DE2537670C3

DE2537670C3 - Träger für die Adsorption von Glucoseisomerase

Info

Publication number: DE2537670C3
Application number: DE2537670A
Authority: DE
Inventors: David Leo Eaton; Ralph Allan Messing
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1974-09-18
Filing date: 1975-08-23
Publication date: 1979-05-10
Also published as: NL7510922A; JPS5163983A; IT1042678B; JPS5839515B2; PH12381A; YU235875A; BE833536A; AU8497375A; DE2537670A1; DE2559847B1; FR2285399B1; FR2285399A1; DE2559847C2; US3982997A; TR18720A; CA1049943A; AR219691A1; ES441026A1; DE2537670B2; GB1518336A

Description

Die Erfindung betrifft großflächige, poröse, anorganische Träger für die Adsorption von Enzympräparaten, insbesondere Glucoseisomerase, zur Umwandlung von Glucose in Fructose.

Die Umwandlung von Glucose in Fructose ist wegen der annähernd doppelten Süßwirkung von Fructose bei gleichem Kaloriengehalt von Interesse. Zur enzymatischen, rationellen Herstellung in kontinuierlicher Arbeitsweise, z. B. in Durchlaufkolonnen, muß das wiederholt zu verwendende Enzym dazu immobilisiert sein, d. h. wasserunlöslich sein. Die bekannte Fructoseherstellung durch alkalische Isomerisation erzeugt unerwünschte, störende (färbende oder säuernde) Nebenprodukte, welche nach der US-PS 34 31 253 zwar durch Zusätze von alkalischem, feinteiligem Aluminiumoxid ausgeschaltet werden können, was aber wegen der langen erforderlichen Verweilzeiten die rationelle, kontinuierliche Herstellung, insbesondere in Durchlaufkolonnen, ausschließt.

Für die enzymatische Herstellung ist die Immobilisierung des Enzyms erforderlich, damit es nicht in Lösung geht, mehr als zweimal verwendet werden kann und das Produkt nicht verunreinigt. Hierfür wurden als Träger bereits Keramiken, z. B. auch Aluminiumoxidkörper vorgeschlagen, siehe die US-PS 35 29 538, 35 56 945, 38 50 751,38 68 304.

Für die enzymatische Umwandlung sind aber auch bestimmte Metallionen wesentlich; so untersuchten T a k a s a k i u. a., in »Studies on Sugar-Isomerizing Enzyme, Purification, Crystallization and Some Properties of Glucose Isomerase from Streptomyces sp.«, in Agr. Biol. Chem., Bd. 33, Nr. 11, p. 1527-34 (1969), den Einfluß verschiedener Metallionen wie Mg, Co, Fe, Mn, Ni, Ba, Ca, Zn, Cu und kamen zu dem Ergebnis, daß für die Aktivität der aus einer Streptomyces species gewonnenen Glucoseisomerase Cobalt- und Magnesiumionen wesentlich sind.

Diese für wesentlich gehaltenen Ionen werden bisher der glucosehaltigen Speiselösung vor dem Kontakt mit dem immobilisierten Enzym zugesetzt, vgl. die Beispiele der US-PS 38 68 304. Dies bedingt allerdings einen zusätzlichen, besonders beim kontinuierlichen Arbeiten mit Durchlaufkolonnen lästigen Verfahrensschritt. Noch bedenklicher ist der Verbleib der Zusätze im Endprodukt. Besonders im Falle von Cobalt ist dies unerwünscht, oder sogar schädlich, z. B. in Nahrungsoder Futtermitteln.

Auch die Immobilisierung des Enzyms durch organische Träger wurde vorgeschlagen, vgl. z. B. die US-PS 37 08 397. nach der Glucoseisomerase auf bestimmten, ionenaustauschenden Zellulosen stabilisiert und akti-

_>n viert werden soll, so daß eine wiederholte Verwendung mit verbesserter Ausbeute erzielt wird. Da es sich hierbei um einen organischen Träger handelt, müssen organischen Trägern generell anhaftende, schwerwiegende Nachteile in Kauf genommen werden, denn sie

j-, sind von Natur aus weniger beständig; sie werden leichter abgebaut und sind dem Befall von Mikroorganismen ausgesetzt Nachteilig ist auch die geringe Abmessungsbeständigkeit; sie quellen und stören die genaue Durchsatzregelung beim kontinuierlichen Be-

Ki trieb. Besonders nachteilig ist auch die Gefahr der Verstopfung der für die rationelle Herstellung in großem Umfang einzusetzenden Durchlaufkolonnen.

Die Erfindung hat einen für die Glucoseisomeraseadsorption geeigneten Träger zur Aufgabe, welcher diese -, Nachteile organischer Stoffe vermeidet, und gleichzeitig die erwähnten, die enzymatische Aktivität fördernden Ionenbedürfrisse befriedigt.

Die Aufgabe wird durch den Träger der Erfindung dadurch gelöst, daß er aus 0,84—12% MgO und 99,16-88% Al₂O₃ in Form poröser Partikel der

durchschnittlichen Größe 0,074—4,76 mm

(4—200 mesh) und einer durchschnittlichen Porenweite

von 100-1000 A besteht

Die Erfindung beruht auf der überraschenden

4-, Feststellung, daß die MgO-Menge des porösen Trägers kritisch für eine große Trägerfläche mit optimalem pH-Wert und die Beschickung mit Glucoseisomerase ist, und darüber hinaus auch teilweise die Metallionenbedürfnisse der Enzyme erfüllt. Wegen des Zusatzes von

w MgO beträgt der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesser im grundsätzlichen Bereich von 100-1000 A nicht 140-220 wie in der US-PS 38 68 304, sondern 150—250 A. Es wurde gegenüber der genannten PS jedoch überraschend gefunden, daß die für

γ-, Glucoseisomerase wesentlichen Magnesiumionen z. B. in Form von Magnesiumoxid so in den porösen Aluminiumoxidträger eingebaut werden können, daß sich das Magnesium in der unmittelbaren Nachbarschaft der in der Trägeroberfläche adsorbierten Glucoseiso-

M) merase befindet.

Der genaue Kausalablauf der günstigen Wirkung von Magnesium für die enzymatische Katalyse der Glucoseisomerase ist unbekannt. Es lassen sich jedoch vier günstige Wirkungen des Einbaues von MgO in das

_b-, poröse Aluminiumoxidgefüge festhalten:

1. Regelung des pH in dem porösen Träger und des Substrats je nach den Enzymbedürfnissen;

2. erhebliche Steigerung der immobilisierten, aktiven Gluccjeisomerase gegenüber der Oberflächenbehandlung mit Magnesiumionen oder deren Einbau.

3. Steigerung der Enzymausnutzung oder Bindungswirksamkeit der Magnesiummenge im porösen Träger.

4. Verlängerung der Enzymhalbwertzeit

Bei MgO-Mengen unter 0,84% sinkt die Adsorptionsfähigkeit des Trägers zu stark, während über 12% MgO die Enzymaktivität abnimmt Beide Wirkungen hängen mit dem MgO-Gehalt des porösen Trägers und/oder der pH-Werte im porösen Träger zusammen, wie die nachfolgenden Beispiele zeigen.

Der aus verschiedenen Anteilen Al₂Oa und MgO bestehende Träger kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Für die vorliegende Erfindung wurde als bevorzugter Bereich der durchschnittlichen Porengrööe des Trägers 150—250 A gefunden, und in diesem Bereich liegen auch die Beispiele. Die Beispiele enthalten ferner Angaben zur Fixierung des Enzyms auf den Trägern, und zur Verwendung des immobilisierten Enzympräparats.

Zur Herstellung der porösen Träger werden Aluminiumoxidpartikel der durchschnittlichen Größe 300 Ä± 200 A mit einer verschiedene Mengen Magnesiumionen enthaltenden Lösung zu einer Aufschlämmung gemischt und vorsichtig getrocknet; z. B. an der Luft, durch geringe Erhitzung (etwa 100⁰C), Sprühtrocknung u. s. f, ohne bei der eintretenden Schrumpfung das beim Zusammenschrumpfen der Partikel entstehende poröse Gerüst mit einer der ursprünglichen Partikelgröße entsprechenden Porenweite zu zerstören.

Nach dem Trocknen wird der poröse Körper durch Erhitzen unterhalb des Sinterbereiches, z. B. auf 400-600⁰C während 1 Std. verfestigt.

Das entstehende Produkt kann erforderlichenfalls fein zerteilt und günstig auf 0,074—4,76 mm (4—20 mesh) vorzugsweise 0,35-0,59 mm (30—45 mesh) klassiert werden. Die Partikelgröße kann auch schon vor dem Brennen unmittelbar durch Sprühtrocknen eingestellt werden.

Die porösen Partikel, zur maximalen Enzymbeschikkung mit einer durchschnittlichen Porenweite unter 1000 A, der Größe 0,35-0,59 mm (30-45 mesh) und großer Oberfläche, z. B. größer als etwa 5 qm/g, werden auf den Innenflächen des Enzyms adsorbiert. Es wurde gefunden, daß sich die Enzymbeschickung durch eine Vorbehandlung der Träger mit einer wäßrigen Citratlösung (z. B. 0,1 Mol Zitronensäure oder Natriumcitratlösung, pH 7) erheblich steigern läßt.

Für die Enzymadsorption werden die porösen Partikel mit einer aus 1—2 ml Enzym pro g gewaschenem porösem Träger bestehenden wäßrigen Glucoseisomeraselösung gemischt. Vorzugsweise besteht das Enzym aus einer stark konzentrierten, z. B. 1000—5000 Einheiten pro ml enthaltenden Lösung. Die Adsorptionsdauer richtet sich u. a. nach der porösen Partikelgröße, der Enzymkonzentration und dergl. und beträgt vorzugsweise etwa 2 Std. Das fertige Präparat kann gelagert werden, z. B. am besten in Wasser, oder als nasser Kuchen.

Zur Verwendung wird das Präparat mit einer auf den der optimalen Isomerisation entsprechenden pH-Wert gepufferten, glucosehaltigen Lösung umgesetzt. Der pH wird auf 7—9, vorzugsweise 7,4—8,8, in bekannter Weise eingestellt.

Nach einer bevorzugten, kontinuierlichen Arbeitswei

se werden die Partikel (035—0,59 nun, 150—250 A Porenweite im Durchschnitt) in eine Durchlaufkolonne gegeben; durch diese wird kontinuierlich eine wenigstens 10 Gew.-%, vorzugsweise 30%, Glucose enthal-) tende Glucoselösung, geleitet und der Durchsatz auf maximale Isomerisation eingestellt, z. B. etwa 42—50%ige Umwandlung von Glucose in Fructose.

Die folgende weitere Beschreibung beruht auf nicht beschränkend aufzufassenden Beispielen.
κι Es wurden im Handel bezogene Aluminiumoxidpartikel mit den folgenden Merkmalen verwendet:

Oberfläche: 100 ±20 qm/g
durchschnittlicher Durchmesser: 300 ± 200 A
ι ■> pH der 10%igen wäßrigen Suspension: 4,4

spezifisches Gewicht: 3,6 g/ccm
Röntgenol, best Gamma-Aluminiumoxidgehalt:
ca. 90%.

2Ii Die lösliche, rohe Glucoseisomerase bestand aus einem etwa 2700 internationale GIucoseisonierase-Einheiten (IGIU) enthaltenden Rohmaterial, wobei eine IGIU die zur Erzeugung von 1 μπι Mol Fructose pro Min. bei 60⁰C, pH 6,85 aus einer 2 M Glucoselösung

2-> erforderliche Enzymaktivität darstellt Nach Immobilisierung der Enzyme wurde für die Isomerisation ein optimaler pH-Bereich von 7,4—8,8 ermittelt Im Hinblick auf dia obere pH-Grenze soll der MgO-Anteil im Träger nicht mehr als 12 Gew.-% betragen. Der

in relative MgO-Anteil wurde für jeden Träger analytisch und spektroskopisch ermittelt.

Bei Prüfung auf Enzymaktivität wurde die Verwendung als nichtlösliches Enzym und eventuelle im praktischen Betrieb bzw. Gebrauch auftretende Aktivi-

r> tätsänderung berücksichtigt In allen Fällen wurde die Wirkung von immobilisierten Enzymen in beschickten Kolonnen von 1,5 cm Durchmesser bei 60⁰C mit einer 50°/oigen Glucosespeiselösung (kationenausgetauschte Cerelose), enthaltend 0,005 M MgCl₂, bei pH 8,4

4Ii gemessen.

Die Aktivität wurde nach der Formel errechnet:

worin E = Aktivitätseinheiten, F = Durchsalz in ml/ Std., IV = immobilisiertes Enzym in Gewicht (g, auf Tagesbasis), χ = % Fructose und x_c = % Fructose im Gleichgewichtszustand (51,2%).

Die Tabelle I enthält die Zusammensetzung von 10 Probekörpern in Form von Kugeln oder Partikeln aus Aluminiumoxid und 0—28,6% MgO, dem bestimmte Mengen destilliertes oder entionisiertes Wasser zugesetzt wurden, wobei der Ansatz durch Zugabe von Eisessigsäure auf 0,1 Mol gebracht wurde. Unter Zusatz des Aluminiumoxids und bei lebhaftem Rühren wurde eine Aufschlämmung bereitet, die weiter gerührt wurde, bis nach etwa 15—30 Min, eine glatte, kremartige Mischung entstanden war. Der pH wurde dann auf 2 —3 eingestellt und die angegebene Magnesiumverbindung in fester oder flüssiger Form zugegeben. Die Mischung wurde weiter etwa 15—30 Min. mit hoher Geschwindigkeit gerührt und durch Schlämmguß oder Spritzguß zu Partikeln oder Kugeln geformt, aufgebrochen und klassiert, sowie bei 600⁰C 16 Std. gebrannt. Vor der Adsorption der Enzyme wurde der Einfluß der MgO-Zusätze auf die pH-Werte bestimmt. Hierzu

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wurden je 1 g des Trägers mit 9 g destilliertem Wasser etwa 15 Min. bis zur Einstellung des Gleichgewichtszustandes gemischt und dann der pH-Wert der Mischung gemessen.

Tabelle I	Bestandteile	AI₂O₃	MgCIj-OH₂O	Mg(OH₂)	lindprodukt	pH	% MgO (Gew.)
Nr.	H₂O				Trägerform
		400	0	0	(30-45 mesh)	4,4	0
	489	100	0	0	sphärisch	4,4	0
1*)	100	99,16	4,3	0	Partikel	7,0	0,84
2**)	100	200	14,2	0	Partikel	7,5	1,4
3**)	244	200	22,3	0	sphärisch	8,2	2,2
4*)	244	200	29,4	0	sphärisch	8,1	2,9
5*)	244	200	38,6	0	sphärisch	8,4	3,8
6*)	244	100	0	10,3	sphärisch	8,8	6,65
7*)	100	100	69,2	0	Partikel	8,9	12,0
8**)	100	100	0	58,1	Partikel	9,3	28,6
9**)	100				Partikel
10**)

*) Pound ( = 454 g).
**)g.

Alle porösen Körper hatten durchschnittliche Porenweiten von 150-250 λ und durchschnittliche Korngröße von 0,35-0,59 mm (30-45 mesh).

Durch Umsetzung wurde das Enzym in jedem Fall auf die Innenporen der Träger in einer Menge von "5 ml Enzym pro 15 g Trägermaterial, während 24 Std. unier häufigem Schütteln adsorbiert, nachdem zuvor die Träger in einer Kolonne mit destilliertem Wasser gewaschen und dann während 1 Std. in einem Schüttelbad mit 0,1 Mol Citratlösung umgesetzt worden waren. Träger und adsorbiertes Enzym wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und auf Enzymaktivität geprüft. In der Tabelle II bezeichnet E₀ die Enzymaktivität pro g, und Eo äqu. den normalisierten Aktivitätswert bei verstärkter Beschickung unter Verwendung unregelmäßiger Partikel oder sphärischer Formen.

Tabelle II	% MgO	pH	Form	/■ο	/:'o (äqiiiv.)
Nr.	0	4,4	sphärisch	203	203
1	0	4,4	Partikel	387	(200)
2	0,84	7,0	Partikel	805	(600)
3	1,4	7,5	sphärisch	650	(650)
4	2,2	8,2	sphärisch	898	898
5	2,9	8,1	sphärisch	899	899
6	3,8	8,4	sphärisch	909	909
7	6,65	8,8	Partikel	916	(720)
8	12,0	8,9	Partikel	768	(600)
9	28,6	9,3	Partikel	200	(50)
K)

Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit sollte die Beschickung pro g Träger wenigstens 500 Aktivitätseinheilen Glucoseisomer^e betragen, wenn eine kontinuierliche Isomerisation (Kolonnendurchlauf) bezweckt wird. Wie die Tabelle II zeigt, läßt sich diese Beschickung erreichen, wenn der MgO Anteil des Trägers 0,84—12 Gew.-%, zur Optimierung sogar _W) 0,84-3,8% beträgt.

Obwohl die eenauen Ursachen nicht bekannt sind.

scheint der pH eine Rolle zu spielen, da die Mindestbeschickung von 500 Einheiten im pH Bereich von 7—8,9 erzielt wird. Der im angegebenen Bereich kritische Zusatz von MgO erfüllt daher nicht nur zumindest einen Teil des Bedürfnisses an Mg⁺+ der Enzyme, sondern setzt darüber hinaus pH Bereiche für den Träger, welche seine Beschickung nach oben und unten begrenzen.

Claims

Patentansprüche:

1. Träger für die Adsorption von Glucoseisomerase, dadurch gekennzeichnet, daß er aus 0^4-12% MgO und 99,16-88% Al₂O₃ in Form poröser Partikel der durchschnittlichen Größe 0,074—4,76 mm (4—20 mesh) und einer durchschnittlichen Porenweite von 100—1000 A besteht

2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel aus 0,84-3,8% MgO und 99,16-96,22 Al₂O₃ bestehen.

3. Träger nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Porenweite der Partikel 150—250 A ist

4. Träger nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Partikelgröße 035—0,59 mm (30—45 mesh) beträgt