CN113804662A - 一种生鲜果蔬中专用于敌敌畏农药残留的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种生鲜果蔬中专用于敌敌畏农药残留的快速检测方法，其属于农药残留快速检测的技术领域。基于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE，来源于鸭血提取）活性的特异性抑制作用，应用超高灵敏荧光素荧光探针检测其抑制程度。在这个检测体系中敌敌畏加标量相同时，敌敌畏减弱的荧光强度（I敌敌畏）比其他农药（I其他农药）要低100倍以上，显示即使敌敌畏含量低于其他农药100倍时，也可定量检测其残留量。通过对农残萃取液稀释100倍，减除其他农残对AChE的影响，实现果蔬中特异性检测敌敌畏农残范围0.02~1.2 mg/kg，检测标准曲线误差率R2>0.99；生鲜果蔬的加标回收率达到71~86%。
Description
技术领域
本发明属于农药残留快速检测领域，具体涉及AChE酶的超高灵敏荧光探针底物及其应用。
背景技术
敌敌畏（DDVP,dichlorvos）是有机磷杀虫剂的一种，杀虫谱广，药效迅速，具有胃毒、触杀和熏蒸作用，可防治菜青虫、小菜蛾、蚜虫、菜螟、黄曲条跳甲、黏虫、甘蓝夜蛾、斜纹夜蛾、红蜘蛛、大猿叶虫等，对害虫击倒力强而快，常被用于蔬菜瓜果临近收获时害虫的防治。如果临近果蔬采摘前、或超量使用敌敌畏，易造成残留超标对人体造成危害。近些年市场监管部门时有敌敌畏在苹果、梨、芹菜、西红柿等果蔬中残留超标的报道，因此，开发一种可便利、准确、快速检测果蔬中敌敌畏残留量检测方法显得十分必要。
农药残留检测技术主要分为传统检测和快速检测。传统检测主要涉及气相色谱、液相色谱及其和质谱技术的联用，检测成本高、耗时长，不利于大范围、高通量展开。近年发展起来的荧光探针技术应用于酶抑制原理，可实现高通量、广谱、快速检测农残。中国发明专利（ZL201810408171.6）以罗丹荧为母体合成了可检测乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的荧光探针NDRO-1，基于酶抑制原理开发了可快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药方法。有机磷和氨基甲酸酯类农药对AChE酶都具有一定的抑制能力，这类基于酶抑制原理的检测方法，还难于实现对果蔬中敌敌畏农残的专项检测。国家标准GB/T5009.199-2003（蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测，水解底物为乙酰胆碱）中农残检出限为：甲胺磷2.0mg/kg、敌敌畏0.1mg/kg、呋喃丹0.05mg/kg；本专利申请人发表的硕士论文（张淑芳，鸭血胆碱酯酶近红外荧光检测探针的研究，2018年，水解底物为荧光探针）中农残检出限为：甲胺磷0.03mg/L、敌敌畏0.2µg/L、呋喃丹0.02mg/L。分别应用胆碱酯和荧光探针2种底物建立的检测方法所得到的农残检测限巨大差异，显示2种底物所作用的AChE酶活性中心位点不同，并且利用荧光探针方法中超低的敌敌畏检测限，改进检测方法应用于专项检测敌敌畏农残成为可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种AChE酶（从鸭血中提取）的荧光检测探针在敌敌畏专项农残检测中的应用。该底物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物荧光具有更高的灵敏度。利用该探针可对AChE快速检测方法，间接实现敌敌畏农残的定量检测。利用荧光探针方法中超低的敌敌畏检测限，改进检测方法应用于专项检测敌敌畏农残成为可能。
本发明提供了一种AChE的荧光检测探针，该底物的酯键可以被AChE水解，生成具有荧光属性的产物。该底物结构如式-1所示。
本发明还提供了检测AChE荧光探针底物的应用。作为AChE的底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶的活性；具体测定方法为：
——体系中以罗丹荧探针衍生物作为酶底物；反应体总系积为335µL，底物浓度选择1.0~20µM，单点测定时底物浓度优选10µM；AChE酶浓度为34µg/mL；
——在PBS缓冲液中，反应温度优选37oC；优选pH7.4为最优反应pH值；
——AChE酶与农残反应的预孵时间为7min；探针与酶的反应时间为12min，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限；物转化率不超过35％时终止反应；
——反应结束后，加入200µL乙腈作为终止剂，使最后的荧光强度检测操作更简便。
间接地定量体系中敌敌畏含量的方法，包括以下步骤：
S1.将萃取的溶液稀释100倍，使待测溶液中农药的含量为0.1~6μg/L；
S2.向稀释后的萃取溶液中，加入酶剂，在恒温混匀仪37oC下，预孵反应7min；
S3.取预孵溶液加入比色皿，再加入含荧光探针的DMSO溶液，在恒温混匀仪37oC下，震荡反应；向比色皿加入终止剂，混匀，得到1号待测溶液；
S4.启动荧光检测仪；将比色皿放入检测仪，在手机APP上读取数据，保存。
S5.酶活性抑制率计算公式：抑制率（%）=[(A0–A1）/A0]·100
式中，A0为无农药的空白相对荧光强度，A1为含农药的测试组相对荧光强度；
S6.根据相对荧光强度计算抑制率，再根据抑制率计算出萃取液中敌敌畏的含量；
S7.根据测得的萃取液中敌敌畏的含量乘上稀释倍数200，得到果蔬样品中敌敌畏的含量。
该探针底物本身没有荧光，而其水解产物具有荧光属性，采用荧光快速检测仪实现产物及底物的快速灵敏检测；所述荧光检测条件为：激发波长465nm，在550～560nm进行荧光发射谱的检测。
特异性检测敌敌畏的原理为：以上方法适用于检测体系中敌敌畏加标量与其他农药加标量相同时，敌敌畏减弱的荧光强度（I敌敌畏）比其他农药（I其他农药）要低100倍以上，通过对农残萃取液稀释100倍，其他农药浓度减低至无法测定程度，进而可以减除其他农药对AChE的影响，实现特异性检测敌敌畏。
有益效果：基于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE，来源于鸭血提取）活性的特异性抑制作用，应用超高灵敏荧光素荧光探针检测其抑制程度。在这个检测体系中敌敌畏加标量相同时，敌敌畏减弱的荧光强度（I敌敌畏）比其他农药（I其他农药）要低100倍以上，显示即使敌敌畏含量低于其他农药100倍时，也可定量检测其残留量。通过对农残萃取液稀释100倍，减除其他农残对AChE的影响，实现特异性检测敌敌畏农残范围10~200μg/L，检测标准曲线误差率R2>0.98；生鲜果蔬的加标回收率达到80-110%。
说明书附图
图1是农药检测的机理图。
图2是敌敌畏的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：荧光探针底物式-1合成
合成路线：
中间体b的合成：称取2.00g荧光素a，1.71gCs2CO3，加入10mLDMF溶解，室温下搅拌，滴加0.75g（0.75mL）CH3I。反应结束后，加入5%的氢氧化钠溶液，用DCM萃取，有机相用饱和食盐水洗涤后，蒸留除去溶剂，得中间体b1.55g，产率71.4%。1HNMR（500MHz,CDCl3）δ8.24（d,J=7.9Hz,1H）,7.74（t,J=7.2Hz,1H）,7.67（t,J=7.6Hz,1H）,7.31（d,J=7.5Hz,1H）,6.97（d,J=2.3Hz,1H）,6.87（dd,J=18.1,9.3Hz,1H）,6.74（dd,J=8.9,2.3Hz,1H）,6.54（d,J=9.7Hz,1H）,6.47（s,1H）,3.92（s,2H）,3.64（s,1H）。
中间体c的合成：取中间体b0.800g，加入20mLCH3OH，10%的NaOH溶液5mL，室温下搅拌6h水解。蒸馏除去甲醇后，用10mL（36%浓盐酸:水=1:11）中和，用DCM萃取，除去DCM得粗品。用硅胶层析柱纯化（展开剂DCM:CH3OH=40:1），得中间体c0.40g，产率52%。1HNMR（500MHz,MeOD）δ8.02（d,J=7.7Hz,1H）,7.79（td,J=7.5,1.1Hz,1H）,7.74-7.69（m,1H）,7.22（d,J=7.7Hz,1H）,6.87（d,J=1.7Hz,1H）,6.75-6.64（m,3H）,6.57（dt,J=8.7,5.5Hz,2H）,4.89（s,8H）,3.86（s,3H）,3.34（dd,J=11.3,9.7Hz,6H）。
探针式-1的合成：取中间体c40mg，加入10滴三乙胺及0.125mL乙酰氯，冰浴下搅拌，反应结束后，用DCM萃取，蒸馏除去DCM后，用硅胶层析柱纯化（展开剂DCM:CH3OH=50:1），得荧光探针式-117mg，产率37.8%。1HNMR（500MHz,CDCl3）δ8.03（d,J=7.5Hz,1H）,7.66（ddt,J=14.0,7.4,3.8Hz,1H）,7.18（d,J=7.6Hz,1H）,7.07（t,J=7.0Hz,1H）,6.88-6.75（m,1H）,6.70（d,J=8.8Hz,1H）,6.63（dd,J=8.8,2.5Hz,1H）,5.30（s,1H）,3.84（s,2H）,2.49-2.19（m,2H）。
实施例2：果蔬中农残萃取方法：
蔬菜、水果的可食用部分，称取试样0.3g于2mL的离心管中，加入1.5mL萃取液（乙酸乙酯/丙酮=9:1），在震荡混合器萃取5min。离心后，取100μL上清液至2mL离心管中，吹干。加入0.6mLPBS（100mM,pH=7.4）溶解，待测。
实施例3：农残检测通用方法
1. 从前处理制备得到的0.6mL待测萃取剂（或加标农药的PBS溶液，或PBS溶液）取6µL，再用PBS（100mM,pH=7.4）稀释100倍至600µL；
2.向稀释后的萃取液300µL加入5µL酶剂（从鸭血提取，AChE蛋白含量2.3mg/ml），在恒温混匀仪37oC下，预孵反应7min；
3. 取预孵溶液300µL，加入比色皿，再加入含荧光探针（非特指为式-1荧光探针）的DMSO溶液30µL，在恒温混匀仪37oC下，震荡反应12min；
4. 向比色皿加入200µL终止剂B，混匀，待测；
5. 启动荧光检测仪，与手机APP链接；根据荧光探针不同，设置相应的激发波长和发射接收波长；
6. 将比色皿放入检测仪，在手机APP上读取数据，保存；
7.酶活性抑制率计算公式：抑制率（%）=[(A0–A1）/A0]·100
式中，A0为空白（无农药）相对荧光强度，A1为测试组（含农药）相对荧光强度。
实施例4：本申请中荧光探针式-1与NDRO-1两种荧光探针底物对AChE酶活性对比
按照实施例2操作方法，检测体系中无农药加标，只改换探针底物的种类和浓度，其他检测条件相同。
本申请中荧光探针底物：
本申请中探针式-1与NDRO-1相比，对AChE酶结合能力和催化活性等动力学常数都有较大的提高。反应后的探针式-1的相对荧光强度是NDRO-1的2.5倍，显示了更高的灵敏性。探针式-1的结构和性能特点，能充分发挥特异性检测敌敌畏农残方法的优势。
实施例5：不同农药检测限比较
按照实施例2操作方法，检测体系中不同浓度加标敌敌畏、甲胺磷、呋喃丹，探针底物为式-1，其他检测条件相同。
在PBS（100mM，pH=7.4）加标农药0.1mg/L检测中，甲胺磷或呋喃丹对荧光强度减弱很少，敌敌畏对荧光强度减弱至仪器的最低检测限，显示在相同农药含量下敌敌畏比其他农药对荧光强度减弱100倍左右。
实施例6：敌敌畏检测标准曲线
根据标准曲线的测定方法，得到抑制率（%）与敌敌畏浓度之间的标准曲线为y=12.955x+14.893，R2=0.9945，x为敌敌畏的浓度；敌敌畏在PBS缓冲液中的检测范围为0.1~6.0µg/L；再根据检测方法的总稀释倍数200，换算得到果蔬样品的检测范围为0.02~1.2mg/kg。该检测范围可以满足国标对果蔬中敌敌畏的限量要求（国家标准GB/T2763-2019，食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量，敌敌畏：0.1~0.5mg/kg）。
实施例7：混合农药加标的影响
在PBS（100mM，pH=7.4）中加标，敌敌畏、敌敌畏+甲胺磷、敌敌畏+呋喃丹、敌敌畏+甲胺磷+呋喃丹,再用PBS（100mM，pH=7.4）稀释100倍后，按实施例3检测，根据抑制率计算结果再乘以总稀释倍数100。
通过以上实验可以看出，甲胺磷、呋喃丹等农药含量对该探针检测敌敌畏的含量影响较小，该方法可以专用于敌敌畏含量的检测。
实施例8：敌敌畏农残回收率测试
将敌敌畏的丙酮溶液，按0.10mg/kg量，喷洒在0.30g果蔬上,晾干后，按照实施例2萃取，萃取液再用PBS（100mM,pH=7.4）稀释100倍，最后按照实施例3检测，根据抑制率计算结果再乘以总稀释倍数200。
本发明的检测方法，对果蔬中敌敌畏农残回收率达到行业70~110%标准。
Claims (6)
1.一种从鸭血提取的乙酰胆碱酯酶活性超高灵敏检测荧光探针，其特征在于：该探针的底物的酯键可被 AChE 快速水解为相应产生强烈的荧光产物；该底物为荧光素类衍生物，其结构通式如式-1 所示：
2.根据权利要求 1 所述的荧光探针在敌敌畏农残检测中的应用，其特征在于：该探针作为AChE 的水解底物，可利用其水解反应活性，通过定量检测水解产物的生成量来测定AChE 的活性。
3.根据权利要求 2 所述的荧光探针在敌敌畏农残检测中的应用，其特征在于：所述酶源为从鸭血提取的乙酰胆碱酯酶单酶。
4.根据权利要求2 所述的荧光探针在敌敌畏农残检测中的应用，其特征在于：该探针用于检测被敌敌畏农残抑制后的酶活性，间接地定量体系中的敌敌畏含量。
5.根据权利要求4所述的的荧光探针在敌敌畏农残检测中的应用，其特征在于：所述间接地定量体系中敌敌畏含量的方法，包括以下步骤：
S1.将萃取的溶液稀释100倍，使待测溶液中农药的含量为0.1~6 μg/L；
S2.向稀释后的萃取溶液中，加入酶剂，在恒温混匀仪37 oC下，预孵反应 7 min；
S3.取预孵溶液加入比色皿，再加入含荧光探针的DMSO溶液，在恒温混匀仪37 oC下，震荡反应；向比色皿加入终止剂，混匀，得到待测溶液；
S4.启动荧光检测仪；将比色皿放入检测仪，在手机APP上读取数据，保存；
S5.酶活性抑制率计算公式：抑制率（%） = [(A0 – A1）/A0]·100
式中， A0为无农药的空白相对荧光强度，A1为含农药的测试组相对荧光强度；
S6.根据相对荧光强度计算抑制率，再根据抑制率计算出萃取液中敌敌畏的含量；
S7.根据测得的萃取液中敌敌畏的含量乘上稀释倍数200，得到果蔬样品中敌敌畏的含量。
6.根据权利要求 5 所述的荧光探针在敌敌畏农残检测中的应用，其特征在于：该探针底物本身没有荧光，而其水解产物具有荧光属性，采用荧光快速检测仪实现产物及底物的快速灵敏检测；所述荧光检测条件为：激发波长 465 nm，在 550～560 nm 进行荧光发射谱的检测。
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