DE2537670B2

DE2537670B2 - Träger für die Adsorption von Glucoseisomerase

Info

Publication number: DE2537670B2
Application number: DE2537670A
Authority: DE
Inventors: David Leo Eaton; Ralph Allan Messing
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1974-09-18
Filing date: 1975-08-23
Publication date: 1978-09-21
Also published as: AU8497375A; YU235875A; US3982997A; JPS5839515B2; CA1049943A; ES441026A1; AR219691A1; IT1042678B; DE2559847B1; NL7510922A; FR2285399B1; JPS5163983A; DE2559847C2; TR18720A; PH12381A; BE833536A; GB1518336A; DE2537670C3; DE2537670A1; FR2285399A1

Description

Die Erfindung betrifft großflächige, poröse, anorganische Träger für die Adsorption von Enzympräparaten, insbesondere Glucoseisomerase, zur Umwandlung von Glucose in Fructose.

Die Umwandlung von Glucose in Fructose ist wegen der annähernd doppelten Süßwirkung von Fructose bei gleichem Kaloriengehalt von Interesse. Zur enzymatischen, rationellen Herstellung in kontinuierlicher Arbeitsweise, z. B. in Durchlaufkolonnen, muß das wiederholt zu verwendende Enzym dazu immobilisiert sein, d. h. wasserunlöslich sein. Die bekannte Fructoseherstellung durch alkalische Isomerisation erzeugt unerwünschte, störende (färbende oder säuernde) Nebenprodukte, welche nach der US-PS 34 31 253 zwar durch Zusätze von alkalischem, feinteiligem Aluminiumoxid ausgeschaltet werden können, was aber wegen der langen erforderlichen Verweilzeiten die rationelle, kontinuierliche Herstellung, insbesondere in Durchlaufkolonnen, ausschließt.

Für die enzymatische Herstellung ist die Immobilisierung des Enzyms erforderlich, damit es nicht in Lösung geht, mehr als zweimal verwendet werden kann und das Produkt nicht verunreinigt. Hierfür wurden als Träger bereits Keramiken, z. B. auch Aluminiumoxidkörper vorgeschlagen, siehe die US-PS 35 29 538, 35 56 945, 38 50 751,38 68 304.

Für die enzymatische Umwandlung sind aber auch bestimmte Metallionen wesentlich; so untersuchten Takasaki u.a., in »Studies on Sugar-Isomerizing Enzyme, Purification, Crystallization and Some Properties of Glucose Isomerase from Streptomyces sp.«, in Agr. Biol. Chem., Bd. 33, Nr. 11, p. 1527-34 (1969), den Einfluß verschiedener Metallionen wie Mg, Co, Fe, Mn, Ni, Ba, Ca, Zn, Cu und kamen zu dem Ergebnis, daß für die Aktivität der aus einer Streptomyces species gewonnenen Glucoseisomerase Cobalt- und Magnesiumionen wesentlich sind.

Diese für wesentlich gehaltenen Ionen werden bisher der glucosehaltigen Speiselösung vor dem Kontakt mit dem immobilisierten Enzym zugesetzt, vgl. die Beispiele der US-PS 38 68 304. Dies bedingt allerdings einen zusätzlichen, besonders beim kontinuierlichen Arbeiten mit Durchlaufkolonnen lästigen Verfahrensschritt. Noch bedenklicher ist der Verbleib der Zusätze im Endprodukt. Besonders im Falle von Cobalt ist dies unerwünscht, oder sogar schädlich, z. B. in Nahrungsoder Futtermitteln.

Auch die Immobilisierung des Enzyms durch organische Träger wurde vorgeschlagen, vgl. z. B. die US-PS J7 08 J97. nach der Glucoseisomerase auf bestimmten, ionenaustauschenden Zellulosen stabilisiert und aktiviert werden soll, so daß eine wiederholte Verwendung mit verbesserter Ausbeute erzielt wird. Da es sich hierbei um einen organischen Träger handelt, müssen organischen Trägern generell anhaftende, schwerwiegende Nachteile in Kauf genommen werden, denn sie sind von Natur aus weniger beständig; sie werden leichter abgebaut und sind dem Befall von Mikroorganismen ausgesetzt. Nachteilig ist auch die geringe Abmessungsbeständigkeit; sie quellen und stören die genaue Durchsatzregelung beim kontinuierlichen Betrieb. Besonders nachteilig ist auch die Gefahr der Verstopfung der für die rationelle Herstellung in großem Umfang einzusetzenden Durchlaufkolonnen.

Die Erfindung hat einen für die Glucoseisomeraseadsorption geeigneten Träger zur Aufgabe, welcher diese Nachteile organischer Stoffe vermeidet, und gleichzeitig die erwähnten, die enzymatische Aktivität fördernden lonenbedürfnisse befriedigt.

Die Aufgabe wird durch den Träger der Erfindung dadurch gelöst, daß er aus 0,84—12% MgO und 99,16-88% AI₂O₃ in Form poröser Partikel der durchschnittlichen Größe 0,074-4,76 mm

(4—200 mesh) und einer durchschnittlichen Porenweite von 100—1000 A besteht.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß die MgO-Menge des porösen Trägers kritisch für eine große Trägerfläche mit optimalem pH-Wert und die Beschickung mit Glucoseisomerase ist, und darüber hinaus auch teilweise die Metallionenbedürfnisse der Enzyme erfüllt. Wegen des Zusatzes von MgO beträgt der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesser im grundsätzlichen Bereich von 100- 1000 A nicht 140-220 wie in der US-PS 38 68 304, sondern 150—250 A. Es wurde gegenüber der genannten PS jedoch überraschend gefunden, daß die für Glucoseisomerase wesentlichen Magnesiuniionen z. B. in Form von Magnesiumoxid so in den porösen Aluminiumoxidträger eingebaut werden können, daß sich das Magnesium in der unmittelbaren Nachbarschaft der in der Trägeroberfläche adsorbierten Glucoseisomerase befindet.

Der genaue Kausalablauf der günstigen Wirkung von Magnesium für die enzymatische Katalyse der Glucoseisomerase ist unbekannt. Es lassen sich jedoch vier günstige Wirkungen des Einbaues von MgO in das poröse Aluminiunioxidgefüge festhalten:

I. Regelung des pH .n dem porösen Träger und des Substrats je nach den Enzymbedürfnissen;

2. erhebliche Steigerung der immobilisierten, aktiven Glucoseisomerase gegenüber der Oberflächenbehandlung mit Magnesiumionen oder deren Einbau.

3. Steigerung der Enzymausnutzung oder ßindungswirksamkeit der Magnesiummenge im porösen Träger.

4. Verlängerung der Enzymhalbwertzeit.

Bei MgO-Mengen unter 0,84% sinkt die Adsorptionsfähigkeit des Trägers zu stark, während über 12% MgO die Enzymaktivität abnimmt. Beide Wirkungen hängen mit dem MgO-Gehalt des porösen Trägers und/oder der pH-Werte im porösen Träger zusammen, wie die nachfolgenden Beispiele zeigen.

Der aus verschiedenen Anteilen AI2O3 und MgO bestehende Träger kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Für die vorliegende Erfindung wurde als bevorzugter Bereich der durchschnittlichen Porengröße des Trägers 150—250 Ä gefunden, und in diesem Bereich liegen auch die Beispiele. Die Beispiele enthalten ferner Angaben zur Fixierung des Enzyms auf den Trägern, und zur Verwendung des immobilisierten Enzympräparats.

Zur Herstellung der porösen Träger werden Aluminiumoxidpartikel der durchschnittlichen Größe 300 Ä± 200 A mit einer verschiedene Mengen Magnesiumionen enthaltenden Lösung zu einer Aufschlämmung gemischt und vorsichtig getrocknet; z. B. an der Luft, durch geringe Erhitzung (etwa 100°C), Sprühtrocknung u. s. f., ohne bei der eintretenden Schrumpfung das beim Zusammenschrumpfen der Partikel entstehende poröse Gerüst mit einer der ursprünglichen Partikelgröße entsprechenden Porenweite zu zerstören.

Nach dem Trocknen wird der poröse Körper durch Erhitzen unterhalb des Sinterbereiches, z. B. auf 400-600⁰C während 1 Std. verfestigt.

Das entstehende Produkt kann erforderlichenfalls fein zerteilt und günstig auf 0,074—4,76 mm (4-20 mesh) vorzugsweise 0,35-0,59 mm (30-45 mesh) klassiert werden. Die Partikelgröße kann auch schon vor dem Brennen unmittelbar durch Sprühtrocknen eingestellt werden.

Die porösen Partikel, zur maximalen Enzymbeschikkung mit einer durchschnittlichen Porenweite unter 1000 A, der Größe 0,35-0,59 mm (30-45 mesh) und großer Oberfläche, z. B. größer als etwa 5 qm/g, werden auf den Innenflächen des Enzyms adsorbiert. Es wurde gefunden, daß sich die Enzymbeschickung durch eine Vorbehandlung der Träger mit einer wäßrigen Citratlösung (z. B. 0,1 Mol Zitronensäure oder Natriumcitratlösung, pH 7) erheblich steigern läßt.

Für die Enzymadsorption werden die porösen Partikel mit einer aus 1 —2 ml Enzym pro g gewaschenem porösem Träger bestehenden wäßrigen Glucoseisomeraselösung gemischt. Vorzugsweise besteht das Enzym aus einer stark konzentrierten, z. B. 1000—5000 Einheiten pro ml enthaltenden Lösung. Die Adsorptionsdauer richtet sich u. a. nach der porösen Partikelgröße, der Enzymkonzentration und dergl. und beträgt vorzugsweise etwa 2 Std. Das fertige Präparat kann gelagert werden, z. B. am besten in Wasser, oder als nasser Kuchen.

Zur Verwendung wird das Präparat mit einer auf den der optimalen Isomerisation entsprechenden pH-Wert gepufferten, glucosehaltigen Lösung umgesetzt. Der pH wird auf 7 — 9, vorzugsweise 7,4—8,8, in bekannter Weise eingestellt.

Nach einer bevorzugten, kontinuierlichen Arbeitsweise werden die Partikel (0,35-0,59 mm, 150—250 A Porenweite im Durchschnitt) in eine Durchlaufkolonne gegeben; durch diese wird kontinuierlich eine wenigstens 10 Gew.-%, vorzugsweise 30%, Glucose enthal-"1 tende Glucoselösung, geleitet und der Durchsatz auf maximale Isomerisation eingestellt, z. B. etwa 42—50%ige Umwandlung von Glucose in Fructose.

Die folgende weitere Beschreibung beruht auf nicht beschränkend aufzufassenden Beispielen.
in Es wurden im Handel bezogene Aluminiumoxidpartikel mit den folgenden Merkmalen verwendet:

Oberfläche: 100 ±20 qm/g
durchschnittlicher Durchmesser: 300 ±200 A
pH der 10%igen wäßrigen Suspension: 4,4

spezifisches Gewicht: 3,6 g/ccm
Röntgenol, best. Gamma-Aluminiumoxidgehalt:
ca. 90%.

jo Die lösliche, rohe Glucoseisomerase bestand aus einem etwa 2700 internationale Glucoseisomerase-Einheiten (IGIU) enthaltenden Rohmaterial, wobei eine IGIU die zur Erzeugung von 1 μπι Mol Fructose pro Min. bei 60°C, pH 6,85 aus einer 2 M Glucoselösung

J-. erforderliche Enzymaktivität darstellt. Nach Immobilisierung der Enzyme wurde für die Isomerisation ein optimaler pH-Bereich von 7,4—8,8 ermittelt. Im Hinblick auf die obere pH-Grenze soll der MgO-Anteil im Träger nicht mehr als 12 Gew.-% betragen. Der

in relative MgO-Anteil wurde für jeden Träger analytisch und spektroskopisch ermittelt.

Bei Prüfung auf Enzymaktivität wurde die Verwendung als nichtlösliches Enzym und eventuelle im praktischen Betrieb bzw. Gebrauch auftretende Aktivi-

r> tätsänderung berücksichtigt. In allen Fällen wurde die Wirkung von immobilisierten Enzymen in beschickten Kolonnen von 1,5 cm Durchmesser bei 6O⁰C mit einer 50%igen Glucosespeiselösung (kationenausgetauschte Cerelose), enthaltend 0,005 M MgCI₂, bei pH 8,4

■hi gemessen.

Die Aktivität wurde nach der Formel errechnet:

worin E= Aktivitätseinheiten, F= Durchsatz in ml/ Std., W = immobilisiertes Enzym in Gewicht (g, auf Tagesbasis), χ = % Fructose und x_c = % Fructose im Gleichgewichtszustand (51,2%).

Die Tabelle I enthält die Zusammensetzung von 10 Probekörpern in Form von Kugeln oder Partikeln aus Aluminiumoxid und 0—28,6% MgO, dem bestimmte Mengen destilliertes oder entionisiertes Wasser zugesetzt wurden, wobei der Ansatz durch Zugabe von Eisessigsäure auf 0,1 Mol gebracht wurde. Unter Zusatz des Aluminiumoxids und bei lebhaftem Rühren wurde eine Aufschlämmung bereitet, die weiter gerührt wurde, bis nach etwa 15—30 Min, eine glatte, kremartige Mischung entstanden war. Der pH wurde dann auf 2 —3 eingestellt und die angegebene Magnesiumverbindung in fester oder flüssiger Form zugegeben. Die Mischung wurde weiter etwa 15—30 Min. mit hoher Geschwindigkeit gerührt und durch Schlämmguß oder Spritzguß zu Partikeln oder Kugeln geformt, aufgebrochen und klassiert, sowie bei 600⁰C 16 Std. gebrannt. Vor der Adsorption der Enzyme wurde der Einfluß der MgO-Zusätze auf die pH-Werte bestimmt. Hierzu

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wurden je 1 g des Trägers mit 9 g destilliertem Wasser etwa 15 Min. bis zur Einstellung des Gleichgewichtszustandes gemischt und dann der pH-Wert der Mischung gemessen.

Tabelle I

Nr.	Bestandteile	AIiO.,	MgCIi-6HiO	Mg(OHi)	lindprodukt	pH	7c MgO Kiew.)
	HiO				Trägerform
		400	0	(J	(30-45 mesh)	4,4	(J
1*)	489	100	0	0	sphärisch	4,4	0
2**)	100	99,16	4,3	(J	Partikel	7,0	0.84
3**)	!00	200	14,2	0	Partikel	7.5	1,4
4*)	244	200	22,3	0	sphärisch	8,2	2,2
5*)	244	200	29,4	(J	sphärisch	8,1	2,9
6*)	244	200	38,6	0	sphärisch	8,4	3,8
7*)	244	100	0	10,3	sphärisch	8.8	6,65
8**)	100	100	69,2	0	Partikel	8,9	12,0
9**)	100	100	0	58,1	Partikel	9.3	28,6
10**)	100				Partikel
*) Pound ( =	454 g).
*♦) g.

Alle porösen Körper hatten durchschnittliche Porenweilen von 150-250 Ä und durchschnittliche Korngröße von 0,35-0,59 mm (30-45 mesh).

Durch Umsetzung wurde das Enzym in jedem Fall auf die Innenporen der Träger in einer Menge von 15 ml Enzym pro 15 g Trägermaterial, während 24 Std. unter häufigem Schütteln adsorbiert, nachdem zuvor die Träger in einer Kolonne mit destilliertem Wasser gewaschen und dann während 1 Std. in einem Schüttelbad mit 0,1 Mol Citratlösung umgesetzt worden

Tabelle II

waren. Träger und adsorbiertes Enzym wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und auf Enzymaktivität geprüft. In der Tabelle II bezeichnet Ea die Enzymaktivität pro g, und £ό äqu. den normalisierten Aktivitätswert bei verstärkter Beschickung unter Verwendung unregelmäßiger Partikel oder sphärischer Formen.

Nr.

% MgO

pH

Au (äquiv.)

1	0	4,4	sphärisch	203	203
2	0	4,4	Partikel	387	(200)
3	0,84	7,0	Partikel	805	(600)
4	1,4	7,5	sphärisch	650	(650)
5	2,2	8,2	sphärisch	898	898
6	2,9	8,1	sphärisch	899	899
7	3,8	8,4	sphärisch	909	909
8	6,65	8,8	Partikel	916	(720)
9	12,0	8,9	Partikel	768	(600)
IO	28,6	9,3	Partikel	200	(50)

Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit sollte die Beschickung pro g Träger wenigstens 500 Aktivitätseinheiten Glucoseisomerase betragen, wenn eine kontinuierliche Isomerisation (Kolonnendurchlauf) bezweckt wird. Wie die Tabelle II zeigt, läßt sich diese Beschickung erreichen, wenn der MgO Anteil des Trägers 0,84—12 Gew.-%, zur Optimierung sogar 0,84-3,8% beträgt.

Obwohl die genauen Ursachen nicht bekannt sind.

scheint der pH eine Rolle zu spielen, da die Mindestbeschickung von 500 Einheiten im pH Bereich von 7—8,9 erzielt wird. Der im angegebenen Bereich kritische Zusatz von MgO erfüllt daher nicht nur zumindest einen Teil des Bedürfnisses an Mg⁺+ der Enzyme, sondern setzt darüber hinaus pH Bereiche für

bo den Träger, welche seine Beschickung nach oben und unten begrenzen.

Claims

Patentansprüche:

1. Träger für die Adsorption von Glucoseissomerase, dadurch gekennzeichnet, daß er aus 0,84-12% MgO und 99,16-88% AI₂O₁ in Form poröser Partikel der durchschnittlichen Größe 0,074—4,76 mm (4—20 mesh) und einer durchschnittlichen Porenweite von 100—1000 Ä besteht.

2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel aus 0,84-3,8% MgO und 99,16-96,22 AI₂O₃ bestehen.

3. Träger nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Porenweite der Partikel 150-250 A ist.

4. Träger nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die durchschnittliche Partikelgröße 0,35—0,59 mm (30—45 mesh) beträgt.