DK142672B - Fremgangsmåde til fremstilling af et dyrefodersupplement indeholdende et antibiotikum AV290-alkylsulfatkompleks. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 142672 DANMARK int.ci.3 a 23 k 1/17 §(21) Ansøgning nr. 2307/74 (22) Indleveret den 26. apr. 1974 (24) Løbedag 26. apr. 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og

framlæggelsesekriftet offentliggjort den 15· CteC. I98O

DIREKTORATET FOR , PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET <3°) Prioritet begæret fra døn

27. apr. 1975, 555240, US

(71) AMERICAN CYANAMID COMPANY, Wayne, New Jersey, US.

(72) Opfinder: Jack Peter Waite, 6l Arundel Drive, Fareham, Hampshire, GB.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling;

Ingeniørfirmaet Budde, Sehou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et dyrefodersupplement indeholdende et antibiotikum AV290-alkylsulfatkompleks.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et dyrefodersupplement af fuldt indhøstede, tørrede, faste gæringsmaskbestanddele, der indeholder et antibiotikum AV290--alkylsulfat-kompleks. Det således fremstillede dyrefodersupplement kan anvendes til øgning af væksthastigheden hos dyr, såsom fjerkræ, svin, tidligt fravænnede grise og drøvtyggere, såsom kreaturer, får og geder.

Antibiotikum AV290 dannes ved gæringsbiosyntese under dyrkning under kontrollerede betingelser af Streptomyces candidus NRRL 3218 og mutanter af denne. Antibiotikum AV290's fremstilling og egenskaber er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3·338.786. Det har været et alvorligt problem at udvinde antibiotiket på økonomisk måde. Ifølge det ovenfor nævnte patentskrift anvendes adsorption på trækul med på 142672 2 følgende eluering og søjlechromatografi. En sådan proces er ikke overdrevent dyr, når det rene antibiotikum skal anvendes til medicinsk behandling. Hvis antibiotiket skal anvendes i dyrefodersupplementspræparater., er prisen imidlertid en meget alvorlig faktor, og der har derfor været behov for en billig fremgangsmåde til udvinding af antibiotiket til dette formål.

Der kendes således fra dansk patentansøgning nr. 5309/71 en fremgangsmåde til fremstilling af et dyrefoderadditiv indeholdende antibiotikum AV 290, hvorved antibiotiket udfældes fra dyrkningsmediet, hvori det er dannet, ved hjælp af såkaldte syntaner (kondensationsprodukter af naphthalensulfonsyrer eller forskellige sulfonerede phenoler med formaldehyd) og tørres sammen med dyrkningsmediets faste bestanddele. Det fremstillede produkt har den fordel, at det kan anvendes direkte som dyrefoderadditiv, således at en isolering af produktets bestanddele ikke er nødvendig.

Det har nu vist sig, at der på tilsvarende fordelagtig måde kan fremstilles et dyrefodersupplement under anvendelse af alkali-metalalkylsulfater, og den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et dyrefodersupplement af fuldt indhøstede, tørrede, faste gæringsmaskbestanddele, der indeholder et antibiotikum AV290-alkylsulfat-kompleks, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at:(a) en fuldt indhøstet gæringsmask, der indeholder antibiotikum AV290, gøres sur til en pH-værdi på 1,9 til 2,1, (b) til masken, der er gjort sur, sættes i tilstrækkelig mængde til at frembringe et kompleks med antibiotikum AV290 et kompleksdannende middel, der udvælges fra gruppen af forbindelser med den almene formel:

CH3—(CH2)n-0-S02-0M

hvori n er et helt tal fra 9 til 17 inklusive, og M er natrium eller kalium, eller en blanding af sådanne, (c) de fuldt indhøstede, faste maskbestanddele isoleres sammen med det udfældede antiobio-tikum AV290-alkylsulfat-kompleks, og (d) blandingen af faste maskbestanddele og antibiotikum AV290-alkylsulfat-kompleks tørres. Typiske alkalimetalalkylsulfater, der kan anvendes, er f.eks. natrium-decylsulfat, kaliumundecylsulfat, natriumlaurylsulfat, kaliumtride-cylsulfat, natriummyristylsulfat, kaliurapentadecylsulfat, natrium-cetylsulfat, kaliumheptadecylsulfat og natriumoctadecylsulfat.

142672 3

Der kan også anvendes blandinger af alkalimetalalkylsulfater, såsom en blanding af natriumundecylsulfat og kaliumoctadecylsulfat, en blanding af kaliumdecylsulfat og natriumheptadecylsulfat, en blanding af kaliumlaurylsulfat og kaliumcetylsulfat, en blanding af na-triumtridecylsulfat, kaliummyristylsulfat og natriumpentadecylsulfat, og lignende. Når der anvendes blandinger af alkalimetalalkylsulfater, fås en tilsvarende blanding af antibiotikum-alkylsulfat-komplekser.

Ved den her omhandlede, nye fremgangsmåde opnås en næsten fuldstændig fjernelse af den antibiotiske aktivitet fra gæringsvæsken. Endvidere kan det således fremstillede antibiotikum-alkylsulfat--kompleks anvendes i dyrefodersupplementspraeparater uden adskillelse af bestanddelene, hvilket er en betydningsfuld, økonomisk fordel.

Produktet af antibiotiket og alkalimetalalkylsulfatet er et reversibelt antibiotikum-alkylsulfat-kompleks. Dets nøjagtige kemiske natur er ikke blevet bestemt, men der er ikke involveret covalente bindinger, og produktet er ikke en fysisk blanding. Dette kompleks, der fremkommer ved reaktion mellem antibiotiket og et alkalimetalalkylsulfat, kombineres ikke nødvendigvis i noget begrænsende støkiometrisk forhold. De kemiske bindinger er reversible, da antibiotikum AV290 kan genvindes fra komplekset ved forskellige metoder, såsom adsorption på en kolonne af tværbundet carboxymethyl-dekstran-gel med påfølgende eluering med vandig syre.

Som udgangsmateriale til den her omhandlede fremgangsmåde anvendes den fuldt indhøstede mask, der fås efter tilendebragt gæring med S. candidus NRRL 3218 eller mutanter af denne. pH-værdien i den fuldt indhøstede mask indstilles først til mellem 1,9 og 2,1, fortrinsvis til ca. 2,0, med en syre. Syrer, der er egnede til dette formål, kan f.eks. være saltsyre, svovlsyre, trifluoreddikesy-re og lignende, skønt selv iseddike kan anvendes. Denne pH-værdiind-stilling synes at være kritisk, idet der under en pH-værdi på 1,9 synes at foregå en nedbrydning af antibiotikum AV290 under tørring af filterkagen selv ved 40°C under vakuum. Derefter tilsættes langsomt en vandig opløsning af et alkalimetalalkylsulfat (eller en blanding af alkalimetalalkylsulfater) under omrøring ved omgivelsestempera-tur. Hele den her omhandlede fremgangsmåde udføres fortrinsvis ved ca.

15 til ca. 30°C, hensigtsmæssigt ved stuetemperatur. Antibiotiket og alkylsulfatet danner et kompleks, der er uopløseligt i vand og der- 142672 4 for udfælder. Det udfældede kompleks og de faste bestanddele i gæringsmasken fjernes derefter ved filtrering eller centrifugering og tørres. De således fremstillede produkter kan tørres (l) ved opslæmning af de våde, fast bestanddele i polære, vandblandbare ikke-op-løsniiigsmidler, såsom acetone, med påfølgende filtrering, skylning og lufttørring eller (2) ved genopslæmning af de våde, faste bestanddele i vand og frysetørring eller spraytørring.

, Når de her omhandlede produkter således er tørret forsigtigt under temperaturbetingelser, hvor antibiotikum AV290 ikke nedbrydes, er de sædvanligvis grå til brune pulvere eller faste stoffer. I tør form er disse produkter overordentlig stabile og holder sig uden betydende tab af den antibiotiske aktivitet i betydelige tidsrum. Denne lange l^gerlevetid er naturligvis en betydningsfuld, praktisk fordel.

Det er en fordel ved den foreliggende opfindelse, at mængden af alkalimetalalkylsulfat, der tilsættes for at udfælde komplekset med antibiotiket, ikke er særlig kritisk, og at det ikke er nødvendigt at følge nogle nøjagtige støkiometriske forhold. I almindelighed er den mængde alkalimetalalkylsulfat, der kræves til udfældning af antibiotikum AV290, 1,5 - 2,5 gram pr. gram AV290-aktivitet i masken. Sædvanligvis foretrækkes ca. 2,0 g alkalimetalalkylsulfat pr. g antibiotisk aktivitet i masken. AV290-indholdet i den fuldt indhøstede mask kan let bestemmes mikrobiologisk (efter indstilling af pH-værdien til 8,0 til 9,0) som beskrevet i USA-patent-skrift nr. 3.338.786. Den foretrukne metode er en tilpasning af en Staphylococcus aureus-turbidimetrisk prøve for tetracyclin, der er beskrevet i "Assay Methods of Antibiotics, a Laboratory Manual" af Grove & Randall, Medical Encyclopedia, Inc. (1955), s. 48-52. Fortrinsvis opløses eller suspenderes den nødvendige mængde alkalimetalalkylsulfat derefter i en passende mængde vand, og den vandige opløsning eller suspension sættes derefter til den fuldt indhøstede mask som beskrevet ovenfor. Ethvert overskud af alkalimetalalkylsulfat, der er tilstede, vil blot forblive i opløsning ved filtreringen.

Det omhandlede dyrefodersupplement er som nævnt virkningsfuldt til øgning af væksthastigheden hos dyr og fjerkræ og anvendes til dette formål sædvanligvis i en mængde, der er tilstrækkelig til at give følgende, omtrentlige doseringsniveauer i mg/dyr/dag: 142672 5

Store drøvtyggere 350

Små drøvtyggere 200

Ikke-drøvtyggere 100

Fjerkræ 2

Der kan anvendes mange forskellige bærestoffer ved fremstillingen af præparater af det her omhandlede dyrefodersupplement, f.eks. soyabønnemel, alfalfamel, bomuldsfrøoliemel, hørfrøoliemel, majsmel, sukkerrørsmelasse, urinstof, benmel, majskolbemel og lignende. Bærestoffet fremmer en ensartet fordeling af komplekset i det færdige foder, hvori supplementet blandes. Det udfører derfor en betydningsfuld funktion ved at sikre en passende fordeling af komplekset i foderet.

Opfindelsen forklares nærmere ved de følgende eksempler.

Eksempel 1

Udfældning af antibiotikum AV29Q-natrlumlaurylsulfatkompleks.

Prøver af fuldt indhøstet, S. candidus-gæret rysteflaske-mask udtages, og deres styrke forøges ved tilsætning af teknisk AV290-sul-fat. Ved prøverne, der er tabelleret i'tabel II, anvendes 100 ml's portioner af mask, hvis pH-værdier indstilles til 2,0 med 15$'s vandig svovlsyre. Derefter tilsættes g "Dicalite 478®" (en diatoméjordart) og dråbevis under omrøring en 2#'s vandig natriumlaurylsul-fatopløsning. Opslæmningerne "ældes" i 3 timer ved stuetemperatur, og de faste bestanddele fjernes ved filtrering og tørres under vakuum ved 4o°C. De brugte filtrater og de tørre filterkager undersøges mikrobiologisk, og resultaterne er angivet i tabel i; 6 t42672 m o t— t— l rH CM »i ·> oo OD ·» ·> CO -=1- 4· o æ od tn oo ud oo t— I O CM ·> *> c— cr\ ·> * CO lf- tn Od co Od o o cm in o tn ud o in ·» ·> UD H OD ·> ·> O tf-

rH =!· CM UD OD OD

O O H O UD UD

m UD UD i ·> ·>

Η OD ·> CM tf- OD

in r-ι -=t- r4 r-l 00 OD

O O m O UD UD

O tn LCD *> it cm ·» cm in tf- i—i in r-i t—i co od

H

, o o m tn id- o o tn r-ι ·> ·> _ ·< 5 tn -=^ cm ·>' o ud c—

H in . ri . CM OD

Bi o o oo m tf- cm o tn c— *> ·> *

CM- tn rM ·> oo o OD

h in o -=f in o\ o o oo C0 OD tf- r-t o tn c- ·» ·> _r

fC\ i—I ·* OD

r4 in O -=4" -=4- OD

Ή . P 4) r-l Φ r4 E &0 O cd \ Ό OD ·Η ti CM d

O i> OD

•H <M < -P Φ . .. cd -P &0 Φ d Ό Ό P cd Ξ cd cd o d <-t h 0¾ rafni! d O O OtnM-Pd cd

O^dXjiHOdrHØrP

!> TD Ό r-l O CO Cd ·Η P cd

ns. d d e ud o &p <m r4 rQ

d -H -rl\ d in Ό ·Η I

Pl, i i^e O CM tD -P <d O

a - x fe κ, _ ω , od

CQWH CM ^¾. d d CM

cd cd ·η H d DS >

Is s p I o_p i < 142672 7

Eksempel 2.

pH-værdiens virkning på udfældningen af komplekset.

Styrken af prøver af S. candidusgæret fuldt indhøstet mask forøges til 4.930 ^/ml ved tilsætning af teknisk AV290-sulfat, og prøvernes pH-værdier indstilles med 15#'s vandig svovlsyre til de i tabel II anførte værdier. Der tilsættes 3*0 g^"Dicalite 478®", og derefter tilsættes dråbevis under omrøring 40 ml af en 2#'s vandig natriumlaurylsulfatopløsning således, at der fås et forhold mellem C-^H^OSOyJa og AV290 på 1,62. Opslæmningerne "ældes" i 3 timer ved stuetemperatur, og de faste bestanddele fjernes ved filtrering og tørres under vakuum ved 4o°C. De brugte filtrater og tørre filterkager undersøges mikrobiologisk, og resultaterne er angivet i tabel II:

Tabel II

______ _ _ _ _ _ _ pH i mask ved udfældning 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 % udgangsmateriale i brugt filtrat 7*3 8,4 6,1 6,9 10,1 Tør fliterkage 55^ 71,6 92,8 83*3 64,2 AV290-balanoe 62,6__78,0__98,9 90,2__74,3

Eksempel 3.

Udfældning af antibiotikum AV290 fra fuldt indhøstet mask ved anvendelse af natriumlaurylsulfat.

En 30 liters prøve af gæringsmask fra et forsøgsanlæg med et mikrobiologisk bestemt indhold på 3-740 Vrol behandles på følgende måde. Maskens pH-værdi indstilles til 2,0 ved tilsætning af 219 ml koncentreret svovlsyre, og der tilsættes derefter 1 kg "Dicalite 478 som filtreringshjælpemiddel. Til masken sættes langsomt under omrøring en opløsning af 240 g natriumlaurylsulfat i 3 liter vand. Den behandlede mask "ældes" derefter under omrøring i 1 time ved stuetemperatur, og de faste bestanddele fjernes ved hjælp af en filterpresse. Filterkagen tørres under vakuum ved 50°C, hvorved der opnås 1-978 g af et tørt produkt, der har et mikrobiologisk bestemt indhold på 4,72$. Dette svarer til en udvinding af antibiotikum AV290 fra 142672 8 masken til den tørre filterkage på 83,2$.

Eksempel 4.

Udfældning af antibiotikum AV290ved anvendelse af natriumAeoyl- sulfat.

En 400 ml's prøve af fuldt indhøstet rysteflaske-mask (mikrobiologisk bestemt indhold 4.590 Vrol) indstilles til en pH-værdi på 2.0 ved tilsætning af 3,9 ml koncentreret svovlsyre, og der tilsættes derefter 5 g "Dicalite 478 ®" som filtreringshjælpemiddel. Til masken sættes langsomt under omrøring 9*68 g "Empicol 0137®" (en 30,5$'s aktiv opløsning af natriumdecylsulfat, fremstillet af Albright & Wilson Chemicals, Ltd.), der er fortyndet til 50 ml med vand. Den behandlede mask "ældes" derefter under omrøring i 1 time ved stuetemperatur, og de faste bestanddele fjernes ved hjælp af et vakuumfilter. Filterkagen tørres under vakuum ved 50°C, hvorved der opnås 20,2 g af et tørt produkt, der har et mikrobiologisk bestemt indhold på 9,14$. Dette svarer til en udvinding af an tibiotikum AV290 fra masken til den tørre filterkage på 100,5$.

Eksempel 5.

Udfældning af antibiotikum AV290 ved anvendelse af en blanding af natriumcetylsulfat og natriumoleylsulfat.

En 400 ml's prøve af fuldt indhøstet rysteflaske-mask (mikrobiologisk bestemt indhold 4.590 ]/ml) indstilles til en pH-værdi på 2.0 ved tilsætning af 3,9 ml koncentreret svovlsyre, og der tilsættes derefter 5 g "Dicalite 478®" som filtreringshjælpemiddel. Til masken sættes langsomt under omrøring 13,51 g "Empicol ChC 30 (en 30$'s aktiv pasta af en blanding af natriumcetylsulfat og natrium-oleylsulfat, fremstillet af Albright & Wilson Chemicals, Ltd.), der er dispergeret i vand til et totalt dispersionsvolumen på 50 ml. Den behandlede mask "ældes" derefter under omrøring i 1 time ved stuetemperatur, og de faste bestanddele fjernes ved hjælp af et vakuumfilter. Filterkagen tørres under vakuum ved 50°Cj hvorved der opnås 24,0 g af et tørt produkt med et mikrobiologisk bestemt indhold på 8,08 $. Dette svarer til en udvinding af antibiotikum AV290 fra masken til den tørre filterkage på 105.» 6$.