verringerung des pH-Werts In der Säule Ist unerwünscht, da sie zur Schrumpfung des Enzymbettes führt, was seinerseits zur Kanalbildung Im Bett fuhren kann. Zusätzlich kann eine Verringerung der Aktivität und in schweren Fällen eine geringere Stabilität des Enzymprodukts erfolgen. Es hat sich gezeigt, daß die Einarbeitung von 0,5 bis 3,0 Gew.-* Magnesiumoxid, bezogen auf das Trockengewicht der Glucose-Isomerase, in das Zellmassenpräparat das -»5 ursprüngliche Absinken des pH-Werts In einem wesentlichen Ausmaß verhindert, so daß relativ stabile pH-Werte am Sirupauslaß erzielt werden Zusätzlich hat sich häufig die Beimischung von fester C 'icose (beispielsweise von Glucose-mnnohydrat), die Im wesentlichen als ein Verdünnungsmittel zur Mischhilfe dient, in das Zellmassenprüparat in Mengen von 2 bis 15 Gew.-% (auf Trocke.ibasls) als günstig erwiesen.

Die bevorzugten Glucose-lsomerase-Tellchen, die hler In Betracht gezogen werden, sind die mit Glutaral- ⁵" dehyd umgesetzten homogenisierten Zellpräparate, die beschrieben und/oder beansprucht werden In der GB-PS 15 16 704 und /oder der US-PS 39 80 521

Gemäß einer günstigen Ausführungsform wird das wasserlösliche Elsensalz mit dem Magnesiumoxid und der Glucose vermischt und anschließend zur Zellmasse gefügt vor der Extruslonsstufe, die zur Bildung des endgültigen Granulats führt.

Erfindungsgemäß Ist die Einarbeitung von jeglichem nlcN-toxischen wasserlöslichen Elsensalz In das ZeII-massen-Enzympräparat möglich, jedoch sind bestimmte Eisensalze bevorzugt, nämlich:

Elsen(IIl)-su!fat ElsenOD-sulfat

ElsendID-chlorld ElsenUD-lactat <·"

Eisen(III)-cItrat ElsenUD-cltrat

Elsen(IIl)-ammonlumcltrat Elsen(II)-acetat

ElsenOlO-nltrat

EisenOID-pyrophosphat

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
In den Belsiplelen wird folgende Terminologie verwendet:

Definition der Aktivität

Die Aktivitätseinheit wird als die Menge an Enzym definiert, die Fructose mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 1 μΜοΙ Fructose pro Minute bei einem vorgegebenen Satz von Isomerislerungsbedingungen erzeugt.

Bewertung der Aktivität
Die Aktivität wird unter folgenden Bedingungen bestimmt:

in Sirup 40% Gew./Gew. gelöste Dextrose

pH Einlaß 8,5

Mg ·* 0,004 m

Temperatur 65° C

Säulendurchmesser 2,5 cm

Säulenhöhe 35 cm

Flußrichtung Abwärtsströmung

Die Aktivität wird als IGIC-Einvielten pro g dargestellt.

Bei lang betriebenen Isomerislerungen massen sich die Kurven des Aktivitätsverfalls exponents-Hen Verfalls- -ⁿ Modellen folgender Form an:

Ad = A₀- tr"'¹
worin / die Anzahl der Stunden nach dem Beginn der Isomerisierung darstellt,

Act die Aktivität bei t = ι bedeutet
A₁, die Aktivität bei / = 0 darstellt und

b die Verrlngerungskonstantc In Stunden ' Ist;
aus dieser Gleichung definiert sich die Halbwertszeit als

\n 2

M/2 = —j— ^b

und wird In Stunden angegeben.

Leistungsfähigkeit oder Produktivität

Die Leistungsfähigkeit wird definiert als kg Dextrose (Ts.), umgewandelt in ein Gemisch von 45% Fnctose und 55^ Glucose pro kg Enzym nach einer vorgegebenen Isomerlsierungszeit.

In den Beispielen wird die Leistungsfähigkeit gemäß einer Gleichung der vorstehend angegebenen Form nach einer Isomerisierungszeit von 2 · T_1n berechnet.

Elsen

Der Eisengehalt wird mittels f'er o-Phenanthrolln-Methode bestimmt (Nordisk Metodik Komite for Levnedsmldler Nr. 22. 1955 U.D.C. 664.7: 546.72).

Farbe

Die Farbe wird nach der CIRF-Methode bestimmt.
_Vl Farbslabllllal

Die Farbstabllllät wird nach einstündigem Erwärmen auf 100⁰C beim pH-Wert 4,2 bestimmt (CIRF).

Beispiel 1

Zugabe von ElseniUD-cltrat, ElsendD-laciat und ElsendlD-sulfat In ^verblndung mit Magnesiumoxid und Dextrose. Zusatz von Elsen(III)-oxid.

Nach der Verfahrenswelse des Beispiels 5 der US-PS 39 80 521 wurde ein Filterkuchen hergestellt.

Der Filterkuchen wurde durch einen Oszlllallonsgranulator, ausgerüstet mit einem Sieb mit Öffnungen von w 1 cm, granuliert.

Das erhaltene grobe Granulat enthielt etwa 76% Wasser (gemessen durch Trocknen bei 105⁰C). Es wurde In 6 Anteile aufgetcl't.

A.*) 8,5 kg des groben granulierten Filterkuchens wurden mit einer axialen Stfangpresse, ausgerüstet mit einem f'S Sieb mit Öffnungen von 0,8 mm Durchmesser, extrudlert. Das Extrudat wurde in einem Fließ- bzw.

Wirbelschichtbett mit Luft von 60-65° C auf einen Wassergehalt von etwa 10% getrocknet.
B. Zu 8,5 kg des grob granulierten Fllterkuchens wurde ein Gemisch von 20 g Magnesiumoxid, 85 g Dextrose-monohydrat und 40 g ElsendID-citrat mit einem Elsengehalt von 16% gefügt. Nach sorgfältigem

Vermischen wurde das Gemisch slranggcprcßt und getrocknet wie In A beschrieben. C". 8.5 kg des groben Granulats wurden mit einem Gemisch von 20 g Magnesiumoxid, 85 g Dcxtroscmonohydra! und 40 g ElsenflD-lactat mit einem Eisengehalt von etwa 19% vermischt. Nach sorgfältigem

Vermischen wurde das Gemisch stranggeprcßt und getrocknet wie In A beschrieben. D. 8,5 kg des groben Granulats wurden mit einem Gemisch von 20 g Magnesiumoxid, 85 g Dextrosemonohydrat und 30 g ElsenUIO-sulfat rnlt einem Elsengehalt von etwa 20% vermischt. Nach sorgfältigem Vermischen wurde das Gemisch stranggepreßt und getrocknet wie In A beschrieben.

E.*) 8,5 kg des groben Granulats wurden sorgfältig mit einem Gemisch von 20 g Magnesiumoxid und 85 g i Dextrose-monohydrat vermischt. Das Gemisch wurde stranggepreßt und getrocknet wie In A beschrieben.

F.*) 8,5 kg des graben Granulats wurden sorgfältig mit 25 g Elsen(III)-oxld, enthaltend etwa 5896 Elsen, vermischt. Das Gemisch wurde stranggepreßt und getrocknet wie In A beschrieben.

*) Vergleichsversuch

Die Präparate wurden auf eine Größe zwischen 0,35 mm und 1,0 mm gesiebt, und die Produkte wurden analyslert.

Uer pH-Wert wurde am Slrup-Ausiaöstrom an Proben gemessen, die nach 2ö bzw. 43 Stunden entnommen wurden. Vor der Bestimmung des pH-Werts wurden die Proben auf 25° C gekühlt.

Tabelle I ²"

j Präparat Aktivität % Zuwachs pH am AuslaB des Sirups nach

^E Gefunden Korrigiert 20 Stunden 43 Stunden

IGIC/g lGIC/g

Wie aus der Tabelle I ersichtlich, erzielt man nur bei Zusatz von iöstlchen tlsen-Komponenien einen bedeut- -·> samen Aktivitätsgewinn. Der Zusatz von Elsen(lII)-oxld ergab nur etwa 6% Im Vergleich mit etwa 30% für die löslichen Salze.

Beispiel 2

Zusatz von Magnesiumoxid + Dextrose und Magnesiumoxid + Dextrose + Elsensalz Nach der Verfahrenswelse des Beispiels V der US-PS 39 80 521 wurde ein Filterkuchen hergestellt. Der

Kuchen wurde mittels eines Oszlllatlor.sgranulators, der mit einem Sieb mit Öffnungen von 1 cm ausgerüstet

war. granuliert.
Das grobe Granulat enthielt etwa 79% Wasser. Es wurde In 5 Anteile von 8,5 kg aufgeteilt.

*) A. 8,5 kg wurden stranggepreßt und getrocknet wie In Beispiel 1 A beschrieben, ohne Hinzufügen von

Zusatzstoffen
*) B. Zu 8,5 kg granuliertem Filterkuchen wurden 25 g Magnesiumoxid gefügt. Nach sorgfältigem Vermischen wurde stranggepreßt und getrocknet wie unter A.

*) C. Zu 8,5 kg granuliertem Filterkuchen v/urden 25 g Magnesiumoxid und 200 g Dextrose-monohydrat gefügt.

Nach dem Vermischen wurde stranggepreßt und getrocknet wie unter A. *) D. Zu 8,5 kg granuliertem Filterkuchen wurde ein Gemisch von 25 g Magnesiumoxid und 300 g Dextrose gefügt. Nach dem Vermischen wurde stranggepreßt und getrocknet.

55 *) Verglelchsbelsptel

E. 8.5 kg des Filterkuchens wurden mit einem Gemisch von 25 g Magnesiumoxid, 200 g Dextrose-monohydrat und 40 g ElsenüID-sulfat, enthaltend etwa 20% Elsen, vermischt. Anschließend wurde stranggepreßt und getrocknet.

Die getrockneten Präparate wurden auf eine Größe zwischen 0,35 mm und 1,0 mm gesiebt, und die Produkte wurden anaiysien.

Der pH-Wert des Sirups am Auslaß wurde In Proben gemessen, die nach 20 bzw. 43 Stunden entnommen und auf 25° C gekühlt wurden.

A*)	246	246	0	6,68	7,62
B	307	326	33	7,99	8,20
C	296	315	28	7,60	7,6S
D	308	328	33	7,90	8,14
E*)	254	267	8	7,99	8,20
F*)	257	260	6	6,86	7,65

A*)	O	220	220	0	6,85	7,40
B*)	I	222	224	2	8,18	8,23
C*)	10	216	240	9	8,14	8,22
D*)	14	216	251	14	8,15	1,21
E	12	272	309	40	8,15	8,27

Wie aus der Tabelle II ersichtlich, ergibt nur der Zusatz eines Elsensalzes einen beträchtlichen Aktivitätsanstieg.

Beispiel 3

Zusatz von Elsen(III)-cltrat, ElsendID-pyrophosphat, Elsen(IIl)-ammonlumcltrat und Elsen(II)-sulfat
Ein grob granulierter Filterkuchen mit etwa 16% Wasser wie In Beispiel I wurde In 6 Anteile von jeweils 8,5 kg aufgeteilt.

*) A. 8,5 kg granulierter Filterkuchen wurden stranggepreßt und getrocknet wie In Beispiel 1 unter Bildung einer Bezugszusammensetzung.

·■> Verglelchsbelsplel

3d B. Zu 8,5 kg des groben Granulats wurde ein Gemisch von 25 g Magnesiumoxid, 25 g ElsenOID-cltrat mit etwa 16« Elsen und 250 g Dextrose-monohydrat gefügt. Nach sorgfältigem Vermischen wurde das Granulat stranggepreßt und getrocknet wie unter A.

C. 8,5 kg des groben Granulats wurden stranggepreßt und getrocknet wie unter A nach Zusatz von 25 g Magnesiumoxid, 50 g Elsen(I!I)-c!trat und 250 g Dextrose-monohydrat.

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J3 t-r. U,-r IXg llva 51WU^II uiOIIUla» nUlUCII TTlG UlIlCI \^ UCliailUCIl, ΙτυίΛΊ J&UU^II UlV UV 5 l_ilOVU\lll/-Wtiai VlJVtU

wurden durch 30 g ElsendlD-pyrophosphat mit einem Elsengehalt von etwa 12%.

E. Zu 8,5 kg des groben Granulats wurden 25 g Magnesiumoxid, 250 g Dextrose-monohydrat und 30 g ElsendID-ammoniumcitrat mit einem Elsengehalt von etwa 1596 gefügt. Nach sorgfältigem Vermischen wurde das Granulat stranggepreßt und getrocknet wie unter A.

F. Zu dem letzten Teil von 8,5 kg wurden 25 g Magnesiumoxid, 250 g Dextrose-monohydrat und 30 g EisenüD-sulfat mit einem Elsengehalt von etwa 30% gefügt. Nach sorgfältigem Vermischen wurde das Granulat stranggepreßt und getrocknet wie unter A.

Die getrockneten Präparate wurden auf eine Größe zwischen 0,35 und 1,0 mm gesiebt, und die erhaltenen Produkte wurden analysiert. Der pH-Wert des Sirups am Auslaß wurde nach 20 und 43 Stunden gemessen.

Tabelle III

Präparat Aktivität % Zuwachs pH am Auslaß des Sirups nach

Gefunden Korrigiert 20 Stunden 43 Stunden

IGIC/g IGIC/g

A*) 229

55 ^{B 261}

C 273

D 266

E 268

on F 263

Es wurde kein beträchtlicher Unterschied der Aktivierungswirkung der verwendeten Elsensalze festgestellt.

*) Verglelchsversuch
*) Beispiel 4

Auswirkung der Einarbeitung von Magnesiumoxid auf das Absinken des pH-Werts, die Aktivität und die Stabilität

229	0	6,64	7,25
293	28	7,90	8,24
306	34	7.84	8,22
299	31	7,79	8,19
301	31	7,70	8,14
295	29	7,87	8,03

Tabelle II

, S*

Präparat % zugesetztes Aktivität IGIC/g % Zuwachs pH am Auslali des Sirups nach gj

Material Gefunden Korrigiert auf 20 Stunden 43 Stunden

zugesetztes inaktives Material

a) Es wurden nach der In Beispiel I beschriebenen Arbeitsweise drei Enzymprllpanttc hergestellt. Zu dem grob granulierten Filterkuchen wurde Magnesiumoxid In uusrclchcndcr Menge zur Bildung von Präparaten mit dem folgenden Magncslumoxldgchall In den endgültigen trockenen Prttpurtilcn gefügt.

Präparat B 1 kein Zusatz 5

Präparat B 2 2% Magnesiumoxid
Präparat B 3 5% Magnesiumoxid

Es wurden Isomerlslerungen durchgeführt In ummantelten 60-ml-Glaskolonnen (W χ Z) = 35 χ 1,5 cm) unter Verwendung von 15 g jedes der drei Präparate. Es wurden folgende Isomlerlerungsparameter ange- io wendet:

Sirup 45'λΊ Gew.-/Gew. wieder aufgelöste Dextrose

pH Einlaß 8,0 ± 0,1

Mg zum Sirup gefügt 0,0008 m 15

Temperatur 65° C

Der pH-Wert am Einlaß von 8,0 liegt unter dem normalerweise angewendeten und als Optimum angesehenen, er wird jedoch hler angewendet, um die Wirkung des Zusatzes von Magnesiumoxid zu zeigen. Die Isomerlslerungen wurden fortgesetzt, bis die Aktivität der Präparate bis auf eine willkürlich gewählte 21) Aktivität von 20-25uMol/Min./g abgenommen hatte.
Man erhielt folgende Ergebnisse:

Die Ergebnisse zeigen, daß der Zusatz von 5* Magnesiumoxid zu hohen ursprünglichen Auslaß-pH-Werten führt. Dies scheint die maximal beobachtete Aktivität sowie die Stabilität und Leistungsfähigkeit In absteigender Richtung zu beeinflussen. 5" Bei dieser Untersuchung ergab die Isomerisierung bei einem Einlaß-pH-Wert von 8,0 eine höhere maximale Aktivität und Leistungsfähigkeit bei Anwesenheit von 2% zugefügtem Magnesiumoxid im Vergleich mit der Arbeitswelse ohne Zusätze,
b) Zur Optimierung des Zusatzes von Magnesiumoxid wurden weitere vier Präparate nach der in Beispiel 1

beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Der Zusatzgehalt der getrockneten Präparate betrug: 55

A kein Magnesiumoxid

;| B '/₂% Magnesiumoxid + 9% Dextrose

C \% Magnesiumoxid + 9% Dextrose

D 2% Magnesiumoxid + 9% Dextrose en

In ummantelten 60-mI-GIassäuIen (// χ D = 35 χ 1,5 ·. m) wurden Isomerislerungen durchgeführt unter Anwendung folgender Parameter:

Sirup 45% Gew./Gew. wiederaufgelöste Dextrose f>5

pH Einlaß 8,4 ± 0,1

Mg zum Sirup gefügt 0,0016m

Temperatur 65° C

) Verglelchsbelsplel Tabelle IV (a) i	des Sirups aus	6,2 7,4 8,6	Laufzeit/Stunden	70	Halbwertszeit, Stunden Leistungsfähigkeit nach 2 x Tf₁	230	369 436 253 aufgeführt.	665
	Präparat Stunden nach Beginn 0 17 (Quellung)		665 665 378 der Kolonne sind	6,1 6,7 7,2	257 238 161 In der folgenden Tabelle ;	6,0 6,2 6,4	350	6,3 6,9
Präparat Maximal gemessene Aktivität/nach Stunden	B 1 B 2 8,4 B 3 9,3		42		140	5,9 6,2 6,3
B 1 88/72 B 2 143/16 B 3 124/16 Die pH-Werte am Auslaß Tabelle IV (a) ii	6,2 7,0 7,7		6,0 6,4 6,7

Die Isomerlslerungen wurden 351 Stunden fortgesetzt. Man erhielt folgende Ergebnisse:
Tabelle IV (b) i

Präparat

Maximal gemessene Aktivität/nach Stunden

Aktivität nach .151 Stunden

Leistungsfähigkeit nach 351 Stunden

A
B
C
D

103/67 105/18 103/18

98/18

79
75
72
65

397 384 371 354

Am Auslaß der Säule wurden die In der folgenden Tabelle angegebenen pH-Werte des Sirups gemessen:
Tabelle IV (b) ii

Präparat	Stunden	nach Beginn	67	140	210	303
	19	43	7,0	7,3	7,4	7,2
_A	6,6	6,7	7,3	7,5	7,5	7,1
B	7,1	7,0	7,7	7,6	7,6	7,2
C	7,4	7,6	7,8	7,6	7,5	7,2
D	8,4	8,0

Die Ergebnisse zeigen keine großen Unterschiede der Aktivität, Stabilität und Leistungsfähigkeit für die vier Präparate. Die pH-Werte am Auslaß wurden beeinflußt. Der Zusatz von \% Magnesiumoxid ergibt einen fast konstanten pH-Wert am Auslaß während des Ansatzes und stellt daher den bevorzugten Zusatzgehalt dar. Sowohl der Zusatz von V₃ als auch 2'*. Magnesiumoxid wirken sich auf den pH-Wert am Auslaß Im Vergleich zur Kontrollprobe aus, jedoch wurde In beiden Fällen eine gewisse Änderung des pH-Werts während der ersten 150 Stunden festgestellt.

Beispiel 5
Isomerislerungsversuche

Für die folgenden Präparate wurde ein grob granulierter Filterkuchen, hergestellt nach Beispiel V der US-PS 39 80 521, verwendet. Der Filterkuchen enthielt etwa 77 % Wasser.

*) 410/A. Kein Zusatz.

*) 410/B. Etwa 10 Gewichtsteile des Gemlschs I wurden zu etwa 90 Gewichtsteilen auf Trockenbasis des

Filterkuchens gefügt. Gemisch 1 bestand aus 100 Teilen Dextrose und 8 Teilen Magnesiumoxid.
⁴> 410/C. Etwa 2 Gewlchtstellc des Gemlschs 2 wurden zu etwa 98 Gcwlchtslellen des Filterkuchens auf Trokkenbasis gefügt. Gemisch 2 bestand aus 100 Teilen Dextrose, 10 Teilen Magnesiumoxid und 12 Teilen Elscn(III)-sulfat.
410/D. Etwa 7 Gewichtslelle des Gemlschs 2 wurden zu etwa 93 Gewichtstellen des Filterkuchens auf Trok-

kenbasis gefügt. ^Sl1 *) 410/E. Kein Zusatz.

Die Gemische 410/A bis 410/E wurden anschließend durch ein Sieb mit Öffnungen von 0,8 mm stranggepreßt und schließlich In einem Fließ- bzw. Wirbelschichtbett auf einen Wassergehalt von etwa 10% getrocknet.
Der Eisengehalt der fünf resultierenden Präparate wurde wie folgt bestimmt:

*) Vergleichsversuch

410/A 410/B 410/C 410/D 410/E

0,01% 0,03% 0,08% 0,18% 0,04%

Es wurden Isomerisierungen durchgeführt mit dem Material der Präparate 410/A, 410/B, 410/D und 410/E unter Anwendung folgender Bedingungen.

Sirup

pH Einlaß

45% Gcw./Gew. wiederaufgelöste Dextrose
8,4 t 0,1

	28	33	644
Mg^J-	0.0016 m
Temperatur	62" C
Saulcnciiiien.sloncn	11 40 cm
	L> 5,8 cm
	V I Liter
Gewicht des Enzyms	26Og

Präparat	Maxima! gemessene Aktivität	Gesamte Ansatzzeit Stunden	pH 21
410/A	158	1293	6,9
410/B	155	936	7,4
410/D	202	1316	7,3
410/E	151	1147	6,9

Sirup	45% Gew./Gew. wiederaufgelöste Dextrose
pH Einlaß	8,4 ± 0,1
Mg³-	0,0016 m
Temperatur	65° C
Säulenabmessungen	H 20 cm
	D 2,5 cm
	V 100 ml
Gewicht des Enzyms	20 g

Das Enzym wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur In dem vorstehend beschriebenen Sirup gequollen und anschließend In die Säule gepackt. Man erhielt folgende Ergebnisse:

Tabelle	V(C)	Maximal gemessene Aktivität	Gesamte Ansa l/zeit. Stunden	pH am Auslaß 17 Stunden	nach 45 Stunden	200 Stunden	llulbwcrlszeit T;, Stunden	Produktivität nach 2 x Γ·_Λ Stunden
Präparat	210 250 190	900 900 900	7,0 7,5 6,9	7,8 8,0 7,4	8,1 8,2 8,2	512 484 485	1510 1725 1340
410/C 410/D 410/E

Die Konzentralion an Elsen In dem Sirup am Auslaß dieser Säulen wurde bestimmt.

Das Enzym wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur in dem vorstehend beschriebenen Sirup gequollen, jedoch beim pH-Wert 8,0 und in die Säule gepackt. Man erhielt folgende Ergebnisse:

Tabelle V (a)

pH am Auslaß nach Halbwertszeit Produktivität

21 Stunden 48 Stunden 92 Stunden 7% Stunden nach 2X7%

Stunden i> §ä

6.8 7,2 842 1880 *' 7,7 8,0 818 1790 | 7,5 7,7 843 2295 _2n (

6.9 7,7 828 1755 f

Die Konzentration des Eisens In dem Auslaß-Sirup aus diesen Säulen wurde bestimmt. i

'9 I

Tabelle V (b) ^2> '

Präparat Fo (TpM) im Auslaß-Sirup ί

! Vh Stünden nach Beginn 21 Stunden nach Beginn 27 Stunden nach Beginn \

ι ^

410/A <1 <} <1 ·

410/B <1 <1 <1

410/D etwa < 1 < 1 < 1

410/E <1 <1 <1 „

Eine zweite Reihe von Isomerlslerungversuchcn wurde mit dem Material der Präparate 410/C, 410/D und 410/E durchgeführt unter Anwendung der folgenden Bedingungen:

Tabelle V (d)

Präparat Fe (TpM) im Ausiaß-Sirup

O Stunden 24 Stunden 72 Stunden 140 Stunden 850 Stunden

(Quellen) nach Beginn nach Beginn nach Beginn nach Beginn

410/C 410/D 41 O/E

0,8

3,6

<0,5

<0,5 <0,5 <0,5

<0,5 <0.5 <0,5

<0,5
<O,5
<0,5

Die CIRF-Farbe des Sirups am Auslaß dieser Säulen wurde bestimmt. Tabelle V (e)

Präparat

CIRh-Farbc im Sirup	24 Stunden	72 Stunden
O Stunden	nach Beginn	nach Beginn
(Quellen)	0,030	0,019
0,266	0,036	0,020
0,247	0,036	0,022
0,232

²⁰ 410/C 410/D 410/E

Zu Vergleichszwecken wurde die CIRF-Farbe der drei Proben des Sirups am Einlaß, der wahrend dieses Zeitraums verwendet wurde, gemessen als 0,019, 0,012 und 0,014.
Die Farbstabilität des Sirups am Auslaß dieser Silulen wurde bestimmt.

Tabelle V (0

Präparat

72 Stunden nach Beginn

³⁵ 410/C 410/D 410/E

Farbstabilität des Sirups	24 Stunden
0 Stunden	nach Beginn
(Quellen)	0,040
0,21	0,050
0,21	0,044
0,22

0,014 0,017 0,017

Zu Vergleichszwecken wurde die Farbstabllltal der drei Proben des Sirups am Einlaß, der während dieses Zeltraums verwendet wurde, gemessen. Die Ergebnisse waren 0,004, 0,002 und 0,004.
Der Eisengehalt der Enzympräparate wurde vor und nach der Anwendung gemessen.

Tabelle V (g)

Präparat

mg Eisen in der Säule gepackt mit 20 g Enzym
Zu Beginn Nach 900 Stunden

410/C 410/D 410/E

16

36

24
42
14

Es läßt sich feststellen, daß der Elsengehalt nach 900 Stunden größer war als der zu Beginn der Untersuchung. So absorbierte das Enzym Elsen aus dem eingesetzten Sirup. Da kein Elsen zu dem bei diesen Versuchen verwendeten Sirup zugesetzt wurde, stammte das durch das Enzym absorbierte Elsen aus den Spuren von Elsen, die In der Natur In den Lösungen kristalliner Dextrose vorhanden sind. Die Analyse des Elsengehalts des 4S°b Gew./Gew. wiederaufgelösien Dextroseslrups zeigte < 0,5 TpM und etwa 0,1 TpM Elsen. Im Verlauf des 900stündlgcn Betriebs dieser Säulen wurden etwa 75 000 g Sirup durch jede Säule geleitet, die 20 g Enzym enthielt. Wenn die durchschnittliche Elsenkonzenlratloa dieses einströmenden Sirups 0,1 TpM betrug, so betrug der Gesamt-Elscngchalt des einströmenden Sirups 75 000 · 10~⁷ g = 7,5 mg.

Dies entspricht gut der durch die Enzympräparate während des Verlaufs der Untersuchung aufgenommenen Menge.

Schlußfolgerungen

Der Zusatz von Magnesiumoxid weist einen beträchtlichen Einfluß auf den pll-Wcrt am Auslaß während des Zellraums von 0 bis 100 Stunden nach Beginn auf. Mit Magnesiumoxid, wie In 410/B und 410/D, war der

in

AusIaß-pH-Wert um 0,5 bis 1,0 Einheiten höher als ohne Magnesiumoxid, wie in 410/A und 410/E. i| Die Zugabe von Eisensalz, wie in 410/D, erhöhte die Wirksamkeil, ohne die Stabilität zu beeinträchtigen,

wodurch eine Gesamtzunahme der Leistungsfähigkeit von 20 bis 30% erzielt wurde.

Der Zusatz geringerer Mengen an Magnesiumoxid und Elsensalz, wie in 410/C, ergab einen geringeren Anstieg des pH-Werts am Auslaß und eine geringere Zunahme der Leistungsfähigkeit, jedoch waren diese Stei- 5 gerungen noch beträchtlich.

Beispiel 6
Vergleich von Eisen(II)- und Elsen(III)-salzen io

Ein Gemisch von Elsensalz, Dextrose und Magnesiumoxid wurde zu Proben eines grob granulierten Fll'erkuchens, hergestellt nach Beispiel V der US-PS 39 80 521, gefigl. Das Gemisch wurde anschließend weiter durch Strangpressen durch ein Sieb mit Öffnungen von 0,8 mm verarbeitet und schließlich In einem Fließ- bzw. Wirbelschichtbett auf einen Wassergehalt von etwa 10% getrocknet. Die Zusammensetzung und die Menge des 15 Gemischs, bestehend aus Elsensalz, Dextrose und Magnesiumoxid, lagen derart, daß endgültige Präparate der folgenden Zusammensetzungen erhalten wurden:

Tabelle Vi (a)

. . 21)

Präparat Eisensalz Dextrose Magnesiumoxid

IG 403 II C 1,2% EisendII)-sulfat 8% 1%

IG 403 II D l,2°/i EisendI)-suirat 8% 1% ,.

IG 403 I! E keines 8% 1%

Die Analyse der Präparate ergab folgende Werte für den aktuellen FE-Gehalt:

IG 403 II C 0,22» -W

IG 463 II D 0,27% IG 403 II E 0,05%

Es wurden Isomerlsierungen unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Sirup 45% wlederaufgelöste Dextrose

pH Einlaß 8,4 ± 0,1

Mg" 0,0016 m

Temperatur 65" C

Säulenabmessungen H 20 cm ■"'

D 2,5 cm

V 100 ml Gewicht der Enzyms 20 g

Das Enzym wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur In dem vorstehend beschriebenen Sirup gequollen und 45 anschließend in die Säule gepackt. Man erhielt folgende Ergebnisse:

Tabelle VI (b)	Maximale gemessene Aktivität	Gesamllaulzcit Stunden	Halbwertszeit Tv, Stunden	Leistungsfähigkeit nach 2 χ Τ<_Λ
Präparat	290 274 254	755 755 755	482 467 431	2093 1914 1635
IG 403 II C IG 403 Il D IG 403 II E

Der Klscngchall der Enzympräparat wurde- vor und nach der Anwendung bestimmt.

Tabelle Vl (c) ''"

Präparat mg Fe in der mit 20 g Enzym gepackten Säule

/u Beginn nach 755 Stunden

68 16

IG 403 II C	44
IG 403 11 D	54
IG 403 II E	10

Erneut stieg der Eisengehall während des Verlaufs der Untersuchung leicht an, was anzeigt, daß die Präparate Elsen aus den Spuren von Eisen absorbierten, die In dem wlederaufgelöslen Dexlroseslrup vorhanden waren.

Schlußfolgerang

Der Zusatz von sowohl Elsen(II)- als auch Elscn-(III)-sulfat steigerte die Aktivität und Leistungsfähigkeit des Enzympräparats.

Beispiel 7 Darstellung der Eisensättigung

Ein grob granulierter Filterkuchchen nach Beispiel 5 der US-PS 39 80 521 wurde für folgende Präparate verwendet:

415/A kein Zusatz

415/B Etwa IO Gewichtstelle des Gemlschs 2 wurden zu etwa 90 Gewichtstellen des Filterkuchen auf Trockenbasis gefügt. Der Filterkuchen enthielt etwa 77% Wasser. Das Ge<r·; sch 2 bestand aus 100 Teilen Dextrose, iö Teiicn Magnesiumoxid und 12 Teilen EisenuiO-suiüu.

Die Gemische 415/A und 415/B wurden anschließend durch ein Sieb mit Öffnungen von 0,8 mm stranggepreßt und schließlich In einem Fließ- bzw. Wirbelschichtbett auf einen Wassergehalt von etwa 10"\. getrocknet.
Der Elsengchall der beiden endgültigen Präparate wurde besl'-nmt:

415/A 415/B

0,03% 0,26%

Es wurden Isomerisierungen mit den Präparaten 415/A und 415/B unter Anwendung folgender Bedingungen durchgeführt:

Sirup	45% Gew./Gew. wiederaufgelöste Dextrose
pH Einlaß	8,3 ± 0,1
Mg	0,0016 m
Fe	0,00007 m (4 TpM)
Temperatur	65" C
Säulenabmessungen	H 20 cm
	D 2,5 cm
	V 100 ml
Gewicht des Enzyms	20 g

Das Enzym wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur in dem Sirup gequollen und anschließend fr> die Säule gepackt. Man erzielte folgende Ergebnisse:

Tabelle VlI (a)	Maximale gemessene aktivität	Zeit bis zur Erzielung der maximalen Aktivität, Stunden	Gesamtlaufzeit Stunden	Halbwertszeit T<_h Stunden	Leistungsfähigkeit nach 2 χ Tt,
Präparat	272 275	160 20	906 906	611 547	2560 2260
415/A 415/B

Die Konzentration an Elsen In dem Sirup am Auslaß dieser Säulen wurde bestimmt.
Tabelle VlI (b)

Präparat Fe (TpM) im Auslaß-Sirup nach

0 Stunden 20 Stunden 70 Stunden

(Quellen)

350 Stunden

900 Stunden

415/A
415/B

<0,5 7

< 0,5 < 0,5

Der Flscngehalt der Knzympr'lpnriilc wurde vor und nach der Anwendung bestimmt.

<0,5
<0,5

0,5 0,6

Tabelle Vll'(c)

Präparat mg Fe in der mit 20 g Enzym gepackten Säule

zu Beginn nach 900 Stunden

415/A 6 320

415/B 52 380

Schlußfolgerungen >°

415/A ergab eine 13% höhere Leistungsfähigkeit als 415/B. Jedoch sei festgestellt, daß 415/B etwa 10 Gew.-% an Nlcht-Enzym-Materlal enthält. So ergaben, berechnet auf der Basis des ursprünglichen enzymhaltlgen Filterkuchens, beide Präparate etwa die gleiche Leistungsfähigkeit.

Die Aktivität von 415/A stieg während der ersten 160 Stunden des Ansatzes an. Dies steht Im Gegensatz zu '5 415/B. wo man eine maximale Aktivität nach 20 Stunden erzielte. Dies zeigt an, daß 415/A langsam Elsen aus dem einströmenden Sirup mit einer resultierenden langsamen Aktivierung aufnahm. Diese langsame Aktivierung stellt auch den Grund für den längeren exponentlellen Verfall der Halbwertszelt, der für 415/A beobachtet wurde, dar, d. h. die Aktivierung und der exponentiell Verfall traten gleichzeitig auf.

Während der 900 Stunden der Untersuchung wurden etwa 90 000 g Sirup durch jede Säule geleitet, die 20 g ^n Enzympräparat enthielt. Der Elsengehalt dieses Sirups betrug 4 TpM. So enthielten 90 000 g Sirup 360 mg Elsen. Der Elsengehalt der beiden Säulen stieg um 314 und 328 mg an. So wurde der größte Teil des Eisens In den einströmenden Sirup durch die Enzympräparate entfernt. Die Ergebnisse zeigen, daß nach 900 Stunden der Elsengehalt des ausströmenden Sirups anzusteigen begann. Dies läßt darauf schließen, daß die Enzympräparate sich der Grenze Ihrer Fähigkeit zur Absorption von Elsen näherten.

Beispiel 8 (nachgereicht) Abwesenheit von MgO und Glucose

Ein Filterkuchen wird gemäß Beispiel V der US-PS 39 80 521 hergestellt und wie In vorstehendem Beispiel 1 beschrieben grob granuliert.

Vor dem Extrudieren wird dem Filterkuchen ElsendID-pyrophosphat/ElsendID-cItrat zugegeben, um nach dem Extrudieren und Trocknen, wie In Beispiel beschrieben, ein Präparat mit einem Elsengehalt von 0,58% zu erhalten. ^vs

Die Aktivität des so hergestellten Präparats beträgt über 400 IGIC/g, wogegen die Aktivität eines Vergleichspräparats ohne Zugabe von Elsensalz 319 IGIC/g beträgt.

Claims

Patentansprüche:

1. Glucose-Isomerase In Form einer Zellmasse In getrockneter TeHchenform, dadurch gekennzeichnet, daß In sie 0,05 bis 2,0 Gew.-% an Eisen, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zeümasse, in Form eines nichttoxischen, wasserlöslichen Elsensalzes eingearbeitet sind.

2. Glucose-Isomerase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 0,2 bis 0,5 und insbesondere 0,2 bis 0,25 Gew.-% an Eisen.

3. Glucose-Isomerase nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Elsen-III-suifat, -Chlorid, -cltrat, -ammoniumcltral, -nitrat oder -pyrophosphat oder Elsen-Il-sulfal, -Iactat, -cltrat oder -acetal als Elsensalz.

4. Verfahren zur Hersteilung der Glucose-Isomerase gemäß Anspruch 1, 2 oder. 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Glucose-Isomerase In Form einer Zeilmasse 0,05 bis 2,0 Gew.-% an Eisen, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zellmasse, In Form eines nichttoxischen, wasserlöslichen Eisensalzes einarbeitet, in eine TeHchenform überführt und trocknet.

5 Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man In die Glucose-Isomerase in Form einer Zellmasse, die durch Umsetzung eines Zellkonzentrals von mindestens teilweise gebrochenen Zellen von Mikroorganismen, das von 0 bis 75% Intakte Zellen und einen Gehalt an Trockensubstanz von 3 bis 30 Gew.-%/Volumen enthält, mit 0,01 bis 1,0 Gewichtstell Glutaraldehyd je Gewichtstell Trockensubstanz im Konzentrat In Form eines zusammenhängenden, festen Produkts und anschließende Entwässerung und Formung des Giucose-Isomerase-Produkts hergestellt worden Ist, 0,05 bis 2,0 Gew.-% an Elsen, bezogen auf das Gewicht der Trockensubstanz der Zellmasse, in Form eines nichttoxischen, wasserlöslichen Eisensalzes einarbeitet, in eine TeHchenform überführt und trocknet.

6 Verwendung der Glucose-Isomerase gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 zum Isomerlsleren von Glucose.