DE2419444C3

DE2419444C3 - Substrat für ein Enzym

Info

Publication number: DE2419444C3
Application number: DE2419444A
Authority: DE
Inventors: Karl Rune Prof. Upplands Väsby Salenstedt; Sven Ivan Arvid M.Sc. Malmö Törnmarck
Original assignee: KOCKUMS CHEMICAL MALMOE SE AB; Kockums Chemical Malmoe AB
Current assignee: Enzymetech International Nv Philipsburg St Ma
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-23
Publication date: 1982-09-09
Also published as: FR2227531A1; FR2227531B1; DK144425C; JPS5046888A; NL7405543A; SU656527A3; SE415036B; CH605581A5; CA1021674A; FI52408C; GB1463422A; NO741465L; NO142265C; AR210059A1; DE2419444B2; JPS574319B2; NO142265B; ES425598A1; IT1019594B; FI52408B

Description

2. Trägergebundene Komposition nach Anspruch !. dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht zusätzlich Spindelöl und/oder Aluminiumstearat und/oder Decanol, Dodecanol, Stearylalkohol oder Polyglykole enthält.

3. Verwendung eines Substrats nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit dem diesem Substrat entsprechenden Enzym und mit einem entsprechenden Indikator zur Indizierung des bei dieser enzymatischen Reaktion gebildeten Reaktionsproduktes.

Die Erfindung betrifft ein Substrat für ein Enzym, welches einem Träger aufgetragen und fest an ihn gebunden ist.

Bei den meisten enzymatischen Reaktionen, d. h. Reaktionen, bei denen ein Substrat unter katalytischer Einwirkung eines Enzyms eine Veränderung erfährt (üblicherweise einen Abbau), liegt sowohl das Substrat als auch das Enzym in der Form einer Lösung und in gewissen Fällen als Suspension vor. Mehrere Vorteile könnten gewonnen werden, nicht zuletzt in bezug auf den Transport und die Handhabung, falls eine der Komponenten, d. h. das Enzym oder das Substrat, in trägergebundener Form zugeführt werden könnte. Es sei hier erwähnt, daß es bereits bekannt ist, ein Enzym mit einem Träger, beispielsweise einem Gel oder Cellulose, zu kombinieren.

Es ist auch bekannt, ein Substrat mit einem Träger zu kombinieren, aber diese Kombination ist bisher derart vorgenommen worden, daß man das Substrat über einen Kuppler kovalent an den Träger gebunden hat, oder auch wurde das Substrat nur lose einem Träger aufgetragen, so daß es leicht wieder davon entfernt werden kann, beispielsweise durch Einwirkung von Wasser. Als Beispiel des bekannten Standes der Technik sei der Bericht »Trägergebundene biologisch aktive Substanzen und ihre Anwendung« von H. D. Ofth und VV. Brumme in Angewandte Chemie, 84Jahrgang (1972), Hefte, Seiten319-368 erwähnt. Dieser Bericht befaßt: sich in erster Linie mit tragergebundenen Enzymen, enthalt jedoch in Tabelle 1 mehrere Hinweise aufträgergebundene Sub strate. Diesen Hinweisen ist gemeinsam, daß sie sich auf Substrate beziehen, die chemisch an einen Tröger gebunden sind, d. h, durch kovalente Bindung oder Ionenbindung (anionisch). Es ist beabsichtigt, die trägergebundenen Substrate zur Reinherstellung von

ίο Enzymen zu benutzen. In diesem Falle erfolgt nur eine enzymatische Substratkomplexbildung, ohne Abbau des Substrats. Durch die US-Patentschrift 26 77917 und die französische Patentschrift 2071058 ist es ferner bereits bekannt, Trägern, wie Holzkohle

is oder expandiertem Perlit, Nährstoff für Pilzmyzel aufzutragen. Die benutzten Nährstoffe sind wasserlöslich und ermöglichen es dem Pilzmyzel, φ: λ, Nährstoff in einem feuchten Mittel zu absorbieren, um den Zuwachs zu unterstützen. Die US-Patentschrift 32 51 749 beschreibt die bakterielle Umwandlung von trägergebundenen Kohlenhydraten in Polysaccharide.

Auch in diesem Falle ist das »Substrat« wasserlöslich

und nur lose auf dem Träger angebracht

Als weiteres Beispiel des Standes der Technik sei

auf die französische Patentschrift 1306640 verwiesen, die das Einschließen von Enzym oder enzymatischem Substrat in einem durchdringlichen Material, beispielsweise einem Polymermaterial, beschreibt Die französische Patentschrift 5 95 782

μ beschreibt das Auftragen von Schwefelsäure auf Kieselgur. Die britische Patentschrift 8 91467 be schreibt das Auftragen auf verschiedene Träger eines Wirkstoffes, welcher imstande ist, oxydierend odei reduzierend (Chinon-Hydrochinon) zu wirken. Die

J5 US-Patentschrift 27 17 852 beschreibt das Auftragen von Enzym auf einen Träger. Die französische Patent schrift 9 40 108 bezieht sich auf einen verstärkender Füllstoff für Gummi, welcher Füllstoff aus einem feinkörnigen Mineral besteht, das mit einem Tensic

oder Schmiermittel, wie Öl oder Fett, überzogen ist Die US-Patentschrift 19 79 380 beschreibt das Über ziehen von Pigmentteilchen, wie Ruß, mit orga nischem Material, beispielsweise Leinöl. Die britische Patentschrift 9 93 944 beschreibt das Überziehen vor Natriumaluminiumsilikat von großer Oberfläche mi einem Farbstoff. Die US-Patentschrift 23 54 31 beschreibt das Überziehen von feinkörnigem Calcium carbonat mit einem Klebstoff, wobei das Produkt zu Verwendung als Pigment in beispielsweise Tapete

so beabsichtigt ist.

Posner und Morales (The Journal of Biological Ch mistry, Bend 247. Nr. 8. Seite 2255) beschreiben ei System, bei welchem Triolein als loser Belag auf einei CeIHt-, Florisil- oder Siliciumdioxyd Gel G-Träger g bunden ist. Diese vorbekannten Systeme dienen zur Be Stimmung der Aktivität von Lipoproteinlipase. Das tat sächliche Substrat ist dabei nicht das gebunden Triolein, sondern das abgelöste und emulgierte Trioleir welches in Gegenwart von Albumin oder anderen Pro

wi teinen einen Lipoproteinkomplex bildet. In wäßrige Lösung ist diese Zubereitung nicht stabil. Man erhä eine fortschreitende Absonderung von Triolein, welche zu größeren Teilchen agglomeriert. Dies hat ein ständig abnehmende Aktivität der Pankreaslipasen au dem Substrat zur Folge, was für die technische Anweri dung einen erheblichen Nachteil darstellt. Darüber hiri aus liegt die erhaltene enzymatische Aktivität verhälj nismäßig niedrig.

Aus der US-PS 36 66627 ist die Herstellung von trägergebundenen Enzymen bekannt. Die dort verwendeten Träger sind nicht inert, sondern derart vorbehandelt, daß sie aktive Stellen aufweisen, welche fähig sind, mit dem Enzym eine Bindung einzugeben. Ein solcher > Träger kann nicht verwendet werden, wenn man ihn mit dem Substrat in wäßriger Lösung zusammengibt. Soweit gemäß diesem bekannten Stand der Technik Substrat zugegeben wird, dient dies dazu, die aktiven Stellen des Enzyms während dessen Bindung an den in Träger zu schützen. Hierdurch wird ein Verlust an enzymatischer Aktivität während der Dauer der Bindung verhindert.

Im Gegensatz zu dem bekannten Stand der Technik bezieht sich die Erfindung auf einen besonderen Typ r, von trägergebundenen Substraten, wobei das Substrat nicht kovalent an den Träger gebunden ist, weder direkt noch über Kuppler, sondern durch Zusammenwirkung zwischen dem Substrat und einem besonderen Träger mit großer spezifischer Oberfläche durch Adsorption >u fest an den Träger gebunden ist.

Dies wird bei einem Substrat der eingangs genannten Art dadurch erreicht, daß es aus

a) einem festen, dem Substrat gegenüber inerten Trä- ^ ger mit einer spezifischen Oberfläche von zumindest 50 mVGramm, nämlich Sjüciumdioxydaerogel, und

b) einer durch Adsorption fest an den Träger gebundenen Schicht, weiche das Substrat, nämlich GIycerintricapronat, Tripelargonin, Tripropionin oder bis-33^-Trinethyl-hexyiadipat. enthält, besteht.

c) wobei die feste Adsorption -r'idurch erhalten wird, daß der Träger unter Umrühren in Methylenchlorid bis zur Bildung einer horr<)genen Aufschläm- mung gegeben wird, daß dann das Substrat zugesetzt und das Umrühren fortgesetzt wird und daß danach das Volumen des Lösungsmittels reduziert und bei kontinuierlichem Umrühren weiter und anschließend bei 50°C endgültig abgetrieben wird.

Es ist also eine Bedingung der Erfindung, daß das Substrat niedrige, definierte Wasserlöslichkeit aufweist und keine Hydrolyse oder Auflösung in Abwesenheit des entsprechenden Enzyms erfährt. Im Gegensatz zu gewissen der obengenannten Patentschriften, wo der Überzug ein lose appliziertes, wasserlösliches Material ist, ist das erfindungsgemäße Substrat fest am Träger adsorbiert und außerdem schwer löslich in Wasser. Hierdurch erhält man erfindungsgemäß in äußerst einfacher und billiger Weise ein fest an einen Träger ge- bundenes, enzymatisches Substrat. Zur Einwirkung auf das trägergebundene Substrat gemäß der Erfindung wird ein Enzym in Wasserphase ausgenutzt, und durch die Natur und die Eigenschaften des trägergebundenen Substrats gemäß der Erfindung erzielt man eine hohe v> und kontrollierbare Affinität zwischen Enzym und Substrat.

Ein Fortschritt liegt weiterhin im wesentlichen darin begründet, daß ein Substrat erhalten wird, welches über lange Zeiträume in wäßriger Lösung stabil ist und im e>o Vergleich zu vorbekannten Substraten, wie denjenigen nach Posner und Morales oder herkömmlichen Substratemulsionen, eine, z. B. 8 bis lOmal. höhere Aktivität liefert. Diese Aktivität wird auch durch eine Gefrierbehandlung in ihrer Höhe und Konstanz nicht beeinträch- < >5 tigt. Durch das erfindungsgemäße Vorgehen gelingt rs also, das Substrat einerseits fest an den Träger zu binden, andererseits aber auch solchermaßen, daß es für das Enzym zugänglich bleibt. Aufgrund seiner vorteilhaften Eigenschaften ist das Substrat besonders als Komponente in enzymaiischen Zeit-Temperatur-Indikatoren geeignet.

Am besten hat der Träger eine spezifische Oberfläche von zumindest 200 m^J/g. Das als Trägerstoff verwendete Siliciumdioxydaerogel ist allgemein im, Handel erhältlich.

Das trägergebundene Substrat gemäß der Erfindung wird am besten dadurch hergestellt, daß das Substrat dem Träger durch Imprägnieren aufgetragen wird, wobei das fertige Produkt die Form eines handlichen und lagerungsstabilen, frei fließenden Pulvers hat.

In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen,-daß die Schicht zusätzlich Spindclöl und/oder Aiuniiniumstearat und/oder Stcarylalkohol enthält.

Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung besteht die dem Träger aufgetragene Schicht also nicht ausschließlich aus Substrat, sondern aus Substrat zusammen mit einem Verdünnungsmittel. Das Substrat wird als im Verdünnungsmittel aufgelöst auf dem Träger vorliegen. Hierbei ist hauptsächlich i.ur das im äußeren Teil der Schicht vorliegende Substrat direkt der Einwirkung des Enzyms zugänglich. Die E-genschäften des Verdünnungsmittels beeinflussen die Zugänglichkeit des Substrats zur Enzymeinwirkung. Die Verdünnungsmittel sind Spindclöl und Decanol, Stearylalkohol und Polyglykolc.

Die Zugänglichke.t des Substrats zur Einwirkung des Enzyms kann durch Zugabe von Aluminiumstearat, zum Verdünnungsmittel weiter beeinflußt werden.

Das Substrat gemäß der Erfindung eignet sich für jede Art von Reaktion unter der Einwirkung des dazugehörigen Enzyms. Es ist außerordentlich vorteilhaft, dieses trägergebundene Substrat zur Standardisierung und Kennzeichnung von Enzymen zu benutzen. Ein Bereich der Technik, auf welchem sich die Erfindung als besonders brauchbar erwiesen hat, sind Indikatoren zur zeittemperaturabhängiger. lndikierung, beispielsweise von Lebensmitteln, auch gekühlten oder tiefgefrorenen. Derartige Indikatoren sind vor allem durch die US-Patentschrift 26 71 028 bekannt.

Falls also ein Indikator, der ein Enzym und dessen Substrat sowie einen Indikicrstoff zur lndikierung des bei der enzymatischem Reaktion gebildeten Reaktionsproduktes umfaßt, denselben Lagerungsbedingungen wie ein Lebensmittel ausgesetzt wird, kann man bei geeigneter Kalibrierung des Indikators den Lagerungszustand des Lebensmittels durch den Farbumschlag des Indikators entscheiden.

Ein solcher indikator, der das trägergebundene Substrat gemäß der Erfindung ausnutzt, umfaßt als wirksame Komponenten das genannte trägergebundene Substrat zusammen mit einem dem Substrat angcpaßten Enzym und einem Indikierstoff, beispielsweise einem pH-Indikator, zur lndikierung der bei der enzymaiischen Reaktion gebildeten Reaktionsprodukte.

1. Herstellung eines subslratbclegten Trägers: In 2500 ml Methylenchlorid wurden in kleinen Mengen und unter Umrührung 100 g Siliciumdioxidaerogel eingebracht, bis eine homogene Aufschlämmung erhalten wurde.

Die Aufschlämmung wurde dann mit 100 g Glycerintricarponat vermischt; das Umrühren wurde während 1 h bei Zimmertemperatur fortgesetzt.

Dann wurde das Methylenchlorid durch Luftblasung durch Filterdüsen und schwaches Erhitzen auf 30 C entfernt. Nachdem das Volumen des Gemisches auf

1500 ml reduziert worden war, wurde die Erhitzung unterbrochen, um ein stoßendes Kochen zu vermeiden; das weitere Abtreiben von Methylenchlorid erfolgte ausschließlich durch Luftblasung bei kontinuierlichem Umrühren,

Das endgültige Abtreiben des Methylenchlorids wurde im Wärmeschrank bei 50 C vorgenommen. Nach beendetem Trocknen im Wärmeschrank erhielt man eine weiße, spröde Masse, welche gemörsert und durch ein Sieb der erwünschten Maschenweite geschichtet wurde, um ein feinkörniges Pulver zu erhalten.

2.· Herstellung eines mit Substrat und Verdünnungsmittel belegten Trägers: Siliciumdioxidaerogel wurde in Methylenchlorid in derselben Weise wie in Beispiel 1 aufgeschlämmt Der Aufschlämmung wurde dann ein Gemisch von 50 g Tricaproin und 50 g Spindelöl unter Umrührung zugesetzt Das Umrühren wurde während 1 h bei Zimmertemperatur fortgesetzt.

Wie in Beispiel 1 wurde das Lösungsmittel dann entfernt, und die erhaltene Masse wurde in einem Mörser bzw. einer Kolloidmühle gemahlen. Man erhielt ein feinkörniges Pulver eines mit Substrat und Verdünnungsmittel belegten Trägers.

3. Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß dem Spindelöl Aluminiumstearat in einer Menge von 10% zugesetzt wurde. Das Ergebnis entsprach Beispiel 2.

4. Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde das Spindelöl durch Stearylalkohol ersetzt Dies verlangte ein Erhitzen, damit das Gemisch von Tricaproin und Stearylalkohol homogen wurde. Im übrigen verfuhr man wie in Beispiel 2, und ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten.

5. Mit den in Beispiel 1—3 hergestellten, substratbelegten Trägern wurden Versuche angestellt, bei denen die zeittemperaturabhängigen Indikiereigenschaften bei Indikierung in Kombination mit dem Enzym Pankreaslipase bestimmt wurden. Die bei der enzymatis'hen Reaktion gebildete Säure wurde mittels eines pH-Indikators indikiert. Das Gewichtsverhältnis zwischen dem Träger und der substratenthaltenden Schicht des Trägers war in sämtlichen Fällen 1:1. Die Ergebnisse sind in Tabetle 1 angezeigt, wobei die folgenden Abkürzungen benutzt sind:

Siliciumdioxidaerogel = F; Tricaproin = TC; Spindelöl = S; Aluminiumstearat = Alst

Tabelle 1

Relative Umschlagzeit

Temp. CQ

TC/F

TC/S/F

TC/S/10% MsUF

2,4
15,5
40,0
321
1396

1,0

2,0

20,0

108

856

1,0

1,7

33

417

970

Einwirkung von Pankreaslipase auf tricaproin zu vergleichen, teils ohne Trager und teils als Belag auf einem Trager gemäß Beispiel 1, Es wurden variierende Konzentrationen des Enzyms benutzt; als Maß der Aktivität wurde ein bei 2Q°C gebildetes Reaktionsprodukt mit Hilfe eines pH-indikatbrs indikiert. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 ersichtlich.

Tabelle 2

Umschlagzeit in Minuten

Lipasekonzentration TC TC/F

(Hg/ml)

1,3

4,5

11,5

32

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß Substrat und Träger mit großer spezifischer Oberfläche eine Aktivitätssteigerung herbeiführen, die etwa zehnmal grüßer ist als dir mit Substrat allein erhältliche Aktivität.

7. Wie in Beispiel 6 wurden Versuche angestellt, um die Aktivität bei der Einwirkung von Enzym auf Substrat zu vergleichen, teils ohne Träger und teils als Belag auf einem Träger. Als Enzym wurde Pankreaslipase benutzt, das Substrat bestand aus Tripelargonin (TP), und der Träger war ein Siliciumdioxidaerogel, das eine spezifische Oberfläche von etwa 30OmVg hatte. Als Maß der Aktivität wurde ein bei 20°C gebildetes Reaktionsprodukt indikiert Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angezeigt

Tabelle 3

Umschlagzeit in Stunden (h)

!5	3	7,5
	1	15
	0,3	37
	0,1	140
	0,03	380
20

Relative Enzymkonzentration

Die Versuchsergebnisse bestätigen, daß man die Zeit- und Temperaturabhängigkeit bei einem mit nur Substrat belegten Träger erhöht, wenn man das Substrat mit einem Verdünnungsmittel kombiniert, d. h., daß dann die relativen Umschlagzeiten verlängert weiden. Die Abhängigkeit wird noch weiter erhöht, fails zusätzlich Aluminiumstearat zugesetzt wird.

6. Versuche wurden angestellt, um die Aktivität bei TP

TP/F

28
77
240
524

4,25

12

25

46

100

240

8. Beispiel 7 wufde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß als Substrat Tripropionin (TPP) statt T^polargonin benutzt wurde. Das Enzym war Pankreaslipase und der Träger Siliciumdioxidaerogel. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angezeigt

Tabelle 4

Umschlagzeit in Stunden (h)

Relative Enzym	TPP	TPP/E I
konzentration
32	1,25	0,5 I
16	4,75	1,25 I
8	21	2,5 I
4	28	21 I
2	70	21 I
1	142	25 I

7 8

9. Beispiel 7 wurde wiederholt, jedoch mit dem Das Enzym war wie bisher Pankreaslipasc und der Unterschied, daß als Substrat bis 3,5,5-Trimethyl- Träger Siliciumdioxidaerogel. Die Ergebnisse sind in Mexyladipat (THA) statt Tripelargonin benutzt wurde. Tabelle 5 angezeigt.

Tabelle 5

Umschlagzeit in Stunden (h) i,

Relative Riuym-	ΤΙΙΛ	τιΐΛ/r
konzcnlralion
16	70	21
8	384	35
4	-	71
2	-	192
I	-	240-284

Aus Beispiel 7-9 gehl hervor, daß Substrat und Trä- ao rung von pholographischem Material, Arzneien, Leger mit großer spezifischer Oberfläche im Vergleich bcnsmillcln oder anderen empfindlichen Waren, die mit der Verwendung von Substrat ohne Träger eine für ihre Haltbarkeit gewisse bestimmte LagerungskriiDigc Steigerung der Aktivität herbeiführt. bedingungen verlangen.

Durch Ausnutzung des erfindungsgemäßen Substrats Die in den Beispielen genannten Träger erfüllen

kann man Indikatoren zustande bringen, die jedoch 25 selbstverständlich die Bedingungen des Ilauptanspruchs. besonderem Zweck angepaßt sind, sei es zur Indikic-

Claims

Patentansprüche:

1. Substrat für ein Enzym, welches einem Träger aufgetragen und imprägniert sowie fest an ihn gebunden ist, dadurch gekenn zeich η et, daß es aus

a) einem festen, dem Substrat gegenüber inerten Träger mit einer spezifischen Oberfläche von zumindest 50m²/Gramm. nämlich Siliciumdioxidaerogel. und

b) einer durch Adsorpiion fest an den Träger gebundenen Schicht, weiche das Substrat nämlich Glycerintricapronat, Tripelargonin, Tripropionin oder bis-3^-Trimethyl-hexyladipat, enthält, besteht,

c) wobei die feste Adsorption dadurch erhalten wird, daß der Träger unter Umrühren in Methylenchlorid bis zur Bildung einer homogenen Aufschlämmung gegeben wird, daß dann das Substrat zugesetzt und das Umrühren fortgesetzt wird und daß danach das Volumen des Lösungsmittels reduziert und bei kontinuierlichem Umrühren weiter und anschließend bei 50⁰C endgültig abgetrieben wird.