DK144425B - Baererbundet enzymsubstrat til anvendelse ved enzymatiske reaktioner - Google Patents

Description

(19) DANMARK ί 'ill

mj 02) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n) 144425 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2231/74 (51) IntCI.3 C 12 Q 1/00 (22) Indleveringsdag 25. apr. 1974 // G 01 N 33/02 (24) Løbedag 23. apr. 1974 (41) Aim. tilgængelig 26. okt. 1974 (44) Fremlagt 8. mar. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 25- apr. 1973, 354412, US

(71) Ansøger KOCKUMS CHEMICAL AKTIEBO LAG, S-21 3 75 Malraoe, SE.

(72) Opfinder Kjell Gunnar Blixt, SE: Sven Ivan Arvid Toerntnarck, SE:

Rolf Juhlin, SE: Karl Rune Salenstedt, SE: Mandayam Tiru, SE.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bur eau.

(54) Bær er bund et enzymsubstrat til an= vendeise ved enzymatiske reaktioner. -

Den foreliggende opfindelse angår et bærerbundet enzymsubstrat til anvendelse ved enzymatiske reaktioner.

Ved de fleste enzymatiske reaktioner, dvs. reaktioner ved hvilke et substrat under katalytisk påvirkning af et enzym undergår en forandring (sædvanligvis nedbrydning), foreligger såvel substratet som enzymet i form af en opløsning og i visse tilfælde som en suspension. Der kan opnås flere fordele, ikke mindst med hen-Φ syn til transport og håndtering, dersom en af komponenterne, dvs. enzymet eller

Uj substratet, kunne tilføres båret på en bærer. For enzymets vedkommende er det her- 04 ved kendt at kombinere dette med en bærer, f.eks. en gel eller cellulose.

_-j. Det er også kendt at kombinere substrat med en bærer, men herved er hidti- dige kombinationer blevet foretaget således, at substratet igennem et koblingsmid- 1— del er blevet bundet covalent til bæreren, eller også er substratet kun blevet an- *

O

144425 2 br.ffgt løst på en bærer, således at det let kan fjernes derfra, f.eks. ved indvirkning af vand. Som eksempel på den kendte teknik kan der nævnes artiklen "TrSger-gebundene biologisch aktive Substanzen und ihre Anwendung" af H.D.Orth og W. Brummer i Angewandte Chemie, vol. 84 (1972), nr. 8, pp 319-368. Denne artikel angår først og fremmest bæreib undre enzymey men angiver i tabel 1 flere referencer, som angår bærerbundne substrater. Fælles for disse referencer er, at de angår substrater, som er kemisk bundne til en bærer, dvs. ved hjælp af covalent binding eller ionbinding (anionisk). Hensigten er at udnytte de bærerbundne substrater til renfremstilling af enzym. I dette tilfælde sker der kun en enzym-substret-kompleks-dannelse uden nedbrydning af substrat. Ifølge USA-patentskrift nr. 2.677.917 og fransk patentskrift nr. 2.071,058 er det endvidere kendt at anbringe næringsmedium for svampemycelium på bærere, såsom trækul eller ekspanderet perlit. De anvendte næringsmedier er vandopløselige og gør det muligt for svampemyceliet at absorbere næringsmediet i et fugtigt medium for at understøtte væksten. Tilsvarende er der i USA-patentskrift nr. 3.251.749 beskrevet bakteriel omdannelse af carbonhydrater, som er anbragt på bærere, til polysaccharider. Også i dette tilfælde er "substratet" vandopløseligt og kun løst anbragt på bæreren.

Som yderligere eksempel på den kendte teknik kan nævnes fransk patentskrift nr. 1.306.640, hvori der er beskrevet indeslutning af enzym eller substrat i et permeabelt materiale, såsom et polymermateriale.

I modsætning til hvad der således er kendt, vedrører den foreliggende opfindelse en speciel type bærerbundet enzymsubstrat, hvor substratet ikke er covalent bundet til bæreren, det være sig direkte eller gennem koblingsmidler, men ved samvirken mellem substratet og en speciel bærer med stor specifik overflade er fast bundet til bæreren ved adsorption. Det er endvidere en betingelse ved opfindelsen, at substratet har lav opløselighed i vand og ikke undergår hydrolyse eller opløsning i fraværelse af det tilsvarende enzym. I modsætning til produkterne ifølge visse af de ovennasvnte patentskrifter, hos hvilke overtrækket udgøres af løst påført, vandopløseligt materiale, er substratet således ved den foreliggende opfindelse fast adsorberet til bæreren og desuden tungtopløseligt i vand. Herved opnås ifølge opfindelsen på en meget enkel og billig måde et til en bærer fast bundet enzymsubstrat. Til påvirkning af det bærerbundne enzymsubstrat ifølge opfindelsen benyttes et enzym i vandfase, og som følge af naturen af og egenskaberne hos det bærerbundne enzymsubstrat ifølge opfindelsen opnås en høj og styrbar affinitet mellem enzymet og substratet.

Det bærerbundne enzymsubstrat ifølge opfindelsen er således ejendommeligt ved, at det består af 1) en fast, over for substratet indifferent bærer med en specifik overflade på mindst 50 m /g, og 2) et til bæreren ved adsorption fast bundet lag, som indeholder et substrat, der har en opløselighed på mindre end 0,1 vægt% i vand ved 20°C og er i hovedsagen stabilt i fraværelse af det tilsva- 144425 3 rende enzym.

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen indeholder laget desuden et med substratet blandbart fortyndingsmiddel.

Fortyndingsmidlet vælges fortrinsvis blandt mineralolier med flere carbon-hydrider, højere alifatiske alkoholer og polyglycoler, men kan også vælges blandt ketoner og ethere. Hvis fortyndingsmidlet er en mineralolie, er det navnlig spindelolie.

Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen kan laget desuden indeholde et viskositetsændrende middel.

Det viskositetsændrende middel kan være metalsalte af fedtsyrer, f.eks. aluminiums t earat.

Ifølge en yderligere foretrukken udførelsesform for opfindelsen har bæreren 2 en specifik overflade på mindst 200 m /g.

Bæreren vælges fortrinsvis blandt organiske/uorganiske polymere, uorganiske oxider, syrer og salte.

Specielt foretrækkes det at vælge bæreren blandt aluminiumoxid, calciumcar-bonat, magnesiumcarbonat, siliciumdioxidaerogel og calciumphosphat.

Ifølge en særlig udførelsesform for opfindelsen er substratet glyceryltri-capronat, tributyrin, tripropionin, bis-3,5,5-trimethylhexyladipat eller tripelar-gonin.

Den faste binding (adsorption), som findes mellem substratet og bæreren i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, tilvejebringes ved anvendelse af en speciel bærer, der som nævnt ovenfor er fast og indifferent over 2 for substratet, og som har en specifik overflade på mindst 50 m /g, fortrinsvis 2 mindst 200 m /g. Gennem den opnåede faste binding undgås enhver uønsket adskillelse af substratet fra bæreren. Selv om det ikke er helt klarlagt, antages det, at den i (Udpræget grad øgede affinitet, som optræder mellem det bærerbundne substrat ifølge opfindelsen og det tilsvarende enzym, kan tilskrives kombinationen med den specielle bærer og først og fremmest dennes store specifikke overflade. Det er ved opfindelsen konstateret, at der ved stigende specifik overflade hos bæreren opnås en tiltagende aktivitet eller reaktionshastighed mellem substrat og enzym. Herved er der opnået en aktivitetsforøgelse på op til 10 gange den normale aktivitet.

Der kan anvendes ethvert substrat, som opfylder de ovenfor anførte fordringer, dvs. substratet skal være tungtopløseligt eller i hovedsagen uopløseligt i vand, hvormed menes, at substratet skal have en opløselighed på mindre end 0,1 vægt% i vand ved 20°C, og substratet skal endvidere være stabilt og ikke undergå hydrolyse eller opløsning i fraværelse af det tilsvarende enzym. Foretrukne substrater ved den foreliggende opfindelse er de, som vælges blandt glyceryltrica-pronat (tricaproin), tripelargonin, tributyrin og bis-3,5,5-trimethylhexyladipat, samt blandede estere af polyvalente alkoholer og organiske og uorganiske syrer.

144425 4

Det bærermateriale, som specielt foretrækkes, er siliciumdioxid i form af o 2 aerogel med en specifik overflade på 200-300 m /g. Sådan siliciumdioxidaerogel fås i handelen under betegnelserne "AerosiJ®, "Cab-O-Si^', "Kiselgel G" og "Fluosil".

Det bærerbundne substrat ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles fortrinsvis ved, at substratet påføres bæreren ved imprægnering, hvorved det færdige produkt fås i form af et lethåndterligt, lagringsstabilt pulver, som er fritløben-de. Således opslemmes bæreren i en væske indeholdende substrat eller substrat og substratfortyndingsmiddel under omrøring. Efter denne behandling afdampes den tilførte væske. Remanensen findeles således, at der opnås partikler af ønsket størrelse og størrelsesfordeling.

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen udgøres det på bæreren påførte lag ikke kun af substrat, men af substrat i kombination med et fortyndingsmiddel. I laget på bæreren kommer substratet således til at foreligge opløst i fortyndingsmidlet. I modsætning til den tidligere beskrevne udførelsesform, hvor hele substratet er direkte tilgængeligt for indvirkning af enzym, er ved denne sidste udførelsesform i hovedsagen kun det substrat, som foreligger i den ydre del af laget, direkte tilgængeligt for indvirkning af enzymet.

Fortyndingsmidlets egenskaber, såsom opløselighed af substrat, aktiverende eller hæmmende enzymeffekter, viskositet og tilbøjelighed til adskillelse under indvirkning af lav temperatur, påvirker substratets tilgængelighed for påvirkning af enzym. Egnede fortyndingsmidler er mineralolier, højere alifatiske alkoholer, såsom decanol, dodecanol, stearylalkohol og polyglycoler samt andre tungtflygtige car-bonhydridforbindelser, som er blandbare med substratet.

En yderligere påvirkning af substratets tilgængelighed for påvirkning af enzym opnås ved tilsætning af et viskositetsændrende middel, såsom aluminiumstea-rat, til fortyndingsmidlet.

Det bærerbundne enzymsubstrat ifølge den foreliggende opfindelse er anvendeligt til ethvert passende formål til reaktion under indvirkning af det tilsvarende enzym. Det er særligt fordelagtigt at anvende dette bærerbundne substrat ved standardisering og karakterisering af enzymer. Et specielt område af teknikken, inden for hvilket den foreliggende opfindelse har vist sig særlig anvendelig, er indikatorer til tids-temperatur-afhængig indikering, f.eks. af næringsmidler og navnlig nedkølede og dybfrosne næringsmidler. Sådanne indikatorer er kendte fra først og fremmest USA-patentskrift nr. 2.671.028.

Hvis således en indikator, som omfatter et enzym og et substrat samt et in- dikeringsstof til indikering af det ved den enzymatiske reaktion dannede reaktionsprodukt, udsættes for samme lagringsbetingelser som et næringsmiddel, er det muligt ved passende kalibrering af indikatoren ved hjælp af indikatorens farveom-slag at afgøre næringsmidlets lagringstilstand.

En indikator, som udnytter det bærerbundne enzymsubstrat ifølge opfindelsen, 5 U4425 omfatter som virksomme komponenter det nævnte bærerbundne substrat i kombination med et efter substratet afpasset enzym og et indikeringsstof, f.eks. en pH-indi- kator, til indikering af ved den enzymatiske reaktion dannede reaktionsprodukter.

Ved anvendelse af det bærerbundne substrat ifølge opfindelsen og det tilsvarende enzym i vandholdige suspensioner kan der sættes fortykkelsesmidler, såsom vandopløselige, højeremolekylære forbindelser, f.eks. agar eller carboxycel-lulose, til suspensionen. Herved opnås en fordel som følge af, at fortykkelsesmidlet, f.eks. agar, giver en vis ændring af reaktionshastigheden.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de nedenstående eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af substratbelagt bærer.

Til 2500 ml methylenchlorid sættes i små portioner og under omrøring 100 g finkornet siliciumdioxid ("Fluosil"), til der opnås en homogen opslemning.

Opslemningen blandes derefter med 100 g glyceryltricapronat (tricaproin, TC), og omrøringen fortsættes i yderligere 1 time ved stuetemperatur.

Derefter fjernes methylenchloridet ved luftblæsning gennem filtermundstykker samt ved opvarmning til 30°C. Efter at blandingens rumfang var formindsket til 1500 ml, blev opvarmningen afbrudt for at undgå stødkogning, Og den fortsatte afdampning af methylenchlorid blev foretaget alene med luftblæsning under kontinuerlig omrøring.

Den endelige afdampning af methylenchloridet udførtes i varmeskab ved 50°C. Efter afsluttet tørring i varmeskabet opnåedes der en hvid, sprød masse, som pulveriseredes i morter og sigtedes gennem en sigte med ønsket maskevidde til opnåelse af et finkornet pulver. Der opnåedes et tilsvarende resultat, når den tørrede, hvide, sprøde masse opslemmedes i vand og formaledes i en kolloidmølle.

Eksempel 2

Fremstilling af bærere belagt med substrat og fortyndingsmiddel.

Finkornet siliciumdioxid med en specifik overflade >50 m^/g opslemmedes i methylenchlorid på samme måde som i eksempel 1. Til opslemningen sattes derefter en blanding af 50 g tricaproin og 50 g spindelolie under omrøring, og omrøringen fortsattes i 1 time ved stuetemperatur.

På tilsvarende måde som i eksempel 1 fjernedes derefter opløsningsmidlet, og den opnåede masse formaledes i morter eller kolloidmølle. Der opnåedes et finkornet pulver af bærer belagt med substrat og fortyndingsmiddel.

Eksempel 3

Eksempel 2 blev gentaget med den forskel, at der sattes aluminiumstearat i en mængde på 10 % til spindelolien. Der opnåedes et tilsvarende resultat som i eksempel 2.

6 14442 5

Eksempel 4

Eksempel 2 blev gentaget, idet dog spindelolien erstattedes med stearylal-kohol. Herved krævedes opvarmning, for at blandingen af tricaproin og stearylal-kohol kan blive homogen- løvrigt gik man frem som i eksempel 2, og der opnåedes et tilsvarende resultat.

Eksempel 5

Der blev foretaget forsøg med de i eksemplerne 1-3 fremstillede, substratbelagte bærere. Ved forsøgene bestemtes de tids-temperatur-afhængige indikerings-egenskaber ved indikering i kombination med enzymet pancreaslipase. Den ved den enzymatiske reaktion dannede syre indikeredes med en pH-indikator. Vægtforholdet mellem bærer og det substratholdige lag på bæreren var i alle tilfælde 1:1. Resultaterne er angivet i tabel 1, idet der er anvendt følgende forkortelser i tabellerne: "Fluosil"*»F; tricaproin=TC; spindelolie=Sj aluminiumstearat=Alst.

Tabel 1

Relativ omslagstid

Temp. TC/F TC/S/F TC/S/1C% Alst/F

(°C) + 20 1,0 1,0 1,0 + 4 2,4 2,0 1,7 _ 5 15,5 20,0 33 - 10 40,0 108 417 - 15 321 856 970 - 20 1396

Forsøgsresultaterne bekræfter det tidligere anførte, nemlig at man med udgangspunkt i et vist tids-temperatur-afhængighedsforhold ved en alene med substrat belagt bærer får forøget dette afhængighedsforhold, når substratet kombineres med fortyndingsmiddel, dvs. de relative omslagstider forlænges. Afhængighedsforholdet forøges yderligere, hvis der til kombinationen substrat-fortyndingsmiddel sættes et viskositetsforøgende middel, såsom aluminiumstearat.

Eksempel 6

For at studere indvirkningen af fortykkelsesmiddel i den vandholdige suspension af enzym-substrat sattes der 0,25 % agar til vandholdige suspensioner af enzym (pancreaslipase) og substratbelagt bærer ifølge eksempel 1. De opnåede indike-ringstider noteredes og er angivet som relative omslagstider i tabel 2, 144425 7

Tabel 2

Relativ omslagstid

Temp. TC/F TC/F

(°C) 0,25 1 agar + 20 1,0 1,0 + 4 2,4 2,4 - 5 12,7 15,5 - 10 84,2 40,0 - 15 1336 321 - 20 >16000 1396

Ved forsøget kunne man tydeligt mærke agarens indvirkning ved temperaturer under -10°C.

Eksempel 7

Der blev foretaget forsøg for at sammenligne aktiviteten ved indvirkning af enzym (pancreaslipase) på substrat (tricaproin), dels uden bærer, dels anbragt på bærer i overensstemmelse med eksempel 1. Ved forsøget anvendtes varierende koncentrationer af enzym, og som mål for aktiviteten indikeredes ved 20°C dannet reaktionsprodukt ved hjælp af ρΗ-indikator. Resultaterne er anført i tabel 3.

Tabel 3

Omslagstid i minutter Lipasekoncentration TC TC/F

(Ug/ml) 3 7,5 <1 1 15 1,3 0,3 37 4,5 0,1 140 11,5 0,03 380 32

Af tabel 3 fremgår det, at kombinationen af substrat og bærer med stor specifik overflade medfører omtrentlig en tidobling af aktiviteten sammenlignet med aktiviteten ved anvendelse af substrat alene.

Eksempel 8

Ligesom i eksempel 7 blev der foretaget forsøg for at sammenligne aktiviteten ved indvirkning af enzym på substrat, dels uden bærer, dels anbragt på bærer.

Som enzym anvendtes pancreaslipase, substratet udgjordes af tripelargonin (TP), 2 og bæreren var "Fluosil" V 300, som havde en specifik overflade på ca. 300 m /g.

Som mål for aktiviteten indikeredes ved 20°C dannet reaktionsprodukt. Resultater- 8 1U&25 ne er anført i tabel 4.

Tabel 4

Omslagstid i timer

Relativ enzymkoncentrat ion TP TP/F

32 21 4,25 16 28 12 8 77 25 4 240 46 2 524 100 1 -240

Eksempel 9

Eksempel 8 blev gentaget, men med den forskel, at der anvendtes tripropio-nin (TPP) som substrat i stedet for tripelargonin. Enzymet var pancreaslipase og bæreren ''Fluosil". Resultaterne er angivet i tabel 5.

Tabel 5

Omslagstid i timer

Relativ enzymkoncentration TPP TPP/F

32 1,25 0,5 16 4,75 1,25 8 21 2,5 4 28 <21 2 70 21 1 142 25

Eksempel 10

Eksempel 8 blev gentaget, men med den forskel, at der anvendtes bis-3,5,5-trimethylhexyladipat (THA) som substrat i stedet for tripelargonin. Enzymet var ligesom tidligere pancreaslipase og bæreren "Fluosil". Resulaterne er anført i tabel 6.

Tabel 6

Omslagstid i timer ·

Relativ enzymkoncentration THA THA/F

16 70 21"" 8 384 35 4 - 71

Claims (2)

144425 9 Tabel 6 (fortsat) Omslagstid i timer Relativ enzymkoncentration THA THA/F 2 - 192 1 _ 240-284 Af eksemplerne 8-10 fremgår det, at kombinationen af substrat og bærer med stor specifik overflade medfører en kraftig forøgelse af aktiviteten sammenlignet med aktiviteten ved anvendelse af substrat uden bærer. Eksempel 11 Man gik frem i hovedsagen som i eksempel 7, men med den forskel, at man i stedet for "Fluosil" anvendte "Kiselgel G" som bærer. Denne bærer har sammensætningen: 13 % CaSO^, 0,02 % chlorid, 0,03 % Fe og resten S1O2. Bærerkornene har en diameter på 5-25 pm. Til det ikke-bærerbundne substrat benyttedes en 1 % opløsning af tricaproin i acetone, medens der til det bærerbundne substrat benyttedes en suspension indeholdende en tilsvarende mængde kiselgel belagt med 30 % tricaproin. Efter tilsætning af enzym (pancreaslipase) noteredes pH 5,4 ved henholdsvis 28 minutter for det bærerbundne substrat og 220 minutter for det ikke-bærerbundne substrat ved 20°C. Det er således tydeligt, at man ved at vælge passende kombinationer af substrat, substrat-fortyndingsmiddel, substrat-fortyndingsmiddel-viskositetsændrende middel, kan fremstille indikatorer til tids-temperatur-afhængig indikering, hvilke indikatorer er afpassede efter de vilkår, som gælder for lagring af en vis vare. Det indses også, at man ved den håndterlige form hos det bærerbundne enzymsubstrat ifølge opfindelsen kan afpasse indikatoren yderligere ved at blande sub-stratmateriale af forskellig art, dvs. blande materiale, som kun er belagt med substrat, og materiale, som er belagt med en kombination af substrat-fortyndings-middel-viskositetsændrende middel. De muligheder, som opnås med hensyn til at afpasse eller styre tids-temperatur-afhængigheden hos indikatoren,er uanede, og ved at benytte det bærerbundne enzymsubstrat ifølge opfindelsen kan der fremstilles indikatorer, som er afpassede efter ethvert særligt formål, det være sig til indikering af fotografisk materiale, lægemidler, næringsmidler eller andre følsomme varer, som af holdbarhedshensyn kræver visse bestemte lagringsbetingelser.

1. Bærerbundet enzymsubstrat til anvendelse ved enzymatiske reaktioner, kendetegnet ved, at det består af 1) en fast, over for substratet in- 2 different bærer med en specifik overflade på mindst 50 m /g, og 2) et til bæreren ved adsorption fast bundet lag, som indeholder et substrat, der har en opløselig-