JPS58209980A - 酵素の精製法 - Google Patents
酵素の精製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素の新規な精製法に関するものでおる。さら
に詳細には本発明は、酵素を含有する溶液、例えば微生
物培養液、細胞抽出液等をハイポーラス型もしくは３チ
以下の架橋度を有するポーラス型の強酸性陽イオン交換
樹脂またはハイポーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂
に接触させて、酵素を選択的に吸着させ、必要ならばイ
オン交換樹脂を水および緩祠液等で十分洗浄し、不純物
を除いた後に、イオン交換樹脂に吸着している酵素を溶
出剤により溶出し、その活性区分を集めて精製酵素溶液
を得る方法に関する。
に詳細には本発明は、酵素を含有する溶液、例えば微生
物培養液、細胞抽出液等をハイポーラス型もしくは３チ
以下の架橋度を有するポーラス型の強酸性陽イオン交換
樹脂またはハイポーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂
に接触させて、酵素を選択的に吸着させ、必要ならばイ
オン交換樹脂を水および緩祠液等で十分洗浄し、不純物
を除いた後に、イオン交換樹脂に吸着している酵素を溶
出剤により溶出し、その活性区分を集めて精製酵素溶液
を得る方法に関する。
従来酵素の精製法としては、数多くの方法が考案されて
おり弱塩基性陰イオン交換樹脂および弱酸性陽イオン交
換樹脂合成吸着剤、セルロース、セファデックス、カー
ボン等の吸着剤を用いる方法が知られている。しかしな
がら、これらの酵素の精製法は工業的に酵素を精製しよ
うとする場合に、いずれも以下で述べるような理由でそ
の使用が難しい例が多い。例えば合成吸着剤であるアン
バーライ）ＸＡＤ系樹脂（０−ムアンドハース社製、商
品名）およびダイヤイオンＨＰ系樹脂（三菱化成工業社
製：商品名）などを用いた酵素精製法では、酵素液を樹
脂と接触させても酵素は樹脂へほとんど吸着しないかま
た線吸着するが、溶出剤で溶出してもほとんど溶出され
ない場合が多い。またとの方法を適用できる酵素岐プロ
テアーゼ、アミラーゼなハ ト分離性などの点で優れた面があるがカラム操作を行う
場合、十分な流速が得られず工業的方法としては問題が
ある。さらにイオン交換樹脂を用いる例としては、弱酸
性陽イオン交換樹脂のアンバーライトＩＲＣ−５０，ｃ
Ｇ−ｓｏ（ロームア／ドハース社製：商品名）および弱
塩基性陰イオン交換樹脂のデュオライ）Ａ−７（ケミカ
ルプロセス社製：商品名）などが知られている。しかし
これらのイオン交換樹脂は中性塩分解能がないこと、比
表面積が小さいことなどの理由から不純物の多い粗酵素
溶液やイオン強度の高い塩類、緩衝液などに溶解してい
る酵素溶液では、イオン交換樹脂に酵素が吸着しないか
、または吸着してもその量は極めて低く実用的でない。
おり弱塩基性陰イオン交換樹脂および弱酸性陽イオン交
換樹脂合成吸着剤、セルロース、セファデックス、カー
ボン等の吸着剤を用いる方法が知られている。しかしな
がら、これらの酵素の精製法は工業的に酵素を精製しよ
うとする場合に、いずれも以下で述べるような理由でそ
の使用が難しい例が多い。例えば合成吸着剤であるアン
バーライ）ＸＡＤ系樹脂（０−ムアンドハース社製、商
品名）およびダイヤイオンＨＰ系樹脂（三菱化成工業社
製：商品名）などを用いた酵素精製法では、酵素液を樹
脂と接触させても酵素は樹脂へほとんど吸着しないかま
た線吸着するが、溶出剤で溶出してもほとんど溶出され
ない場合が多い。またとの方法を適用できる酵素岐プロ
テアーゼ、アミラーゼなハ ト分離性などの点で優れた面があるがカラム操作を行う
場合、十分な流速が得られず工業的方法としては問題が
ある。さらにイオン交換樹脂を用いる例としては、弱酸
性陽イオン交換樹脂のアンバーライトＩＲＣ−５０，ｃ
Ｇ−ｓｏ（ロームア／ドハース社製：商品名）および弱
塩基性陰イオン交換樹脂のデュオライ）Ａ−７（ケミカ
ルプロセス社製：商品名）などが知られている。しかし
これらのイオン交換樹脂は中性塩分解能がないこと、比
表面積が小さいことなどの理由から不純物の多い粗酵素
溶液やイオン強度の高い塩類、緩衝液などに溶解してい
る酵素溶液では、イオン交換樹脂に酵素が吸着しないか
、または吸着してもその量は極めて低く実用的でない。
一方強塩基性陰イオン交換樹脂では巨大網目構造型のア
ンバーライトＩＲＡ−９０４，ＩＲＡ −９３８（ロー
ムアンドハース社輿：商品名）を用いて、ペプシンの吸
着溶出やクレアチニンキナーゼの分析への応用などが知
られている。
ンバーライトＩＲＡ−９０４，ＩＲＡ −９３８（ロー
ムアンドハース社輿：商品名）を用いて、ペプシンの吸
着溶出やクレアチニンキナーゼの分析への応用などが知
られている。
本発明者らは幅広い酵素の工業的鞘製方法を種々検討し
た。その結果イオン変換樹脂の中でハイポーラス型もし
くは３ｑ６以下の架橋度を有するポーラス型の強酸性陽
イオン交換樹脂またはハイポーラス型の強塩基性陰イオ
ン交換樹脂と各種酵素溶液とを接触させることによシｌ
Ｗ素をイオン交換樹脂に高い吸着量で吸着させることが
でき、適尚な溶出剤で溶出すると、溶出液中に収率良く
しかも酵素比活性を高めて、酵素を浴出できることを見
出し本発明を完成するに至った。本発明で見出したハイ
ポーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂では、同系統の
巨大網目構造型強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライ
トＩＲＡ−９０４、ＩＲＡ−９３８と比較して吸着量で
２倍以上、酵素比活性上昇の点で１〜３倍の差が見られ
、極めて実用的な酵素精興法である・ 以下本発明の詳細な説明する。
た。その結果イオン変換樹脂の中でハイポーラス型もし
くは３ｑ６以下の架橋度を有するポーラス型の強酸性陽
イオン交換樹脂またはハイポーラス型の強塩基性陰イオ
ン交換樹脂と各種酵素溶液とを接触させることによシｌ
Ｗ素をイオン交換樹脂に高い吸着量で吸着させることが
でき、適尚な溶出剤で溶出すると、溶出液中に収率良く
しかも酵素比活性を高めて、酵素を浴出できることを見
出し本発明を完成するに至った。本発明で見出したハイ
ポーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂では、同系統の
巨大網目構造型強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライ
トＩＲＡ−９０４、ＩＲＡ−９３８と比較して吸着量で
２倍以上、酵素比活性上昇の点で１〜３倍の差が見られ
、極めて実用的な酵素精興法である・ 以下本発明の詳細な説明する。
本Ｑ ｊｌ、ｌ］で用いられる巨大網目構造のイオン交
換樹脂としては、巨大網目構造を持つスチレン−ジビニ
ルベンゼン重合体の母核に４級アミン−または３級アミ
ンさらにはスルフォン基を交換基として導入したものが
あげられる。具体的には、例えばハイポーラス型の強塩
基性陰イオン交換樹脂では、ダイヤイオンＨＰＡ−２５
、ＨＰ Ａ −７５（三菱化成工業社製：商品名）など
があげられる。ハイポーラス型強酸性陽イオン交換樹脂
では、ダイヤイオンＨＰＫ−１６、！（ＰＫ−２５、Ｈ
ＰＫ−３０、ＨＰＫ−４０（三菱化成工業社製：商品名
）などがあげられる。
換樹脂としては、巨大網目構造を持つスチレン−ジビニ
ルベンゼン重合体の母核に４級アミン−または３級アミ
ンさらにはスルフォン基を交換基として導入したものが
あげられる。具体的には、例えばハイポーラス型の強塩
基性陰イオン交換樹脂では、ダイヤイオンＨＰＡ−２５
、ＨＰ Ａ −７５（三菱化成工業社製：商品名）など
があげられる。ハイポーラス型強酸性陽イオン交換樹脂
では、ダイヤイオンＨＰＫ−１６、！（ＰＫ−２５、Ｈ
ＰＫ−３０、ＨＰＫ−４０（三菱化成工業社製：商品名
）などがあげられる。
これらのイオン交換樹脂は第１表に示されるように１５
０Ａ以上の大きな平均細孔半径５ｍ″ｈ−乾燥樹脂 以
上の広い比表面積さらに０．２ｃ４／Ｖ−乾燥樹脂 の
大きな細孔容積を持っているので分子量の大きな酵素分
子でもかなシの量がマクロポア−に出入シできる。これ
がこれら樹脂で高い吸着量および高い溶出率が得られる
原因と考えられる。
０Ａ以上の大きな平均細孔半径５ｍ″ｈ−乾燥樹脂 以
上の広い比表面積さらに０．２ｃ４／Ｖ−乾燥樹脂 の
大きな細孔容積を持っているので分子量の大きな酵素分
子でもかなシの量がマクロポア−に出入シできる。これ
がこれら樹脂で高い吸着量および高い溶出率が得られる
原因と考えられる。
また３係以下の架橋度を有するポーラス型の強酸性陽イ
オン交換樹脂では、例えばダイヤイオンＰＫ、２０４．
ＰＫ２０６（三菱化成工業社製：商品名）などがあげら
れる。これらのイオン交換樹脂はハイポーラス型のイオ
ン交換樹脂に比べると１→今一乾燥樹脂程度の比表面積
、０．１鴫々−乾燥樹脂程度の細孔容積でマクロポアー
の数が少ないと考えられるが、スチレン−ジビニルベン
ゼン重合体のジビニルベンゼン含険が３係以下ト少ない
ため、スチレン−ジビニルベンゼン重合体内にできるミ
ク四ボアーが大きく、マクロポアーを通った酵素分子が
ミクロボアー内に出入できハイボージス型のイオン交換
樹脂と同様に高い吸着量および溶出率が得られるものと
考えられる。
オン交換樹脂では、例えばダイヤイオンＰＫ、２０４．
ＰＫ２０６（三菱化成工業社製：商品名）などがあげら
れる。これらのイオン交換樹脂はハイポーラス型のイオ
ン交換樹脂に比べると１→今一乾燥樹脂程度の比表面積
、０．１鴫々−乾燥樹脂程度の細孔容積でマクロポアー
の数が少ないと考えられるが、スチレン−ジビニルベン
ゼン重合体のジビニルベンゼン含険が３係以下ト少ない
ため、スチレン−ジビニルベンゼン重合体内にできるミ
ク四ボアーが大きく、マクロポアーを通った酵素分子が
ミクロボアー内に出入できハイボージス型のイオン交換
樹脂と同様に高い吸着量および溶出率が得られるものと
考えられる。
本発明で用いるイオン交換樹脂の交＃４基は強塩基およ
び強酸であることから強いイオン交換作用を示すため塩
類高濃度溶液、高濃度緩＠液および不糾物の多い溶液中
に存在する酵素と樹脂とを接触させても酵素を吸着する
ことができることが特徴である。各種酵素を用いて吸着
、溶出実験を行ない、その時の吸着音、および溶ｍ率を
第２表に示したが、本発明で使用できる酵素は極めて巾
広く、効果的に精製できる。
び強酸であることから強いイオン交換作用を示すため塩
類高濃度溶液、高濃度緩＠液および不糾物の多い溶液中
に存在する酵素と樹脂とを接触させても酵素を吸着する
ことができることが特徴である。各種酵素を用いて吸着
、溶出実験を行ない、その時の吸着音、および溶ｍ率を
第２表に示したが、本発明で使用できる酵素は極めて巾
広く、効果的に精製できる。
また従来見い出されているイオン交換樹脂や合成吸着剤
に比べて大きな優位差を有する６さらに酵素蛋白の等電
点により強酸性陽イオン交換および強塩基性陰イオン交
換樹脂を使い分けることができる・ 一般的に酵素はｐＨが中性付近で安定性が良いので、中
性付近で操作を行なうことが、収率を高めるために重要
である。酸性側に等電点を持つ酵素蛋白は中性付近では
負に帯電しているため、強塩基性陰イオン交換樹脂に吸
着させるのが適している。一方アルカリ側に等電点を持
つ酵素蛋白は中性付近では正に帯電しているため、強酸
性陽イオン焚負樹脂に１貫着させるのが適している。
に比べて大きな優位差を有する６さらに酵素蛋白の等電
点により強酸性陽イオン交換および強塩基性陰イオン交
換樹脂を使い分けることができる・ 一般的に酵素はｐＨが中性付近で安定性が良いので、中
性付近で操作を行なうことが、収率を高めるために重要
である。酸性側に等電点を持つ酵素蛋白は中性付近では
負に帯電しているため、強塩基性陰イオン交換樹脂に吸
着させるのが適している。一方アルカリ側に等電点を持
つ酵素蛋白は中性付近では正に帯電しているため、強酸
性陽イオン焚負樹脂に１貫着させるのが適している。
本発明に適用できる酵素としてはあらゆる種類の酸化還
元＃素、転移酵素、加水分ＰＲ−醗素、リアーゼ、イン
メラーゼ、リガーゼなどがあげられるが、具体的には第
２表および実施例に記載したものが好適なものとしてあ
げられる。
元＃素、転移酵素、加水分ＰＲ−醗素、リアーゼ、イン
メラーゼ、リガーゼなどがあげられるが、具体的には第
２表および実施例に記載したものが好適なものとしてあ
げられる。
本発明の方法において、培養液または細胞抽出液のごと
き粗ｊ１％素液に在る酵素を吸着せしめる場合、イオン
交換樹脂を粗酵素液と混合して回分式に攪拌する方法、
若しくはイオン交換樹脂ヲ力ラム・クロマトグラフィー
の手法を用いてもよい０回分法では、粗酵素液を適当な
ｐＨに調節し、１１５〜１／ｘｏｔのイオン交換樹脂を
加え、ゆるやかに３０〜６０分間攪拌する。温度妹酵素
の安定性にもよるが、一般的には低温が望ましい。
き粗ｊ１％素液に在る酵素を吸着せしめる場合、イオン
交換樹脂を粗酵素液と混合して回分式に攪拌する方法、
若しくはイオン交換樹脂ヲ力ラム・クロマトグラフィー
の手法を用いてもよい０回分法では、粗酵素液を適当な
ｐＨに調節し、１１５〜１／ｘｏｔのイオン交換樹脂を
加え、ゆるやかに３０〜６０分間攪拌する。温度妹酵素
の安定性にもよるが、一般的には低温が望ましい。
カラムクロマトグラフィーの手法では、ｐＨを適当に調
節した粗酵素液を樹脂カラムに通し、処理温度は回分法
の場合と同様である。吸着された酵素を溶出するには、
緩衝液、塩類、界面活性剤、例えば０．１〜０．５ Ｍ
リン酸緩衝液、０．１〜ＩＭ硫酸アンモニウム、０．
５％）リドンＸ−１００を含む緩衝液等の如き通常の溶
出剤を用いることができる。溶出剤の癲択は、酵素の種
類、夾雑物の量と種類、使用されたイオン交換樹脂の種
類等に合せてなされるべきであるが、特定の酵素を純度
よく分画するためには、酵素の安定性を加味し、硫酸ア
ンモニウムと緩碕液の混合系が一般に優れている。溶出
剤によっては夾雑している酵素とクロマト分離をするこ
とも可能である。
節した粗酵素液を樹脂カラムに通し、処理温度は回分法
の場合と同様である。吸着された酵素を溶出するには、
緩衝液、塩類、界面活性剤、例えば０．１〜０．５ Ｍ
リン酸緩衝液、０．１〜ＩＭ硫酸アンモニウム、０．
５％）リドンＸ−１００を含む緩衝液等の如き通常の溶
出剤を用いることができる。溶出剤の癲択は、酵素の種
類、夾雑物の量と種類、使用されたイオン交換樹脂の種
類等に合せてなされるべきであるが、特定の酵素を純度
よく分画するためには、酵素の安定性を加味し、硫酸ア
ンモニウムと緩碕液の混合系が一般に優れている。溶出
剤によっては夾雑している酵素とクロマト分離をするこ
とも可能である。
巨大網目構造を有する強塩基性陰イオン交換樹脂および
強酸性陽イオン交換樹脂を酵素精製に用いる特徴的利点
は、大きな吸着容量を持つこと、夾雑物の多い粗酵素液
に直接応用できること、分画能が高く、他の夾雑する酵
素とのクロマト分離も可能で酵素比活性を大巾に高める
ことができること、工業的スケールでカラムクロマトグ
ラフィーを行う場合に早い流速が確保できること等があ
げられる。
強酸性陽イオン交換樹脂を酵素精製に用いる特徴的利点
は、大きな吸着容量を持つこと、夾雑物の多い粗酵素液
に直接応用できること、分画能が高く、他の夾雑する酵
素とのクロマト分離も可能で酵素比活性を大巾に高める
ことができること、工業的スケールでカラムクロマトグ
ラフィーを行う場合に早い流速が確保できること等があ
げられる。
本発明の方法に従って得られる精製酵素は種々の条件下
に保存してもその保存安定性、熱安定性に関し、悪影響
を受けることがない。
に保存してもその保存安定性、熱安定性に関し、悪影響
を受けることがない。
本発明の精製法は、沈澱化、透析法またはクロマトグラ
フィー的手法などのＩｙ素精精製法併用することももち
ろん可能である。
フィー的手法などのＩｙ素精精製法併用することももち
ろん可能である。
次に本発明の態様を実施例により説明する。
実施例１
ラクテートデヒドロゲナーゼ生産菌、ラクトバシル、Ｘ
、−ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌ
ｇａｒｉｃｕｓ） Ｉ Ａ Ｍ １１２０菌株の培養液
（１７Ｉ）を遠心分離して得た菌体を、５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，ｏ）ｓｏｙで洗浄後、５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）２５０ｍｌに懸濁し、ガラスピーズ（
９１ＩＯ，２５〜０．５朋）を加え、ダイノミル（Ｄｙ
ｎｏ ｍｔｌｌ）で菌体を破砕した。
、−ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌ
ｇａｒｉｃｕｓ） Ｉ Ａ Ｍ １１２０菌株の培養液
（１７Ｉ）を遠心分離して得た菌体を、５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，ｏ）ｓｏｙで洗浄後、５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）２５０ｍｌに懸濁し、ガラスピーズ（
９１ＩＯ，２５〜０．５朋）を加え、ダイノミル（Ｄｙ
ｎｏ ｍｔｌｌ）で菌体を破砕した。
得られた菌体破砕物懸濁液を遠心分゛離し、抽出液２５
０ｍ／を得た。この抽出液には、約２０，０００国際単
位（以下ＩＵと略す）のラクテートデヒドロゲナーゼが
含まれていた。この抽出液を５ＱｍｌのダイヤイオンＨ
ＰＡ−２５（ＯＨタイプ）を充填したカラムに流速５０
ＨＩｔ７Ｂｆ間で通し、抽出液中のラクテートデヒド
ロゲナーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交
換樹脂を５０ ｍＭ燐酸緩衝液（Ｉ）Ｈ７，０）５００
ｍ／で洗浄後、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２００扉ｌをイオン交換
樹脂カラムに流速５６ｍ１／時間で通して、ｌＱｍ／分
画で酵素の溶出を行なった。ラクテートデヒドロゲナー
ゼ活性が５１ Ｕ、７４ｎｅ以上を示すフラクション１
００＋ｎ／を集めた。この溶出液中のラクテートデヒド
四ゲナーゼは１７５０１Ｕ、収率は８７．５ ％、酵素
の比活性の上昇率は１５倍であった。
０ｍ／を得た。この抽出液には、約２０，０００国際単
位（以下ＩＵと略す）のラクテートデヒドロゲナーゼが
含まれていた。この抽出液を５ＱｍｌのダイヤイオンＨ
ＰＡ−２５（ＯＨタイプ）を充填したカラムに流速５０
ＨＩｔ７Ｂｆ間で通し、抽出液中のラクテートデヒド
ロゲナーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交
換樹脂を５０ ｍＭ燐酸緩衝液（Ｉ）Ｈ７，０）５００
ｍ／で洗浄後、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２００扉ｌをイオン交換
樹脂カラムに流速５６ｍ１／時間で通して、ｌＱｍ／分
画で酵素の溶出を行なった。ラクテートデヒドロゲナー
ゼ活性が５１ Ｕ、７４ｎｅ以上を示すフラクション１
００＋ｎ／を集めた。この溶出液中のラクテートデヒド
四ゲナーゼは１７５０１Ｕ、収率は８７．５ ％、酵素
の比活性の上昇率は１５倍であった。
実施例２
リボプロティン リパーゼ（ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＬ
ｉｐａｓｅ ）生産菌リゾプス・ジャボニクス（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｅ ｊａｐｏｎｉａｕａ ＫＹ５２１ ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ ３６５１ ）菌株の培養液を遠心分離して得た
リボプロティンリパーゼ含有の上澄液（培養ろ液）１ｊ
（リボプロティンリパーゼ活性６００ ＮＵ）を１０（
１１４のダイヤイオンＨＰＡ−２５（ＣＩタイプ）を充
填し九カラムに流速１００吟時間で通塔し、培養ｐ液中
リボプロティンリパーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめ
る。イオン交換樹脂を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐａａｓ）
ｘｊで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む、５０ ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）３００扉ｌをイオン交換樹脂
カラムに流速１００ψ時間 で通して１０＋／分画で酵
素の溶出を行なった。リボプロティンリパーゼ活性０．
５ＩＵβ以上を示すフジクツ３フ１８０ ティンリパーゼは３ ８ ０ ＩＵ，収率は６３．３係
、酵素の比活性の上昇率は１１倍であった。
ｉｐａｓｅ ）生産菌リゾプス・ジャボニクス（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｅ ｊａｐｏｎｉａｕａ ＫＹ５２１ ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ ３６５１ ）菌株の培養液を遠心分離して得た
リボプロティンリパーゼ含有の上澄液（培養ろ液）１ｊ
（リボプロティンリパーゼ活性６００ ＮＵ）を１０（
１１４のダイヤイオンＨＰＡ−２５（ＣＩタイプ）を充
填し九カラムに流速１００吟時間で通塔し、培養ｐ液中
リボプロティンリパーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめ
る。イオン交換樹脂を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐａａｓ）
ｘｊで洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む、５０ ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）３００扉ｌをイオン交換樹脂
カラムに流速１００ψ時間 で通して１０＋／分画で酵
素の溶出を行なった。リボプロティンリパーゼ活性０．
５ＩＵβ以上を示すフジクツ３フ１８０ ティンリパーゼは３ ８ ０ ＩＵ，収率は６３．３係
、酵素の比活性の上昇率は１１倍であった。
実施例３
グルタミナーゼ生産菌シュードモナス属の二種でＰ−２
１０（ＡＴＣ．（！−２１０２．５）菌株の培養液５１
を遠心分離して得た菌体を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨａ
ｏ）２１で洗浄後、１０ｍＭアスパラギン酸ナトリウム
を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）５００扉ｌに
懸濁し、ガラスピーズ（ダ０．５〜ｏ．７５ｎ）を加え
、ダイノミルで菌体を破砕した。得られた菌体破砕懸濁
液を遠心分離し、抽出液５ ５ ０ １！ｌを得た。こ
の抽出液には約２００００ＩＵのグルタミナーゼが含ま
れていた。この抽出液を２５０４のダイヤイオンＨｐｘ
−３ｏ（ｕａクイブ）を充填したカラムに流速２ ５
０ ｍｌ／時間で通し、抽出液中のグルタミナーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を１ ０
ｍＭアスパラギン酸ナトリウムを含む１０ｍＭ１ｌｉ
酸緩衝液（ ｐＨ６．０）１５１で洗浄後、１０ｍＭア
スパラギン酸ナトリウムおよび０．５Ｍ硫酸アンモニウ
ムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨｓ．ｏ）ｔｊをイオ
ン交換樹脂カラムに流速２ ５ ０ ｍｌ／時間で通し
て、２０−分画で酵素の溶出を行なった。グルタミナー
ゼ活性が５ＩＵ／ｄ以上を示すフラクション６０（１＋
ｊを集めた。この溶出液中のグルタミナーゼは１３，０
ＯＯＩＵ１収率は６５チ、酵素の比活性の上昇率は４２
倍でありた。
１０（ＡＴＣ．（！−２１０２．５）菌株の培養液５１
を遠心分離して得た菌体を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨａ
ｏ）２１で洗浄後、１０ｍＭアスパラギン酸ナトリウム
を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）５００扉ｌに
懸濁し、ガラスピーズ（ダ０．５〜ｏ．７５ｎ）を加え
、ダイノミルで菌体を破砕した。得られた菌体破砕懸濁
液を遠心分離し、抽出液５ ５ ０ １！ｌを得た。こ
の抽出液には約２００００ＩＵのグルタミナーゼが含ま
れていた。この抽出液を２５０４のダイヤイオンＨｐｘ
−３ｏ（ｕａクイブ）を充填したカラムに流速２ ５
０ ｍｌ／時間で通し、抽出液中のグルタミナーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を１ ０
ｍＭアスパラギン酸ナトリウムを含む１０ｍＭ１ｌｉ
酸緩衝液（ ｐＨ６．０）１５１で洗浄後、１０ｍＭア
スパラギン酸ナトリウムおよび０．５Ｍ硫酸アンモニウ
ムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨｓ．ｏ）ｔｊをイオ
ン交換樹脂カラムに流速２ ５ ０ ｍｌ／時間で通し
て、２０−分画で酵素の溶出を行なった。グルタミナー
ゼ活性が５ＩＵ／ｄ以上を示すフラクション６０（１＋
ｊを集めた。この溶出液中のグルタミナーゼは１３，０
ＯＯＩＵ１収率は６５チ、酵素の比活性の上昇率は４２
倍でありた。
実施例４
ピラノースオキシダーゼ生産菌コリオラスペルシカラー
（Ｃｏｒｉｏｒｕｓ ｖｅｒｇｔａｏｌｏｒ）ＡＴＣＣ
２０１５５菌株の培養液−ｘｏｌを濾過して得た菌体を
５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐａ７．ｏ）ｔｊに懸濁し、ガ
ラスピーズ（グ０．５〜０．７５闘）を加え、ダイノミ
ルで菌体を破砕した。得られた菌体破砕物懸濁液を遠心
分離し、抽出液８００づを得た。この抽出液には，９５
０ＩＵのピラノースオキシダーゼが含まれていた。この
抽出液を５００４のダイヤイオンＨｐＡ− ７ ５ （
ｃｌｌタイプ）を充填したカラムに流速２ ｓ ｏ
ｍｌ／時間で通し、抽出液中のピラノースオキシダーゼ
をイオン交換樹脂に吸着せしめる。イオン交換樹脂を０
． １ Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ）リス緩衝
液（ｐＨ７．０）２．５１で洗浄後、０．２５Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．ｏ）
ｚ／をイオン交換樹脂カラムに流速５００睦特間で通し
て、２０ｒｒｔ１分画で酵素の溶出を行な９た。ピラノ
ースオキシダーゼ活性が０． ２ ５ ＩＩＩ／−以上
を示すフラクション７５０ｄを集めた。この溶出液中の
ピラノースオキシダーゼは７３２ＩＵ．収率７７チ、酵
素の比活性の上昇率は１７．８倍であった。
（Ｃｏｒｉｏｒｕｓ ｖｅｒｇｔａｏｌｏｒ）ＡＴＣＣ
２０１５５菌株の培養液−ｘｏｌを濾過して得た菌体を
５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐａ７．ｏ）ｔｊに懸濁し、ガ
ラスピーズ（グ０．５〜０．７５闘）を加え、ダイノミ
ルで菌体を破砕した。得られた菌体破砕物懸濁液を遠心
分離し、抽出液８００づを得た。この抽出液には，９５
０ＩＵのピラノースオキシダーゼが含まれていた。この
抽出液を５００４のダイヤイオンＨｐＡ− ７ ５ （
ｃｌｌタイプ）を充填したカラムに流速２ ｓ ｏ
ｍｌ／時間で通し、抽出液中のピラノースオキシダーゼ
をイオン交換樹脂に吸着せしめる。イオン交換樹脂を０
． １ Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ）リス緩衝
液（ｐＨ７．０）２．５１で洗浄後、０．２５Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．ｏ）
ｚ／をイオン交換樹脂カラムに流速５００睦特間で通し
て、２０ｒｒｔ１分画で酵素の溶出を行な９た。ピラノ
ースオキシダーゼ活性が０． ２ ５ ＩＩＩ／−以上
を示すフラクション７５０ｄを集めた。この溶出液中の
ピラノースオキシダーゼは７３２ＩＵ．収率７７チ、酵
素の比活性の上昇率は１７．８倍であった。
実施例５
グロテアーゼ生産菌 セラチア属（Ｓθｒｒａｔｉａｓ
ｐ、ＡＴｃｃ２１０７４）菌株の培養液を遠心分離して
得たプロテアーゼ含有の上澄液（培養沖液）１１（プロ
テアーゼ６００ ＫＵ）を５０ｍ１のダイヤイオンＨＰ
Ａ、−７５（ＣＩタイプ）を充填したカラムに流速２０
０ｍ（／時間で通塔し、培養Ｐ液中のプロテアーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７）１５０１！Ｉ／で洗浄後、Ｉ
Ｍ 硫Ｈｙ ｙモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
ｌ（７）１５０Ｍをイオン交換樹脂力２ムに流速５０ｍ
１７時間で通して、１０ｍ１分画で酵素の溶出を行なっ
た。プロテアーゼ活性２０００８７ｍ１以上を示すフラ
クション８０ｄを集めた。この溶出液中のプロテアーゼ
は、５１０ ＫＵ、収率は８５％、酵素の比活性の上昇
ボは８倍であった。
ｐ、ＡＴｃｃ２１０７４）菌株の培養液を遠心分離して
得たプロテアーゼ含有の上澄液（培養沖液）１１（プロ
テアーゼ６００ ＫＵ）を５０ｍ１のダイヤイオンＨＰ
Ａ、−７５（ＣＩタイプ）を充填したカラムに流速２０
０ｍ（／時間で通塔し、培養Ｐ液中のプロテアーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７）１５０１！Ｉ／で洗浄後、Ｉ
Ｍ 硫Ｈｙ ｙモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
ｌ（７）１５０Ｍをイオン交換樹脂力２ムに流速５０ｍ
１７時間で通して、１０ｍ１分画で酵素の溶出を行なっ
た。プロテアーゼ活性２０００８７ｍ１以上を示すフラ
クション８０ｄを集めた。この溶出液中のプロテアーゼ
は、５１０ ＫＵ、収率は８５％、酵素の比活性の上昇
ボは８倍であった。
特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社手続補正書
特許庁長官殿
１、事件の表示
昭和５７年特許願第７０５９８号
２、発明の名称
酵素の精製法
３、補正をする者
名称 （１０２）協和醗酵工業株式会社（置：０３−２
０１−７２１１内線２７５１）明細書の特許請求の範囲
の欄及び発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容− ＋１１ 特許請求の範囲を別紙のとおシ訂正する。
０１−７２１１内線２７５１）明細書の特許請求の範囲
の欄及び発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容− ＋１１ 特許請求の範囲を別紙のとおシ訂正する。
（２）明■＠Ｌ−−−−
１真下４−３行の「もしくは３％以下の架橋度を有する
ポーラス型」を削除する。
ポーラス型」を削除する。
（３）３頁１０−１１行の「ケミカルプロセス社製」を
「ダイヤモンドジャムロック社製」に訂正する。
「ダイヤモンドジャムロック社製」に訂正する。
（４）３真下６行の「溶解している」の前に「酵素が」
を加入する。
を加入する。
（５）３真下３行を次のごとく追加訂正する。
［ない。また強酸性陽イオン交換樹脂では巨大網目構造
型のＡＧＭＰ−５０（バイオラッド製 ・ラボラトリ−社：商品名）等が酵素を吸着ハ 溶出できるといわれているが、吸Ｎ劉°等明らかてなく
実用的な適用は不明である。」（６）４頁６−７行の［
もしくは３％以下の架橋度を有するポーラス型」を削除
する。
型のＡＧＭＰ−５０（バイオラッド製 ・ラボラトリ−社：商品名）等が酵素を吸着ハ 溶出できるといわれているが、吸Ｎ劉°等明らかてなく
実用的な適用は不明である。」（６）４頁６−７行の［
もしくは３％以下の架橋度を有するポーラス型」を削除
する。
（７）４真下７−１行を次のごとく訂正する。
［至った。
本発明で使用されるハイポーラス型の強塩基性陰イオン
交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属するーによればある
種の酵素の吸脱着に適用できることが知られている巨大
網目構造型の強塩基性陰イオン交換樹脂であるアンバー
ライトＩＲＡ−９０４、Ｉ几Ａ−９３８と比較して吸着
量で２倍以上、酵素比活性上昇で１〜３倍の効果をあげ
ることができる。
交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属するーによればある
種の酵素の吸脱着に適用できることが知られている巨大
網目構造型の強塩基性陰イオン交換樹脂であるアンバー
ライトＩＲＡ−９０４、Ｉ几Ａ−９３８と比較して吸着
量で２倍以上、酵素比活性上昇で１〜３倍の効果をあげ
ることができる。
一方、本発明で使用するハイポーラス型の強酸性陽イオ
ン交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属する−は酵素を吸
着溶出できるといわれている巨大網目構造型の強酸性陽
イオン交換樹脂であるＡＧＭＰ −５０、デュオライト
ｏ−１ｏ（ダイヤモンドジャムロック社ｊＲ：商品名）
に比べ２−３倍の吸着量を有する。」（８）５頁４−５
行の「４級アミンまたは３級アミンさらにはスルフォン
基」を１４級アンモニウム基またはスルホ基」に訂正す
る。
ン交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属する−は酵素を吸
着溶出できるといわれている巨大網目構造型の強酸性陽
イオン交換樹脂であるＡＧＭＰ −５０、デュオライト
ｏ−１ｏ（ダイヤモンドジャムロック社ｊＲ：商品名）
に比べ２−３倍の吸着量を有する。」（８）５頁４−５
行の「４級アミンまたは３級アミンさらにはスルフォン
基」を１４級アンモニウム基またはスルホ基」に訂正す
る。
（９）６頁を全文削除する。
Ｑｏ ７頁第１表の下２行を削除する。
ａｌ）８頁１０−１１行を次のごとく訂正する。
「％に本発明で用いるイオン交換樹脂は酵素の吸着およ
び溶出に適用できることが知られている巨大網目構造の
イオン交換樹脂に比べ吸着量や溶出率等に優れている。
び溶出に適用できることが知られている巨大網目構造の
イオン交換樹脂に比べ吸着量や溶出率等に優れている。
さ」
Ｕり １０頁第２表の１行目の「比活性上昇率」を「比
活性上昇率＊１」、２行目の「６０．６Ｕ／ｌｄＪをｒ
６０．６ Ｉ Ｕ／ｄ”Ｊにそれぞれ訂正する。
活性上昇率＊１」、２行目の「６０．６Ｕ／ｌｄＪをｒ
６０．６ Ｉ Ｕ／ｄ”Ｊにそれぞれ訂正する。
Ｑ３１１１頁下１行０「ダイヤイオンＰＫ−２０６」を
［デュオライト０−１０Ｊ、ｒ２００ ９５ ６Ｊを［
９０９５４Ｊにそれぞれ訂正する。
［デュオライト０−１０Ｊ、ｒ２００ ９５ ６Ｊを［
９０９５４Ｊにそれぞれ訂正する。
Ｑ４）１１頁の第２表に次の記載を追加する。
Ｑ５１１２頁７行のｒ １１５〜１／ｌｏ ｉＪＯ前に
「該液に対し」を加入する。
「該液に対し」を加入する。
（１０１４頁１２−１３行の「約２０．０００国際年位
（以下ＩＵと略す月を［約２０，０ＯＯＩＵＪに訂正す
る。
（以下ＩＵと略す月を［約２０，０ＯＯＩＵＪに訂正す
る。
に訂正する。
（１８１９頁１２行〕「Ｕ」をｌ’−ＩＵＪに訂正する
。
。
Ｈ９頁５行の「加水分解酵素」を「加水分解酵素」に訂
正する。
正する。
特＃！Ｆ請求の範囲
性隘イオン交換樹脂に接触させて酵素を吸着させ、該イ
オン交換樹脂に吸着した酵素を溶出剤により溶出し、そ
の活性区分を集めて精製酵素溶液を得ることを特徴とす
る酵素の精製法。
オン交換樹脂に吸着した酵素を溶出剤により溶出し、そ
の活性区分を集めて精製酵素溶液を得ることを特徴とす
る酵素の精製法。
Claims (1)
- 酵素を含有する溶液を７１イボ−ラス型もしくは３チ以
下の架橋度を有するポーラス型の強酸性陽イオン交換樹
脂またはノ・イボ−ラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂
に接触させて酵素を吸着させ、該イオン交換樹脂に吸着
した酵素を溶出剤により溶出し、その活性区分を集めて
精製酵素溶液を得ることを特徴とする酵素の精製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57070598A JPS58209980A (ja) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | 酵素の精製法 |
| US06/488,174 US4560661A (en) | 1982-04-27 | 1983-04-25 | Process for purifying enzymes |
| DE8383104077T DE3372381D1 (en) | 1982-04-27 | 1983-04-26 | Process for purifying enzyme |
| EP83104077A EP0092845B1 (en) | 1982-04-27 | 1983-04-26 | Process for purifying enzyme |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57070598A JPS58209980A (ja) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | 酵素の精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58209980A true JPS58209980A (ja) | 1983-12-07 |
| JPH0260312B2 JPH0260312B2 (ja) | 1990-12-14 |
Family
ID=13436156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57070598A Granted JPS58209980A (ja) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | 酵素の精製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4560661A (ja) |
| EP (1) | EP0092845B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58209980A (ja) |
| DE (1) | DE3372381D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013203692A (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-07 | Mitsubishi Chemicals Corp | 精製フェノール系化合物の製造方法 |
Families Citing this family (13)
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|---|---|---|---|---|
| EP0262118A1 (en) * | 1986-01-16 | 1988-04-06 | Cetus Corporation | Methods and fungal strains for pyranosone production |
| US4758349A (en) * | 1987-03-12 | 1988-07-19 | Ma Hsien Chih | Separation process for biological media |
| NL8700767A (nl) * | 1987-04-01 | 1988-11-01 | Groningen Science Park | Dipeptidase, isolering daarvan uit melkzuurbacterien, antilichamen tegen het dipeptidase, gebruik van het dipeptidase en van de antilichamen daartegen. |
| US5059535A (en) * | 1989-04-12 | 1991-10-22 | Chembiomed, Ltd. | Process for the separation and purification of sialyl transferases |
| ATE167230T1 (de) * | 1989-08-23 | 1998-06-15 | Hadassah Med Org | Wundheilmittel enthaltend heparanase |
| DE4027290C2 (de) * | 1990-08-29 | 1995-03-23 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus enzymhaltigen Suspensionen |
| CA2149922C (en) * | 1992-12-04 | 2007-05-15 | Thomas W. Macallister | Genetically engineered glutaminase and its use in antiviral and anticancer therapy |
| PH31093A (en) * | 1993-08-06 | 1998-02-05 | Nestec Ltd | Lactobacillus bulgaricus having decreased acid production and/or improved aroma and flavor production and food composition comprising said lactobacillus. |
| JPH08205861A (ja) * | 1994-12-07 | 1996-08-13 | Kikkoman Corp | 新規なピラノース・オキシダーゼ、ピラノース・オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びピラノース・オキシダーゼの製造法 |
| DE10134347B4 (de) * | 2001-07-02 | 2006-09-28 | Nordmark Arzneimittel Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Aufreinigung eines Enzyms |
| WO2006116540A2 (en) * | 2005-04-27 | 2006-11-02 | Avici Systems | An application specific reconfigurable network processor |
| TW200741005A (en) * | 2005-08-10 | 2007-11-01 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | A purification method of cytidine diphosphate |
| WO2015123433A2 (en) * | 2014-02-12 | 2015-08-20 | Goddard Labs, Inc. | Rapid detection of human pathogens in plant material or water |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2952586A (en) * | 1955-02-23 | 1960-09-13 | Nagase & Co Ltd | Purification of proteases |
| DE1036192B (de) * | 1955-02-23 | 1958-08-14 | Nagase & Co Ltd | Verfahren zur Reinigung von Proteasen |
| ES429986A1 (es) * | 1973-09-13 | 1977-05-16 | Cpc International Inc | Un procedimiento para preparar un producto portador de levu-losa. |
| JPS5170871A (en) * | 1974-12-16 | 1976-06-18 | Mitsubishi Chem Ind | Fuyoseikosozaino seizoho |
| JPS52110886A (en) * | 1976-03-12 | 1977-09-17 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Collecting method of urokinase |
| JPS5736986A (en) * | 1980-08-13 | 1982-02-27 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Immobilized aminoacylase agent and its preparation |
-
1982
- 1982-04-27 JP JP57070598A patent/JPS58209980A/ja active Granted
-
1983
- 1983-04-25 US US06/488,174 patent/US4560661A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-04-26 DE DE8383104077T patent/DE3372381D1/de not_active Expired
- 1983-04-26 EP EP83104077A patent/EP0092845B1/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013203692A (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-07 | Mitsubishi Chemicals Corp | 精製フェノール系化合物の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0092845A2 (en) | 1983-11-02 |
| US4560661A (en) | 1985-12-24 |
| DE3372381D1 (en) | 1987-08-13 |
| JPH0260312B2 (ja) | 1990-12-14 |
| EP0092845B1 (en) | 1987-07-08 |
| EP0092845A3 (en) | 1984-03-14 |
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