DE2419444A1

DE2419444A1 - Traegergebundene komposition aus enzymatischem substrat

Info

Publication number: DE2419444A1
Application number: DE2419444A
Authority: DE
Inventors: Kjell Gunnar Blixt; Rolf Juhlin; Karl Rune Prof Salenstedt; Mandayam Dr Phil Tiru; Sven Ivan Arvid Toernmarck
Original assignee: Food Control AB
Current assignee: Enzymetech International Nv Philipsburg St Ma
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-23
Publication date: 1974-11-21
Also published as: SU656527A3; DE2419444C3; FR2227531B1; CH605581A5; JPS5046888A; NO142265C; FI52408C; CA1021674A; NO741465L; SE415036B; JPS574319B2; DE2419444B2; BR7403325D0; NL7405543A; DK144425B; ES425598A1; FI52408B; NO142265B; GB1463422A; AR210059A1

Description

FOOD CONTROL AB, Södergatan 12, 211 34 MALMÖ, Schweden

Trägergebundene Komposition aus enzymatischem

Substrat

Die Erfindung betrifft ein Substrat für Enzyme, genauer gesagt ein Substrat, welches einem Träger aufgetragen und fest an ihn gebunden ist.

Bei den meisten enzymatischen Reaktionen, d.h. Reaktionen, bei denen ein Substrat unter katalytischer Einwirkung eines Enzyms eine Veränderung erfährt (üblicherweise einen Abbau), liegt sowohl das Substrat als auch das Enzym in der Form einer Lösung und in gewissen Fällen als Suspension vor. Mehrere Vorteile könnten gewonnen werden, nicht zuletzt in bezug auf den Transport und die Handhabung, falls eine der Komponenten, d.h. das Enzym oder das Substrat, in trägergebundener Form zugeführt werden könnte. Es sei hier erwähnt, dass es bereits bekannt ist, ein Enzym mit einem Träger,beispielsweise einem Gel oder Cellulose, zu kombinieren.

Es ist auch bekannt, ein Substrat mit einem Träger zu kombinieren, aber diese Kombination ist bisher derart vorgenommen worden, dass man das Substrat über einen Kuppler kovalent an den Träger gebunden hat, oder auch wurde das Substrat nur lose einem Träger aufgetragen, so dass es leicht wieder davon entfernt werden kann, beispielsweise durch Einwirkung von Wasser. Als Beispiel des bekannten Standes der Technik sei der Bericht "Träger-gebundene biologisch aktive Substanzen und ihre Anwendung" von H.D. Orth und W. Brumme in Angewandte Chemie, 84. Jahrgang (1972), Heft 8, Seite 319-368 erwähnt. Dieser Bericht befasst sich in erster Linie mit trägergebundenen Enzymen, enthält jedoch in Tabelle 1 mehrere Hinweise auf trägergebundene Substrate. Diesen Hinweisen ist gemeinsam, dass sie sich auf Substrate beziehen, die chemisch an einen Träger gebunden sind, d.h. durch kovalente Bindung oder Ionenbindung (anionisch). Es ist beabsichtigt, die trägergebundenen Substrate zur Reinherstellung von Enzymen zu benutzen. In diesem Falle erfolgt nur

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eine enzymatische Substratkomplexbxldung, ohne Abbau des Substrats. Durch die USA-Patentschrift 2 677 917 und die französische Patentschrift 2 071 058 ist es ferner bereits bekannt, Trägern, wie Holzkohle oder expandiertem Perlit, Nährstoff für Pilzmyzel aufzutragen. Die benutzten Nährstoffe sind wasserlöslich und ermöglichen es dem Pilzmyzel, den Nährstoff in einem feuchten Mittel zu absorbieren, um den Zuwachs zu unterstützen. Die USA-Patentschrift 3 251 749 beschreibt die bakterielle Umwandlung von trägergebundenen Kohlenhydraten in Polysaccharide. Auch in diesem Falle ist das "Substrat" 'wasserlöslich und nur lose auf dem Träger angebracht.

Als weiteres Beispiel des Standes der Technik sei auf die französische Patentschrift 1 306 640 verwiesen, die das Einschliessen von Enzym oder enzymatischem Substrat in einem durchdringlichen Material, beispielsweise einem Polymermaterial, beschreibt. Die französische Patentschrift 595 782 beschreibt das Auftragen von Schwefelsäure auf Kieselgur. Die britische Patentschrift 891 467 beschreibt das Auftragen auf verschiedene Träger eines Wirkstoffes, welcher imstande istroxydierend oder reduzierend (Chinon-Hydrochincn) zu wirken. Die USA-Patentschrift 2 717 852 beschreibt das Auftragen von Enzym auf einen Träger. Die französische Patentschrift 940 108 bezieht sich auf einen verstärkenden Füllstoff für Gummi, welcher Füllstoff aus einem feinkörnigen Mineral besteht, das mit einem Tensid oder Schmiermittel, wie Öl oder Fett, überzogen ist. Die USA-Patentschrift 1 979 380 beschreibt das Ueberziehen von Pigmentteilchen, wie Pvuss, mit organischem Material, beispielsweise Leinöl. Die britische Patentschrift 993 944 beschreibt das Ueberziehen von Natriumaluminiumsilikat von grosser Oberfläche mit einem Farbstoff. Die USA-Patentschrift 2 354 318 beschreibt das Ueberziehen von feinkörnigem Calciumcarbonat mit einem Klebstoff, wobei das Produkt zur Verwendung als Pigment in beispielsweise Tapeten beabsichtigt ist.

Im Gegensatz zu dem bekannten Stand der Technik bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen besonderen Typ von trägergebundenen Substraten, wobei das Substrat nicht kovalant an den Träger gebunden ist, weder direkt noch über Kuppler, sondern durch Zusammenwirkung zwischen dem Substrat und

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3 24194U

einem besonderen Träger mit grosser spezifischer Oberfläche durch Adsorption fest an den Träger gebunden ist. Ferner ist es eine Bedingung der Erfindung, dass das Substrat niedrige Wasserlöslichkeit aufweist und keine Hydrolyse oder Auflösung in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms erfährt. Im Gegensatz zu gewissen der oben genannten Patentschriften/ wo der Ueberzug ein lose appliziertes, wasserlösliches Material ist, so ist das erfindungsgemässe Substrat fest am Träger adsorbiert und ausserdem schwerlöslich in Wasser. Hierdurch erhält man erfindungsgemäss in äusserst einfacher und billiger Weise ein fest an einen Träger gebundenes, enzymatisches Substrat. Zur Einwirkung auf das trägergebundene Substrat gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym in Wasserphase ausgenutzt, und durch die Natur und die Eigenschaften des trägergebundenen Substrats gemäss der Erfindung erzielt man eine hohe und kontrollierbare Affinität zwischen Enzym und Substrat.

Gemäss der Erfindung wird also eine trägergebundene Komposition eines enzymatischen Substrats zustandegebracht, welche aus 1) einem festen, dem enzymatischen Substrat gegenüber inerten Träger mit einer spezifischen Oberfläche von zu-

2
.mindest 50 m /g und 2) einer durch Adsorption fest an den Träger gebundenen Schicht besteht, welche ein in Wasser schwerlösliches und in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms hauptsächlich stabiles Substrat enthält.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung enthält die Schicht ausserdem ein mit dem Substrat vermischbares Verdünnungsmittel.

Das Verdünnungsmittel wird vorzugsv/eise unter Mineralölen mit mehreren Kohlenwasserstoffen, höheren aliphatischen Alkoholen, Ketonen oder Xthern sowie Polyglykolen gewählt.

Gemäss einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Schicht ausserdem ein viskositätsänderndes Mittel enthalten.

Das viskositätsändernde Mittel kann aus Metallseifen bestehen, beispielsweise Aluminiumstearat.

Gemäss einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform

der Erfindung hat der Träger eine spezifische Oberfläche von

2
zumindest 200 m /g.

Der Träger wird vorzugsweise unter organischen/anorgani-409847/1032

sehen Polymeren/ anorganischen Oxyden, Säuren und Salzen gewählt.

Insbesondere wird bevorzugt, den Träger unter

Aluminiumoxyd, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonate und Siliciumdioxydaerogel und Calciumphosphat zu wählen.

Gemäss einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht das Substrat aus Glycerintricapronat.

Ein besonderer Aspekt der Erfindung betrifft einen enzymatischen Indikator, der eine trägergebundene Komposition eines enzymatischen Substrats in Kombination mit einem dem Substrat entsprechenden Enzym und einem Indikator zur Indikierung des bei der enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsproduktes umfasst.

Die zwischen dem Substrat und dem Träger gemäss der vorliegenden Erfindung vorhandene, feste Bindung (Adsorption) wird durch Verwendung eines speziellen Trägers zustandegebracht, der wie oben erwähnt fest und dem enzymatischen Substrat gegenüber

2 inert ist sowie eine spezifische Oberfläche von zumindest 50 m /g,

2
vorzugsweise zumindest 200 m /g, hat. Durch die zustandegebrachte, feste Bindung vermeidet man jegliche unerwünschte Trennung des Substrats vom Träger. Obgleich dies nicht völlig klargelegt ist, dürfte ferner die auffallend grosser gewordene Affinität, die zwischen dem trägergebundenen Substrat gemäss der Erfindung und dem entsprechenden Enzym auftritt, auf die Kombination mit dem speziellen Träger, vor allem auf dessen grosse spezifische Oberfläche, zurückzuführen sein. Es konnte festgestellt werden, dass bei zunehmender spezifischer Oberfläche des Trägers eine zunehmende Aktivität oder Reaktionsgeschwindigkeit zwischen dem · Substrat und dem Enzym auftritt. Dabei ist eine Aktivitätssteigerung erhalten worden, die bis zu zehnmal grosser ist als die normale Aktivität.

Ohne alle die bekannten, verschiedenen Enzymen entsprechenden Substrate aufzuzählen, leuchtet es ein, dass die Erfindung auf jedes Substrat anwendbar ist, welches den obengenannten Anforderungen genügt, d.h. das Substrat soll schwerlöslich oder hauptsächlich unlöslich in Wasser sein, womit gemeint ist, dass das Substrat eine Löslichkeit von weniger als 0,1 Gewichts-% in Wasser bei 20⁰C haben soll. Ferner muss das

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Substrat stabil sein und darf keine Hydrolyse oder Auflösung in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms erfahren. Bevorzugte Substrate gemäss der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die unter Glycerintricapronat (Tricaproin), Tripelargonin, Tributyrin und bis~3,5,5-Trimethyl-Hexyladipat, Mischestern mehrwertiger Alkohole und organischen oder anorganischen Säuren gewählt werden.

Die z.Z. besonders bevorzugten Trägerstoffe sind

Siliciumoxyd in Form von Aerogel mit einer spezifischen Ober-

2
fläche von etwa 200-300 m /g. Derartiges Siliciumdioxydaerogel ist im allgemeinen Handel unter den Bezeichnungen "Aerosil", "Cab-O-Sil"/ "Kieselgel G" der Firma Merck und "Fluosil" (Nynäs Petroleum AB, Schweden) erhältlich.

Das trägergebundene Substrat gemäss der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise dadurch hergestellt, dass das Substrat dem Träger durch Imprägnieren aufgetragen wird, wobei das fertige Produkt die Form eines handlichen und lagerungsstabilen, freifliessenden Pulvers hat. Somit wird der Träger unter Umrühren in einer Flüssigkeit aufgeschlämmt, welche Substrat oder Substrat und Substratverdünnungsmittel enthält. Nach dieser Behandlung wird die zugeführte Flüssigkeit abgetrieben. Der Rückstand wird derart feinverteilt, dass Teilchen der erwünschten Grosse und Größenverteilung erhalten werden.

In ihrer einfachsten, grundlegenden Ausführungsform umfasst die Erfindung einen Träger mit einer Schicht eines Substrats der oben beschriebenen Art. Wie bereits erwähnt, soll der Träger fest und dem Substrat gegenüber chemisch inert sein

sowie eine Oberfläche pro Gewichtseinheit von zumindest 50 m /g haben.

Gemäss einer anderen Ausführungsform der Erfindung besteht die dem Träger aufgetragene Schicht nicht ausschliesslich aus Substrat, sondern aus Substrat in Kombination mit einem Verdünnungsmittel. Das Substrat wird also als im Verdünnungsmittel aufgelöst in der Trägerschicht vorliegen. Im Gegensatz zu der früher beschriebenen Ausführungsform, wo das gesamte Substrat direkt der Einwirkung des Enzyms zugänglich ist, so ist bei dieser letzteren Ausführungsform hauptsächlich nur das im äusseren Teil der Schicht vorliegende Substratmaterial

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direkt der Einwirkung des Enzyms zugänglich. Die Eigenschaften des Verdünnungsmittels, wie Löslichkeit des Substrats, aktivierende oder hemmende Enzymwirkungen, Viskosität und Neigung zur Trennung unter der Einwirkung von niedriger Temperatur, beein-: flüssen die Zugänglichkeit des Substrats zur Enzymeinwirkung. Geeignete Verdünnungsmittel sind Mineralöle, höhere aliphatische Alkohole, wie Decanol, Dodecanol, Stearylalkohol und Polyglykole sowie andere schwerflüchtige Kohlenwasserstoffverbindungen, die mit dem Substrat mischbar sind.

Die Zugänglichkeit des Substrats zur Einwirkung von Enzym kann durch Zugabe eines viskositätsändernden Mittels, wie Aluminiumstearat, zum Verdünnungsmittel weiter beeinflusst werden.

Die Substratkomposition gemäss der vorliegenden Erfindung eignet sich für jede Art von Reaktion unter der Einwirkung des dazugehörigen Enzyms. Es ist ausserordentlich vorteilhaft, dieses trägergebundene Substrat zur Standardisierung und Kennzeichnung von Enzymen zu benutzen. Ein Bereich der Technik, auf welchem sich die vorliegende Erfindung als besonders brauchbar erwiesen hat, sind Indikatoren zur zeit-temperaturabhängigen Indikierung, beispielsweise von Lebensmitteln, auch gekühlten oder tiefgefrorenen solchen. Derartige Indikatoren sind vor allem durch die USA-Patentschrift 2 671 028 bekannt.

Falls also ein Indikator, der ein Enzym und dessen Substrat sowie einen Indikierstoff zur Indikierung des bei der enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsproduktes umfasst, denselben Lagerungsbedingungen wie ein Lebensmittel ausgesetzt wird, kann man bei geeigneter Kalibrierung des Indikators den Lagerungszustand des Lebensmittels durch den Farbumschlag des Indikators entscheiden.

Ein entsprechender, enzymatischer Indikator, der das trägergebundene Substrat gemäss der vorliegenden Erfindung ausnutzt, umfasst als wirksame Komponenten das genannte trägergebundene Substrat in Kombination mit einem dem Substrat angepassten Enzym und einem Indikierstoff, beispielsweise einem pH-Indikator, zur Indikierung der bei der enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsprodukte.

Bei Verv/endung des trägergebundenen Substrats gemäss

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der Erfindung und dem entsprechenden Enzym im wässrigen Suspensionen können Verdickungsmittel, wie wasserlösliche, hochmolekulare Verbindungen, beispielsweise Agar oder Carboxycellulose, der Suspension zugesetzt werden. Hierdurch gewinnt man den Vorteil, dass das Verdickungsmittel, beispielsweise Agar, eine gewisse Veränderung der Reaktionsgeschwindigkeit herbeiführt.

Die Erfindung ist nun anhand einiger Ausführungsbeispiele im folgenden näher erläutert. Es sei jedoch betont, dass die genannten Beispiele nur zur Erläuterung dienen und die Erfindung also nicht begrenzen. Ferner sei betont, dass ausser den als Beispiel gegebenen enzymatisehen Systemen selbstverständlich viele andere enzymatische Systeme brauchbar und von der Erfindung umfasst sind.

Beispiel 1

Herstellung eines substratbelegten Trägers.

In 2500 ml Methylenchlorid wurden in kleinen Mengen und unter Umrührung 100 g feinkörnigen Siliciumdioxyds ("Fluosil" von Nynäs Petroleum, Schweden) eingebracht, bis eine homogene Aufschlämmung erhalten wurde.

Die Aufschlämmung wurde dann mit 100 g Glycerintricapronat (Tricaproin, TC) vermischt, und das Umrühren wurde während 1 h bei Zimmertemperatur fortgesetzt.

Dann wurde das Methylenchlorid durch Luftblasung durch Filterdüsen und schwaches Erhitzen auf 30 C entfernt. Nachdem das Volumen des Gemisches auf 1500 ml reduziert worden war, wurde die Erhitzung unterbrochen, um ein Stosskochen zu vermeiden, und das weitere Abtreiben von Methylenchlorid erfolgte ausschliesslich durch Luftblasung bei kontinuierlichem Umrühren.

Das endgültige Abtreiben des Methylenchlorids wurde im Wärmeschrank bei 50°C vorgenommen. Nach beendetem Trocknen im Wärmeschrank erhielt man eine weisse, spröde Masse, welche gemörsert und durch ein Sieb der erwünschten Maschenweite gesichtet wurde, um ein feinkörniges Pulver zu erhalten. Ein entsprechendes Ergebnis erhielt man, als die getrocknete, weisse und spröde Masse in Wasser aufgeschlämmmt und in einer Kolloidmühle gemahlen wurde.

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Beispiel 2

Herstellung eines mit Substrat und Verdünnungsmittel belegten Trägers.

Feinkörniges Siliciumdioxyd wurde in Methylenchlorid in derselben Weise wie in Beispiel 1 aufgeschlämmt. Der Aufschlämmung wurde dann ein Gemisch von 50 g Tricaproin und 50 g Spindelöl unter Umrührung zugesetzt. Das Umrühren wurde während 1 h bei Zimmertemperatur fortgesetzt.

Wie in Beispiel 1 wurde das Lösungsmittel dann entfernt, und die erhaltene Masse wurde in einem Mörser bzw. einer Kolloidmühle gemahlen. Man erhielt ein feinkörniges Pulver eines mit Substrat und Verdünnungsmittel belegten Trägers.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, dass dem Spindelöl Aluminiumstearat in einer Menge von 10% zugesetzt wurde. Das Ergebnis entsprach Beispiel 2.

Beispiel 4

Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde das Spindelöl durch Stearylalkohol ersetzt. Dies verlangte ein Erhitzen, damit das Gemisch von Tricaproin und Stearylalkohol homogen werde. Im übrigen verfuhr man wie in Beispiel 2, und ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten.

Beispiel 5

Mit den in Beispiel 1-3 hergestellten, substratbelegten Trägern wurden Versuche angestellt, bei denen die zeit-temperaturabhängigen Indikiereigenschaften bei Indikierung in Kombination mit dem Enzym Pankreaslipase bestimmt wurden. Die bei der enzymatischen Reaktion gebildete Säure wurde mittels eines pH-Indikators indikiert. Das Gewichtsverhältnis zwischen dem Träger und der substratenthaltenden Schicht des Trägers war in sämtlichen Fällen 1:1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angezeigt, wobei die folgenden Abkürzungen benutzt sind: Fluosil=F; Tricaproin=TC; Spindelöl=S; Aluminiumstearat=Alst.

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Tabelle 1 Relative Umschlagzeit

Temp TC/F TC/S/F TC/S/10%Alst/F

+20 1,0- 1/0 1,0

+ 4 2,4 2,0 1,7

-5 15,5 20,0 33

-10 40,0 108 417

-15 321 856 970

-20 1396

Die Versuchsergebnisse bestätigen die früher gemachten Aussagen,nämlich dass man mit Ausgang von einer gewissen Zeit- und Temperatürabhängigkeit bei einem mit nur Substrat belegten Träger diese Abhängigkeit erhöht, wenn man das Substrat mit einem Verdünnungsmittel kombiniert, d.h. die relativen Umschlagzeiten werden verlängert. Die Abhängigkeit wird noch weiter erhöht, falls der Kombination Substrat-Verdünnungsmittel viskositätssteigernde Mittel zugesetzt werden, wie Aluminiumstearat.

Beispiel 6

Um die Einwirkung von Verdickungsmittel in der wässrigen Suspension von Enzym-Substrat zu studieren, wurde wässrigen Suspensionen von Enzym (Pankreaslipase) und substratbelegtem Träger gemäss Beispiel 1 0,25% Agar zugesetzt. Die erhaltenen Indikierungszeiten wurden notiert und sind als relative Umschlagzeiten in Tabelle 2 angezeigt.

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Tabelle 2	TC/F
Relative Umschlagzeit	-
TC/F	1,0
0,25% Agar	2,4
1,0	15,5
2,4	40,0
12,7	321
84,2	1396
1336
>16000

Beim Versuch konnte die Einwirkung des Agars bei Temperaturen unter -1O°C deutlich bemerkt werden.

Beispiel 7

Versuche wurden angestellt, um die Aktivität bei Einwirkung von Enzym (Pankreaslipase) auf Substrat (Tricaproin) zu vergleichen, teils ohne Träger und teils als Belag auf einem Träger gemäss Beispiel 1. Es wurden variierende Konzentratxonen von Enzym benutzt, und als Mass der Aktivität wurde ein bei 20°C gebildetes Reaktionsprodukt mit Hilfe eines pH-Indikators indikiert. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3 ersichtlich.

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Tabelle 3 Umschlagzeit in Minuten

Lipasekonzentration TC TC/F (μg/ml)

3 7,5 < 1

1 15 1,3

0,3 37 4,5

0,1 140 11,5

0,03 380 32

Aus Tabelle 3 geht hervor, dass die Kombination von Substrat und Träger mit grosser spezifischer Oberfläche eine Aktivitätssteigerung herbeiführt, die etwa zehnmal grosser ist als die mit Substrat allein erhältliche Aktivität.

Beispiel 8

Wie in Beispiel 7 wurden Versuche angestellt, um die Aktivität bei der Einwirkung von Enzym auf Substrat zu vergleichen, teils ohne Träger und teils als Belag auf einem Träger. Als Enzym wurde Pankreaslipase benutzt, das Substrat bestand aus Tripelargonin (TP), und der Träger war "Fluosil" V 300,

2 der eine spezifische Oberfläche von etwa 300 m /g hatte. Als

Mass der Aktivität wurde ein bei 20°C gebildetes Reaktionsprodukt indikiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angezeigt.

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Tabelle 4 Umschlagzeit in Stunden (h)

Relative Enzymkonzentration TP TP/F

32 21 4,25

16 28 12

8 4 2 1

Beispiel 9

Beispiel 8 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, dass als Substrat Tripropionin (TPP) statt Tripelargonin benutzt wurde. Das Enzym war Pankreaslipase und der Träger "Fluosil". Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angezeigt.

77	25
240	46
524	100
	240

	Tabelle	5	Sturiden	(h)	TPP/F
	Umschlagzeit	in	TPP		0,5
Relative	Enzymkonzentration		1,25
	32

16 4,75 1,25

8 21 2,5

4 · 28 <21

2 70 .21

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142 25

Beispiel 10

Beispiel 8 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, dass als Substrat bis-3,5,5-Trimethyl-Hexyladipat (THA) statt Tripelargonin benutzt wurde. Das Enzym war wie bisher Pankreaslipase und der Träger "Fluosil". Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angezeigt.

Tabelle	6	Stunden (h)	THA/F
Umschlagzeit in	THA	21
Relative Enzymkonzentration	70	35
16	384	71
8	-	192
4	-	240-284
2
1

Aus Beispiel 8-10 geht hervor, dass die Kombination von Substrat und Träger mit grosser spezifischer Oberfläche im Vergleich mit der Verwendung von Substrat ohne Träger eine kräftige Steigerung der Aktivität herbeiführt.

Beispiel 11

Man verfuhr im wesentlichen wie in Beispiel 7, jedoch mit dem Unterschied, dass man statt "Fluosil" "Kieselgel G" der Firma Merck als Träger benutzte. Dieser Träger hat die folgende Zusammensetzung: 13% CaSO₄, 0,02% Chlorid, 0,03% Fe und als Rest SiOp. Die Trägerkörner hatten einen Durchmesser von 5-25 ym. Für das nicht trägergebundene Substrat wurde eine 1%-ige Lösung von Tricaproin in Aceton benutzt, während man für das trägergebundene Substrat eine Suspension ausnutzte, die eine.entsprechende Menge Kieselgel belegt mit 30% Tricaproin enthielt. Nach Zugabe von Enzym fEankxeaslinase^ wurde bei 20°C ein pH

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von 5/4 bei 28 min für das trägergebundene Substrat bzw. 220 min für das nicht trägergebundene Substrat beobachtet.

Es leuchtet somit ein_f dass man durch Wahl zweckdienlicher Kombinationen von Substrat, Substrat-Verdünnungsmittel und Substrat-Verdünnungsmittel-viskositätsänderndes Mittel Indikatoren für zeit-temperatürabhängige Indikierung zustandebringen kann, welche den für die Lagerung einer gewissen Ware geltenden Bedingungen angepasst sind. Es leuchtet auch ein, dass man durch die handliche Form des Substrats gemäss der Erfindung den Indikator noch weiter anpassen kann, indem man Substratmaterialien verschiedener Arten vermischt, d.h. Materialien, die ausschliesslich mit Substrat belegt sind, und Materialien, die mit einer Kombination von Substrat-Verdünnungsmittel-viskositätsänderndem Mittel usw. belegt sind. Die Möglichkeiten, welche sich zur Anpassung oder Regelung der Zeit-Temperaturabhängigkeit des Indikators öffnen, sind ungeahnt, und durch Ausnutzung des erfindungsgemässen Substrats kann man Indikatoren zustandebringen, die jedem besonderen Zweck angepasst sind, sei es zur Indikierung von photographischem Material, Arzneien, Lebensmitteln, oder anderen empfindlichen Waren, die für ihre Haltbarkeit gewisse bestimmte Lagerungsbedingungen verlangen.

Es sei hervorgehoben, dass die oben gegebene Beschreibung nur zur Erläuterung der Erfindung dient und die Erfindung also nicht begrenzt. Offensichtlich können im Rahmen der von den Patentansprüchen definierten Erfindung viele Abänderungen vorgenommen v/erden.

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Claims

is 24194U

Patentansprüche

ΓΏ. Trägergebundene Komposition eines enzymatisehen Substrats, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus 1) einem festen, dem enzymatisehen Substrat gegenüber inerten Träger mit einer

2 spezifischen Oberfläche von zumindest 50 m /g und 2) einer durch Adsorption fest an den Träger gebundenen Schicht besteht, welche ein in Wasser schwerlösliches und in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms hauptsächlich stabiles Substrat enthält.
2. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht ausserdem ein mit dem Substrat vermischbares Verdünnungsmittel enthält.
3. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verdünnungsmittel unter Mineralölen, höheren aliphatischen Alkoholen und Polyglykolen gewählt ist.
4. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mineralöl Spindelöl ist.
5. Trägergebundene Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht ausserdem ein viskositätsänderndes Mittel enthält.
6. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das viskositätsändernde Mittel Aluminiumstearat ist.
7. Trägergebundene Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine

spezifische Oberfläche von zumindest 200 m /g hat.
8. Trägergebundene Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger unter organischen/anorganischen Polymeren, anorganischen Oxyden, Säuren und Salzen gewählt ist.
9. Trägergebundene Komposition nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger unter Aluminiumoxyd, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Siliciumdioxydaerogel und Calciumphosphat gewählt ist.
10. Trägergebundene Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus Glycerintricapronat besteht.
11. Enzymatischer Indikator, der eine trägergebundene Komposition eines enzymatisehen Substrats in Kombination mit einem

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dem Substrat entsprechenden Enzym und einem Indikator zur Indikierung des bei der enzymatxschen Reaktion gebildeten Reaktionsprodukte s umfasst.

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