CN113433103A

CN113433103A - 一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法

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Publication number: CN113433103A
Application number: CN202110724091.3A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 王冬伟; 周志强; 刘东晖
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113433103B

Abstract

本发明提供了一种检测2,4‑二氯苯氧乙酸的方法，属于农药检测技术领域，包括将碱性磷酸酶溶液与样品混合、静置，得到静置液；将静置液与焦磷酸钠溶液、Tris‑HCl缓冲液混合后进行反应，得到反应液；将反应液与硝酸铈溶液混合、振荡，得到振荡液，测定所述振荡液的荧光发射光谱，得到最大荧光强度，将所述最大荧光强度转化为酶抑制率；将酶抑制率代入线性方程，得到样品中2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度。采用本发明提供的方法不需制备检测探针，45min就能得到检测结果；线性方程的线性范围为2.5～200μg/L，检测限为0.98μg/L。

Description

一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法

技术领域

本发明属于农药检测技术领域，尤其涉及一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法。

背景技术

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一种多用途农用化学品，可用作植物生长调节剂或除草剂。2,4-D的生物活性随浓度高低有所不同：低浓度时2,4-D具有类似于植物内源生长素吲哚乙酸的活性，可促进植物生长，还可防止落果；而高浓度时2,4-D对阔叶杂草具有灭活作用。2,4-D具有价格低廉，施药量较少等优点，广泛应用于农业生产。2,4-D虽然被分类为低毒农药(大鼠急性经口半数致死量：639～764mg/kg)，但研究发现2,4-D可能具有多种毒性效应，包括致癌性、神经毒性、生殖毒性等。2,4-D的衍生物2,4-滴丁酯，因具有“2,4-滴丁酯易挥发，使用时容易造成登记作物和邻近作物药害事故；对水生生物急性毒性为高毒，慢性毒性表现为存活率、生殖能力下降。

目前，检测农产品中2,4-D残留的标准方法为色谱法，包括气相色谱法、液相色谱法、色谱-质谱联用法等。而2,4-D可抑制ALP活性，已有多种基于ALP的生物传感器用于检测2,4-D。然而，已有的生物传感器需要进行耗时较长的准备过程，例如电极制备或检测探针合成，这一过程往往较为繁琐且耗时，与农药残留快速检测的需求较不匹配。因此，开发更加简单快捷的检测技术，可推动ALP在2,4-D快速检测领域的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法，采用本发明提供的方法能够简单快速的检测样品中2,4-二氯苯氧乙酸的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法，包括以下步骤：

1)将碱性磷酸酶溶液与样品混合、静置，得到静置液；

2)将所述步骤1)得到的静置液与焦磷酸钠溶液、Tris-HCl缓冲液混合后进行反应，得到反应液；

3)将所述步骤2)得到的反应液与硝酸铈溶液混合、振荡，得到振荡液，测定所述振荡液的荧光发射光谱，得到最大荧光强度，将所述最大荧光强度转化为酶抑制率；

所述酶抑制率＝(FD-F0)/(F-F0)×100，FD代表存在2,4-二氯苯氧乙酸时，荧光发射光谱中的最大荧光强度，F0代表不存在2,4-二氯苯氧乙酸时，荧光发射光谱中的最大荧光强度，F代表荧光发射光谱中的最大荧光强度；

4)将所述步骤3)得到的酶抑制率代入线性方程，得到样品中2,4-二氯苯氧乙酸的浓度；

所述线性方程为：酶抑制率＝37.22×log₁₀c-3.2，c的单位为μg/L。

优选的，所述步骤1)碱性磷酸酶溶液与样品的体积比为1:5。

优选的，所述碱性磷酸酶溶液的浓度为100U/mL。

优选的，所述步骤1)静置的条件包括：静置的时间为15min，静置的环境温度为37℃。

优选的，所述步骤2)焦磷酸钠溶液与Tris-HCl缓冲液、碱性磷酸酶溶液的体积比为2:4:1；

所述焦磷酸钠溶液的浓度为1mM；

所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为8.0。

优选的，所述步骤2)反应的条件包括：反应的环境温度为37℃，反应的时间为25min。

优选的，所述步骤3)硝酸铈溶液与碱性磷酸酶溶液的体积比为4:1。

优选的，所述硝酸铈溶液的浓度为0.5mM。

优选的，所述步骤3)振荡的条件包括：振荡的转速为500rpm，振荡的时间为5min。

优选的，所述步骤3)测定振荡液的荧光发射光谱的荧光激发波长为300nm。

本发明提供了一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法，本发明检测2,4-二氯苯氧乙酸的机理是：铈离子与焦磷酸根离子通过自组装作用生成铈-焦磷酸根配位聚合物(Ce-PPi)，相比于铈离子，Ce-PPi荧光强度明显增强。而碱性磷酸酶(ALP)可催化焦磷酸根离子(PPi)水解，减少Ce-PPi的生成，使溶液荧光强度降低。而2,4-D抑制ALP活性，减少PPi的水解，使Ce-PPi含量提高，荧光强度上升。基于2,4-D对ALP-Ce-PPi体系荧光强度的调节作用，开发出了2,4-D的荧光光谱检测方法。

根据本发明实施例的结果可知：采用本发明提供的方法不需制备检测探针，45min就能得到检测结果；线性方程的线性范围为2.5～200μg/L，检测限为0.98μg/L。

附图说明

图1为不同浓度2,4-D存在时Ce-PPi-ALP体系的荧光发射光谱；

图2为2,4-D浓度对数与IE之间的线性方程；

图3为ALP浓度、静置时间、反应温度和反应时间对检测结果的影响结果；

图4为Ce-PPi-ALP体系对2,4-D的选择性结果，其中1-10分别为2,4-D、钠离子、钙离子、锌离子、维生素C、葡萄糖、甘氨酸、莠去津、异丙甲草胺、百草枯。

具体实施方式

1)将碱性磷酸酶溶液与样品混合、静置，得到静置液；

本发明将碱性磷酸酶溶液与样品混合、静置，得到静置液。

在本发明中，所述样品优选包括自来水、食品和蔬菜；所述食品优选包括大米，所述蔬菜优选包括大白菜。本发明对所述样品的处理没有特殊限定，采用常规样品处理方式即可，在本发明具体实施方式中优选按照《Fei Qu,Yang Sun,Shuxian Guo,Hang Yan,Jinmao You.Fluorescent Detection of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid in FoodSamples Based on Covalent Organic Frameworks and MnO₂ Nanosheets.FoodAnalytical Methods,2020,13(10):1842-1851.》文献中第三页的方法进行处理。

在本发明中，所述碱性磷酸酶溶液与样品的体积比优选为1:5。在本发明中，所述碱性磷酸酶溶液的浓度优选为100U/mL。本发明优选使用Tris-HCl缓冲液(浓度：50mM，pH＝8.0)为溶剂，来配制碱性磷酸酶溶液。在本发明中，所述碱性磷酸酶催化焦磷酸根离子水解，可以与铈离子反应的焦磷酸根离子减少，从而Ce-PPi生成减少，荧光强度降低。在本发明中，所述碱性磷酸酶一下简称为ALP。

在本发明中，所述静置的条件优选包括：静置的时间优选为15min，静置的环境温度优选为37℃。在本发明中，所述静置是为了让2,4-D与ALP充分作用，使酶活性的抑制效果达到最佳。

本发明将得到的静置液与焦磷酸钠溶液、Tris-HCl缓冲液混合后进行反应，得到反应液。

在本发明中，所述焦磷酸钠溶液与Tris-HCl缓冲液、碱性磷酸酶溶液的体积比优选为2:4:1。在本发明中，所述焦磷酸钠溶液的浓度优选为1mM，所述焦磷酸钠与铈离子反应，生成Ce-PPi。在本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为50mM，pH值为8.0。

在本发明中，所述反应的条件优选包括：反应的环境温度优选为37℃，反应的时间优选为25min。所述反应的目的是ALP催化焦磷酸根离子水解的反应充分进行。

本发明将得到的反应液与硝酸铈溶液混合、振荡，得到振荡液，测定所述振荡液的荧光发射光谱，得到最大荧光强度，将所述最大荧光强度转化为酶抑制率；所述酶抑制率＝(FD-F0)/(F-F0)×100，FD代表存在2,4-二氯苯氧乙酸(以下简称2,4-D)时，荧光发射光谱中的最大荧光强度，F0代表不存在2,4-二氯苯氧乙酸时，荧光发射光谱中的最大荧光强度，F代表荧光发射光谱中的最大荧光强度。

在本发明中，所述硝酸铈溶液与碱性磷酸酶溶液的体积比优选为4:1。在本发明中，硝酸铈溶液的浓度优选为0.5mM。在本发明中，所述硝酸铈与焦磷酸根离子反应，生成Ce-PPi。在本发明中，所述硝酸铈优选为硝酸铈六水合物。

在本发明中，所述振荡的条件优选包括：振荡的转速优选为500rpm，振荡的时间优选为5min。本发明优选在室温下进行振荡，振荡后铈离子与焦磷酸根离子充分反应生成Ce-PPi。

在本发明中，测定振荡液的荧光发射光谱的荧光激发波长优选为300nm。

本发明将得到的酶抑制率代入线性方程，得到样品中2,4-二氯苯氧乙酸的浓度；所述线性方程为：酶抑制率＝37.22×log₁₀c-3.2，c的单位为μg/L。

在本发明中，所述线性方程的获取优选包括：将样品替换为一系列浓度的2,4-二氯苯氧乙酸溶液，其余步骤同上在此不再赘述。本发明优选使用超纯水配制不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸溶液，浓度分别为：50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和4000μg/L。在本发明中，所述线性方程检测2,4-D浓度的线性范围：0.5-100μg/L，检测限为0.046μg/L。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

合成铈-焦磷酸根配位聚合物荧光纳米粒子(简称Ce-ppi)：

首先以Tris-HCl缓冲液(浓度：50mM，pH＝8.0)为溶剂，配制浓度为100U/mL的碱性磷酸酶(简称ALP)溶液。以超纯水为溶剂配制一系列浓度(50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、4000μg/L)的2,4-二氯苯氧乙酸(简称2,4-D)溶液，用于建立标准曲线法定量检测2,4-D。

取5μLALP溶液于2mL塑料离心管中，再向离心管中加入25μL 2,4-D溶液并将两者充分混合，静置于37℃环境中15min。之后，向离心管中加入10μL浓度为1mM的焦磷酸钠溶液与20μL浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，充分混合后，静置于37℃环境中反应25min。反应完毕后，向离心管中加入20μL浓度为0.5mM的硝酸铈溶液，并用超纯水将溶液总体积稀释至500μL。溶液在室温500rpm振荡5min后，装入比色皿中测定荧光发射光谱(荧光激发波长：300nm)，记录最大荧光强度。将不同浓度2,4-D存在时溶液的最大荧光强度转化为酶抑制率(IE，％)，IE＝(FD-F0)/(F-F0)×100(式中，FD和F0分别代表存在或不存在2,4-D时，镧系金属配位聚合物(铈+焦磷酸根离子)-ALP体系荧光发射光谱中的最大荧光强度；F代表镧系金属配位聚合物荧光发射光谱中的最大荧光强度。其中，F＝9362.2，F0＝4128.9，F和F0为固定值)建立IE与2,4-D浓度对数间的线性方程(结果如图1和2)，即可通过标准曲线法实现2,4-D的定量检测。

线性方程为：酶抑制率＝37.22×log₁₀c-3.2，c的单位为μg/L，线性范围：2.5～200μg/L，检测限为0.98μg/L。

实施例2

采用与实施例1相同的方法考察ALP浓度、静置时间、反应温度和反应时间对检测结果的影响，结果如下：

当ALP浓度达到1.25U/mL时，再提高ALP浓度，Ce-PPi的荧光强度不会发生变化，表明此时PPi反应完全(图3中的A)。因此，选择1U/mL为ALP浓度。

静置时间25min后，Ce-PPi的荧光强度不再变化(图3中的B)。因此，选择25min为ALP与PPi混合反应的时间。

反应温度为37℃时，Ce-PPi的荧光强度达到最低值(图3中的C)。因此，选择37℃为反应温度。

从图3中的D中可以看出，2,4-D与ALP混合反应的时间为15min时，Ce-PPi-ALP体系的荧光强度增强程度最大。而Ce-PPi-ALP体系的荧光强度与ALP的催化活性呈负相关，表明在与2,4-D混合反应15min之后，ALP的催化活性受到了最大程度的抑制。因此，选择15min为2,4-D与ALP混合反应的时间。

实施例3

检测样品试验方法：

采用添加回收法验证方法检测实际样品(自来水、大米与大白菜)中2,4-D残留的能力。自来水取自中国农业大学理学院内，过0.22μm滤膜后稀释2,4-D标准溶液，分别配制含不同浓度2,4-D(0.05、0.2或0.1mg/L)的水样。检测时，取50μL含2,4-D的水样，其余检测步骤与检测标准溶液中2,4-D的步骤相同(实施例1)。大米与大白菜样品购买自本地超市，样品中添加的2,4-D残留的提取方法参考上述文献报道，具体步骤如下：准确称取1g捣碎的样品于10mL塑料离心管中，加入10μL 2,4-D溶液(浓度分别为5、20或100mg/L)静置30min。之后向离心管中加入2mL二氯甲烷，混合均匀后超声30min。之后涡旋2min后，4000rpm离心5min，上清液过0.22μm滤膜后氮吹至干。向离心管中加入1mL超纯水，超声至溶液透明无沉淀存在，得到样品提取液。检测时，取50μL提取液，其余检测步骤与检测标准溶液中2,4-D的步骤相同。

检测样品实施例：

回收率(％)＝测定浓度/添加浓度×100

相对标准偏差(RSD)：指三次平行实验回收率的相对标准偏差

表1检测实际样品中2,4-D残留的回收率与RSD

注：大白菜与大米样品中2,4-D添加浓度与测定浓度为mg/kg，自来水样品中2,4-D添加浓度与测定浓度为mg/L。

检测方法的选择性：为了验证方法对于目标物2,4-D的选择性，选取几种金属离子(钠离子、钙离子、锌离子)、生化物质(维生素C、葡萄糖、甘氨酸)与使用量较大的农药(莠去津、异丙甲草胺、灭多威、戊唑醇、嘧菌酯)，代替2,4-D加入Ce-PPi-ALP体系，以同样的操作步骤测定每种物质对Ce-PPi-ALP体系荧光强度的影响。所有非目标物浓度均为500μg/L。

选择性实验结果：图4展示了多种选取的非目标物质对Ce-PPi-ALP体系荧光强度的影响，可见即使非目标物质的浓度是2,4-D的10倍(500μg/L，2,4-D浓度是50μg/L)，其对Ce-PPi-ALP体系荧光强度依然不会产生显著的影响，表明该检测方法对2,4-D的选择性良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将碱性磷酸酶溶液与样品混合、静置，得到静置液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)碱性磷酸酶溶液与样品的体积比为1:5。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶溶液的浓度为100U/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)静置的条件包括：静置的时间为15min，静置的环境温度为37℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)焦磷酸钠溶液与Tris-HCl缓冲液、碱性磷酸酶溶液的体积比为2:4:1；

所述焦磷酸钠溶液的浓度为1mM；

所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为8.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)反应的条件包括：反应的环境温度为37℃，反应的时间为25min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)硝酸铈溶液与碱性磷酸酶溶液的体积比为4:1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述硝酸铈溶液的浓度为0.5mM。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)振荡的条件包括：振荡的转速为500rpm，振荡的时间为5min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)测定振荡液的荧光发射光谱的荧光激发波长为300nm。