DE2559847B1

DE2559847B1 - Enzympraeparate fuer die Umwandlung von Glucose in Fructose,sowie Verfahren zu partiellen Isomerisation einer Glucoseloesung zu einer Fruktoseloesung

Info

Publication number: DE2559847B1
Application number: DE2559847A
Authority: DE
Inventors: Messing Raiph Allan; Eaton David Leo
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1974-09-18
Filing date: 1975-08-23
Publication date: 1980-03-13
Also published as: AU8497375A; DE2537670A1; NL7510922A; DE2537670C3; IT1042678B; DE2559847C2; PH12381A; AR219691A1; TR18720A; FR2285399A1; YU235875A; ES441026A1; FR2285399B1; BE833536A; JPS5839515B2; JPS5163983A; GB1518336A; US3982997A; DE2537670B2; CA1049943A

Description

Die Erfindung betrifft immobilisierte wasserunlösliche Glucoseisomerasepräparate zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in Fructose sowie ein Verfahren zur partiellen Isomerisation einer Glucoselösung zu einer Fructoselösung.

Die Umwandlung von Glucose in Fructose ist wegen der annähernd doppelten Süßwirkung von Fructose bei gleichem Kaloriengehalt von Interesse. Zur enzymatischen, rationellen Herstellung in kontinuierlicher Arbeitsweise, z. B. in Durchlaufkolonnen, muß das wiederholt zu verwendende Enzym dazu immobilisiert sein, d. h. wasserunlöslich sein. Die bekannte Fructoseherstellung durch alkalische Isomerisation erzeugt unerwünschte, störende (färbende oder säuernde) Nebenprodukte, welche nach der US-PS 34 31 253 zwar durch Zusätze von alkalischem, feinteiligen Aluminiumoxid ausgeschaltet werden können, was aber wegen der langen erforderlichen Verweilzeiten die rationelle, kontinuierliche Herstellung, insbesondere in Durchlaufkolonnen ausschließt.

Für die enzymatische Herstellung ist die Immobilisierung des Enzyms erforderlich, damit es nicht in Lösung geht, mehr als nur einmal verwendet werden kann und das Produkt nicht verunreinigt. Hierfür wurden als Träger bereits Keramiken, z. B. auch Aluminiumoxidkörper vorgeschlagen, siehe die US-PS 35 29 538, 35 56 945,38 50 751,38 68 304.

Für die enzymatische Umwandlung sind aber auch bestimmte Metallionen wesentlich; so untersuchten Takasaki u.a., in »Studies on Sugar-Isomerizing Enzyme, Purification, Crystallization and Some Properties of Glucose Isomerase from Streptomyces sp.«, in Agr. Biol. Chem., Bd. 33, Nr. 11, p. 1527-34 (1969), den Einfluß verschiedener Metallionen wie Mg, Co, Fe, Mn, Ni, Ba, Ca, Zn, Cu und kamen zu dem Ergebnis, daß für die Aktivität der aus einer Streptomyces species gewonnenen Glucoseisomerase Cobalt- und Magnesiumionen wesentlich sind.

Diese für wesentlich gehaltenen Ionen werden bisher der glucosehaltigen Speiselösung vor dem Kontakt mit dem immobilisierten Enzym zugesetzt, vgl. die Beispiele der US-PS 38 68 304. Dies bedingt allerdings einen zusätzlichen, besonders beim kontinuierlichen Arbeiten mit Durchlaufkolonnen lästigen Verfahrensschritt.

Noch bedenklicher ist der Verbleib der Zusätze im Endprodukt. Besonders im Falle von Cobalt ist dies unerwünscht oder sogar schädlich, z. B. in Nahrungsoder Futtermitteln.
Auch die Immobilisierung des Enzyms durch organisehe Träger wurde vorgeschlagen, vgl. z. B. die US-PS 37 08 397, nach der Glucoseisomerase auf bestimmten, ionenaustauschenden Zellulosen stabilisiert und aktiviert werden soll, so daß eine wiederholte Verwendung mit verbesserter Ausbeute erzielt wird.. Da es sich hierbei um einen organischen Träger handelt, müssen organischen Trägern generell anhaftende, schwerwiegende Nachteile in Kauf genommen werden, denn sie sind von Natur aus weniger beständig; sie werden leichter abgebaut und sind dem Befall von Mikroorganismen ausgesetzt. Nachteilig ist auch die geringe Abmessungsbeständigkeit; sie quellen und stören die genaue Durchsatzregelung beim kontinuierlichen Betrieb. Besonders nachteilig ist auch die Gefahr der Verstopfung der für die rationelle Herstellung in großem Umfang einzusetzenden Durchlaufkolonnen.

Die DE-OS 24 05 316 beschreibt Enzympräparate, in denen das Enzym an die Innenfläche eines porösen Keramikkörpers mit einer durchschnittlichen Korngröße von 0,074—4,76 mm und etwa 100—1000 Ä betra-

J5 genden Porendurchmessern gebunden ist. Nicht behandelt wird die bei der Herstellung von Fructose durch enzymatische Flucoseumwandlung auftretende Problematik der Zufuhr der weiter oben erwähnten Metallionen ohne wesentliche Störung und Komplizierung des kontinuierlichen Verfahrensablaufs auch ohne Verunreinigung des Endprodukts.

Die Erfindung hat ein Enzympräparat für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose in Fructose zur Aufgabe, welches die die Enzymaktivität fördernden Metallionen ohne übermäßige Verfahrenskomplizierung und Störung oder Verunreinigung liefert.

Diese Aufgabe wird durch das Enzympräparat der Erfindung gelöst, in dem die Glucoseisomerase auf einem Träger aus 0,84—12% MgO und 99,16—88% AI2O3 in Form poröser Partikel der durchschnittlichen Größe 0,074—4,76 mm und der durchschnittlichen Porenweite 100—1000 Ä adsorbiert ist.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß die MgO Menge des porösen Trägers kritisch für eine große Trägerfläche mit optimalem pH-Wert und die Beschickung mit Glucoseisomerase ist, und darüber hinaus auch teilweise die Metallionenbedürfnisse der Enzyme erfüllt. Wegen des Zusatzes von MgO beträgt der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesser im grundsätzlichen Bereich von 100-1000 Ä nicht 140-220 wie in der US-PS 38 68 304 oder in der DE-OS 24 05 316, sondern 150—250 Ä. Es wurde gegenüber der genannten PS jedoch überraschend gefunden, daß die für Glucoseisomerase wesentlichen Magnesiumionen, z. B. in Form von Magnesiumoxid, so in den porösen Aluminiumoxidträger eingebaut werden können, daß sich das Magnesium in der unmittelbaren Nachbarschaft der in der

Trägeroberfläche adsorbierten Glucoseisomerase befindet.

Der genaue Kausalablauf der günstigen Wirkung von Magnesium für die enzymatische Katalyse der Glucoseisomerase ist unbekannt. Es lassen sich jedoch vier günstige Wirkungen des Einbaus von MgO in das poröse Aluminiumoxidgefüge festhalten:

1. Regelung des pH in dem porösen Träger und des Substrats je nach den Enzymbedürfnissen;

2. erhebliche Steigerung der immobilisierten, aktiven Glucoseisomerase gegenüber der Oberflächenbehandlung mit Magnesiumionen oder deren Einbau;

3. Steigerung der Enzymausnutzung oder Bindungswirksamkeit der Magnesiummenge im porösen Träger;

4. Verlängerung der Enzymhalbwertzeit.

Bei MgO Mengen unter 0,84% sinkt die Adsorptionsfähigkeit des Trägers zu stark, während über 12% MgO die Enzymaktivität abnimmt. Beide Wirkungen hängen mit dem MgO Gehalt des porösen Trägers und/oder der pH-Werte im porösen Träger zusammen, wie die nachfolgenden Beispiele zeigen.

Der aus verschiedenen Anteilen AI2O3 und MgO bestehende Träger kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Für die vorliegende Erfindung wurde als bevorzugter Bereich der durchschnittlichen Porengröße des Trägers 150—250 Ä gefunden, und in diesem Bereich liegen auch die Beispiele. Die Beispiele enthalten ferner Angaben zur Fixierung des Enzyms auf den Trägern und zur Verwendung des immobilisierten Enzympräparats.

Zur Herstellung der porösen Träger werden Aluminiumoxidpartikel der durchschnittlichen Größe 300 Ä±200 Ä mit einer verschiedenen Mengen Magnesiumionen enthaltenden Lösung zu einer Aufschlämmung gemischt und vorsichtig getrocknet, z. B. an der Luft, durch geringe Erhitzung (etwa 100⁰C), Sprühtrocknung usf., ohne bei der eintretenden Schrumpfung das beim Zusammenschrumpfen der Partikel entstehende poröse Gerüst mit einer der ursprünglichen Partikelgröße entsprechenden Porenweite zu zerstören.

Nach dem Trocknen wird der poröse Körper durch Erhitzen unterhalb des Sinterbereiches, z. B. auf 400—600° C während 1 Std. verfestigt.

Das entstehende Produkt kann erforderlichenfalls fein zerteilt und günstig auf 4—200 mesh, 0,074— 4,76 mm, vorzugsweise 30—45 mesh, 0,35—0,59 mm klassiert werden. Die Partikelgröße kann auch schon vor dem Brennen unmittelbar durch Sprühtrocknen eingestellt werden.

Die porösen Partikel, zur maximalen Enzymbesehikkung mit einer durchschnittlichen Porenweite unter 1000 Ä, der Größe 30—45 mesh, 0,35—0,59 mm, und großer Oberfläche, z. B. größer als etwa 5 qm/g, werden auf den Innenflächen des Enzyms adsorbiert. Es wurde gefunden, daß sich die Enzymbeschickung durch eine Vorbehandlung der Träger mit einer wäßrigen Citratlösung (z. B. 0,1 Mol Zitronensäure oder Natriumcitratlösung, pH 7) erheblich steigern läßt.

Für die Enzymadsorption werden die porösen Partikel mit einer aus 1—2 ml Enzym pro g gewaschenem porösen Träger bestehenden wäßrigen Glucoseisomeraselösung gemischt. Vorzugsweise besteht das Enzym aus einer stark konzentrierten, z. B. 1000—5000 Einheiten pro ml enthaltenden Lösung. Die Adsorptionsdauer richtet sich u. a. nach der porösen Partikelgröße, der Enzymkonzentration und dergl. und beträgt

vorzugsweise etwa 2 Std. Das fertige Präparat kann gelagert werden, z. B. am besten in Wasser, oder als nasser Kuchen.

Zur Verwendung wird das Präparat mit einer auf den der optimalen Isomerisation entsprechenden pH-Wert gepufferten, glucosehaltigen Lösung umgesetzt. Der pH wird auf 7—9, vorzugsweise 7,4—8,8 in bekannter Weise eingestellt.

Nach einer bevorzugten, kontinuierlichen Arbeitsweise werden die Partikel (30—45 mesh, 150—250 Ä Porenweite im Durchschnitt) in eine Durchlaufkolonne gegeben; durch diese kontinuierlich eine wenigstens 10 Gew.-%, vorzugsweise 30%, Glucose enthaltende Glucoselösung, geleitet und der Durchsatz auf maximale Isomerisation eingestellt, z. B. etwa 42—50%ige Umwandlung von Glucose in Fructose.

Die folgende weitere Beschreibung beruht auf nicht beschränkend aufzufassenden Beispielen.

Es wurden im Handel bezogene Aluminiumoxidpartikel mit den folgenden Merkmalen verwendet:

Oberfläche:	100 ±20 qm/g
durchschnittlicher
Durchmesser:	300±200 Ä
pH der 10%igen wäßrigen
Suspension:	4,4
spezifisches Gewicht:	3,6 g/ccm
Röntgenol. best. Gamma-
Aluminiumoxidgehalt:	ca. 90%.

Die lösliche, rohe Glucoseisomerase bestand aus einem etwa 2700 internationale Glucoseisomerase-Einheiten (IGIU) enthaltenden Rohmaterial, wobei eine IGIU die zur Erzeugung von 1 μηι Mol Fructose pro Min. bei 60° C, pH 6,85 aus einer 2 M Glucoselösung erforderliche Enzymaktivität darstellt. Nach Immobilisierung der Enzyme wurde für die Isomerisation ein optimaler pH-Bereich von 7,4—8,8 ermittelt. Im Hinblick auf die obere pH-Grenze soll der MgO-Anteil im Träger nicht mehr als 12 Gew.-% betragen. Der relative MgO-Anteil wurde für jeden Träger analytisch und spektroskopisch ermittelt.

Bei Prüfung auf Enzymaktivität wurde die Verwendung als nichtlösliches Enzym und eventuelle im praktischen Betrieb bzw. Gebrauch auftretende Aktivitätsänderung berücksichtigt. In allen Fällen wurde die Wirkung von immobilisierten Enzymen in beschickten Kolonnen von 1,5 cm Durchmesser bei 60° C mit einer 50%igen Glucosespeiselösung (kationenausgetauschte Celerose) enthaltend 0,005 M MgCI₂ bei pH 8,4 gemessen.

Die Aktivität wurde nach der Formel errechnet

worin

E — Aktivitätseinheiten,

F = Durchsatz in ml/Std.,

W — immobilisiertes Enzym in Gewicht (g, auf

Tagesbasis),
χ = % Fructose und
Xe = % Fructose im Gleichgewichtszustand (51,2%).

Die Tabelle I enthält die Zusammensetzung von 10 Probekörpern in Form von Kugeln oder Partikeln aus Aluminiumoxid und 0—28,6% MgO, dem bestimmte Mengen destilliertes oder entionisiertes Wasser zugesetzt wurden, wobei der Ansatz durch Zugabe von Eisessigsäure auf 0,1 Mol gebracht wurde. Unter Zusatz

des Aluminiumoxids und bei lebhaftem Rühren wurde eine Aufschlämmung bereitet, die weiter gerührt wurde, bis nach etwa 15—30 Min. eine glatte, kremartige Mischung entstanden war. Der pH wurde dann auf 2—3 eingestellt und die angegebene Magnesiumverbindung in fester oder flüssiger Form zugegeben. Die Mischung wurde weiter etwa 15—30 Minuten mit hoher Geschwindigkeit gerührt und durch Schlämmguß oder

Tabelle I

Spritzguß zu Partikeln oder Kugeln geformt, aufgebrochen und klassiert, sowie bei 600⁰C 16 Std. gebrannt. Vor der Adsorption der Enzyme wurde der Einfluß der MgO-Zusätze auf die pH-Werte bestimmt. Hierzu wurden je 1 g des Trägers mit 9 g destilliertem Wasser etwa 15 Min. bis zur Einstellung des Gleichgewichtszustandes gemischt und dann der pH-Wert der Mischung gemessen.

	H₂O	Al₂O₃	Bestandteile	Mg(OH₂)	Endprodukt	pH	%MgO
Nr.			MgCl₂-OH₂O		Trägerform		(Gew.)
	489	400		0	(30-45 mesh)	4,4	0
1*)	100	100	0	0	sphärisch	4,4	0
2**)	100	99,16	0	0	Partikel	7,0	0,84
3**)	244	200	4,3	0	Partikel	7,5	1,4
4*)	244	200	14,2	0	sphärisch	8,2	2,2
5*)	244	200	22,3	0	sphärisch	8,1	2,9
6*)	244	200	29,4	0	sphärisch	8,4	3,8
7*)	100	100	38,6	10,3	sphärisch	8,8	6,65
8**,	100	100	0	0	Partikel	8,9	12,0
9**)	100	100	69,2	58,1	Partikel	9,3	28,6
10**)		0	Partikel

*) pound x 454 g)
**_)g

Alle porösen Körper hatten durchschnittliche Porenweiten von 150 - 250 Ä und durchschnittliche Korngrössen von 0.35 - 0.59 mm (30-45 mesh).

Durch Umsetzung wurde das Enzym in jedem Fall auf die Innenporen der Träger in einer Menge von 15 ml Enzym pro 15 g Trägermaterial, während 24 Std. unter häufigem Schütteln adsorbiert, nachdem zuvor die Träger in einer Kolonne mit destilliertem Wasser gewaschen und dann während 1 Std. in einem Schüttelbad mit 0,1 Mol Citratlösung umgesetzt worden

Tabelle II

waren. Träger und adsorbiertes Enzym wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und auf Enzymaktivität geprüft. In der Tabelle II bezeichnet Eo die Enzymaktivität pro g, und Ea äqu. den normalisierten Aktivitätswert bei verstärkter Beschickung unter Verwendung unregelmäßiger Partikel oder sphärischer Formen.

Nr. %MgO pH Form E₀

E₀
(äquiv.)

1	0	4,4	sphärisch	203	203
2	0	4,4	Partikel	387	(200)
3	0,84	7,0	Partikel	805	(600)
4	1,4	7,5	sphärisch	650	(650)
5	2,2	8,2	sphärisch	898	898
6	2,9	8 ml	sphärisch	899	899
7	3,8	8,4	sphärisch	909	909
8	6,65	8,8	Partikel	916	(720)
9	12,0	8,9	Partikel	768	(600)
10	28,6	9,3	Partikel	200	( 50)

Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit sollte die Beschickung pro g Träger wenigstens 500 Aktivitätseinheiten Glucoseisomerase betragen, wenn eine kontinuierliche Isomerisation (Kolonnendurchlauf) bezweckt wird. Wie die Tabelle II zeigt, läßt sich diese Beschickung erreichen, wenn der MgO-Anteil des Trägers 0,84—12 Gew.-°/o, zur Optimierung sogar 0,84—3,8% beträgt.

Obwohl die genauen Ursachen nicht bekannt sind, scheint der pH eine Rolle zu spielen, da die Mindestbeschickung von 500 Einheiten im pH-Bereich von 7 — 8,9 erzielt wird. Der im angegebenen Bereich kritische Zusatz von MgO erfüllt daher nicht nur zumindest einen Teil des Bedürfnisses an Mg⁺⁺ der Enzyme, sondern setzt darüber hinaus pH-Bereiche für den Träger, welche seine Beschickung nach oben und unten begrenzen.

Claims

Patentansprüche:

1. Enzympräpatat für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose in Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß Glucoseisomerase auf einem Träger aus 0,84—12% MgO und 99,16—88% AI2O3 in Form poröser Partikel der durchschnittlichen Größe 0,074—4,76 mm und einer durchschnittlichen Porenweite von 100—1000 Ä adsorbiert ist.

2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoseisomerase auf poröse Partikel der Zusammensetzung 0,84—3,8% MgO und 99,16—96,22% Al₂O₃ adsorbiert ist.

3. Enzympräparat nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoseisomerase auf Partikel mit der durchschnittlichen Porenweite 150—250Ä adsorbiert ist.

4. Enzympräparat nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoseisomerase auf Partikel der durchschnittlichen Partikelgröße 0,35—0,59 mm adsorbiert ist.

5. Verfahren zur partiellen Isomerisation einer Glucoselösung zu einer Fructoselösung unter Verwendung des Enzympräparates nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei einem pH-Wert von 7—9, vorzugsweise 7,4—8,8, durchgeführt wird.