CN113340832A - 一种基于比色原理检测过氧化氢及乳酸的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于比色原理检测过氧化氢及乳酸的方法及其应用。本发明中以氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和N‑(3‑眯基)‑苯胺为原料制备聚苯胺衍生物保护的金纳米粒子，然后进一步与对巯基苯酚反应制得对巯基苯酚金纳米粒子。本发明中通过实验发现，利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢分解产生羟基自由基，羟基自由基可使苯酚发生交联聚合，能够有效促使本发明制备的巯基苯酚金纳米粒子发生聚集，并导致溶液颜色的变化，这一变化与过氧化氢的浓度密切相关，因此，利用本发明的对巯基苯酚金纳米粒子可用于检测过氧化氢，或是用于检测在酶催化代谢过程中会产生过氧化氢的相关物质，如乳酸、葡萄糖、胆固醇等。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测领域，特别涉及一种基于比色原理检测过氧化氢及乳酸的方法及其应用。
背景技术
过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)作为人体内活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)之一，是重要的信号分子和氧化应激指标，过量的H2O2可使DNA损伤，细胞死亡，衰老，进一步可导致慢性炎症，癌症和中枢神经系统疾病等疾病。因此，建立高效的H2O2分析方法具有重要意义。同时，H2O2作为生化过程中的中间体，主要在新陈代谢过程中通过物质的氧化分解产生，例如乳酸氧化酶(Lactate oxidase，LOX)氧化乳酸(Lactate)。故而，通过检测乳酸氧化过程中所产生的H2O2的量，可以实现乳酸的检测。乳酸是人体内糖代谢的中间产物，主要通过肝脏代谢。体内乳酸堆积会引起肌肉的酸痛甚至会引起酸中毒从而导致休克，死亡等，因此，测定血液中的乳酸浓度对乳酸中毒有重要的诊断意义。
目前，常用测定H2O2和乳酸的分析方法主要有色谱法，分光光度计法，电化学分析法，化学滴定法等，尽管已经应用于实际中，但这些方法仍然存在检测成本高、步骤繁琐且周期长、特异性低或依赖专业仪器设备等不足，这在即时检验(point-of-care testing，POCT)和家庭保健(health care)领域的应用十分受限，无法满足急剧增长的医疗服务需求。而比色法(colorimetry)具有成本低、操作简单、检测速度快且结果可视化等优点，近年来被广泛用于分析检测。它是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
近几年，智能手机的使用量呈爆炸式增长，智能手机凭借其强大的用户量，优秀的数据处理和图像采集能力等优点，成为了POCT的有效工具。目前通过智能手机可以检测心率、血压和运动状态等物理参量和生理信号，譬如，公开号为CN106725389A的中国专利申请“一种利用手机实现血压和心率检测的方法”将生物检测芯片、运动监测芯片与手机通过GSM通讯模块进行连接，通过信息采集和数据转换软件对芯片获得的数据进行转换并显示于手机屏幕上，获得的数据可加密传至网络云端服务器，形成一套完整的老年人健康监护体系，解决了老人不会使用手机的问题，实现了在外子女远程监测老人生理健康的心愿。又如公开号为CN108013869A的中国专利申请“一种基于智能手机的血压心率测量系统”利用光电传感器采集脉搏信号，信号经放大和转换后，通过双通道传输至智能手机，最后经心率血压测量app收集显示。但这些方法都需要第三方的设备来辅助智能手机完成数据收集、数据接收的工作。然而目前基于智能手机进行生化检测还较少。这可能是由于缺少适用于手机的生化传感检测体系的建立，以及相应的适用于生化检测的手机应用程序软件(applications,APP)开发不成熟。
依据智能手机自身的高分辨率摄像头和强大的处理器，利用检测结果可视化的特点，开发个性化的应用程序，搭建RGB分析模型，实现人体代谢物的灵敏、准确及便捷“掌上”检测。将高灵敏传感检测新技术与便携性好、普及性高的移动终端设备相结合，在智能手机上实现与生理病理相关的人体代谢物的传感检测，为可穿戴设备检测和便携式家庭检测提供新的思路和方法，在健康管理、临床诊疗、疾病监测等方面具有广阔的应用潜力。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种对巯基苯酚金纳米粒子的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供所述方法制备得到的对巯基苯酚金纳米粒子。
本发明的第三个目的在于提供所述对巯基苯酚金纳米粒子的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种基于比色原理检测过氧化氢和/或乳酸的方法，该方法灵敏度高、检测限低、选择性好，检测过程简单，克服了现有技术检测过程复杂耗时、成本高的缺点。
本发明的第五个目的在于提供所述基于比色原理检测过氧化氢和/或乳酸的方法的应用。
本发明的第六个目的在于提供一种基于智能手机用于实现上述检测H2O2和乳酸的检测系统。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种对巯基苯酚金纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将氯金酸(HAuCl4)溶液加入到氢氧化钠溶液中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)，混合均匀置于4℃条件下静置，得到混合溶液I；将N-(3-眯基)-苯胺(NAAN)溶于水中，4℃条件下静置，得到N-(3-眯基)-苯胺溶液；将N-(3-眯基)-苯胺溶液加入到混合溶液I中振荡混合均匀，得到PNAAN-Au NPs溶液(聚苯胺衍生物保护的金纳米粒子)；
(2)将对巯基苯酚的乙醇溶液加入到步骤(1)中得到的PNAAN-Au NPs溶液中，振荡混合均匀，得到MP-Au NPs溶液，即所述的对巯基苯酚金纳米粒子。
步骤(1)中所述的氯金酸(HAuCl4)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和N-(3-眯基)-苯胺(NAAN)的摩尔比为1：3.2～12.8：7.1～28.4；优选为1:6.4:14.2。
步骤(1)中所述的HAuCl4溶液的浓度优选为1.14mmol/L。
步骤(1)中所述的氢氧化钠溶液的浓度优选为10mmol/L。
步骤(1)中所述的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的分子量为40000～200000；优选为40000。
步骤(1)中所述的混合溶液I中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.4～1.6mg/mL；优选为0.8mg/mL。
步骤(1)中所述的4℃条件下静置的时间均为30分钟以上。
步骤(1)中所述的N-(3-眯基)-苯胺(NAAN)的用量为按其在所述反应体系的终浓度为8～32mM添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为16mM添加计算。
步骤(1)中所述的振荡混合均匀的条件为:200～300rpm振荡5～10分钟；优选为：室温、300rpm振荡10分钟。
步骤(2)中所述的对巯基苯酚与PNAAN-Au NPs的摩尔比为480～48000：1；优选为48000：1。
步骤(2)中所述的振荡混合均匀的条件为:200～300rpm振荡60～120分钟；优选为：室温、300rpm振荡120分钟。步骤(2)中所述的对巯基苯酚的乙醇溶液的浓度为0.1～1mmol/L(每0.1～1uM对巯基苯酚配比1ml乙醇计算)。
所述的对巯基苯酚金纳米粒子的制备方法，在步骤(2)之后，还包括进一步将得到的MP-Au NPs进一步纯化的步骤：具体为：
将MP-Au NPs溶液离心、去上清，然后加入去离子水吹打使积聚的MP-Au NPs重新分散，继续离心、去除上清液，再次加入去离子水吹打使积聚的MP-Au NPs重新分散，得到纯化后的MP-Au NPs。
所述的离心的条件为：5000～6000rpm离心5～8分钟；优选为：5000rpm离心8分钟。
所述的加入去离子水优选为加入等体积的去离子水。
一种对巯基苯酚金纳米粒子，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的对巯基苯酚金纳米粒子在检测过氧化氢、乳酸、葡萄糖、胆固醇、酒精、乳糖、胆碱、丙酮酸，酒精，黄嘌呤，氨基酸，三磷酸甘油酯和尿酸中的至少一种中的应用。
所述的乳酸、葡萄糖、胆固醇、酒精、乳糖、胆碱、丙酮酸，酒精，黄嘌呤，氨基酸，三磷酸甘油酯和尿酸等这些物质通过酶促反应可产生过氧化氢，如葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖、胆固醇氧化酶氧化胆固醇等酶促反应皆可产生过氧化氢，即通过酶联级反应，只需加入对应底物(代谢物)的氧化酶，经酶促反应产生过氧化氢，当氧化酶的量是固定且过量时，过氧化氢的量与底物(代谢物)的浓度呈正相关，通过检测过氧化氢的量即可实现代谢物浓度的检测。
一种基于比色原理检测过氧化氢的方法，为通过如下任一种方法实现：
(A)基于显色法检测H2O2
S1、配制至少五个不同浓度梯度的H2O2水溶液；
S2、将辣根过氧化物酶(HRP)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的H2O2水溶液进行反应，待反应结束后分别测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；
S3、根据步骤S2测量得到的吸光度比值与H2O2水溶液的浓度绘制标准曲线；
S4、将辣根过氧化物酶(HRP)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；再根据步骤S2绘制的标准曲线获得待测样品中H2O2的浓度和/或含量；
(B)基于智能手机检测系统检测H2O2
所述的基于智能手机检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括智能手机(自带摄像头)、暗箱、面光源和比色皿，用于采集标准溶液和待测溶液的颜色图像(即数码照片)；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像进行截图处理，获取兴趣区域；
所述的颜色分析模块为将兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得标准溶液和待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值，最后根据标准溶液的颜色分量比值G/B的平均值与标准溶液的浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为依据待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值与绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量(即用于显示待测溶液的浓度和/或含量)；
所述的基于智能手机检测系统检测H2O2，通过如下步骤实现：
S5、配制至少五个浓度梯度的H2O2水溶液；
S6、将辣根过氧化物酶(HRP)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的H2O2水溶液进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块分别获取反应后的溶液的颜色图像；
S7、将步骤S6中获取颜色图像通过智能手机检测系统中的图像预处理模块进行截图处理，获取兴趣区域；
S8、通过智能手机检测系统中的颜色分析模块将步骤S7中所截取的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，进而获取不同浓度过氧化氢水溶液对应的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与浓度绘制线关系曲线；
S9、将辣根过氧化物酶(HRP)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块获取反应后的溶液的颜色图像，并通过图像预处理模块获得待测样品的兴趣区域，经分析模块获得三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与步骤S8中制线的关系曲线，计算得到待测溶液中H2O2的浓度和/或含量。
步骤S1中所述的H2O2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.001～5μM添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.001、0.05、0.5、2.5、5添加计算，或按其在所述反应体系的终浓度为0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5添加计算。
步骤S5中所述的H2O2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.001～2.5μM添加；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.001、0.05、0.25、0.8、2.5μM添加计算，或按其在所述反应体系的终浓度为0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5μM添加计算。
步骤S2和S4中所述的紫外吸收光谱的波长范围是350～800nm，吸光度比值为波长680nm与波长534nm之间对应的吸光度的比值(A680/A534)。
步骤S2、S4、S6和S9所述的反应时间取决于MP-Au NPs的聚集程度，聚集程度以吸光度比值A680/A534表示；金纳米粒子的聚集程度可视化为溶液颜色的变化，即由葡萄酒红色变成紫色，直至蓝色甚至蓝白色时终止；体系中所含H2O2的终浓度为100μM以内时，其反应的时间优选为30～60分钟；更优选为45分钟。
步骤S2、S4、S6和S9所述的辣根过氧化物酶(HRP)的用量为其按其在所述反应体系的终浓度为3～30U/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为3U/L添加计算。
方法(B)中所述的智能手机检测系统(或称为智能手机检测APP)为基于智能手机的Android studio、采用JAVA编程语言撰写的手机应用程序，命名为“Color Picker”。
方法(B)中所述的颜色分量为颜色图像中划定区域内所有像素点各颜色分量除以像素点的个数作为这个区域的颜色分量的平均值。
一种基于比色原理检测乳酸(lactate)的方法，为通过如下任一种方法实现：
(C)基于显色法检测乳酸
S10、配制至少五个不同浓度梯度的乳酸水溶液；
S11、将辣根过氧化物酶(HRP)和乳酸氧化酶(LOX)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的乳酸水溶液进行反应，待反应结束后分别测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；
S12、根据步骤S1测量得到的吸光度比值与乳酸水溶液的浓度绘制标准曲线；
S13、将辣根过氧化物酶(HRP)和乳酸氧化酶(LOX)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；再根据步骤S2绘制的标准曲线获得待测样品中乳酸的浓度和/或含量；
(D)基于智能手机检测系统检测乳酸
所述的基于智能手机检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括智能手机(自带摄像头)、暗箱、面光源和比色皿，用于采集标准溶液和待测溶液的颜色图像(即数码照片)；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像进行截图处理获取兴趣区域；所述的颜色分析模块为将获取颜色图片的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得标准溶液和待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值，最后根据标准溶液的颜色分量比值G/B的平均值与标准溶液的浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为依据待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值与和绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量(即用于显示待测溶液的浓度和/或含量)；
所述的基于智能手机检测系统检测乳酸，通过如下步骤实现：
S14、配制至少五个浓度梯度的乳酸水溶液；
S15、将辣根过氧化物酶(HRP)和乳酸氧化酶(LOX)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的乳酸水溶液进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块分别获取反应后的溶液的颜色图像；
S16、将步骤S15中获取颜色图像通过智能手机检测系统中的图像预处理模块进行截图处理，获取兴趣区域；
S17、通过智能手机检测系统中的颜色分析模块将步骤S16中所截取的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析进而获取不同浓度乳酸水溶液对应的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与浓度绘制关系曲线；
S18、将辣根过氧化物酶(HRP)和乳酸氧化酶(LOX)加入到上述对巯基苯酚金纳米粒子(MP-Au NPs)的水溶液中，混合均匀后分别加入待测样品进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块获取反应后的溶液的颜色图像，并通过图像预处理模块获得待测样品的兴趣区域，经分析模块获得三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值和步骤S17中绘制的关系曲线，计算得到待测溶液中乳酸的浓度和/或含量。
步骤S10中所述的乳酸水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.005～5μM添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.05、0.25、1.5、2.5、5μM添加计算，或按其在所述反应体系的终浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5μM添加计算。
步骤S14中所述的乳酸水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.005～2.5μM添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.05、0.25、0.8、1.5、2.5μM添加计算，或按其在所述反应体系的终浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5μM添加计算。
步骤S11和S13中所述的紫外吸收光谱的波长范围是350～800nm，吸光度比值为波长680nm与波长534nm之间对应的吸光度的比值(A680/A534)。
步骤S11、S13、S15和S18中所述的反应时间取决于MP-Au NPs的聚集程度，聚集程度以吸光度比值A680/A534表示；金纳米粒子的聚集程度可视化为溶液颜色的变化，即由葡萄酒红色变成紫色，直至蓝色甚至蓝白色时终止；体系中所含乳酸的终浓度为100μM以内时，其反应的时间优选为30～60分钟；更优选为45分钟。
步骤S11、S13、S15和S18中所述的辣根过氧化物酶(HRP)的用量为其按其在所述反应体系的终浓度为3～30U/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为3U/L添加计算。
步骤S11、S13、S15和S18中所述的乳酸氧化酶(LOX)的用量为其在所述反应体系的终浓度为50～500U/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为50U/L添加计算。
方法(D)中所述的智能手机检测系统(或称为智能手机检测APP)为基于智能手机的Android studio、采用JAVA编程语言撰写的手机应用程序，命名为“Color Picker”。
方法(D)中所述的颜色分量值为颜色图像中划定区域内所有像素点各颜色分量除以像素点的个数作为这个区域的颜色分量的平均值。
一种基于智能手机用于实现上述检测H2O2和/或乳酸的检测系统，包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括智能手机(自带摄像头)、暗箱、面光源和比色皿，用于采集标准溶液和待测溶液的颜色图像(即数码照片)；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像进行截图处理，获取颜色图片的兴趣区域；
所述的颜色分析模块为将所获取颜色图片的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的三大颜色分量值中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与标准溶液的浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为依据待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值与绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量(即用于显示待测溶液的浓度和/或含量)。
所述的图像采集模块中的比色皿为透光性好的比色皿；优选为一次性、透光性好的的塑料比色皿。
所述的图像采集模块中面光源为可调控、发射光线均匀的LED面光源。
所述的颜色分量值为颜色图像中划定区域内所有像素点各颜色分量除以像素点的个数作为这个区域的各颜色分量的平均值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明中利用金纳米粒子的表面离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)效应，即当金纳米颗粒发生聚集时，其SPR特征峰的位置向长波长方向红移且吸光度下降并伴随溶液颜色的变化。本发明利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢分解产生羟基自由基，羟基自由基可使苯酚发生交联聚合，能够有效促使巯基苯酚修饰的金纳米粒子发生聚集，并导致溶液颜色的变化(由葡萄紫红色变为紫色、蓝色和蓝白色)，这一变化与过氧化氢的浓度密切相关，提供建立可视化检测过氧化氢新原理。
(2)本发明利用乳酸代谢过程中产生的过氧化氢可作为探针底物，故而过氧化氢的量与乳酸浓度呈正相关，即通过准确测定代谢反应过程中产生的过氧化氢含量，就能够有效地获得乳酸含量或水平，这为建立可视化检测乳酸提供了新的思路。
(3)本发明基于过氧化氢诱导对巯基苯酚金纳米粒子的聚集，提供一个通用型检测平台，由于人体新陈代谢活动中产生大量的过氧化氢，如葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖、胆固醇氧化酶氧化胆固醇等，即通过检测人体中酶催化代谢过程中产生的过氧化氢，且基于酶的特异性，即可实现人体代谢物如葡萄糖、胆固醇、酒精、尿酸、乳糖、胆碱、丙酮酸，酒精，黄嘌呤，氨基酸，三磷酸甘油酯等一些疾病相关人体代谢物的特异性检测。
(4)本发明利用移动终端的便携性和普及性，开发基于智能手机的生化检测应用程序，解锁智能手机应用于人体代谢物的便捷和直观检测的新功能，无需额外的设备和复杂的操作。所建立的基于智能手机的比色传感技术灵敏度高，检测限低、选择性好，线性宽，准确性好，检测过程简单，适用于临床诊断和家庭保健，对于医疗条件匮乏地区的医学检测具有巨大的应用价值和市场推广性。
附图说明
图1是本发明基于智能手机的比色传感用于H2O2和lactate的检测方法示意图。
图2是金纳米粒子的表征图；其中，A为PNAAN-Au NPs与MP-Au NPs的紫外吸收光谱图；B为MP-Au NPs的透射显微镜照片；C为MP-Au NPs的粒径图。
图3是不同反应体系的紫外吸收光谱图和MP-Au NPs在与HRP，H2O2反应前后的状态变化图；其中，A为不同反应体系的紫外吸收光谱图(图中，a：PNAAN-Au NPs+HRP+H2O2；b：MP-Au NPs+H2O2；c：MP-Au NPs+HRP；d：MP-Au NPs+HRP+H2O2)；B为MP-Au NPs与HRP，H2O2反应前的透射显微镜照片(插图为MP-Au NPs聚集前的颜色照片)；C为MP-Au NPs与HRP，H2O2孵育后的透射显微镜照片(插图为MP-Au NPs聚集后的颜色照片)。
图4是MP-Au NPs在与HRP和H2O2反应的动力学变化图；其中，A为MP-Au NPs在与HRP，H2O2反应的时间变化图；B为吸光度比值A680/A534的变化图。
图5是不同浓度的H2O2引起MP-Au NPs的聚集反应结果图；其中，A为在不同浓度的H2O2下的MP-Au NPs的紫外吸收光谱图；B为MP-Au NPs的吸光度比值A680/A534随H2O2浓度变化的标准曲线。
图6是MP-Au NPs 1、MP Au NPs 2在NaCl、HCl及NaOH下的紫外吸收光谱图(插图为对应溶液的颜色)；其中，A、D分别为MP-Au NPs 1、MP Au NPs 2与30mM NaCl反应20min前后的紫外光谱图；B、E分别为MP-Au NPs 1、MP Au NPs 2在0.1M HCl下的紫外吸收光谱图；图C、F分别为MP-Au NPs 1、MP Au NPs 2在0.1M NaOH下的紫外吸收光谱图。
图7是为不同反应体系的紫外吸收光谱图(图中，a：MP-Au NPs+HRP；b：MP-Au NPs+HRP+LOX；c：MP-Au NPs+HRP+lactate；d：MP-Au NPs+HRP+LOX+Lactate)。
图8是不同浓度的lactate引起MP-Au NPs的聚集反应结果图；其中，A为在不同浓度的lactate下的MP-Au NPs的紫外吸收光谱图；B为MP-Au NPs的吸光度比值A680/A534随lactate浓度变化的标准曲线。
图9是基于MP-Au NPs的lactate比色检测的选择性实验结果图(图中，a为MP-AuNPs+HRP+LOX+乳酸；b为MP-Au NPs+HRP+LOX+蔗糖；c为MP-Au NPs+HRP+LOX+甘氨酸；d为MP-Au NPs+HRP+LOX+柠檬酸；e为MP-Au NPs+HRP+LOX+葡萄糖；f为MP-Au NPs+HRP+LOX+醋酸；g为MP-Au NPs+HRP+LOX)。
图10是基于智能手机的H2O2的比色检测系统图；其中，A为智能手机所拍摄的MP-AuNPs随H2O2浓度变化的颜色图片；B为对颜色图片进行截图处理；C为在进行截图处理后所得到的一系列MP-Au NPs随H2O2浓度变化的颜色图片(H2O2浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5和2.5μM)；D为智能手机APP以RGB模型对颜色图片进行识别分析并输出R、G、B颜色分量值的显示界面；E为R、G、B三大分量平均值分别随H2O2变化的结果；F为G、B两大分量平均值间的比值G/B随H2O2浓度变化的拟合曲线。
图11是基于智能手机的lactate的比色检测结果图；其中，A为在进行截图处理后所得到的一系列MP-Au NPs随lactate浓度变化的颜色图片(lactate浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5、10和100μM)；B为三大颜色分量R、G、B的平均值以及颜色分量比值R/B、G/R、G/B的平均值随lactate浓度变化的拟合曲线(lactate浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5和2.5μM)；C为G、B两大颜色分量比值G/B的平均值随lactate浓度变化的拟合曲线(lactate浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5和2.5μM)；D为使用智能手机APP分析待测溶液中lactate浓度的结果显示界面。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的N-(3-眯基)-苯胺(N-(3-amidino)-aniline；NAAN)可参考文献(Ma Y,Yung L.Synthesis of Self-Stabilized Poly(N-(3-Amidino)-Aniline)Particles and their CO2-Responsive Properties[J].Particle&Particle SystemsCharacterization,2015,32(7):743-748.)合成得到，其合成路线如下：
实施例1一种MP-Au NPs的合成方法
1.1 PNAAN-Au NPs的合成
将4μL HAuCl4(10％,1.14mM)注入961μL 10mM的氢氧化钠溶液中，然后加入25μL32mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP；M＝40000)溶液，混合均匀(30s)置于4℃冰箱保存30分钟，此为溶液1；将N-(3-眯基)-苯胺(NAAN)溶于水并配成400mg/ml的溶液置于4℃冰箱保存30分钟，此为溶液2；30分钟后，向溶液1注入10μL的溶液2(NAAN在体系中的终浓度为16mM)，混合均匀，室温300rpm振荡10分钟取出即可得到聚N-(3-眯基)-苯胺保护的金纳米粒子(PNAAN-Au NPs)溶液。
1.2配体交换
本发明利用巯基可与金形成紧密稳定的金硫键，故将100μL 1mM的对巯基苯酚(C6H6OS)乙醇溶液加入到1ml PNAAN-Au NPs溶液中混合均匀，室温300rpm振荡120分钟取出可得到MP-Au NPs。
PNAAN-Au NPs和MP-Au NPs的紫外吸收光谱如图2A所示，配体交换前后紫外的最大吸收峰位置没有改变，最大紫外吸收峰位置为534nm；扫描电镜结果如图2B所示，粒径分布情况如图2C所示，从扫描电镜和粒径分布结果可知，本实施例制备的MP-Au NPs尺寸均匀，分散性好，其平均粒径大小为28±3.8nm。
实施例2一种利用MP-Au NPs的SPR光学特性检测H2O2的方法
金纳米颗粒(gold nanoparticles,Au NPs)由于其表面等离子共振(surfaceplasmon resonance，SPR)效应，在特定波长下将引起强烈的光吸收。随着金纳米颗粒粒径的增加，其吸收峰的位置向长波长方向红移，溶液的颜色则由红色渐变为变成暗紫色，蓝色甚至蓝白色。如图1所示，本发明利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢产生羟基自由基，利用羟基自由基可使苯酚基团发生交联进而介导金纳米粒子聚集，提供一种用于检测H2O2的方法：
2.1 MP-Au NPs对H2O2的响应
①对MP-Au NPs溶液进行纯化，将实施例1中1.2所制备的MP-Au NPs在5000rpm下进行离心8分钟，然后去除上清液，加入等体积去离子水，吹打使底部积聚的MP-Au NPs重新分散，继续在5000rpm下离心5分钟，去除上清液液，加入去离子水使积聚的MP-Au NPs重新分散，即可得到纯化的MP-Au NPs溶液(浓度为0.8nM)。
②将10μL 300U/L HRP溶液加入985μL已纯化的MP-Au NPs溶液中，混合均匀后，继续加入5μL 20mM H2O2，反应结束后，测量其紫外吸收光谱。
③为验证MP-Au NPs的聚集是由羟基自由基介导，即在辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与H2O2共同作用下，让HRP、H2O2分别单独与MP-Au NPs进行孵育(溶液中HRP、H2O2的最终浓度分别为3U/L，0.1mM)；另外，为排除所聚集的金纳米粒子是PNAAN-Au NPs，让PNAAN-Au NPs(实施例1制得)与HRP、H2O2共同进行孵育。
结果如图3A所示(图中，a：PNAAN-Au NPs+HRP+H2O2；b：MP-Au NPs+H2O2；c：MP-AuNPs+HRP；d：MP-Au NPs+HRP+H2O2)，在只有HRP，H2O2单独存在的情况下，MP-Au NPs的特征峰几乎没有变化，除此之外，PNAAN-Au NPs与HRP和H2O2进行孵育后，其紫外特征峰也无明显变化。而在HRP、H2O2同时存在下，MP-Au NPs的紫外特征峰的吸光度下降并伴随红移，其峰形较为宽胖，说明金纳米粒子聚集了，反应前后的分散度如图3B和3C所示，反应前金纳米粒子较为疏散，而反应后金纳粒子团聚在一起，如图3B和3C中的插图所示，颜色也从葡萄紫红色变成蓝色。这说明MP-Au NPs的聚集是在HRP与H2O2共同存在下发生的，而且所聚集的金纳米粒子不是PNAAN-Au NPs，进一步说明对巯基苯酚成功取代PNAAN。
2.2为选取合适的反应时间，向985μL的0.48nM MP-Au NPs溶液加入10μL 0.3U/mLHRP，混合均匀，继续加入5μL 20mM的H2O2溶液，室温下反应，测量60分钟内反应溶液的紫外吸收光谱。结果如图4所示，反应在45分钟时达到反应终点。
2.3H2O2的光学检测
将30％(v/v)的过氧化氢溶液用去离子水进行稀释，依次配成不同浓度的标准溶液。向985μL的MP-Au NPs溶液加入10μL 0.3U/mL HRP，混合均匀，然后分别加入5μL不同浓度的H2O2溶液，在室温下反应45分钟后测量溶液的紫外吸收光谱；其中，反应体系中H2O2的终浓度分别为0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5、10和100μM。
结果如图5所示：MP-Au NPs溶液在534nm处的吸光度随着H2O2浓度的增加而下降(图5A)，且当H2O2浓度高于0.5μM时，MP-Au NPs的紫外特征峰发生红移；这一变化在H2O2的浓度在0.001到5μM之间有良好的线性关系(图5B)。
实施例3金纳米粒子的稳定性对比实验
为了进一步评估本发明所制备的对巯基苯酚修饰金纳米粒子的稳定性，本实验通过与现有的常规方法所制备的金纳米粒子在不同介质(比如具有较高浓度的盐溶液、强酸及强碱)中的稳定性进行比较，用以评估本发明中PNAAN作为稳定剂是否能够有效提高金纳米粒子的稳定性，具体步骤如下：
3.1材料：
①对巯基苯酚购于上海麦克林生化科技有限公司；氯化钠、盐酸、氢氧化钠购于天津大茂化学试剂厂；
②基于羧基保护的金纳米粒子(COOH-Au NPs)所制备的对巯基苯酚修饰金纳米粒子(简称MP-Au NPs 1)参考中国专利(专利号为“201710504857.0”、名称为“一种基于修饰纳米金的过氧化氢及过氧化物酶检测方法”)制备得到；即将10mL 10nM的粒径为13nmCOOH-Au NPs加入到100μL 20μM对巯基苯酚溶液中，混合均匀后，锡箔包被震荡2小时，即得MP-Au NPs 1；
③基于聚N-(3-眯基)-苯胺保护的金纳米粒子(PNAAN-Au NPs)所制备的对巯基苯酚修饰金纳米粒子(简称MP-Au NPs 2)参考本发明实施例1制备得到；即向10mL PNAAN-AuNPs加入1mL 1mM对巯基苯酚溶液，混合均匀后，锡箔包被震荡2小时，即得MP-Au NPs 2。
3.2实验步骤：
取等体积(900μL)纳米金溶液，分装至6个样品管(A、B、C为0.58nM MP-Au NPs 1，D、E、F为10nM MP-Au NPs 2)；其中A、D加入100μL氯化钠溶液(NaCl，300mM)至终浓度为30mM，向B、E加入100μL盐酸溶液(HCl，1M)至终浓度为0.1M，向C、F加入100μL氢氧化钠溶液(NaOH，1M)至终浓度为0.1M，反应20min，使用分光光度计(UV-2550,SHIMADZU,Japan)测定紫外吸收光谱，分别与MP-Au NPs 2分散于去离子水中所形成的空白组进行对照。
3.3结论：
由图6可知，本发明中基于PNAAN-Au NPs所制备的功能化金纳米粒子MP-Au NPs 2在多种介质中，如高浓度盐溶液(NaCl溶液，30mM)、强酸(HCl，0.1M)及强碱(NaOH，0.1M)中均具有非常好的稳定性。与MP-Au NPs 2分散于去离子水中所形成的对照组相比，MP-AuNPs 2在高盐溶液(图6A)、强酸(图6B)和强碱(图6C)中溶液颜色均未变化，实验数据显示其紫外吸收光谱未见明显改变，最大紫外吸收峰强度基本无降低，位置未见红移，说明MP-AuNPs 2在高盐溶液、强酸和强碱中均未出现明显聚集，保持优异的稳定性，表明本发明中所报道的基于PNAAN-AuNPs配体置换所制备的MP-Au NPs 2在实际应用中具有优异的抗干扰性能。然而，MP-Au NPs 1与高浓度盐溶液(NaCl溶液，30mM)孵育20分钟后，其吸光度下降且溶液颜色变淡说明金纳米粒子发生了部分聚集(图6D)。特别是，MP-Au NPs 1中加入强酸(HCl，0.1M)(图6E)及强碱(NaOH,0.1M)(图6F)，其溶液颜色瞬间由原来的粉红色变成蓝色，实验结果显示紫外吸收光谱发生严重偏移且吸光度大大下降，证明强酸(HCl，0.1M)及强碱(NaOH,0.1M)可快速诱导MP-Au NPs 1发生强烈的聚集。由此可见，与MP-Au NPs 1相比，本发明采用PNAAN作为新的金纳米粒子保护剂取代传统所用的羧基保护剂，所制备的MP–AuNPs 2具有更加优异的稳定性，能够抵抗一般可引起金纳米粒子聚集的干扰因素，具有在高浓度的盐溶液、强酸及强碱等极端条件下广泛使用的潜力。
实施例4一种利用MP-Au NPs的SPR光学特性检测lactate的方法
如图1所示，本发明利用乳酸氧化酶氧化乳酸产生过氧化氢，过氧化氢进一步被辣根过氧化物酶氧化分解成羟基自由基，结合实施例2，提供了一种新型检测lactate的方法：
4.1 MP-Au NPs对lactate的响应
将10μL 300U/L HRP，10μL 5000U/L乳酸氧化酶(Lactate oxidase，LOX)依次加入975μL已纯化的0.23nM MP-Au NPs溶液(实施例2中的2.1纯化后再稀释)中，混合均匀后，继续加入5μL 20mM的乳酸溶液，室温反应45分钟后，测量溶液的紫外吸收光谱。为进一步验证是在辣根过氧化物酶，乳酸氧化酶，乳酸(HRP/LOX/lactate)共同作用下所导致的MP-AuNPs的聚集，分别向含有3U/L HRP的MP-Au NPs溶液单独加入LOX，乳酸进行排除实验，MP-AuNPs以含有3U/L HRP的MP-Au NPs溶液为空白对照。
结果如图7所示(图中，a：MP-Au NPs+HRP；b：MP-Au NPs+HRP+LOX；c：MP-Au NPs+HRP+lactate；d：MP-Au NPs+HRP+LOX+Lactate)，单独向含有3U/L HRP的MP-Au NPs溶液加入LOX、lactate的对照组，其特征峰与空白组相似，而同时加入LOX和lactate的MP-Au NPs溶液，其特征峰的吸光度下降，并伴随红移，其峰形较为宽胖，说明只有HRP、LOX、lactate的同时存在才能使MP-Au NPs聚集。
4.2 lactate的光学检测
4.2.1将乳酸用去离子水进行稀释，依次配成不同浓度的标准溶液。向975μL已纯化的0.23nM MP-Au NPs溶液(实施例2中的2.1纯化得到后再稀释)依次加入10μL 300U/LHRP，10μL 5000U/L LOX，混合均匀，然后分别加入5μL不同浓度的乳酸溶液，在室温下反应45分钟后测量溶液的紫外吸收光谱；其中，反应体系中乳酸的终浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5、10和100μM。
结果如图8所示：MP-Au NPs溶液在534nm处的吸光度随着lactate浓度的增加而下降(图8A)，且当H2O2浓度高于1.5μM时，MP-Au NPs的紫外特征峰发生红移；这一变化在lactate的浓度在0.05到5μM之间有良好的线性关系(图8B)。
4.2.2为验证该方法对于乳酸的检测具有单一性响应，采用不同的物质替换乳酸(乳酸的终浓度3.5μM)进行选择性实验，向0.25nM MP-Au NPs溶液(实施例2中的2.1纯化再稀释)依次加入10μL 0.3U/mL HRP，10μL 5U/mL LOX混合均匀，然后分别加入5uL 20mM的蔗糖、甘氨酸、柠檬酸、葡萄糖、醋酸，混合均匀，于室温下反应45分钟后，测量溶液的紫外吸收光谱，以含有3U/L HRP、50U/L LOX的MP-Au NPs溶液为空白对照。
结果如图9所示，以空白组作为参考，加入的蔗糖、甘氨酸、柠檬酸、葡萄糖、醋酸的MP-Au NPs溶液，比值A680/A534没有太大的变化，且插图中显示这些溶液的颜色相差不大，而含有3.5μM乳酸的MP-Au NPs溶液的比值A680/A534高于0.9，溶液的颜色也变成了紫蓝色。这说明该方法对于检测lactate具有良好的选择性。
实施例5基于智能手机的比色分析系统和检测方法
5.1基于智能手机的比色分析系统
本发明中基于智能手机的检测分析系统包括四大模块，分别为图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块，其中图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块依次连接；
所述的图像采集模块包括智能手机(自带摄像头)(或者采用数码相机)、暗箱、面光源和比色皿，主要用于颜色图像的采集；其中，所述的比色皿透光性好，用于承装金纳米粒子溶液，待反应结束后，置于暗箱中，将面光源(如LED面光源)置于比色皿后面进行照射，通过智能手机的自带摄像机(或数码相机)拍摄装有金纳米粒子溶液的比色皿，获取反应溶液的颜色图像(即数码照片)并保存于手机(或数码相机)相册中；所述的样品溶液包括已知浓度的标准溶液和未知浓度的待测溶液；
所述的图像预处理模块为将获取的反应后的溶液的颜色图像进行截图处理，获取兴趣区域；所述的截图处理可通过图片处理工具如Photoshop、智能手机等进行一键式截图处理，所有截图的大小、像素保持一致；
所述的颜色分析模块为通过手机APP将颜色图像的兴趣区域转换成位图格式，以RGB颜色模型分析，进而获得标准溶液和待测溶液的R、G、B三大颜色分量值，进一步计算可获得颜色分量值比值R/B、G/R、G/B；最后通过计算分别获得R、G、B、R/B、G/R、G/B的平均值；依据标准溶液的R、G、B三大颜色分量平均值，或颜色分量比值(R/B、G/R、G/B)的平均值与浓度之间的关系，绘制工作曲线，然后再选择拟合度最高、灵敏度最好的一条作为标准工作曲线；所述的手机APP为基于智能手机的安卓系统(android studio)，采用Java工具语言编写应用程序(Color Picker APP)，该手机APP可将颜色图像的像素信息转化为颜色信息，并以红绿蓝(Red/Green/Blue,RGB)颜色模型表示；颜色图像的兴趣区域截图上传至APP后，点击RGB虚拟按钮，相应的R、G、B颜色分量值显示在手机软件界面上；所述的颜色分量值为图像划定区域内所有像素点的R、G、B数值的平均值(即将图像中划定区域内所有像素点各颜色分量都求出来，然后除以像素点的个数作为这个区域的各颜色分量的平均值)；通过颜色分析模块可以获得反应后的标准溶液以及待测样液的R、G、B三大颜色分量值，以及颜色分量比值(R/B、G/R、G/B)，并经进一步计算获取R、G、B、R/B、G/R、G/B的平均值；
所述的结果显示模块为根据上述拟合度最高的工作曲线所对应的颜色分量平均值或颜色分量比值的平均值和绘制的标准工作曲线，计算得到待测溶液的浓度，也可以在进一步根据获得的待测溶液的浓度和体积，获得其含量；即将待测溶液的颜色图像上传至Color Picker APP进行分析，输出其R、G、B三大颜色分量值，并进一步输出颜色分量值比值R/B、G/R、G/B，经计算获得R、G、B、R/B、G/R、G/B的平均值，依据绘制的工作曲线进行计算可得到待测溶液的浓度(含量)；所述的待测溶液的颜色图像可以直接点击软件的Camera虚拟键直接调用智能手机摄像头进行实时拍照，所获得的颜色图像由APP自动进行截图处理，或先使用智能手机摄像头(数码相机)采集待测溶液的颜色图像并保存至手机本地相册，然后进入Color Picker APP点击Photo虚拟键直接调用已保存图像并手动进行截图处理进行；截图处理后的兴趣区域图像直接由Color Picker APP加载分析输出R、G、B三大颜色分量平均值，依据工作曲线计算得出待测溶液的浓度并显示在软件界面上。
5.2基于智能手机的比色分析系统检测H2O2
本发明中基于智能手机的比色分析系统检测H2O2的原理如图1所示，检测流程如图9所示，其检测方法具体如下：
(1)用去离子水配制五个浓度以上的H2O2标准水溶液；将10μL HRP加入985μL已纯化后的0.25nM MP-Au NPs溶液(实施例2中的2.1纯化再稀释)中，混合均匀，然后继续加入H2O2标准水溶液混合均匀，室温下反应45分钟，反应结束后将溶液转移至一次性比色皿中；如图10A所示，通过图像采集模块采集样品溶液的颜色图像(即数码照片)；本实施例配制的反应体系中，HRP的终浓度为3U/L；H2O2的终浓度为0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5μM；本实验的全部反应先在离心管等容器中进行，待反应结束后再将反应样液转移至比色皿中，也可以在比色皿中直接进行反应。
(2)如图10B所示，通过图像预处理模块将步骤(1)中获取的反应溶液的颜色图像进行截图处理，经截图处理后获得一系列含有不同浓度H2O2的MP-Au NPs溶液的兴趣区域(图10C)。
(3)通过颜色分析模块分析步骤(2)中所截取的兴趣区域，由Color Picker APP分析输出R、G、B三大颜色分量值(图10D)，进一步计算获得颜色分量比值R/B、G/R、G/B；然后经计算获得R、G、B、R/B、G/R、G/B的平均值，最后对含有已知不同浓度(0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5μM)H2O2的MP-Au NPs溶液所对应的三大颜色分量值(R、G、B)或颜色分量比值R/B、G/R、G/B的平均值的数据进行拟合比较(图10E)；如图10F所示，通过比较，本发明优选拟合度最高、灵敏度最好的颜色分量比值G/B拟合的曲线作为标准工作曲线，该工作曲线的线性范围在0.001～2.5μM。
5.3基于智能手机的比色分析系统实现乳酸(lactate)的检测
(1)用去离子水配制五个浓度以上的乳酸水溶液；依次向975μL 0.23nM MP-AuNPs溶液加入10μL HRP、10μL LOX，混合均匀，继续加入5μL不同浓度的乳酸水溶液，室温下反应45分钟，反应结束后将溶液转移至一次性比色皿中；通过图像采集模块采集样品溶液的颜色图像(即数码照片)；本实施例配制的反应体系中，HRP的终浓度为3U/L；LOX的终浓度为50U/L；乳酸的终浓度为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5、10、100μM；
(2)如图11A所示，通过图像预处理模块将步骤(1)中获取的反应溶液的颜色图像进行截图处理后获得一系列含有不同lactate浓度的MP-Au NPs溶液的兴趣区域。
(3)通过颜色分析模块分析步骤(2)所截取的兴趣区域，由Color Picker APP分析输出对含有已知不同浓度(0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5、3.5、5、10、100μM)lactate的MP-Au NPs溶液所对应的三大颜色分量值(R、G、B)，并计算获得颜色分量比值R/B、G/R、G/B；然后进一步计算获得R、G、B、R/B、G/R、G/B的平均值，最后对含有已知不同浓度(0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.5、2.5μM)lactate的MP-Au NPs溶液所对应的三大颜色分量值(R、G、B)或颜色分量比值R/B、G/R、G/B的平均值的数据进行拟合比较(图11B)。如图11C所示，本发明优选拟合度最高、灵敏度最好的颜色分量比值G/B拟合的曲线作为标准工作曲线，该工作曲线的线性范围在0.05～2.5μM；将所拟合的线性工作曲线内置于Color Picker APP中作为后续测试的内置标准曲线。
(4)依次分别将10μL HRP、10μL LOX加入975μL 0.25nM MP-Au NPs溶液，混合均匀后，将待测样品加入其中，室温下反应45分钟，反应结束后通过图像采集模块获取待测溶液的颜色图像，然后经图像预处理模块、颜色分析模块处理分析得到待测溶液三大颜色分量(R、G、B)中的G、B值，然后进一步计算颜色分量比值G/B，再计算获得其颜色分量比值G/B的平均值，依据颜色分量比值G/B的平均值和步骤(3)所拟合的线性工作曲线计算得到待测溶液中乳酸的浓度(也可以在进一步根据获得的待测溶液的浓度和体积，获得其含量)；其中，反应体系中HRP、LOX以及所用MP-Au NPs溶液的浓度与上述步骤(1)相同。
反应结束后，将装有未知lactate浓度的反应溶液的比色皿置于暗箱中，用面光源进行照射，使用智能手机拍摄溶液的颜色图像，通过Color Picker APP识别分析该颜色，输出颜色图像的R、G、B三大颜色分量平均值，手动在手机Color Picker APP界面点击浓度(Concentration)虚拟按键“Conc”，Color Picker APP依据内置标准曲线进行计算并在手机屏幕上显示未知样品的乳酸的浓度(图11D)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种对巯基苯酚金纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将氯金酸溶液加入到氢氧化钠溶液中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀置于4℃条件下静置，得到混合溶液I；将N-(3-眯基)-苯胺溶于水中，4℃条件下静置，得到N-(3-眯基)-苯胺溶液；将N-(3-眯基)-苯胺溶液加入到混合溶液I中振荡混合均匀，得到PNAAN-AuNPs溶液；
(2)将对巯基苯酚的乙醇溶液加入到步骤(1)中得到的PNAAN-Au NPs溶液中，振荡混合均匀，得到MP-Au NPs溶液，即所述的对巯基苯酚金纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的对巯基苯酚金纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和N-(3-眯基)-苯胺的摩尔比为1：3.2～12.8：7.1～28.4；
步骤(1)中所述的混合溶液I中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.4～1.6mg/mL；
步骤(1)中所述的聚乙烯吡咯烷酮的分子量为40000～200000；
步骤(1)中所述的N-(3-眯基)-苯胺的用量为按其在所述反应体系的终浓度为8～32mM添加计算；
步骤(2)中所述的对巯基苯酚与PNAAN-Au NPs的摩尔比为480～48000：1；
步骤(2)中所述的对巯基苯酚的乙醇溶液的浓度为0.1～1mmol/L。
3.根据权利要求1所述的对巯基苯酚金纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的振荡混合均匀的条件为:200～300rpm振荡5～10分钟；
步骤(2)中所述的振荡混合均匀的条件为:200～300rpm振荡60～120分钟。
4.一种对巯基苯酚金纳米粒子，其特征在于，通过权利要求1～3任一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子在检测过氧化氢、乳酸、葡萄糖、胆固醇、酒精、乳糖、胆碱、丙酮酸，酒精，黄嘌呤，氨基酸，三磷酸甘油酯和尿酸中的至少一种中的应用。
6.一种基于比色原理检测过氧化氢的方法，其特征在于，为通过如下任一种方法实现：
(A)基于显色法检测H2O2
S1、配制至少五个不同浓度梯度的H2O2水溶液；
S2、将辣根过氧化物酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的H2O2水溶液进行反应，待反应结束后分别测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；
S3、根据步骤S2测量得到的吸光度比值与H2O2水溶液的浓度绘制标准曲线；
S4、将辣根过氧化物酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；再根据步骤S2绘制的标准曲线获得待测样品中H2O2的浓度和/或含量；
(B)基于智能手机检测系统检测H2O2
所述的基于智能手机检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括智能手机、暗箱、面光源和比色皿，用于采集标准溶液和待测溶液的颜色图像；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像进行截图处理，获取兴趣区域；
所述的颜色分析模块为将兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得标准溶液和待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值，最后根据标准溶液的颜色分量比值G/B的平均值与标准溶液的浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为依据待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值与绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量；
所述的基于智能手机检测系统检测H2O2，通过如下步骤实现：
S5、配制至少五个浓度梯度的H2O2水溶液；
S6、将辣根过氧化物酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的H2O2水溶液进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块分别获取反应后的溶液的颜色图像；
S7、将步骤S6中获取颜色图像通过智能手机检测系统中的图像预处理模块进行截图处理，获取兴趣区域；
S8、通过智能手机检测系统中的颜色分析模块将步骤S7中所截取的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，进而获取不同浓度过氧化氢水溶液对应的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与浓度绘制关系曲线；
S9、将辣根过氧化物酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块获取反应后的溶液的颜色图像，并通过图像预处理模块获得待测样品的兴趣区域，经分析模块获得三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与步骤S8中绘制的关系曲线，计算得到待测溶液中H2O2的浓度和/或含量。
7.根据权利要求6所述的基于比色原理检测过氧化氢的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的H2O2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.001～5μM添加计算；
步骤S5中所述的H2O2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.001～2.5μM添加；
步骤S2、S4、S6和S9所述的反应时间为30～60分钟；
步骤S2、S4、S6和S9所述的辣根过氧化物酶的用量为其按其在所述反应体系的终浓度为3～30U/L添加计算。
8.一种基于比色原理检测乳酸的方法，其特征在于，为通过如下任一种方法实现：
(C)基于显色法检测乳酸
S10、配制至少五个不同浓度梯度的乳酸水溶液；
S11、将辣根过氧化物酶和乳酸氧化酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的乳酸水溶液进行反应，待反应结束后分别测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；
S12、根据步骤S1测量得到的吸光度比值与乳酸水溶液的浓度绘制标准曲线；
S13、将辣根过氧化物酶和乳酸氧化酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后测量紫外吸收光谱，得到吸光度比值；再根据步骤S2绘制的标准曲线获得待测样品中乳酸的浓度和/或含量；
(D)基于智能手机检测系统检测乳酸
所述的基于智能手机检测系统包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括智能手机、暗箱、面光源和比色皿，用于采集标准溶液和待测溶液的颜色图像；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像进行截图处理获取兴趣区域；所述的颜色分析模块为将获取颜色图片的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得标准溶液和待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值，最后根据标准溶液的颜色分量比值G/B的平均值与标准溶液的浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为依据待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值与和绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量；
所述的基于智能手机检测系统检测乳酸，通过如下步骤实现：
S14、配制至少五个浓度梯度的乳酸水溶液；
S15、将辣根过氧化物酶和乳酸氧化酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后分别加入不同浓度的乳酸水溶液进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块分别获取反应后的溶液的颜色图像；
S16、将步骤S15中获取颜色图像通过智能手机检测系统中的图像预处理模块进行截图处理，获取兴趣区域；
S17、通过智能手机检测系统中的颜色分析模块将步骤S16中所截取的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析进而获取不同浓度乳酸水溶液对应的三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与浓度绘制关系曲线；
S18、将辣根过氧化物酶和乳酸氧化酶加入到权利要求4所述的对巯基苯酚金纳米粒子的水溶液中，混合均匀后加入待测样品进行反应，待反应结束后用智能手机检测系统中的图像采集模块获取反应后的溶液的颜色图像，并通过图像预处理模块获得待测样品的兴趣区域，经分析模块获得三大颜色分量中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值和步骤S17中绘制的关系曲线，计算得到待测溶液中乳酸的浓度和/或含量。
9.根据权利要求8所述的基于比色原理检测乳酸的方法，其特征在于：
步骤S10中所述的乳酸水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.005～5μM添加计算；
步骤S14中所述的乳酸水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.005～2.5μM添加计算；
步骤S11、S13、S15和S18中所述的反应时间为30～60分钟；
步骤S11、S13、S15和S18中所述的辣根过氧化物酶的用量为其按其在所述反应体系的终浓度为3～30U/L添加计算；
步骤S11、S13、S15和S18中所述的乳酸氧化酶的用量为其在所述反应体系的终浓度为50～500U/L添加计算。
10.一种基于智能手机用于实现检测H2O2和/或乳酸的检测系统，其特征在于：包括依次连接的图像采集模块，图像预处理模块，颜色分析模块和检测结果显示模块；
所述的图像采集模块包括智能手机、暗箱、面光源和比色皿，用于采集标准溶液和待测溶液的颜色图像；
所述的图像预处理模块为将获取的标准溶液和待测溶液的颜色图像进行截图处理，获取颜色图片的兴趣区域；
所述的颜色分析模块为将所获取颜色图片的兴趣区域转换为位图格式，以RGB颜色模型分析，用于获得标准溶液和待测溶液的三大颜色分量值中的G、B颜色分量值，并分别计算其颜色分量比值G/B，再进一步计算获得颜色分量比值G/B的平均值，最后根据颜色分量比值G/B的平均值与标准溶液的浓度绘制关系曲线；
所述的结果显示模块为依据待测溶液的颜色分量比值G/B的平均值与绘制的关系曲线，获得待测溶液的浓度和/或含量。
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