CN111504971A - 基于目标响应式3d打印模型与智能手机集成的2,4-二氯苯氧乙酸现场定量检测平台 - Google Patents

基于目标响应式3d打印模型与智能手机集成的2,4-二氯苯氧乙酸现场定量检测平台 Download PDF

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Abstract

一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)现场定量检测平台，属于生物传感器技术领域。本发明基于所制备的碳点(CDs)/CoOOH复合材料，碱性磷酸酶可以催化底物L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐产生还原性强的抗坏血酸，有效地将CoOOH纳米片还原为钴离子进而分解CDs/CoOOH复合材料。通过引入2,4‑D以调控CDs/CoOOH复合材料的荧光响应信号来实现对其定量检测。基于此，进一步结合3D打印模型和智能手机应用程序实现荧光图像数据的采集与分析。本发明具有低背景、携带方便、成本低廉等优势，能够对2,4‑D进行现场检测，为食品安全和生命健康的便携式监测提供了新的方法。

Description

基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-二氯苯氧 乙酸现场定量检测平台
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-二氯苯氧乙酸现场定量检测平台。
背景技术
2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一种苯氧乙酸类除草剂，同时也作为一种植物生长调节剂，在农业生产和环境防疫中应用广泛。然而，该物质为半衰期20～312天的中持久性化学物质，被认为可能对人类致癌的化合物。2,4-D的滥用及处理方法不当将会对众多水生和哺乳动物造成器官损伤、神经行为发育迟缓等危害，所造成的环境和生命安全隐患已经成为公众关注的焦点。目前实验室常规的农药分析方法如高效液相色谱法、质谱法和表面增强拉曼散射法等，可以实现准确、灵敏的分析。然而，由于实验室大型仪器繁琐的操作、耗时的分析以及对外部电源的需求等缺点，在一定程度地限制了这些方法的应用，不能满足农药现场检测的要求。因此，建立一种易操作、低成本、便携化的农药检测平台对环境及生命安全具有重要意义。
近年来，研究人员开发用于检测农药的灵敏、可靠和便携式传感器在现场检测应用方面做出了巨大努力。例如，所建立的基于颜色变化的试纸条方法，具有操作简单、易于携带的优点，但是该方法对于目标物的分析仅限于定性识别，不能识别低浓度农药存在时的细微颜色变化，其准确度也较低。此外，由于尺寸小、可编程、易操作、获取图像分辨率高等优点，基于智能手机的传感分析技术成为实现快速现场检测领域中极具吸引力的方式。尽管该方法获取分析数据的便携性及准确度都得到了有效的提高，然而在数据分析处理方面仍然需要计算机辅助，这对于实现现场检测仍然是一个挑战。另外，环境因素如样品与相机的相对位置，光源强度等，都会对图像的采集和分析产生明显的影响，导致检测重复性差、准确度低等结果。因此，基于现有的便携化检测设备，研发稳定性好、准确度高的便携式生物传感器以建立新型农药检测方法，将为环境安全监测和生命安全监测提供新的视角。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有农药检测技术中存在的测试稳定性差、测试方法繁琐、携带不方便和选择性较低等问题，提供一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台(简称为3D打印模型-智能手机检测平台)，该平台可以准确、简便、高选择性地检测2,4-D的含量。
本发明所述的一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台，其建立方法如下：
(1)首先，将0.8～1.5g柠檬酸和1.5～2.5g尿素加入到5.0～15.0mL N,N-二甲基甲酰胺溶液(≥99.9％)中，搅拌5～15min后放入聚四氟乙烯反应釜，在150～170℃下恒温反应5～8h，冷却后分别经过碱洗(20mL、1.0～1.5mol L-1氢氧化钠水溶液)、酸洗(25mL、4～6wt％盐酸溶液)、水洗后在15000～18000r min-1的转速下离心5～15min，冷冻干燥后得到碳点(CDs)；
其次，将3.0mL、0.75～1.25mol L-1的氢氧化钠水溶液与10.0mL、8.0～12.0mmolL-1的六水合氯化钴水溶液混合后超声1～3min，再将500μL、0.6～1.0mol L-1的次氯酸钠水溶液加入其中后超声10～20min，以5000～8000r min-1的转速离心5～10min后得到CoOOH纳米片浓度0.010～0.050mg mL-1的CoOOH纳米片水溶液；
最后，将5.0mL、0.3mg mL-1的CDs水溶液与5.0mL、0.010～0.050mg mL-1的CoOOH纳米片水溶液混合并搅拌8～15min，然后将混合溶液以15000～18000r min-1的转速离心5～15min，将所得沉淀重新溶于10mL去离子水中得到CDs/CoOOH复合材料水溶液；
(2)在比色皿中，将50μL、0.1～15.0mg L-1的2,4-D水溶液和50μL、6.0～8.0U L-1碱性磷酸酶(ALP)水溶液混合后在37℃下孵育5～60min，实现2,4-D对ALP活性的抑制；随后，向上述混合液中加入120μL、20～160μmol L-1的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐水溶液和100μL pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，在37℃下孵育5～30min后，将160μL步骤(1)制备得到的CDs/CoOOH复合材料水溶液加入其中混合；25℃下平衡5～10min后，将比色皿放入3D打印模型中，在532nm激光下，用手机记录不同2,4-D浓度下对应的比色皿溶液的红色荧光图片。可以观察到，随着农药2,4-D浓度的增加，获取到的红色荧光图片的颜色逐渐变暗(图1)。
3D打印模型是由软件SolidWorks完成建模设计，使用聚乳酸(PLA)黑色耗材，并由FlashForge 3D打印机制作完成。其外观尺寸为120.0毫米(长)×78.0毫米(宽)×34.5毫米(高)，可将激光器、比色皿、滤光片、智能手机放置其中，并固定相互间的位置。3D打印模型可供放置的配件参数如下：
激光器：尺寸为20毫米(直径)×60毫米(长)，作为定量检测平台的光源，激光波长为532nm。
比色皿：尺寸为10毫米(长)×10毫米(宽)×40毫米(高)，作为样品池盛放样品溶液。
滤光片：尺寸为10毫米(长)×10毫米(宽)，作用是屏蔽环境光和激发光的干扰。
智能手机：型号为努比亚Z17(配有2300万后置摄像头)，作用是采集和分析荧光图片。
激光器与比色皿的间距为15毫米，位于手机摄像头前的滤光片与比色皿之间的间距为2毫米。激光器发射出的光垂直打到装有待测样品的比色皿中，在经滤光片屏蔽环境光和激发光后，智能手机的摄像头可以捕捉到待测样品的荧光图像。滤光片放置在智能手机摄像头前，光路从激光器到比色皿再到手机摄像头呈直角型。3D打印模型的内部构造可将激光器、比色皿、滤光片、智能手机放置在固定位置，有效避免了图像获取时因位置不固定及环境光带来的外在干扰。
(3)使用自编写的智能手机应用程序(APP)分析处理步骤(2)获取到的不同2,4-D浓度下对应的图片。利用该APP内置的图像处理程序，将获取的颜色信息转化为灰度值，建立灰色值与农药浓度的关系曲线，从而得到本发明所述的基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台；再通过测量待测样品中未知浓度的农药灰度值，由智能手机APP分析得出农药浓度值，从而完成待测样本浓度的测试。
APP通过开发工具Android Studio完成设计。主要功能分为：Photo-取样拍照；File-打开待测样本图像所在目录；Information-相关APP信息说明如版权信息等。
主要有如下模块：
Camera Activity：使用Take Picture功能完成拍照(图片像素为3024×3024)，并将图像存入指定位置。
Data：首先，通过getPixe方法提取样本图像的RGB值，即红(R)、绿(G)、蓝(B)三个通道的颜色。为了屏蔽由于环境因素的影响，以(1353，2041)像素点为对称中心，选取像素为125×125的矩形区域为分析区域，从该分析区域中选取25个像素点进行分析，其中所选取的各像素点之间的距离为5个像素。计算每个像素点的RGB值，然后根据后面所述的公式转换为对应的灰度值，将所得灰度值从小到大依次排列，选取中间的三个数值的平均值作为最终的灰度值。
RGB值转为灰度值遵循以下算法Gray＝0.299R+0.587G+0.114B，为了避免低速的浮点运算，采用整数运算和位运算进行优化Gray＝(313524R+615514G+119538B)>>20。
Fore：根据若干组灰度值和对应农药浓度值，运用回归分析曲线拟合并计算拟合优度(R2)。
功能的实现：
Photo：采用Camera Activity模块。
File：通过输入的数据得到所需图像的路径并访问。
Analysis：采用Data模块得到每个样本的灰度值，再根据Fore模块得到的拟合曲线，得到样本中的农药浓度。
该APP具有内置的图像处理程序，可将获取的颜色信息转化为灰度值，建立灰度值与2,4-D浓度的线性关系，从而得到基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台。
本发明机理如下：
基于所制备的CDs/CoOOH复合材料，ALP可以催化水解底物L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐产生还原性较强的抗坏血酸，其可以有效地将CoOOH纳米片还原为钴离子进而分解CDs/CoOOH复合材料。2,4-D作为ALP的抑制剂可以抑制其催化底物产生抗坏血酸，以减少CDs/CoOOH复合材料的分解。通过引入2,4-D以调控CDs/CoOOH复合材料的荧光响应信号来实现对其定量检测。基于此，将待测样本放置在3D打印模型的比色皿槽中，进一步结合智能手机对图像数据进行采集及分析，得到待测样品图像对应的灰度值，根据灰度值与2,4-D浓度的线性关系，从而计算出样本中2,4-D的浓度，以此来实现对农药的现场检测。
本发明具有以下特点：
(1)本发明制备的基于智能手机的2,4-D含量检测平台具有低背景、高选择性等优点，通过调控CDs/CoOOH复合材料的荧光响应对2,4-D进行定量分析。
(2)本发明构建过程成本低、稳定性好、简便易操作等优点。结合智能手机采集及分析图像数据，实现对2,4-D进行现场检测。
本发明基于智能手机的2,4-D含量检测平台在提高农药检测的选择性及构建便携式检测设备以实现即时检验方面显现出巨大的潜力。
附图说明
图1：实施例2中待测样本图像颜色与农药含量的关系示意图；
图2：实施例3中手机分析的灰度值(Smartphone Readout)与2,4-D浓度的线性关系图；
图3：实施例3中3D打印模型-智能手机检测平台检测2,4-D示意图。
具体实施方式
实施例1：CDs/CoOOH复合材料的制备
首先将1.0g柠檬酸和2.0g尿素加入到10.0mL N,N-二甲基甲酰胺溶液(≥99.9％)中，搅拌10min后，在160℃下恒温反应6h，冷却后分别经过碱洗(20mL、1.2mol L-1氢氧化钠水溶液)、酸洗(25mL、5wt％盐酸溶液)、水洗后离心、冷冻干燥后得到CDs；其次，将3.0mL、1.0mol L-1的氢氧化钠水溶液与10.0mL、10.0mmol L-1的六水合氯化钴水溶液混合并超声2min，将500μL、0.9mol L-1的次氯酸钠水溶液加入并超声15min，离心后得到CoOOH纳米片水溶液。将5.0mL 0.3mg mL-1的CDs水溶液与5.0mL CoOOH纳米片水溶液(0.025mg mL-1)混合并搅拌10min，离心后得到CDs/CoOOH复合材料水溶液。
实施例2：智能手机辅助图像的获取
将50μL的2,4-D水溶液(1.0mg L-1)和50μL ALP水溶液(7.0U L-1)混合后在37℃下孵育30min，实现2,4-D对ALP活性的抑制；随后，向上述混合液中加入120μL的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐水溶液(100μmol L-1)和100μL pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，在37℃下孵育10min后，将实施例1中制备的CDs/CoOOH复合材料水溶液(160μL)加入混合均匀；25℃下平衡10min后，将比色皿放入3D打印模型中，在532nm激光下得到本实施例2,4-D浓度下对应的红色荧光图片。在本例的2,4-D浓度下，样本对应的图像手机读取灰度值为42.57。
实施例3：APP对2,4-D检测的应用
根据实施例2的方法可以制备不同浓度的2,4-D(0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、12.0和15.0mg L-1，得到不同浓度下对应的灰度值分别是46.46、44.11、42.57、40.86、35.34、28.93、22.20、18.62、12.29。用肉眼即可观察到随着2,4-D的增加，比色皿内溶液的颜色显现出从深到浅的变化，使用智能手机自制的APP获取样本图像，该APP具有内置的图像处理程序，可将相应的图像信息转换为灰度值。根据若干组灰度值和对应农药浓度值，运用回归分析拟合出关系曲线。从而得到了灰度值与2,4-D浓度的线性关系，从而实现对2,4-D进行现场手持化检测(如图2、图3所示)；
实施例4：对实际样本中2,4-D的检测
表1：基于智能手机和紫外可见方法检测实际样品中的2,4-二氯苯氧乙酸
Figure BDA0002486286290000061
利用本发明开发的3D打印模型-智能手机检测平台，采用标准加入法，对环境样品和生物样品中的2,4-D进行检测，探究其实用性。具体样品为湖水、梨汁、人尿液和人血清样品，向其中添加2,4-D标准液(0.1、0.5、1.0和5.0mg L-1)。在分析过程中，用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)将样品稀释以抵抗背景干扰，湖水、梨汁、人尿液和人血清样品的稀释倍数依次为1，50，50，100。并利用本发明开发的3D打印模型-智能手机检测平台进行检测。如表1所示，实际样品中2,4-D的添加回收率(添加回收率是指向样品基质中加入定量的待测物，使用所建立的方法对分析后得到的结果与加入定量值的比值)为89.3～103.2％，相对标准偏差(RSD)小于3.1％。所得结果与紫外可见方法分析的结果基本一致，表明该检测策略在实际样品中具有适用性。

Claims (5)

1.一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台，其由如下方法构建得到：
(1)首先，将0.8～1.5g柠檬酸和1.5～2.5g尿素加入到5.0～15.0mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌5～15min后放入聚四氟乙烯反应釜，在150～170℃下恒温反应5～8h，冷却后分别经过碱洗、酸洗、水洗后在15000～18000r min-1的转速下离心5～15min，冷冻干燥后得到碳点(CDs)；
其次，将3.0mL、0.75～1.25mol L-1的氢氧化钠水溶液与10.0mL、8.0～12.0mmol L-1的六水合氯化钴水溶液混合后超声1～3min，再将500μL、0.6～1.0mol L-1的次氯酸钠水溶液加入其中后超声10～20min，以5000～8000r min-1的转速离心5～10min后得到CoOOH纳米片浓度0.010～0.050mg mL-1的CoOOH纳米片水溶液；
最后，将5.0mL、0.3mg mL-1的CDs水溶液与5.0mL、0.010～0.050mg mL-1的CoOOH纳米片水溶液混合并搅拌8～15min，然后将混合溶液以15000～18000r min-1的转速离心5～15min，将所得沉淀重新溶于10mL去离子水中得到CDs/CoOOH复合材料水溶液；
(2)在比色皿中，将50μL、0.1～15.0mg L-1的2,4-D水溶液和50μL、6.0～8.0U L-1碱性磷酸酶水溶液混合后在37℃下孵育5～60min，实现2,4-D对ALP活性的抑制；随后，向上述混合液中加入120μL、20～160μmol L-1的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐水溶液和100μL、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，在37℃下孵育5～30min后，将160μL步骤(1)制备得到的CDs/CoOOH复合材料水溶液加入其中混合；25℃下平衡5～10min后，将比色皿放入3D打印模型中，在532nm激光下，用智能手机记录不同2,4-D浓度下对应的比色皿溶液的红色荧光图片，可以观察到，随着农药2,4-D浓度的增加，获取到的红色荧光图片的颜色逐渐变暗；
(3)使用自编写的智能手机应用程序APP分析处理步骤(2)获取到的不同2,4-D浓度下对应的红色荧光图片，将获取的颜色信息转化为灰度值，建立灰色值与2,4-D农药浓度的关系曲线，从而得到基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台；再通过测量待测样品中未知浓度的农药灰度值，由智能手机应用程序APP分析得出农药浓度值，从而完成待测样本浓度的测试。
2.如权利要求1所述的一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台，其特征在于：3D打印模型是由软件SolidWorks完成建模设计，使用聚乳酸黑色耗材，并由FlashForge 3D打印机制作完成；3D打印模型可将激光器、比色皿、滤光片和智能手机放置其中，并固定相互间的位置。
3.如权利要求2所述的一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台，其特征在于：由激光器作为定量检测平台的光源，激光波长为532nm；比色皿作为样品池盛放样品溶液；智能手机带有摄像头采集和分析荧光图片，在智能手机摄像头前放置滤光片，用以屏蔽环境光和激发光；光路从激光器到比色皿再到手机摄像头呈直角型。
4.如权利要求3所述的一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台，其特征在于：3D打印模型的尺寸为120.0毫米×78.0毫米×34.5毫米，激光器的尺寸为60毫米×20毫米；滤光片的尺寸为10毫米×10毫米；激光器与比色皿的间距为15毫米，位于手机摄像头前的滤光片与比色皿之间的间距为2毫米。
5.如权利要求1所述的一种基于目标响应式3D打印模型与智能手机集成的2,4-D现场定量检测平台，其特征在于：智能手机应用程序APP通过开发工具Android Studio完成设计，有如下模块，
Camera Activity：使用Take Picture功能完成拍照，图片像素为3024×3024，并将图像存入指定位置；
Data：首先，通过getPixe方法提取样本图像的RGB值，即红(R)、绿(G)、蓝(B)三个通道的颜色；为了屏蔽由于环境因素的影响，以(1353，2041)像素点为对称中心，选取像素为125×125的矩形区域为分析区域，从该分析区域中选取25个像素点进行分析，其中所选取的各像素点之间的距离为5个像素；计算每个像素点的RGB值，然后根据后面所述的公式转换为对应的灰度值，将所得灰度值从小到大依次排列，选取中间的三个数值的平均值作为最终的灰度值；RGB值转为灰度值遵循以下算法Gray＝0.299R+0.587G+0.114B，为了避免低速的浮点运算，采用整数运算和位运算进行优化Gray＝(313524R+615514G+119538B)>>20；
Fore：根据若干组灰度值和对应农药浓度值，运用回归分析曲线拟合并计算拟合优度(R2)；
功能的实现：
Photo：采用Camera Activity模块；
File：通过输入的数据得到所需图像的路径并访问；
Analysis：采用Data模块得到每个样本的灰度值，再根据Fore模块得到的拟合曲线，得到样本中的农药浓度。
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