SU656527A3 - Способ получени ферментного субстрата на твердом носителе - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО СУБСТРАТА НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ ность, равную по меньшей мере 50 м /г или предпочтительно 200 . Образующийс  на носителе слой субст рата прочно с ним св зан и содержит субстрат, трудно растворимый в воде и стабильный в отсутствии соответствующе го фермента. Субстрат должен быть стабильным и не гидролизоватьс  или не раствор тьс  в отсутствии фермента, а также должен быть труднорастворимым или нерастворимым в воде, В качестве субстрата согласно описываемому способу используют трикапронат глицерина (трикапроин), трипомергонин, трибутирин и бис-3,5-5 триматилГексиладипат , с мешенные ефиры многоатомных спиртов и органических или неорганических кислот. Слой может, кроме того, содержать растворитель,смешивающийс  с субстратом , Предпочтительными разбавител ми  вл ютс  минеральные масла, содержащие несколько углеводородов, высшие алифатические спирты, кетоны или эфиры и полигликоли. При другом осуществлении данного изобретени  указанный слой содержит вещество измен ющее в зкость. Таким веществом может быть, например стеара алюмини , агар. . Предпочтительными носител ми  вл ют с  органические,неорганические полимеры неорганические окиси, кислоты или соли. Особо предпочтительным носителем  вл етс  окись алюмини , карбонат кальци , карбонат магни , сипикааэрозоль ил фосфат кальци . В качестве субстрата можно также использовать трикапронат глицерина. Предпочтительно в качестве носител  примен ть аэрогель окиси : кремни . Степень доступности субстрата дл  воздействи  фермента можно измен ть путем добавлени  к разбавителю добавок агентов, модифицирующих в зкость, напр мер стеарата апюм нк , Композици  субстрата, используемого при осушествленни способа пригодна дл  любой реакции, протекающей при воздействиисоответствующего фермента Такой адсорбированный носителем, субстрат выгодно примеч ть при стандартизации и характеристике ферментов. Специальной областью, в которой применение данного изобретени  оказалось наиболее пригодным,  вл етс  приготовление индикаторов, реагирующах в заисимости от времени и температуры, например, дл  пишевых продуктов, искусственно охлажденные и замороженные до низкой температуры. Если композици , содержаща  фермент и соответствующий субстрат, а также индикатор продукта, образующегос  при ферментной реакции, например индикатор рН, хранитс  в таких же услови х, как пищевой продукт, можно при соответствующей калибровке индикатора определить состо ние хран щегос  продукта по изменению цвета индикатора. Пример 1. Тонкоизмельченную окись кремни  в количестве 10О г добавл ют небольшими порци ми, при перемешивании к 2500 мл .хлористого метилена и получают гомогенную суспензию . Ее смешивают со 100 г трикапролата глицерина, после чего смесь продолжают перемешивать в течение 1 ч при комнатной температуре. Смесь продувают и удал ют хлористый метилен. При этом ее нагревают до 30 С, как только объем смеси уменьшитс  и станет равным 15ОО мл нагревание прекращают. Продувание продолжают без нагрева смеси, обеспечива  при этом ее непрерьюное перемешивание. Окончательное удаление .хлористого метилена провод т в шкафу при 50 и получают сухой хрупкий продукт белого цвета, который измельчают в ступке, просеивавэт через соответствующее сито и получают тонкоизмельченный порошок. Такой же результат получают при суспендировании указанного продукта в воде и последующей обработке его в коллоидной мельнице. Пример 2. Тонкоизмельченную окись кремни  суспендируют в .хлористом метилене, как описано в примере 1. К этой суспензии при перемешивании добавл ют смесь из 50 г трикапроина и 50 г веретенного масла и перемешивают еще в течение 1 час при комнатной температуре . Затем удал ют растворитель, как описано в примере 1, и полученную массу измельчают. Получают порошкообразный носитель, покрытый раствором субстрата. Пример 3. Процесс получени  ферментного субстрата на твердом носителе ведут по примеру 2 за исключением того, что к веретённому маслу добавл lOT 10% стеарата алюмини . Получают такой же продукт, как в примере 2. Пример 4. Процесс ведут по. примеру 2 за исключением того, что примен ют стеариловый спирт (вместо веретенного масла). В этом случае дл  гомогенизации смеси трикапроииа и стёа рилового спирта ее нагревают. В осталь ном процедура не отличаетс  от описанн в примере 2. Пример 5. Провод т испытани  покрытых субстратом носителей, приготовленных по примерам 1-3. При этих испытани х определ ют индикаторные свойства, завис щие от времени и темпе ратуры, в присутствии фермента липазы поджелудочной железы. Наличие кислоты образующейс  при ферментации, обнаруживают с помощью индикатора рН. Во всех случа х весовое отношение носител  к содержащему субстрат слою на ука занном носителе равно 1:1, Полученные результаты показаны в табл. 1, где при менены следующие обозначени : F флуосил , ТС - трикапроин, 5 веретенное масло, А 6 St - стеарат алюмини . Таблица Пример 6, Дл  изучени  действи  сгустителей (добавок) в водной суспензии ферментного субстрата добавл ют 0,25% агара к водной суспензич фермента (липаза поджелудочной железы) и покрытого субстратом носител , описанного В примере 1. Полученное врем  индикации приведено в табл. 2, как относительное врем  изменени . б л и ц а 2 27 Вли ние агара сказываетс  при темпениже -10°С. ратуpax Пример 7. Провод т испытани  с целью сравнени  активности при воз- действии фермента липаза поджелудочной железы на субстрат (трикапроин) без носител  и на субстрат, нанесенный на носитель в соответствии с. примером 1. При испытании примен ют разные концентрации фермента, активность продукта реакции, образовавшегос  при 2О°С, определ ют с помощью индикатора рН. Полученные результаты показаны в табл. 3, . Т а б л и 3 Из табл. 3 видно, что при комбинации субстрата и носител  с большой удельной поверхностью активность липазы увели- чиваетс  примерно в дес ть раз по сравнению с активностью при наличии только одного субстрата. Пример 8. Провод т такое же испытание, как описано в примере 7, дл  сравнени  активности энзима на субстрате без носител  и энзима, нанесенного на носитель. В качестве энзима используют липазу поджелудочной железы. Субстратом служит трипеларгонин ТР, а носителем - флуосил 300 с удельной поверхностью , равной примерно ЗОО м /г. Используют продукт реакции, образующий-, с  при 20°С, в качестве меры активности. Полученные результаты приведены в табл,4. Таблица4

Пример 9, Повтор ют процесс примеру 8, за исключением того, что