DK147236B

DK147236B - Partikelformet cellemasseprodukt af glucoseisomerase, samt fremgangsmaade til dets fremstilling

Info

Publication number: DK147236B
Application number: DK368278AA
Authority: DK
Inventors: Tage Kjaer Nielsen; William Carasik; Lena Elisabeth Zittan; Keith Gibson
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1977-08-23
Filing date: 1978-08-21
Publication date: 1984-05-21
Also published as: NL187584C; NL7808495A; IT1174334B; ATA611178A; DK368278A; NL187584B; IT7850815A0; JPS5444092A; FR2401170B1; SE465369B; AT364879B; DE2833644C2; AU3833878A; SE7808865L; CA1100065A; AU515471B2; JPS5856639B2; DK147236C; FR2401170A1; DE2833644A1

Description

147236

Opfindelsen angår et tørret, partikelformet cellemasseprodukt af glucoseisomerase, samt en fremgangsmåde til fremstilling heraf. 1 henhold til den kendte teknik ansås det tidligere for nødvendigt at aktivere glucoseisomerasen ved tilsætning af cobaltioner til glucosesiruppen (fødesiruppen).

Da cobaltforbindelser samtidig betragtes som værende giftige, medførte denne foranstaltning nødvendigheden.af at reducere cobaltionkoncentrationen i den isomeriserede sirup (produktsiruppen) til en værdi i området af 10 ppm (parts per million), f.eks. ved en ionbytningsproces.

2 14723.6

En anden løsning på dette problem er anvendelsen af procesbetingelser, som overflødiggør aktiveringen af enzymet ved tilsætning af cobaltioner. Som eksempel på anvendelsen af sådanne procesbetingelser kan der henvises til beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1097/76.

Det er for nylig erkendt, jfr. f.eks. beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3858/75, at også jernioner er i stand til at aktivere glucoseisomeraseenzymer, hvilket har ført til forslag om at tilsætte små mængder af et jernsalt til fødesiruppen. I denne forbindelse må det bemærkes, at glucosesiruppen i sig selv oftest indeholder små mængder opløst jern.

Imidlertid er tilsætningen af et opløst jernsalt til fødesiruppen forbundet med praktiske vanskeligheder.

For det første indebærer tilsætning til fødesiruppen en doseringsproces. Dernæst må tilsætningen løbende kontrolleres ved kemiske analyser af fødesiruppen, før den tilføres isomeriseringsreaktoren. Endelig er det sandsynligt, at enzymproduktets mætningspunkt nås i løbet af en kolonnefyldnings levetid, fordi enzymproduktets kapacitet med hensyn til binding af jernioner er enten meget ringe eller i hvert fald begrænset. Når mætningspunktet er nået, vil jernsaltet begynde at sive ud i produktstrømmen. Tilstedeværelsen af jernioner i produktsiruppen kan give anledning til farve-dannelse i en sådan grad, at det vil være nødvendigt at fjerne dem, f.eks. ved ionbytning, en proces som yderligere vil øge oparbejdningsomkostningerne. Alt i alt er tilsætning af jernsaltet til fødesiruppen ufordelagtig.

I henhold til ovennævnte danske patentansøgning nr. 3858/75 aktiveres glucoseisomerase i uopløseliggjort form ved en forbehandling med en vandig jernsaltopløsning.

Det anbefales imidlertid yderligere at supplere fødesiruppen med et jernsalt med den begrundelse, at det under for- 3 147236 behandlingen bundne jern dissocieres og fjernes med produktsiruppen. Forbehandlingen med jern forekommer derfor ikke at kunne råde bod på de ovenfor nævnte ulemper.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et enzymprodukt, hvori jernsaltet er inkorporeret i enzymproduktet. Dette princip vil være fordelagtigt, hvis jernet forbliver så fast bundet, at der praktisk talt ikke forekommer udsivning af jernioner fra enzymproduktet i løbet af dettes praktiske levetid.

Glucoseisomerase er et intracellulært enzym, som ikke isoleres fra mikroorganismen med henblik på fremstillingen af et aktivt enzymprodukt (se f.eks. U.S. patentskrifterne nr. 3.821.086, 3.779.869 og 3.980.521). I nærværende beskrivelse anvendes betegnelserne "cellemasseprodukt" og "partikelformet cellemasseprodukt" i forbindelse med produkter og partikler heraf, som er tildannet eller på anden måde fremstillet ud fra mikroorganismens cellemateriale ved behandling med organiske reagenser, f.eks. glutar-aldehyd, proteiner eller agglomerende midler, f.eks. poly-elektrolytter. På vægtbasis repræsenterer glucoseisomerase-indholdet af cellemasseproduktet i almindelighed en meget ringe del af produktet som helhed.

Det har nu overraskende vist sig, at cellemasseprodukter af glucoseisomerase er i stand til at binde betragtelige mængder jern og endvidere, at længere tids kontakt mellem glucoseisomeraseproduktet og føde- og/eller produktsirup højst medfører meget små tab af jern. Tilstedeværelsen af en mængde på nogle få ppm af et jernsalt i produktsiruppen er tilladelig. Den mængde jern, der kan inkorporeres i cellemasseproduktet, overstiger langt den mængde, der er nødvendig til aktivering af glucoseisomera-sen.

147236 4

Især har det vist sig muligt at inkorporere ugiftige, vandopløselige jernsalte i fast tilstand i cellemasseproduktet i forbindelse med, at dette bringes på partikulær form, f.eks. umiddelbart forud for en ekstruderingspro-ces. Under passende omstændigheder er det også muligt at inkorporere jernsaltene i form af koncentrerede vandige opløsninger .

I overensstemmelse hermed er det tørrede, partikelformede cellemasseprodukt af glucoseisomerase ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at der på basis af cellemasseproduktets tørstofindhold er inkorporeret mindst 0,05 vægtprocent jern i form af et ugiftigt vandopløseligt jernsalt heri.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af nævnte tørrede, partikelformede cellemasseprodukt af glucoseisomerase, som er ejendommelig ved, at der i cellemasseproduktet på basis af dettes tørstofindhold inkorporeres mindst 0,05 vægtprocent jern i form af et ugiftigt, vandopløseligt jernsalt, og at cellemasseproduktet omdannes til et partikelformet produkt og tørres.

I henhold til en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen inkorporeres jernsaltet i fast tilstand i cellemasseproduktet af glucoseisomerase.

I henhold til endnu en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåde ifølge opfindelsen anvendes et cellemasseprodukt af glucoseisomerase, som er fremstillet ved at et koncentrat af et helt eller delvist sønderdelt cellemateriale fremstillet ud fra mikroorganismer af Bacillus coagu-lans, hvilket koncentrat har et tørstofindhold på fra 3 til 30% efter vægt pr. rumfangsenhed, omsættes med fra 0,01 til 1,0 vægtdel glutaraldehyd pr. vægtdel tørstofindhold i koncentratet, til dannelse af et kohærent, fast produkt, hvorefter man fjerner vand og former glucoseisomeraseproduktet.

5 147236 I henhold til yderligere en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen inkorporeres sammen med jernsaltet mindst 0,5 vægtprocent magnesiumoxid og mindst 2 vægtprocent glucose i fast tilstand, begge beregnet på basis af cellemasseproduktets tørstofindhold.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således et partikelformet produkt, som uden videre foranstaltninger er egnet til udblødning i glucosesirup forud for dets anvendelse til isomerisering.

Der indkorporeres som nævnt mindst 0,05 vægtprocent, almindeligvis fra 0,05 til 2,0 vægtprocent, jern i form af et ugiftigt, vandopløseligt jernsalt i cellemasseproduktet. Inkorporering af mere end 2,0 vægtprocent jern er mulig, men tjener ikke noget praktisk formål. Det foretrukne jernindhold ligger i området fra 0,2 til 0,5 vægtprocent, fortrinsvis fra ca. 0,2 til 0,25 vægtprocent.

Kun lidt eller intet af det jern, der er inkorporeret i cellemasseproduktet i en mængde på fra 0,05 til 2,0%, vil gå over i produktsiruppen i løbet af enzymets praktiske levetid. I virkeligheden er det jernholdige enzymprodukt i stand til yderligere at optage jern fra en jernholdig sirup. Eksempelvis kan en fødesirup, der tilføres isomeriseringskolonnen med et jernindhold på 4 ppm, meget vel forlade denne som produktsirup med et jernindhold på mindre end 1 ppm.

I praksis har det vist sig, at øget produktivitet og/eller forbedret stabilitet af glucoseisomeraseproduktet kan opnås ved yderligere tilblanding af andre faste stoffer til cellemasseproduktet. I særlig grad har det initiale pH-fald, som optræder 1-2 dage efter, at en ny kolonnefylding med frisk enzymprodukt er taget i brug, voldt visse problemer. Et fald i kolonnefyldningens pH er uønsket, fordi det bevirker krympning af kolonnefyldningen, hvilket 147236 6 igen kan medføre kanaldannelse. En yderligere følge heraf kan blive en nedgang i aktiviteten og, i alvorligere tilfælde, i stabiliteten af enzymproduktet. Inkorporering af fra 0,5 til 3,0 vægtprocent magnesiumoxid, baseret på tørvægten af cellemasseproduktet, har vist sig at kunne nedbringe det initiale pH-fald i væsentlig grad og således at tilvejebringe et relativt stabilt pH i produktsiruppen.

Ydermere har tilsætning til forblandingen af glucose i fast form (f.eks. glucosemonohydrat) i mængder på fra 2-15 vægtprocent baseret på cellemasseproduktets tørvægt vist sig at være ønskelig, idet glucosen hovedsageligt virker som et fortyndingsmiddel i tørblandingsprocessen.

I henhold til en foretrukken udførelsesform fremstilles en forblanding af det vandopløselige jernsalt i fast tilstand med magnesiumoxid og glucose, hvorefter denne blandes op i cellemasseproduktet forud for ekstruderings-processen, som fører til det partikelformede produkt.

Følgende jernsalte er foretrukne:

Ferrisulfat Ferrosulfat

Ferrichlorid Ferrolactat

Ferricitrat Ferrocitrat

Ferriammoniumcitrat Ferroacetat

Ferrinitrat Ferripyrophosphat

Opfindelsen skal herefter beskrives nærmere under henvisning til de efterfølgende eksempler.

7 147236 I eksemplerne er følgende terminologi benyttet:

Definition af aktivitet

Enheden for enzymaktivitet er defineret som den mængde enzym, som katalyserer omdannelsen af glucose til fructose med en begyndelseshastighed på 1 micromol fructose pr. min. under givne reaktionsbetingelser.

Bestemmelse af aktivitet

Aktiviteten bestemmes under følgende betingelser: Fødesirup 40 vægt-% opløst glucose pH af fødesirup 8,5

Mg 0,004 M

Temperatur 65°C

Kolonne, diam./højde højde 2,5/35 cm Væskestrømmens retning nedad

Aktiviteten udtrykkes i IGIC-enheder pr. g enzymprodukt .

I langtias-isomeriseringsforsøg tilpasses kurverne for aktivitetens aftagelse i eksponentialkurver med følgende formel: * » “bt A = A0e hvori t er tiden i timer efter isomeriseringsprocessens start, A og A er aktiviteterne til henholdsvis tiderne t ° -1 og 0, og b er en konstant med dimensionen h

Ud fra denne ligning defineres halveringstiden i timer som 147236 8 Τι = ln 2 % —

Produktivitet

Produktiviteten defineres som mængden af glucose 1 kg pr. kg enzymprodukt, som i løbet af en given tid omdannes til en blanding indeholdende 45% fructose.

I eksemplerne er produktiviteten beregnet i henhold til ovenstående ligning efter en isomeriseringstid på 2 x Th.

Jern

Jernindholdet bestemmes efter ortho-phenanthro-lin-metoden (Nordisk Metodik Komité for Levnedsmidler nr.

22, 1955, U.D.C. 664.7: 546.72).

Farve

Farveintensiteten måles i henhold til CIRF-meto- den.

Farvestabilitet

Farvestabiliteten bestemmes efter 1 times opvarmning af produktsiruppen til 100°C ved pH 4,2 efter CIRF-metoden.

Den i eksemplerne benyttede magnesiumoxid er en tung kvalitet af typen ER/B fra firmaet Pharmelko, Milano,

Italien.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler. De med mærkede forsøgsbetingelser er sammenligningsforsøg.

Eksempel 1 9 147236

Tilsætning af ferricitrat, ferrolactat og ferrisulfat i forbindelse med magnesiumoxid og glucose. Tilsætning af ferrioxid.

Udgangsmaterialet er et cellemasseprodukt af glu-coseisomerase, som er fremstillet ud fra et koncentrat af helt eller delvist sønderdelt cellemateriale af mikroorganismen Bacillus coagulans. Koncentratet, der har et tørstofindhold på fra 3 til 30% efter vægt pr. rumfangsenhed, omsættes med fra 0,01 til 1,0 vægtdele glutaraldehyd pr. vægtdel tørstofindhold i koncentratet. Herved dannes et kohærent, fast produkt, hvorfra vandet fjernes ved filtrering på en filterpresse (jfr. eksempel 5 i U.S. patentskrift nr. 3.980.521).

Filterkagen granuleres ved hjælp af et oscillerende granuleringsapparatur med en sigte med 1 cm huller.

Det grove granulat indeholder ca. 76% vand (bestemt ved tørring ved 105°C). Det deles i 6 portioner.

+ ^A. 8,5 kg af den grove granulerede filterkage ekstruderes ved hjælp af et axialt ekstruderingsapparatur, som er forsynet med et filter med huller med en diameter på 0,8 mm. Ekstrudatet tørres i fluidiseret tilstand med luft ved en temperatur på 60 - 65°C til et vandindhold på ca.

10%.

B. Til 8,5 kg af den grove granulerede filterkage sættes en blanding af 20 g magnesiumoxid, 85 g glucosemono-hydrat og 40 g ferricitrat med et jernindhold på 16%.

Blandingen ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

·_/ 10 unse C. 8,5 kg af det grove granulat blandes med en blanding af 20 g magnesiumoxid, 85 g glucosemonohydrat og 40 g ferrolactat med et jernindhold på ca. 19%. Blandingen ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

D. 8,5 kg af det grove granulat blandes med en blanding af 20 g magnesiumoxid, 85 g glucosemonohydrat og 30 g ferrisulfat med et jernindhold på ca. 20%. Blandingen ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

+^E. 8,5 kg af det grove granulat blandes grundigt med en blanding af 20 g magnesiumoxid og 85 g glucosemonohydrat. Blandingen ekstruderes og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

+ ^F. 8,5 kg af det grove granulat blandes grundigt med 25 g ferrioxid indeholdende ca. 58% jern. Blandingen ekstruderes og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

Produkterne sigtes til opnåelse af et produkt med en kornstørrelse på mellem 0,35 mm og 1,0 mm, og produkterne analyseres.

I den udløbende sirupstrøm måles pH-værdien i prøver, som tages efter 20 og 43 timers forløb. Før pH-be-stemmelsen afkøles prøverne til 25°C.

Tabel I

I I IGIC/q I IGIC/ct I forøgelse I 20 timer I 43 timer I

III III I

| +k I 246 | 246 I 0 I 6,68 | 7,62 | | B | 307 | 326 | 33 | 7,99 | 8,20 | | C | 296 | 315 | 28 | 7,60 | 7,98 | | D | 308 | 328 | 33 | 7,90 | 8,14 | | +)E | 254 | 267 | 8 | 7,99 | 8,20 | | +)F | 257 | 260 | 6 | 6,86 | 7,65 |

I I_!_!_!_!_L

Som det fremgår af tabel I opnås der kun ved tilsætning af opløselige jernforbindelser en aktivitetsforøgelse af betydning. Ved tilsætning af ferrioxid fås kun en forøgelse på ca. 6% sammenlignet med ca. 30% for de opløselige salte.

Eksempel 2

Tilsætning af magnesiumoxid + glucose og magnesiumoxid + glucose + jernsalt.

Der fremstilles en filterkage på analog måde som beskrevet i eksempel 1. Filterkagen granuleres ved hjælp af et oscillerende granuleringsapparatur, som er forsynet med en sigte med 1 cm huller.

Det grove granulat indeholder ca. 79% vand. Det opdeles i 5 portioner på 8,5 kg.

147236 12 + ^A. 8,5 kg ekstruderes og tørres på analog måde som beskrevet i eksempel 1A uden tilsætning af additiver.

+^B. Til 8,5 kg granuleret filterkage sættes 25 g magnesiumoxid. Der ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

+)C. Til 8,5 kg granuleret filterkage sættes 25 g magnesiumoxid og 200 g glucosemonohydrat. Der ekstruderes efter blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

+^D. Til 8,5 kg granuleret filterkage sættes en blanding af 25 g magnesiumoxid og 300 g glucose. Der ekstruderes efter blanding og tørres.

E. 8,5 kg filterkage blandes med en blanding af 25 g magnesiumoxid, 200 g glucosemonohydrat og 40 g ferrisulfat indeholdende ca. 20% jern. Der ekstruderes derefter og tørres .

De tørrede produkter sigtes til opnåelse af et produkt med en kornstørrelse på mellem 0,35 mm og 1,0 mm, og produkterne analyseres.

I den udløbende sirup måles pH-værdien i prøver, som tages efter 20 og 43 timer, og som er afkølet til 25°C.

Tabel II

13 U7236

I i i I I I

II 11 materiale IGIC/q 111 I

J II II I i I A lo | 220 | 220 | 0 I 6,85 | 7,40 | | +)B I 1 I 222 I 224 | 2 | 8,18 | 8,23 | | +)C | 10 | 216 | 240 | 9 | 8,14 | 8,22 | I +b I 14 | 216 [ 251 | 14 | 8,15 | 1,21 | | E | 12 | 272 | 309 | 40 | 8,15 | 8,27 |

J_!_1 ' I_I I I_L

Som det fremgår af tabel II fås der kun ved tilsætning af et jernsalt en signifikant forøgelse i aktiviteten.

Eksempel 3

Tilsætning af ferricitrat, ferripyrophosphat, ferriaromoni-umcitrat og ferrosulfat.

En groft granuleret filterkage med ca. 76% vand som i eksempel 1 deles i 6 portioner på hver 8,5 kg.

+^A. 8,5 kg granuleret filterkage ekstruderes og tør res på analog måde som beskrevet i eksempel 1 til opnåelse af et sammenligningsprodukt.

14 147236 B. Til 8,5 kg af det grove granulat sættes en blanding af 25 g magnesiumoxid, 25 g ferricitrat med ca.

16% jern og 250 g glucosemonohydrat. Granulatet ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

C. 8,5 kg af det grove granulat ekstruderes og tør-- res på analog måde som beskrevet under punkt A efter tilsætning af 25 g magnesiumoxid, 50 g ferricitrat og 250 g glucosemonohydrat.

D. 8,5 kg af det grove granulat behandles på analog måde som beskrevet under punkt C, idet dog de 50 g ferricitrat erstattes med 30 g ferripyrophosphat med et jernindhold på ca. 12%.

E. Til 8,5 kg af det grove granulat sættes 25 g magnesiumoxid, 250 g glucosemonohydrat og 30 g ferriammonium-citrat med et jernindhold på ca. 15%. Granulatet ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

F. Til den sidste portion på 8,5 kg sættes 25 g magnesiumoxid, 250 g glucosemonohydrat og 30 g ferrosulfat med •et jernindhold på ca. 30%. Granulatet ekstruderes efter grundig blanding og tørres på analog måde som beskrevet under punkt A.

De tørrede produkter sigtes til opnåelse af et produkt med en kornstørrelse på mellem 0,35 mm og 1,0 mm, og de vundne produkter analyseres. Den udløbende sirups pH-værdi bestemmes efter 20 og 43 timers forløb.

Tabel III

1C 147236 15

II il I

j_ I IGIC/σ I IGIC/q 1 1 20 timer I 43 timer I

I I I I I I I

| A | 229 | 229 I 0 | 6,64 | 7,25 | | B | 261 | 293 | 28 | 7,90 | 8,24 | | C | 273 | 306 | 34 | 7,84 | 8,22 | | D | 266 | 299 | 31 | 7,79 | 8,19 | | E | 268 | 301 | 31 | 7,70 | 8,14 | | . F | 263 | 295 | 29 | 7,87 | 8,03 |

I I_!_l_I_!_I

Der konstateres ingen signifikant forskel med hensyn til de anvendte jernsaltes aktiverende effekt.

Eksempel 4

Isomeriseringsforsøg.

En groft granuleret filterkage, som er fremstillet på analog måde som beskrevet i eksempel 1, anvendes til følgende produkter. Filterkagen indeholder ca. 77% vand.

147236 16 + ^ 410/A: Ingen tilsætning.

+ ^ 410/B: Ca. 10 vægtdele af blanding 1 sættes til ca. 90 vægtdele, beregnet på tørstof, af filterkagen.

Blanding 1 består af 100 dele glucose og 8 dele magnesiumoxid.

410/C: Ca. 2 vægtdele af blanding 2 sættes til ca. 98 vægtdele af filterkagen, beregnet på tørstof.

Blanding 2 består af 100 dele glucose, 10 dele magnesiumoxid og 12 dele ferrisulfat.

410/D: Ca. 7 vægtdele af blanding 2 sættes til ca. 93 vægtdele af filterkagen, beregnet på tørstof.

+ V410/E: Ingen tilsætning.

Blandingerne 410/A - 410/E ekstruderes derefter gennem en sigte med 0,8 mm huller og tørres derefter i fluidiseret tilstand til et vandindhold på ca. 10%.

Jernindholdet i de fem slutprodukter bestemmes: 410/A: 0,04% 410/B: 0,03% 410/C: 0,08% 410/D: 0,18% 410/E: 0,04%

Der udføres isomeriseringer med materiale fra produkterne 410/A, 410/B, 410/D og 410/E under følgende betignelser: 17 147236

Sirup: 45 vægtprocent genopløst glucose

Indløbs-pH-værdi: 8,4-0,1

Mg ++: 0,0016 M

Temperatur: 62 °C

Kolonnestørrelse: højde: 40 cm diameter: 5,8 cm rumfang: 1 liter Enzymvægt: 260 g.

Enzymet udblødes i 2 timer ved stuetemperatur i den ovenfor angivne sirup, idet der dog anvendes en pH-værdi på 8,0, og pakkes derefter i kolonnen.

Der fås følgende resultater:

Tabel IV (a) i i i i i i i" | Produkt | Max. målt |Samlet |Udløbs-pH-værdi | Halverings- | Produkti- [ | | aktivitet | forsøgs-1 efter timer_[ tid T ^ | vitet ef- | | | |tid, || || timer | ter 2| | | Itimer | 21 | 48 | 92 | | timer |

I I I 1 I I I I I

| 410/A | 158 I 1293 | 6,9 | 6,8 |7,2 | 842 | 1880 | | 410/B | 155 | 936 | 7,4 | 7,7 |8,0 | 818 | 1790 | | 410/D | 202 | 1316 | 7,3 | 7,5 |7,7 | 843 | 2295 | | 410/E | 151 | 1147 | 6,9 | 6,9 |7,7 | 828 | 1755 |

J_!_I 1111_I_L

Koncentrationen af jern i den fra disse kolonner udløbende sirup bestemmes.

Tabel IV (b) 18 147236 I I Ϊ | Produkt J_Fe (ppm) i udlcfoende sirup_|

II I I I

| I 2,5 timer efter | 21 timer efter | 27 timer efter | I I start __L_j£grt start _[_

II I I I

| 410/A | <i | *1 | <i I

I 410/B I <1 | *1 | <1 I

| 410/D I ca. <1 | <1 | <1 | | 410/E | <1 | <1 | *1 |

J_I_!_!_I

Der udføres yderligere isomeriseringsforsøg med materiale fra produkterne 410/C, 410/D og 410/E under anvendelse af følgende betingelser:

Sirup: 45 vægtprocent genopløst glucose

Indløbs-pH-værdi: 8,4-0,1

Mg++: 0,0016 M

Temperatur: 6 5 °C

Kolonnestørrelse: højde: 20 cm diameter: 2,5 cm rumfang: 100 ml Enzymvægt: 20 g.

Enzymet udblødes i 1 time ved stuetemperatur i den ovenfor angivne sirup og pakkes derefter i kolonnen.

19 147236

Der fås følgende resultater:

II I I I I I I I

| 410/C I 210 I 900 | 7,0 | 7,8 |8,1 | 512 | 1510 | | 410/D I 250 I 900 | 7,5 | 8,0 J8,2 | 484 | 1725 | | 410/E | 190 | 900 | 6,9 | 7,4 {8,2 | 485 | 1340 |

I I I I I I I_!_L

Koncentrationen af jern i den fra disse kolonner udløbende sirup bestemmes.

I I(udblødning) I efter start |efter start Iefter._start [efter start I

| 410/C | 0,8 I <0,5 | <0,5 | <0,5 | <0,5 | | 410/D | 3,6 | <0,5 | <0,5 | <0,5 | <0,5 | | 410/E | <0,5 | *0,5 | <0,5 | <0,5 | <0,5 |

I I_!_!_!_J_L

20 urne CIRF-farven af den fra disse kolonner udløbende sirup b e s teinmes.

Tabel IV (e) i i i" | Produkt J_CIKF-farve i sirup_[

II I I I

| I 0 timer | 24 timer efter | 72 timer efter |

I I (udblødning) I start I start I

II I I I

| 410/C I 0,266 I 0,030 | 0,019 | | 410/D | 0,247 | 0,036 | 0,020 | | 410/E | 0,232 | 0,036 | 0,022 |

I ' I_!_!_L

Til sammenligning blev CIRF-farven af tre prøver af den i denne periode anvendte fødesirup bestemt til 0,019, 0,012 og 0,014.

Farvestabiliteten af den fra disse kolonner udløbende sirup bestemmes.

Tabel IV (f) 21 1A7236 i i Γ I Produkt J_Farvestabilitet af sirup__J_

II II I

I I (udblødning) l start l start I

II II I

I 410/C I 0,21 I 0,040 | 0,014 | I 410/D | 0,21 I 0,050 | 0,017 | I 410/E | 0,22 | 0,044 | 0,017 |

Til sammenligning blev farvestabiliteten af tre prøver af den i denne periode anvendte fødesirup bestemt. Resultaterne var 0,004, 0,002 og 0,004.

Jernindholdet af enzymprodukterne bestemmes før og efter anvendelsen.

Tabel IV (g)

I I I

| Produkt J_mg jern i med 20 g enzym pakket kolonne_[

II I I

J[_1_Ved^jtart_L_ Efter 900 timer I

II I I

| 410/C I 16 I 24 | | 410/D | 36 | 42 | | 410/E | 8 | 14 |

I 1_!_I

147236 22

Det skal bemærkes, at jernindholdet efter 900 timers forløb er større end ved forsøgets begyndelse. Enzymet adsorberer derfor jern fra fødesiruppen. Idet der ikke blev sat jern til den i disse forsøg anvendte fødesirup, stammer det af enzymet adsorberede jern fra spor af jern, som naturligt er til stede i opløsningerne af krystallinsk glucose. Ved analyse af jernindholdet i den 45 vægtprocent genopløste glucosesirup fås under 0,5 ppm jern, ca. 0,1 ppm jern. I løbet af de 900 timer, hvor forsøget med disse kolonner stod på, blev der ledet ca. 75 kg sirup gennem hver kolonne indeholdende 20 g enzym.

Såfremt den gennemsnitlige jernkoncentration i fødesiruppen er 0,1 ppm, bliver det totale jernindhold i fødesiruppen ca. 7,5 mg.

Dette svarer godt til den mængde, som under forsøget optages af enzymprodukterne.

Konklusion

Tilsætningen af magnesiumoxid har en signifikant indflydelse på udløbs-pH-værdien i perioden mellem 0 og 100 timer efter forsøgets start. Med magnesiumioxid (forsøg 410/B og 410/D) er udløbs-pH-værdien 0,5 - 1,0 enheder højere end uden magnesiumoxid (forsøg 410/A og 410/E),

Ved tilsætning af jernsalt (forsøg 410/D) forøges aktiviteten uden forringelse af stabiliteten, og der fås i alt en forøgelse i produktiveten på mellem 20 og 30%.

Tilsætning af mindre mængder magnesiumioxid og jernsalt (forsøg 410/C) giver en mindre forøgelse i udløbs-pH-værdien og en mindre forøgelse i produktiviteten, men disse forøgelser er signifikante.

Eksempel 5 23 147236

Sammenligning af ferro- og ferrisalte.

En blanding af jernsalt, glucose og magnesiumoxid sættes til prøver af groft granulerede filterkager, som er fremstillet på analog måde som beskrevet i eksempel 1.

Blandingen behandles derefter yderligere ved ekstrudering gennem en sigte med 0,8 mm huller og derefter ved tørring som fluidiseret masse til et vandindhold på ca. 10%. Produktet og mængden af forblandingen bestående af jernsalt, glucose og magnesiumoxid er således, at der fås slutprodukter med følgende sammensætninger:

1 . 1 1 I I

III I I

| IG 403 II C I1,2% ferrisulfat | 8% | 1% | | IG 403 II D |1,2% ferrosulfat | 8% | 1% |

| IG 403 II E |lntet | 8% | 1% I

J_I_|_I_L

Ved analyse af produkterne fås følgende resultater for det egentlige jernindhold: IG 403 II C: 0,22% IG 403 II D: 0,27% IG 403 II E: 0,05%.

Isomeriseringerne udføres under følgende betingelser: 147236 24

Sirup: 45 vægtprocent genopløst glucose

Indløbs-pH-værdi: 8,4-0,1

MG ++: 0,0016 M

Temperatur: 65°C

Enzymet udblødes i 1 time ved stuetemperatur i ovennævnte sirup og pakkes derefter i kolonnen.

Der fås følgende resultater:

111 1 1 I

i I I I I I

[ IG 403 II C i 290 | 755 | 482 1 2093 [ | IG 403 II D | 274 | 755 | 467 | 1914 | | IG 403 II E | 254 | 755 | 431 | 1635 |

J_[_!_[_!_L

Jernindholdet i enzymprodukterne bestemmes før og efter anvendelsen.

Tabel V (c) oc 147236

ZD

I I I

| Produkt J_mg jern i med 20 g enzym pakket kolonne_I

II I I

j_I_Vedjstart __J_Eft^_755_yiær____l_

II I I

| IG 403 II C | 44 | 52 | | IG 403 II D | 54 | 68 | | IG 403 II E | 10 | 16 |

J_!_!_L

Jernindholdet forøges lidt i løbet af forsøget, hvilket indikerer, at produkterne adsorberer jern fra i den genopløste glucose tilstedeværende spor af jern.

Konklusion

Ved tilsætning af enten ferro- eller ferrisulfat forøges aktiviteten og produktiviteten af enzympræparatet.

Eksempel 6 Påvisning af jernmætning-.

En groft granuleret filterkage, som er fremstillet på analog måde som beskrevet i eksempel 1 anvendes til følgende produker: 26 147236 415/A: Ingen tilsætning.

415/B: Ca. 10 vægtdele af blanding 2 sættes til ca. 90 vægtdele af filterkagen, beregnet på tørstof.

Filterkagen indeholdt ca. 77% vand. Blanding 2 består af 100 dele glucose, 10 dele magnesiumoxid og 12 dele ferrisulfat.

Blandingerne 415/A og 415/B ekstruderes derefter gennem et filter med 0,8 mm huller og tørres derefter i fluidiseret tilstand til et vandindhold på ca. 10%.

Jernindholdet i de to slutprodukter bestemmes: 415/A: 0,03% 415/B: 0,26%.

Isomeriseringer udføres med produkterne 415/A og 415/B under anvendelse af følgende betingelser:

Sirup: 45 vægtprocent genopløst glucose

Indløbs-pH-værdi: 8,3-0,1

Mg ++: 0,0016 M

Fe-indhold: 0,00007 M (4 ppm)

Temperatur: 65°C

Kolonnestørrelse: højde: 20 cm diameter: 2,5 cm rumfang: 100 ml En z ymvægt: 2 0 g.

Enzymet udblødes i siruppen i 1 time ved stuetemperatur og pakkes derefter i kolonnen. Der fås følgende resultater:

J I I - I I I I

III I II I

| 415/A I 272 I 160 | 906 | 611 | 2560 | | 415/B | 275 | 20 | 906 | 547 | 2260 |

J_I_I_|_I_!_L

Koncentrationen af jern i den fra disse kolonner udløbende sirup bestemmes.

Tabel VI (b) _ j | | Produkt | Fe (ppm) i udløbende sirup ved |

I J_L

III I II I

I 1(udblødning)I I II I

| 415/A | <0,5 | <0,5 | <0,5 | <0,5 | 0,5 | | 415/B | 7 | <0,5 | <0,5 | <0,5 | 0,6 |

J_I_I_!_I I_L

Jernindholdet i enzympræparaterne bestemmes før og efter anvendelsen.

Tabel VI (c) 28 147236

I l I

| Produkt J_mg jern i med 20 g enzym pakket kolonne_|

II I I

I l ved start I efter 900 timer I

II I I

I 415/A I 6 | 320 | I 415/B | 52 | 380 |

J_1_!_L

Konklusion

Porsøg 415/A giver 13% højere produktivitet end forsøg 415/B. Det skal imidlertid bemærkes, at forsøg 415/B indeholder ca. 10 vægtprocent ikke-enzymmateriale. Beregnet på basis af filterkage indeholdende det oprindelige enzym giver begge produkterne således omtrentligt samme produktivitet .

Aktiviteten af forsøg 415/A forøges i løbet af de første 160 timer af forsøget. Dette er i modsætning til forsøg 415/B, ved hvilket der fås maximal aktivitet efter 20 timers forløb. Dette indicerer, at der under forsøg 415/A langsomt adsorberes jern fra fødesiruppen med en deraf følgende langsom aktivering. Denne langsomme aktivering er også årsag til den længere eksponentielle halveringstid, som konstateres for forsøg 415/A, d.v.s. aktivering og eksponentiel nedbrydning sker samtidig.

I løbet af de 900 timer, som forsøget varer, ledes der ca. 90 kg sirup gennem hver kolonne indholdende 20 g enzymprodukt. Jernindholdet af denne sirup er 4 ppm.

147236 29 90 kg sirup indeholder derfor 360 mg jern. Jernindholdet i de to kolonner forøges med 314 og 328 mg. Den største del af jern i fødesiruppen fjernes således af enzymprodukterne.

Det fremgår af resultaterne, at efter 900 timers forløb begynder jernniveauet i den udløbende sirup at forøges.

Dette kunne tyde på, at enzymprodukterne nærmer sig grænsen for deres evne til at absorbere jern.

Claims

147236

1. Tørret, partikelformet cellemasseprodukt af glu-coseisomerase, kendetegnet ved, at der på basis af cellemasseproduktets tørstofindhold er inkorporeret mindst 0.05 vægtprocent jern i form af et ugiftigt vandopløseligt jernsalt heri.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af cellemasseproduktet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der i et glucoseisomeraseholdigt cellemasseprodukt på basis af cellemasseproduktets tørstofindhold inkorporeres mindst 0,05 vægtprocent jern i form af et ugiftigt, vandopløseligt jernsalt, og at cellemasseproduktet omdannes til et partikelformet produkt og tørres.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at jernsaltet inkorporeres i fast tilstand i cellemasseproduktet af glucoseisomerase.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2-3, kendete g n e t ved, at der anvendes et cellemasseprodukt af glucoseisomerase, som er fremstillet ved at et koncentrat af et helt eller delvist sønderdelt cellemateriale fremstillet ud fra mikroorganismer af Bacillus coagulans, hvilket koncentrat har et tørstofindhold på fra 3 til 30% efter vægt pr. rumfangsenhed, omsættes med fra 0,01 til 1,0 vægtdele glutaraldehyd pr. vægtdel tørstofindhold i koncentratet, til dannelse af et kohærent, fast produkt, hvorefter man fjerner vand og former glucoseisomeraseproduktet.