DE2419444B2

DE2419444B2 - Substrat für ein Enzym

Info

Publication number: DE2419444B2
Application number: DE2419444A
Authority: DE
Inventors: Kjell Gunnar Blixt; Rolf Akers Styckebruk Juhlin; Karl Rune Prof. Upplands Vaesby Salenstedt; Mandayam Dr.Phil. Jaerfaelia Tiru; Sven Ivan Arvid M.Sc. Malmoe Toernmarck
Original assignee: Kockums Chemical & Co Malmoe (schweden) AB KB
Current assignee: Enzymetech International Nv Philipsburg St Ma
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-23
Publication date: 1978-04-06
Also published as: JPS5046888A; FR2227531A1; NO741465L; DK144425B; CA1021674A; SE415036B; NO142265C; JPS574319B2; DK144425C; DE2419444A1; DE2419444C3; BR7403325D0; AR210059A1; IT1019594B; NL7405543A; SU656527A3; CH605581A5; NO142265B; FI52408B; ES425598A1

Description

besteht.

2. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht zusätzlich Spindelöl und/oder Aluminiumstearat und/oder Decanol, Dodecanol, Stearylalkohol oder Polyglykole enthält.

3. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Siliciumdioxidaerogel besteht. r>

4. Trägergebundene Komposition nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus Glycerintricapronat besteht.

5. Verwendung des Substrats für ein Enzym, welches einem Träger aufgetragen und fest an jo diesen gebunden ist, zusammen mit dem diesem Substrat entsprechenden Enzym und mit einem entsprechenden Indikator zur Indikierung des bei dieser enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsproduktes. 3")

Die Erfindung betrifft ein Substrat für ein Enzym, welches einem Träger aufgetragen und fest an ihn gebunden ist.

Bei den meisten enzymatischen Reaktionen, d. h. Reaktionen, bei denen ein Substrat unter katalytischer Einwirkung eines Enzyms eine Veränderung erfährt ·»> (üblicherweise einen Abbau), liegt sowohl das Substrat als auch das Enzym in der Form einer Lösung und in gewissen Fällen als Suspension vor. Mehrere Vorteile könnten gewonnen werden, nicht zuletzt in bezug auf den Transport und die Handhabung, falls eine der Komponenten, d. h. das Enzym oder das Substrat, in trägergebundener Form zugeführt werden könnte. Es sei hier erwähnt, daß es bereits bekannt ist, ein Enzym mit einem Träger, beispielsweise einem Gel oder Cellulose, zu kombinieren.

Es ist auch bekannt, ein Substrat mit einem Träger zu kombinieren, aber diese Kombination ist bisher derart vorgenommen worden, daß man das Substrat über einen Kuppler kovalent an den Träger gebunden hat, oder auch wurde das Substrat nur lose einem t>n Träger aufgetragen, so daß es leicht wieder davon entfernt werden kann, beispielsweise durch Einwirkung von Wasser. Als Beispiel des bekannten Standes der Technik sei der Bericht »Trägergebundene biologisch aktive Substanzen und ihre Anwendung« b-> von H. D. Orth und W. Brumme in Angewandte Chemie, 84. Jahrgang (1972), Heft 8, Seiten 319-368 erwähnt. Dieser Bericht befaßt sich in erster Linie mit trägerpebundenen Enzymen, enthält jedoch in Tabelle 1 mehrere Hinweise aufträgergebundene Substrate. Diesen Hinweisen ist gemeinsam, daß sie sich auf Substrate beziehen, die chemisch an einen Träger gebunden sind, d. h. durch kovalente Bindung oder Ionenbindung (anionisch). Es ist beabsichtigt, die trägergebundenen Substrate zur Reinherstellung von Enzymen zu benutzen. In diesem Falle erfolgt nur eine enzymatische Substratkomplexbildung, ohne Abbau des Substrats. Durch die USA-Patentschrift 26 77 917 und die französische Patentschrift 20 71058 ist es ferner bereits bekannt, Trägern, wie Holzkohle oder expandiertem Perlit, Nährstoff für Pilzmyzel aufzutragen. Die benutzten Nährstoffe sind wasserlöslich und ermöglichen es dem Pilzmyzel, den Nährstoff in einem feuchten Mittel zu absorbieren, um den Zuwachs zu unterstützen. Die USA-Patentschrift 32 51 749 beschreibt die bakterielle Umwandlung von trägergebundenen Kohlenhydraten in Polysaccharide. Auch in diesem Falle ist das »Substrat« wasserlöslich und nur lose auf dem Träger angebracht.

Als weiteres Beispiel des Standes der Technik sei auf die französische Patentschrift 13 06 640 verwiesen, die das Einschließen von Enzym oder enzymatischem Substrat in einem durchdringlichen Material, beispielsweise einem Polymermaterial, beschreibt. Die französische Patentschrift 5 95 782 beschreibt das Auftragen von Schwefelsäure auf Kieselgur. Die britische Patentschrift 8 91467 beschreibt das Auftragen auf verschiedene Träger eines Wirkstoffes, welcher imstande ist, oxydierend oder reduzierend (Chinon-Hydrochinon) zu wirken. Die USA-Patentschrift 27 17 852 beschreibt das Auftragen von Enzym auf einen Träger. Die französische Patentschrift 940 108 bezieht sich auf einen verstärkenden Füllstoff für Gummi, welcher Füllstoff aus einem feinkörnigen Mineral besteht, das mit einem Tensid oder Schmiermittel, wie Öl oder Fett, überzogen ist. Die USA-Patentschrift 19 79 380 beschreibt das Überziehen von Pigmentteilchen, wie Ruß, mit organischem Material, beispielsweise Leinöl. Die britische Patentschrift 9 93 944 beschreibt das Überziehen von Natriumaluminiumsilikat von großer Oberfläche mit einem Farbstoff. Die USA-Patentschrift 23 54 318 beschreibt das Überziehen von feinkörnigem Calciumcarbonat mit einem Klebstoff, wobei das Produkt zur Verwendung als Pigment in beispielsweise Tapeten beabsichtigt ist.

Im Gegensatz zu dem bekannten Stand der Technik bezieht sich die Erfindung auf einen besonderen Typ von trägergebundenen Substraten, wobei das Substrat nicht kovalent an den Träger gebunden ist, weder direkt noch über Kuppler, sondern durch Zusammenwirkung zwischen dem Substrat und einem besonderen Träger mit großer spezifischer Oberfläche durch Adsorption fest an den Träger gebunden ist. Ferner ist es eine Bedingung der Erfindung, daß das Substrat niedrige, definierte Wasserlöslichkeit aufweist und keine Hydrolyse oder Auflösung in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms erfährt. Im Gegensatz zu gewissen der obengenannten Patentschriften, wo der Überzug ein lose appliziertes, wasserlösliches Material ist, so ist das erfindungsgemäße Substrat fest am Träger adsorbiert und außerdem schwer löslich in Wasser. Hierdurch erhält man erfindungsgemäß in äußerst einfacher und billiger Weise ein fest an einen Träger gebundenes, enzymatisches Substrat. Zur Einwirkung auf das träger-

gebundene Substrat gemäß der Erfindung wird ein Enzym in Wasserphase ausgenutzt, und durch die Natur und die Eigenschaften des trägergebundenen Substrats gemäß der Erfindung erzielt man eine hohe und kontrollierbare Affinität zwischen Enzym und Substrat.

Gemäß der Erfindung ist ein Substrat der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, daß es aus

a) einem festen, dem Substrat gegenüber inerten Träger mit einer spezifischen Oberfläche von zumindest 50 mVGramm und

b) einer durch Adsorption fest an den Träger gebundenen Schicht, welche das Substrat, das eine Löslichkeit von weniger als 0,1 Gewichtsprozent in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms hauptsächlich stabil ist, enthält,

besteht.

In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, daß die Schicht zusätzlich Spindelöl und/oder Aluminiumstearat und/oder Stearylalkohol enthält.

Die Patentansprüche 3 und 4 nennen weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Am besten hat der Träger eine spezifische Oberfläche von zumindest 200 m²/g.

Der Träger wird am günstigsten unter organischen/ anorganischen Polymeren, anorganischen Oxiden, Säuren und Salzen gewählt.

Insbesondere wird als Träger Aluminiumoxid, CaI-ciumcarbonat, Magnesiumcarbonat oder Siliciumdioxydaerogel und Calciumphosphat verwendet, wobei der Träger aber die im Anspruch 1 angegebenen Bedingungen erfüllen muß.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht das Substrat aus Glycerintricapronat.

Die Verwendung des Substrats nach den Ansprüchen 1 bis 4 ist im Anspruch 5 angegeben.

Die zwischen dem Substrat und dem Träger gemäß der Erfindung vorhandene, feste Bindung (Adsorption) wird durch Verwendung eines speziellen Trägers zustande gebracht, der, wie oben erwähnt, fest und dem Substrat gegenüber inert ist sowie eine spezifische Oberfläche von zumindest 50 m²/g (am besten zumindest 20OmVg) hat. Durch diese feste Bindung vermeidet man jegliche unerwünschte Trennung des Substrats vom Träger. Es konnte festgestellt werden, daß bei zunehmender spezifischer Oberfläche des Trägers eine zunehmende Aktivität oder Reaktionsgeschwindigkeit zwischen dem Substrat und dem Enzym auftritt. Dabei ist eine Aktivitätssteigerung erhalten worden, die bis zu zehnmal größer ist als die normale Aktivität.

Es ist klar, daß jedes Substrat anwendbar ist, welches den obengenannten Anforderungen genügt, d. h. das eine Löslichkeit von weniger als 0,1 Gewichts-% in Wasser bei 20°C hat. Ferner muß das Substrat in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms stabil sein. Als solche Substrate sind Glycerintricapronat (Tricaproin), Tripelargonin, Tributyrin und bis 3,5,5-Trimethyl-Hexyladipat, Mischestem mehrwertiger Alkohole und organischen oder anorganischen Säuren zu nennen.

Das als Trägerstoff bevorzugte Siliciumdioxidaerogel ist allgemein im Handel erhältlich.

Das trägergebundene Substrat gemäß der Erfindung wird am besten dadurch hergestellt, daß das Substrat dem Träger durch Imprägnieren aufgetragen wird, wobei das fertige Produkt die Form eines handlichen und lagerungsstabilen, frei fließenden Pulvers hat. Somit wird der Träger unter Umrühren in einer Flüssigkeit aufgeschlämmt, welche das Substrat oder das Substrat und ein Substratverdünnungsmittel enthält. Nach dieser Behandlung wird die zugeführte Flüssigkeit abgetrieben. Der Rückstand wird derart fein verteilt, daß Teilchen der erwünschten Größe und Größenverteilung erhalten werden.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bein steht die dem Träger aufgetragene Schicht nicht ausschließlich aus Substrat, sondern aus Substrat zusammen mit einem Verdünnungsmittel. Das Substrat wird als im Verdünnungsmittel aufgelöst auf dem Träger vorliegen. Hierbei ist hauptsächlich nur das im

i> äußeren Teil der Schicht vorliegende Substrat direkt der Einwirkung des Enzyms zugänglich. Die Eigenschaften des Verdünnungsmittels beeinflussen die Zugänglichkeit des Substrats zur Enzymeinwirkung. Die Verdünnungsmittel sind Spindelöl und Decanol, Stearylaikohol und Polyglykole.

Die Zugänglichkeit des Substrats zur Einwirkung des Enzyms kann durch Zugabe von Aluminiumstearat, zum Verdünnungsmittel weiter beeinflußt werden.
Das Substrat gemäß der Erfindung eignet sich für

2j jede Art von Reaktion unter der Einwirkung des dazugehörigen Enzyms. Es ist außerordentlich vorteilhaft, dieses trägergebundene Substrat zur Standardisierung und Kennzeichnung von Enzymen zu benutzen. Ein Bereich der Technik, auf welchem sich die Erfindung als besonders brauchbar erwiesen hat, sind Indikatoren zur zeittemperaturabhängigen Indikierung, beispielsweise von Lebensmitteln, auch gekühlten oder tiefgefrorenen. Derartige Indikatoren sind vor allem durch die USA-Patentschrift 26 71 028 bekannt.

Falls also ein Indikator, der ein Enzym und dessen Substrat sowie einen Indikierstoffzur Indikierung des bei der enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsproduktes umfaßt, denselben Lagerungsbedingungen wie ein Lebensmittel ausgesetzt wird, kann man bei geeigneter Kalibrierung des Indikators den Lagerungszustand des Lebensmittels durch den Farbumschlag des Indikators entscheiden.

Ein solcher Indikator, der das trägergebundene Substrat gemäß der Erfindung ausnutzt, umfaßt als wirk-

<r> same Komponenten das genannte trägergebundene Substrat zusammen mit einem dem Substrat angepaßten Enzym und einem Indikierstoff, beispielsweise einem pH-Indikator, zur Indikierung der bei der enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsprodukte.

1. Herstellung eines substratbelegten Trägers: In 2500 ml Methylenchlorid wurden in kleinen Mengen und unter Umrührung 100 g Siliciumdioxidaerogel eingebracht, bis eine homogene Aufschlämmung erhalten wurde.

Die Aufschlämmung wurde dann mit 100 g Glycerintricarponat vermischt; das Umrühren wurde während 1 h bei Zimmertemperatur fortgesetzt.

Dann wurde das Methylenchlorid durch Luftblasung durch Filterdüsen und schwaches Erhitzen auf 30'C

bo entfernt. Nachdem das Volumen des Gemisches auf 1500 ml reduziert worden war, wurde die Erhitzung unterbrochen, um ein stoßendes Kochen zu vermeiden; das weitere Abtreiben von Methylenchlorid erfolgte ausschließlich durch Luftblasung bei kontinuierlichem

b5 Umrühren.

Das endgültige Abtreiben des Methylenchlorids wurde im Wärmeschrank bei 50' C vorgenommen. Nach beendetem Trocknen im Wärmeschrank erhielt man

eine weiße, spröde Masse, welche gemörsert und durch ein Sieb der erwünschten Maschenweite geschichtet wurde, um ein feinkörniges Pulver zu erhalten.

2. Herstellung eines mit Substrat und Verdünnungsmittel belegten Trägers: Siliciumdioxidaerogel wurde in Methylenchlorid in derselben Weise wie in Beispiel 1 aufgeschlämmt. Der Aufschlämmung wurde dann ein Gemisch von 50 g Tricaproin und 50 g Spindelöl unter Umrührung zugesetzt. Das Umrühren wurde wahrend 1 h bei Zimmertemperatur fortgesetzt.

Wie ;n Beispiel 1 wurde das Lösungsmittel dann entfernt, und die erhaltene Masse wurde in einem Mörser bzw. einer Kolloidmühle gemahlen. Man erhielt ein feinkörniges Pulver eines mit Substrat und Verdünnungsmittel belegten Trägers.

3. Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß dem Spindelöl Aluminiumstearat in einer Menge von 10% zugesetzt wurde. Das Ergebnis entsprach Beispiel 2.

4. Beispiel 2 wurde wiederholt, jeooch wurde das Spindelöl durch Stearyialkohol ersetzt. Dies verlangte ein Erhitzen, damit das Gemisch von Tricaproin und Stearyialkohol homogen wurde. Im übrigen verfuhr man wie in Beispiel 2, und ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten.

5. Mit den in Beispiel 1-3 hergestellten, substratbelegten Trägern wurden Versuche angestellt, bei denen die zeittemperaturabhängigen Indikiereigenschaften bei Indikierung in Kombination mit dem Enzym Pankreaslipase bestimmt wurden. Die bei der enzymatischen Reaktion gebildete Säure wurde mittels eines pH-Indikators indikiert. Das Gewichtsverhäitnis zwischen dem Träger und der substratenthaltenden Schicht des Trägers war in sämtlichen Fällen 1:1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angezeigt, wobei die folgenden Abkürzungen benutzt sind:

Siliciumdioxidaerogel = F; Tricaproin = TC; Spindelöl = S; Aluminiumstearat = Alst.

Tabelle 1

Relative Umschlagzeit

Temp.
("C)

TC/F

TC/S/F

TC/S/10%
Alst/F

+20	1,0	1,0	1,0
+4	2,4	2,0	1,7
-5	15,5	20,0	33
-10	40,0	108	417
-15	321	856	970
-20	1396	—	—

Tabelle 2

Umschlagzeit in Minuten

Lipasikonzentration TO
(Hg/ml)

TC/F

0,3

0,1

0,03

Die Versuchsergebnisse bestätigen, daß man die Zeit- und Temperaturabhängigkeit bei einem mit nur Substrat belegten Träger erhöht, wenn man das Substrat mit einem Verdünnungsmittel kombiniert, d. h., daß dann die relativen Umschlagzeiten verlängert werden. Die Abhängigkeit wird noch weiter erhöht, falls zusätzlich Aluminiumstearat zugesetzt wird.

6. Versuche wurden angestellt, um die Aktivität bei Einwirkung von Pankreaslipase auf Tricaproin zu vergleichen, teils ohne Träger und teils als Belag auf einem Träger gemäß Beispiel 1. Es wurden variierende Konzentrationen des Enzyms benutzt; als Maß der Aktivität wurde ein bei 20'C gebildetes Reaktionsprodukt mit Hilfe eines pH-Indikators indikiert. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 ersichtlich.

7,5

140

380

1,3 4,5 U,5 32

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß Substrat und Träger mit großer spezifischer Oberfläche eine Aktivitätssteigerung herbeiführen, die etwa zehnmal größer ist als die mit Substrat allein erhältliche Aktivität.

7. Wie in Beispiel 6 wurden Versuche angestellt, um die Aktivität bei der Einwirkung von Enzym auf Substrat zu vergleichen, teils ohne Träger und teils als Belag auf einem Träger. Als Enzym wurde Pankreaslipase benutzt, aas Substrat bestand aus Tripelargonin (TP), und der Träger war ein Siliciumdioxidaerogel, das eine spezifische Oberfläche von etwa 300 m²/g halte. Als Maß der Aktivität wurde ein bei 20 C gebildetes Reaktionsprodukt indikiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angezeigt.

Tabelle 3
"' Umschlagzeit in Stunden (h)

Relative Enzymkonzentration

TP

TP/F

32

16

240

524

4,25

12

25

46

100

240

8. Beispiel 7 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß als Substrat Tripropionin (TPP) statt Tripelargonin benutzt wurde. Das Enzym war Pankreaslipase und der Träger Siliciumdioxidaerogel. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angezeigt.

Tabelle 4
Umschlagzeit in Stunden (h)

TPP/E

Relative Enzym	TPP
konzentration
32	1,25
16	4,75
8	21
4	28
2	70
1	142

0,5

1,25

2,5

21

25

9. Beispiel 7 wurde wiederholt, jedoch mil dem Unterschied, daß als Substrat bis 3,5,5-Trimethyl-Hexyladipat (THA) statt Tripelargonin benutzt wurde. Das Enzym war wie bisher Pankreaslipase und der Träger Siliciumdioxidaerogel. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aneezeiet.

Tabelle

Umschlagzeit in Stunden (h)

Relative Enzymkonzentration

TIIA

70 384

ΤΙΙΑ/Γ

21

35

71

192

240-284

Aus Beispiel 7-9 geht hervor, daß Substrat und Träger mit großer spezifischer Oberfläche im Vergleich mit der Verwendung von Substrat ohne Träger eine kräftige Steigerung der Aktivität herbeiführt.

Durch Ausnutzung des ernndungsgemäßen Substrats kann man Indikatoren zustande bringen, die jedoch besonderem Zweck angepaßt sind, sei es zur Indikicrung von photographischem Material, Arzneien, Lebensmitteln oder anderen empfindlichen Waren, die für ihre Haltbarkeit gewisse bestimmte Lagerungsbedingungen verlangen.

Die in den Beispielen genannten Träger erfüllen selbstverständlich die Bedingungen des Ilauptanspruchs.

Claims

Patentansprüche:

1. Substrat für ein Enzym, welches einem Träger aufgetragen und fest an ihn gebunden ist, da- > durch gekennzeichnet, daß es aus

a) einem festen, dem Substrat gegenüber inerten Träger mit einer spezifischen Oberfläche von zumindest 50 nr/Gramm und _|(|

b) einer durch Adsorption fest an den Träger gebundenen Schicht, welche das Substrat, das eine Löslichkeit von weniger als 0,1 Gewichtsprozent in Wasser bei 20' C besitzt und in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms haupt- ^. sächlich stabil ist, enthält,