CN106496204B - 荧光探针和基于羧酸酯酶抑制法的农药残留检测试剂盒 - Google Patents

荧光探针和基于羧酸酯酶抑制法的农药残留检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光探针和基于羧酸酯酶抑制法的农药残留检测试剂盒以及应用该试剂盒的检测方法。所述农药残留检测试剂盒，包括试剂储备液a和试剂储备液b；其中，试剂储备液a为含有磷酸盐的缓冲液，试剂储备液b为所述荧光探针的溶液。实验发现，所述探针本身的荧光强度非常弱，加入羧酸酯酶后，探针发生反应，释放出IR‑780半菁骨架荧光母体，溶液荧光显著增强，表明该方法可用于羧酸酯酶活性的检测；而向羧酸酯酶中加入微量农药后，溶液荧光会明显减弱，表明微量农药能够抑制羧酸酯酶的活性，从而可用于农药残留的检测。本发明具有操作简便，成本低，快速高效灵敏等优点，易于推广和应用，在农业、食品等领域中有着巨大的应用前景。

Description

荧光探针和基于羧酸酯酶抑制法的农药残留检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种荧光探针和基于羧酸酯酶抑制法的农药残留检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
农副产品中超标的农药残留影响着消费者的食用安全，因此对食品中农药残留量的快速准确检测是食品安全检测的重要课题。目前，国内外检测农药残留普遍采用的方法有光谱法、色谱法以及色谱法与其它技术的联用，这些方法具有检测结果准确，灵敏度高等优点，但检测成本较高，测定时间较长，且需要具有一定专业技术水平的人员才能进行操作，只适合在实验室中进行研究分析。
酶抑制法是快速农残检测技术中研究最成熟、应用最广泛的方法。羧酸酯酶能有效地催化酯类和酰胺类化合物水解，属丝氨酸水解酶家族。羧酸酯酶的主要功能是催化药物(包括前体药物)生成相应的自由酸，催化一些内源性化合物(如短链和长链酰基甘油、长链酰基肉毒碱和长链酰基酯等)的水解，参与脂质运输和代谢以及信号跨膜转导，并可保持生物膜的完整性。此外，肝微粒体羧酸酯酶中的一些同功酶与特定致癌物的代谢及肝癌的发生相关。因此，测定生物体中羧酸酯酶的活性(浓度)具有重要意义。
常见的残留农药(如有机磷农药、氨基甲酸酯类农药和拟除虫菊酯类农药)在一定条件下能够抑制羧酸酯酶的催化水解功能，且抑制率与农药的浓度呈正相关。将样品和羧酸酯酶反应，如果样品中没有农药残留或者残留量极少，就不会明显的抑制羧酸酯酶的活性；反之，如果样品中农药残留量较高，羧酸酯酶的活性就会被农药所抑制，再利用一些特定的颜色、光吸收或pH值等的变化，从而达到检测农药残留的目的。
目前利用羧酸酯酶抑制原理，结合光学探针方法检测农药残留的报道仍较少。因此，开发新的、可以与羧酸酯酶发生特异性作用的有效的荧光探针在农业、食品等领域中有着巨大的应用前景。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明以三碳菁IR-780骨架为荧光母体，4-(氯甲基)苯基乙酸酯作为特异性响应基团，设计合成了一种检测羧酸酯酶的荧光探针。实验发现，该荧光探针本身的荧光强度非常弱，加入羧酸酯酶后，探针化合物发生反应，释放出半菁骨架荧光母体，溶液荧光显著增强，表明该方法可用于羧酸酯酶浓度检测和与羧酸酯酶具有特异性作用的农药残留检测。
一方面本发明提供了一种新的荧光探针，其具有如下式(I)所示的结构，
该荧光探针优势明显，具体表现为：式(I)所示荧光探针本身无荧光，而与羧酸酯酶反应后则可发出强烈的荧光，反应速度快，并且灵敏度高。反应过程如下：
更为重要的是，该显色反应仅在羧酸酯酶存在的条件下发生，其他常见的无机盐、糖类、生物巯基物种、血清白蛋白和胆碱酯酶等均不会对该反应产生干扰。因此，可以广泛应用于酶抑制法对农药残留的检测。
另一方面，本发明还提供了式(I)所示的荧光探针的制备方法，其包含以下步骤：在催化剂存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物反应，得到式(I)所示化合物
在一些实施方案中，所述的制备方法中的催化剂选自有机碱或无机碱；其中，所述有机碱选自三乙胺、吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠中的至少一种。
在一些实施方案中，所述的制备方法中式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和催化剂的投料摩尔比为1：0.5～5：0.5～5；在另一些实施方案中，中式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和催化剂的投料摩尔比优选为1：1～4：1～4；在另一些实施方案中，中式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和催化剂的投料摩尔比更优选为1：1：1.5。
在一些实施方案中，所述的制备方法中反应温度为0℃～60℃；在另一些实施方案中，反应温度优选为30℃～60℃；还在一些实施方案中，更有选为40℃～50℃。
在一些实施方案中，所述的制备方法的反应时间根据投料量的不同为1～24小时，投料量增加，反应时间相应延长。
在一些实施方案中，所述的制备方法优选在惰性气体，如氮气或氩气中反应。
在一些实施方案中，所述的制备方法中反应在合适的有机溶剂中进行，合适的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈中的至少一种。
本发明所提供的荧光探针(I)的制备方法，简便易行，后处理简单，易于规模化生产。
还在另一方面，本发明还提供了包含式(I)所示的荧光探针的试剂盒，所述试剂盒包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a为磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示荧光探针的溶液。
在一些实施方案中，所述试剂盒中的试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，所述磷酸盐的摩尔浓度为0.01～0.5M，优选为10mM；所述试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度为1～10mM，优选为1mM。
在一些实施方案中，所述试剂盒中的试剂储备液a和所述试剂储备液b的体积比为200/1。
在一些实施方案中，所述试剂盒中，试剂储备液a的pH值为6～9，在另一些实施方案中，试剂储备液a的pH值优选为7.4。
还在另一方面，本发明还提供了包含荧光探针(I)的试剂盒通过酶抑制法测定样品中的羧酸酯酶的浓度和/或检测样品中的农药残留的用途。
还在另一方面，本发明提供了一种使用所述包含荧光探针(I)的试剂盒检测羧酸酯酶浓度的方法，包括如下步骤：
(1)制备标准曲线
以630～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在发射波长为650～750nm处的荧光强度记为F，并测定溶剂空白在发射波长为650～750nm处的荧光强度记为F0，以羧酸酯酶的浓度C(U/mL)为横坐标，荧光强度变化值ΔF为纵坐标绘制标准曲线，其中，ΔF＝F-F0；
(2)检测样品中羧酸酯酶的浓度
将步骤(1)所述羧酸酯酶标准品溶液替换为待测样品溶液，按照所述步骤(1)所述方法检测待测样品在与步骤(1)相同的发射波长为650～750nm处的荧光强度，记为F’，将F’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中羧酸酯酶的浓度。
在一些实施方案中，使用所述的试剂盒时，其中，所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和羧酸酯酶标准储备溶液混匀而得，所述羧酸酯酶标准储备溶液中，溶剂为试剂储备液a，羧酸酯酶的浓度为10U/mL；所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液的溶剂为试剂储备液a，体积均为2mL，浓度依次为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6和1.0U/mL。
还在另一方面，本发明提供了一种使用含有所述荧光探针的试剂盒检测农药残留的方法，包括如下步骤：
(i)测定对照样品荧光强度或荧光成像
以630～690nm作为激发波长，向不含农药的对照样品的溶液中加入一定浓度的试剂储备液b，在发射波长为650～750nm处用荧光仪测定体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦进行荧光成像；
(ii)测定待测样品荧光强度或荧光成像
向待测样品中加入与步骤(i)相同浓度的试剂储备液b，测定体系在与步骤(i)相同的发射波长处的荧光强度或者是用激光共聚焦进行荧光成像，并与步骤(i)荧光强度或荧光成像对比。
当待测样品中有农药残留存在时，样品中的羧酸酯酶受到抑制，则测得到荧光强度或荧光成像减弱。
使用本发明中所述试剂盒时，激发波长可选630～690nm波长段，其中在一些实施方案中，选择激发波长635nm为最佳；在另一些实施方案中，选择激发波长670nm为最佳；发射波长可选650～750nm波长段，其中在一些实施方案中，选择发射波长705nm为最佳。
与现有技术相比，本发明使用含有所述荧光探针的试剂盒检测农药残留，具有以下特点：
1)试剂储备液b本身无荧光；而与羧酸酯酶反应后则可发出强烈的荧光，当有农药存在时，荧光强度会明显减弱，荧光强度变化明显。
2)反应速度快，15分钟内即可显色稳定。
3)灵敏度高，羧酸酯酶浓度在≥0.01U/mL时即有荧光强度信号。
4)该显色反应仅在羧酸酯酶存在的条件下发生，其他常见的无机盐、糖类、生物巯基物种、血清白蛋白和胆碱酯酶不产生干扰。
5)具有近红外荧光发射波长，可用荧光光谱法检测，背景信号较低。
附图说明
图1为试剂盒与不同浓度的羧酸酯酶反应的荧光光谱；
图2为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱；
图3为试剂盒检测肝癌细胞中不同种类农药抑制羧酸酯酶活性的荧光强度变化；
图4为试剂盒检测斑马鱼中不同种类农药抑制羧酸酯酶活性的荧光强度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，例如，根据本发明反应条件做一些常规的修改，用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。
化合物的结构是通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)来确定的。1H-NMR、13C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。1H-NMR、13C-NMR的测定是用Bruker Ultrashield-400核磁共振谱仪和Bruker Avance III HD 600核磁共振谱仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)。用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰),d(doublet，双峰),t(triplet，三重峰),m(multiplet，多重峰),br(broadened，宽峰),dd(doublet of doublets，双二重峰),brs(broadened singlet，宽单峰)。偶合常数，用赫兹(Hz)表示。
柱层析一般使用青岛海洋化工200目～300目硅胶为载体。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。
实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行；
氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球或钢釜；
说明书中无特殊说明，室温为20℃～30℃，实施例中所描述的温度误差为±5℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)反应所使用的展开剂的体系有：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
实施例1：式(I)所示荧光探针的制备
实验步骤如下：将三碳菁IR-780骨架(0.41g,1.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，向其中加入4-(氯甲基)苯基乙酸酯(0.18g,1.0mmol)和催化剂碳酸钾(0.21g,1.5mmol)，所得反应体系在45℃下反应2小时。反应完毕后，冷却至室温，减压除去溶剂得粗产品。所得粗产物用硅胶柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝1/1)作洗脱液，得到蓝绿色固体产物0.29g。
该荧光探针的结构表征数据结果如下：
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):8.67(d,J＝14.9Hz,1H),7.57(d,J＝7.5Hz,1H),7.48-7.40(m,4H),7.40-7.33(m,2H),7.29(s,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,2H),7.00(d,J＝2.1Hz,1H),6.96(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.42(d,J＝14.9Hz,1H),5.18(s,2H),4.24(t,J＝7.4Hz,2H),2.72-2.66(m,2H),2.62(t,J＝6.0Hz,2H),2.18(s,3H),1.85(dd,J＝14.6,7.3Hz,4H),1.73(s,6H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H)；
13C NMR(151MHz,CD3OD)δ(ppm):179.42,171.13,163.65,163.10,155.83,152.22,147.18,143.56,143.07,135.44,135.06,130.23,130.14,129.84,128.75,128.43,123.83,123.07,117.45,115.71,115.32,113.99,104.88,102.75,71.29,52.08,47.61,30.10,28.42,25.12,22.28,21.67,20.93,11.61.
实施例2：式(I)所示荧光探针与不同浓度羧酸酯酶反应的光谱性质
将荧光探针溶液b(1mM，50μL)溶于磷酸盐缓冲液(10mM，5mL)中，然后加入不同浓度的羧酸酯酶标准溶液，再用10mM磷酸盐缓冲液定容到10mL。不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液中羧酸酯酶的浓度依次为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6和1U/mL。所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品的溶液的体积均为2mL。37℃下反应15min，测量其紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以650nm为激发波长；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压700V。实验结果如图1所示，图1为试剂盒与不同浓度的羧酸酯酶反应的荧光光谱。
图1结果表明，本发明中的荧光探针具有以下特点：
1)探针在溶液中无荧光，背景信号较低；但随着羧酸酯酶的加入，该探针在约670nm处产生强吸收，并在705nm处荧光显著增强；
2)紫外可见吸收的强度和荧光强度随羧酸酯酶浓度的增加而增加；
实施例3：式(I)所示荧光探针与其他物质反应情况(选择性研究)
在10μM的荧光探针溶液中分别加入各种物质：氯化钾(150mM)、氯化钙(2.5mM)、氯化镁(2.5mM)、葡萄糖(10mM)、活性氧(10μM)、谷胱甘肽(5mM)、半胱氨酸(1mM)、高半胱氨酸(1mM)、人血清白蛋白(0.5mg/mL)、牛血清白蛋白(0.5mg/mL)、乙酰胆碱酯酶(0.1μg/L)、丁酰胆碱酯酶(20U/L)和羧酸酯酶(1U/mL)。在37℃下反应15min后，使用荧光仪F-4600测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以650nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压700V。在10mL混合了上述各种物质的溶液中加入50μL的探针溶液(1mM)，再加入羧酸酯酶使其最终浓度为1U/mL。
实验结果如图2所示，图2为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱。实验结果表明，只有羧酸酯酶可引起荧光探针产生明显的光信号响应，证明该荧光探针对羧酸酯酶具有高度的选择性，氯化钾、氯化钙、氯化镁、葡萄糖、活性氧、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等其他物质的存在均不会不干扰羧酸酯酶的测定。
实施例4：测试剂盒检测肝癌细胞中不同种类农药抑制羧酸酯酶活性的荧光强度 变化
1)肝癌细胞内羧酸酯酶活性测定
肝癌细胞于玻璃培养皿中贴壁生长；培养液为DMEM培养液，其中含10％胎牛血清、100mg/mL青霉素和100mg/mL链霉素；培养条件为37℃，5％CO2；培养时间为12～24小时。在进行细胞内羧酸酯酶的荧光成像前，肝癌细胞用含有10μM试剂储备液b的胎牛血清的DMEM在37℃下孵育20min，然后用试剂储备液a清洗三次后用激光共聚焦显微镜TCS SP5在635nm的激发波长下荧光成像。
2)三种农药对肝癌细胞中羧酸酯酶活性的抑制效果测定
培养好的肝癌细胞用试剂储备液a清洗三次，取三组，分别用5μM西维因农药、毒死蜱农药和溴氰菊酯农药处理10min，然后用试剂储备液a将多余农药冲洗掉。在进行细胞内羧酸酯酶的荧光成像前，肝癌细胞用含有10μM试剂储备液b的胎牛血清的DMEM在37℃下孵育20min，然后用试剂储备液a清洗三次后用激光共聚焦显微镜在635nm的激发波长下荧光成像，然后与上一步中结果进行比对。实验结果如图3所示，图3为试剂盒检测肝癌细胞中不同种类农药抑制羧酸酯酶活性的荧光强度变化。
图3中3A为没有加试剂储备液b时的荧光成像，3B为添加了试剂储备液b后的荧光成像，3C、3D和3E分别为用西维因、毒死蜱和溴氰菊酯处理过的样品，加入试剂储备液b后的荧光成像。
实验结果：由图3中的3A和3B对比可知：肝癌细胞中的羧酸酯酶能够与荧光探针在短时间内发生强烈反应，从而释放出更多的半菁骨架荧光团，荧光增强。而由图3中的3C、3D和3E可知，加入不同农药处理之后的肝癌细胞荧光强度显著降低，说明农药对羧酸酯酶活性有不同程度的抑制作用，其中，溴氰菊酯的抑制作用最强(图3E)，毒死蜱次之(图3D)，西维因抑制作用最弱(图3C)。
实施例5：农药残留检测试剂盒检测斑马鱼中不同种类农药抑制羧酸酯酶活性的 荧光强度变化
1)斑马鱼体内羧酸酯酶活性测定
斑马鱼生长在E3幼体介质中(15mM NaCl,0.5mM KCl,1mM Mg2SO4,1mM CaCl2,0.15mMKH2PO4,0.05mM Na2HPO4,0.7mM NaHCO3,5-10％亚甲蓝；pH 7.5)。在进行斑马鱼内羧酸酯酶的荧光成像前，先将生长5天的斑马鱼与10μM的试剂储备液b在28℃孵育20min。孵育完成后，用试剂储备液a清洗三次后，用激光共聚焦显微镜TCS SP5在635nm的激发波长下进行荧光成像。
2)三种农药对斑马鱼体内羧酸酯酶活性的抑制效果测定
现将斑马鱼分成三组，分别用5μM西维因农药、毒死蜱农药和溴氰菊酯农药处理10min后，用试剂储备液a洗涤三次；在进行斑马鱼内羧酸酯酶的荧光成像前，先将生长5天的斑马鱼与10μM的试剂储备液b在28℃孵育20min。孵育完成后，用试剂储备液a清洗三次后，用激光共聚焦显微镜TCS SP5在635nm的激发波长下进行荧光成像，将结果与上一步进行对比。实验结果如图4所示，图4为农药残留检测试剂盒检测斑马鱼中不同种类农药抑制羧酸酯酶活性的荧光强度变化。
图4中4A为没有加试剂储备液b时的荧光成像，可以看出斑马鱼本身在红外区域荧光很微弱，几乎可以忽略不计；4B为添加了试剂储备液b后的荧光成像，4C、4D和4E分别为用西维因、毒死蜱和溴氰菊酯处理过的样品，加入试剂储备液b后的荧光成像。
实验结果：由图4中的4A和4B可知斑马鱼体内的羧酸酯酶能够与荧光探针在短时间内发生强烈反应，从而释放出更多的半菁骨架荧光团，荧光得到增强。而由图4中的4C、4D和4E可知，加入不同农药处理之后的斑马鱼体内荧光强度显著降低，说明农药对羧酸酯酶活性有不同程度的抑制作用，其中，溴氰菊酯的抑制作用最强(图4E)，毒死蜱次之(图4D)，西维因抑制作用最弱(图4C)。与肝癌细胞中的检测结果相一致。
以上实施例4和实施例5很好的验证了，应用含有本发明式(I)所示的荧光探针的试剂盒可以通过对比荧光强度或荧光成像的方式，直观地判断待测样品是否含有农药残留，并且在检测多种不同农药残留方面，本发明所提供的试剂盒反应迅速，灵敏程度高，操作简单，适于广泛应用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种荧光探针，其具有如下式(I)所示的结构，
2.一种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，包含以下步骤：在催化剂存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物反应，得到式(I)所示化合物
所述催化剂选自有机碱或无机碱；其中，所述有机碱选自三乙胺、吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和催化剂的投料摩尔比为1：0.5～5：0.5～5；
所述反应的反应温度为0℃～60℃；
所述反应在合适的有机溶剂中进行，所述合适的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈中的至少一种。
4.一种含有权利要求1所述的荧光探针的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a为磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示荧光探针的溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，所述磷酸盐的摩尔浓度为10～500mM；所述试剂储备液b中式(I)荧光探针的浓度为1～10mM。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6～9。
7.权利要求4～6任一项所述的试剂盒通过酶抑制法测定样品中的羧酸酯酶的浓度和/或检测样品中的农药残留的用途。
8.一种使用权利要求4～6任一项所述的试剂盒检测羧酸酯酶浓度的方法，其包含以下步骤：
(1)制备标准曲线
以630～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在发射波长650～750nm处的荧光强度记为F，并测定溶剂空白在发射波长为650～750nm处的荧光强度记为F0，以羧酸酯酶的浓度C(U/mL)为横坐标，荧光强度变化值ΔF为纵坐标绘制标准曲线，其中，ΔF＝F-F0；
(2)检测样品中羧酸酯酶的浓度
将步骤(1)所述羧酸酯酶标准品溶液替换为待测样品溶液，按照步骤(1)所述方法检测待测样品在与步骤(1)相同的发射波长处的荧光强度，记为F’，将所述F’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中羧酸酯酶的浓度。
9.一种使用权利要求4～6任一项所述的试剂盒检测农药残留的方法，包括如下步骤：
(i)测定对照样品荧光强度或荧光成像
以630～690nm作为激发波长，向不含农药的对照样品的溶液中加入一定浓度的试剂储备液b，在发射波长为650～750nm处测定体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦进行荧光成像；
(ii)测定待测样品荧光强度或荧光成像
向待测样品中加入与步骤(i)相同浓度的试剂储备液b，测定体系在与步骤(i)相同的发射波长处的荧光强度，或者是用激光共聚焦进行荧光成像，并与步骤(i)荧光强度或荧光成像对比。
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