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Verfahren zur Reinigung von Proteasen Die Erfindung hezieht sich auf
ein wirtschaftliches und einfaches Verfahren zur Gewinnung von Proteasen hoher Reinheit
aus proteasenhaltigen Lösungen Sie bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren,
bei dem Proteasen unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen isoliert, entfärbt
und gereinigt werden.
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Proteasen sind Enzyme, die in großem Umfange in der Medizin, der
Xahrungsmittelindustrie, Lederverarbeitung, Faserbehandlung und verschiedenen anderen
Industrien verwendet werden. Die Proteasen müssen jedoch gut gereinigt werden, damit
man sie fiir spezifische Arzneien, zur Herstellung bestimmter Nahrungsmittel oder
für wissenschaftliche Forschungen verwenden kann. Es sind hisher verschiedene Verfahren
zur Reinigung von Proteasen verwendet worden; beispielsweise können die Proteasen
ein oder mehrmals durch Aussalzen, durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels
und/oder durch Einstellung des pH-Wertes ausgefällt werden. Diese gebräudlichen
Reinigungsverfahren verursachen jedoch oft eine Abscheidung oder Ausfällung verschiedener
Arten von fremdem Protein und anderen Verunreinigungen zusammen mit den Enzymen.
Es ist deshalb iil)lich. zur Erreichung eines wirklich zufriedenstellenden Reinheitsgrades
unter peinlich genauen Bedingungen zu arbeiten, wodurch die Ausbeute an den gewünschten
Enzymen heträchtlich vermindert wird.
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Außerdem beruhen alle diese Methoden auf einer Laboratoriumsteehnik
und sind deshalb nicht für großtechnische Verwendung geeignet.
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Proteasen sind Bestandteile oder Sekrete vieler Arten von Tieren,
Pflanzen oder Mikroorganismen; ihre (;gattungen sind deshalb außerordentlich zahlreich.
Die Proteasen sind wie andere Enzyme Proteine und können in solche mit saurem, neutralem
oder basischem isoelektrischem Punkt eingeteilt werden.
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Als Ergebnis eingehender Experimente hat sich herausgestellt, daß
die Proteasen mit neutralem oder basischem isoelektrischem Punkt bei Ver-endung
grobporöser Kationeiiaustauscherharze durch ein Adsorptions-Auswasch-Verfallren
gereinigt werden können. Unter »Adsorptions-Auswaseh-Verfahren ist ein Verfahren
zu verstehen, bei dem die Protease an das Harz adsorbiert und die adsorbierte Protease
anschließend mit einem Lösungsmittel aus dem Harz herausgewaschen wird. Mit anderen
Worten: Wenn eine verunreinigte Proteasenlösung durch eine Kolonne geleitet wird,
die mit einem grobporösen Kationenaustauscherharz gefüllt ist, welches mit einer
Lösung mit geeignetem pH-Wert und passender Ionenstärke behandelt wurde, wird das
zu gewinnende Enzym in der Harzl<olonne adsorbiert werden. während der größte
Teil der Verunreinigungen durchläuft. Dann läßt man eine Lösung mit anderem p11-
Wert
und anderer Ionerlstärke durch die Kolonne strömen, so daß lediglich das gewiinschte
Enzym aus der Kolonne herausgelöst wird und die meisten der adsorbierten Verunreinigungen
darin verbleiben. Auf diese Weise kann eine wirksame Reinigung sehr einfach durchgeführt
werden. Dieses Verfahren unterscheidet sich von jedem üblichen Reinigungsprozeß
und ermöglicht eine Reinigung im großen Maßstah mit einer einfachen Apparatur. Wie
im nachfolgenden ausgeführt wird, können sehr viele Ionenaustauscherharze zur wirkungsvollen
Adsorption von Proteasen und anschließendem Herauswaschen der Proteasen in aktivem
Zustand verwendet werden. Jedoch kommen entsprechend den Versuchsergehnissen von
allen lonenaustauscherharzen nur grohporöse Kationenaustauscher in Frage.
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Proteasen werden aus biologischen Stoffen gewonneu und enthalten
deshalb gewöhnlich färbende Verunreinigungen. Manche der färbenden Stoffe, besonders
melaminähnliche, welche in Proteasen aus Pflanzen oder Mikroorganismen enthalten
sind, besitzen eine derart hohe Affinität zu dem Enzymprotein, daß es sehr schwierig
ist, sie durch ein übliches Reinigungsverfahren vollständig zu entfernen. Bei Verwendung
des Adsorptions-Auswasch-Verfahrens kann ein verhältnismäßig großer Teil der Lösung,
welche die herausgewaschene Protease enthält, oft bis zu völliger Farblosigkeit
gereinigt werden, während der Rest
eine kleine Menge der färbenden
Substanz als Verunreinigung enthalten kann. Zur vollständigen Entfernung solcher
färbenden Stoffe in diesem Restteil kann das Adsorptions-Auswasch-Verfahren wiederholt
werden.
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Um jedoch diese Komplizierung und die damit verbundene Herabsetzung
der Ausbeute zu vermeiden, ist es oft vorzuziehen. ein »Entfärbungsverfahren« zu
l)enutzen, welches im nachfolgenden näher beschrieben wird: Das Enzym kann ohne
Verluste entfärbt werden. wenn man die Enzymlösung durch eine Kolonne eines Kationen-
oder Anionenaustauscherharzes hindurchleitet, welches, wie weiter unten erwähnt
wird, hohe Affinität zu der färbenden Verunreinigung besitzt, ohne das Enzym zu
adsorbieren. Dieses Entfärhungsverfahren kann nicht nur zur Entfärbung der beim
Adsorptions-Auswasch-Verfahren erhaltenen gefärbten Fraktion verwendet werden, sondern
auch zur Reinigung jeder anderen gefärbten Proteasenlösung.
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Es ist ferner ein wirkungsvolles Verfahren, nicht nur Proteasen, sondern
auch Amylasen und andere Enzyme zu entfärben.
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Die Erfindung ist nachstehend im einzelnen näher veranschaulicht.
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A. Adsorptions-Auswasch-Prozeß Entsprechend den Ergebnissen der Forschungsarbeiten.
welche der Erfindung zugrunde liegen, bilden die Ionenaustauscherharze, die in der
Lage sind, gewisse Proteasen zu adsorbieren und sie in aktivem Zustand wieder freizugeben,
sehr grob poröse Phenoxyharze, wie z. B. grobporöse Phenolpolymere, die Phenoxvessigsäure
als lonenaustauschradikale enthalten (von dem Wissenschaftlichen Forschungsinstitut
in Tokio, Japan, hergestellt und im nachfolgenden als Kaken-Resin 1 hezeichnet),
grobporöse Phenolpolymere, die Methylen-Sulfonsäure als Ionenaustauschradikale enthalten
(Duolite C-10), grobporose Acrylpolymere. deren Ionenaustauschradikale durch Carhoxvlsäure
gebildet werden (Duolite CS-101 und Amberlite IRC-50), sehr grob poröse Phenolpolymere
mit phenolischen Ionenaustauschradikalen (Duolite S-30). sehr grob poröse Styrolpolymere
mit Sulfonsäuregruppen als Ionenaustauschradikale (Low Crosslinking Dowex-50) usw.
Unter diesen sind stark saure und schwach saure Harze. Die Stärke des Säuregrades
des Kationenaustauscherharzes ist demnach unwesentlich. Ebenso ist die Harzgrundlage
nicht auf eine spezifische Verbindung beschränkt.
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Jedoch müssen alle verwendbaren Kationenaustauscherharze grob porös
sein, wenn auch nicht alle grohporösen Kationenaustauscherharze immer verwendet
werden können, weil die Adsorption des Enzyklus an dem Ionenaustauscherharz nicht
durch einen einfachen Ionenaustauschvorgang, sondern über einen außerordentlich
komplizierten Mechanismus vor sich geht. Das kann man auch aus der Tatsache schließen
daß Proteasen trotz ihres amphoteren Charakters nur mühsam wirkungsvoll durch ein
grobporöses Anionenaustauscherharz adsorbiert und aus diesem ausgewaschen werden
können.
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Das Papain, die Bac.-natto-Protease, die Bac.-amyloliquefaciens-Protease
und vier Arten der B.-subtilis-Protease usw., deren isoelektrischer Punkt e twa
im Neutralen oder darüber liegt, können von vielen untersuchten Enzymen auf wenigstens
einem der obenerwähnten Harze adsorbiert und aus diesem herausgewaschen werden.
Es läßt sich deshalb sagen, daß alle Proteasen, deren isoelektrischer Punkt im Neutralen
oder darüber liegt, mittels eines Adsorptions-
Auswasch-Verfahrens durch wenigstens
eines der erfindungsgemäßen grohporösen E4ationenaustauscherharze gereinigt werden
können.
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Das l Herauswaschen der Protease, welche an einem Harz adsorbiert
ist, wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen eine Adsorption nicht eintritt.
Dies kann normalerweise erreicht werden, indem man durch das Harz, welches die Protease
adsorbiert hat, eine Pufferlösung mit hohem p-Wert oder eine stark konzentrierte
Salzlösung leitet.
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Es folgen einige Ausführungsbeispiele, die das Verfahren der Adsorption
von Proteasen an grol)-porösen Kationenaustauscherharzen und das Herluswaschen der
Proteasen aus diesen Harzes mit T,ösungsmitteln veranschaulichen.
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Beispiel 1 Reinigung von Bac.-subtilis-Protease mit Duolite C-10
Das zerkleinerte Duolite C-10 wurde durch zweimalige Behandlung mit der fünffachen
Menge 2N Natronlauge (NaOH) in die Na-Form umgewandelt und dann mit Wasser gewaschen.
Von dem Harz wurde ein Anteil mit der Maschengröße 60 bis 150 in einer Raummenge
von 2 1 gesammelt. durch zweimalige Behandlung mit ungefähr 5 1 2 N-Salzsäure (H
Cl) in die H-Form übergeführt und mit Wasser gewaschen, worauf das Harz durch Ilindurehleiten
von 5 1 einer Phosphat-Pufferlösung (PH 7,0) welche 0,1 M Na-+ enthielt. gewaschen
und in 5 1 der gleichen Pufferlösung suspensiert wurde. Der p-Wert der Suspension
wurde durch tropfenweise Zugahe gesättigter NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Dieses
Harz wurde in ein Glasrohr von 5 cm Durchmesser eingefüllt, so daß eine Kolonne
von 75 cm Höhe entstand. Darauf wurden 5 1 der besagten Phosphat-Pufferlösung durch
die Kolonne gegeben, so daß der pH-Wert der hindurchgelaufenen Lösung der gleiche
wie der der ursprünglichen Pufferlösung wurde. Das Harz war damit zur Verwendung
fertig.
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Ein aus einer handelsüblichen Kulturlösung durch Aussalzen erhaltenes
Rohprodukt von B.-subtilis-Protease wurde in Wasser oder einer verdünnten Phosphat-Pufferlösung
aufgelöst.
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5 1 einer Lösung, deren Proteasenaktivität pro Milliliter ungefähr
0,07 Casein-Tyrosin-Einheiten war (Cas.T.U./Min. bei 350 C) [Gehalt ungefähr 1 ovo
reine Proteasen wurden bereitet und auf einen p Wert von 7,0 eingestellt. Es ist
am besten. wenn der Gehalt an Ammoniumsulfat und anderen Salzen in der Lösung möglichst
gering ist, jedoch haben weniger als 1 0/o solcher Salze keinen merklichen Einfluß.
Beim Durchleiten dieser Enzymlösung durch die obige Harzkolonne (mit der besagten
0,1 MPufferlösung auf p, 7 abgepuffert) mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1
1 pro Stunde wurde die gesamte Protease in der Kolonne adsorbiert. während die Proteinverunreinigungen
und ein Teil der färbenden Bestandteile durchliefen.
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Darauf wurden ungefähr 5 1 Waschwasser mit einer Durchsatzgesebwindigkeit
von 1 1 pro Stunde durch die Kolonne geleitet. wobei ein großer Teil des adsorbierten
melaminähnlichen Farbstoffes ausgewaschen wurde, die Protease aber nicht. Darauf
wurden 2 1 400/oiges Aceton und anschließend 5 1 Waschwasser durchgeleitet, wodurch
der größte Teil der adsorbierten Farbstoffe entfernt wurde, die Protease jedoch
nicht. Je höher die Konzentration des anwesenden Salzes war, desto mehr färbende
Bestandteile wurden auf dem Harz adsorbiert. Da in der ursprünglichen
Enzymlösung
in diesem Falle ein beträchtlicher Anteil Salz enthalten war, wurde die Farbe adsorbiert;
nach dem jedoch das Salz mit Wasser herausgewaschen war, ließ sich die Farbe ebenfalls
entfernen. Um die färbenden Bestandteile so gut wie möglich herauswaschen. wurde,
wie oben beschrieben, mit Aceton gespült.
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Wenn man eine alkalische Pufferlösung, welche 0,2 M Natriumchlorid.
0,2 M Dinatriumphosphat und 0,2 M Ammoniak in einer Menge von 1 1 pro Stunde durch
die gewaschen Kolonne leitete, waren ungefähr 41 der ersten herausgewaschenen Lösung
farblos und enthielten kein Protein.
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Beim Fortsetzen des Spiilens gelangte nach und nach etwas gelöstes
Protein in die Lösung, und die Proteinkonzentration stieg allmählich an, aber die
Lösung blieb farblos.
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Bisher hatte die herausgewaschene Lösung einen pH-Wert von 6,5 bis
7,2. Ungefähr 2,5 1 einer farblosen proteinhaltigen Fraktion folgten, und die Lösung
begann allmählich Farbe zu zeigen. Zu gleicher Zeit stieg der pH-Wert der Lösung
schnell von ungefähr 7 auf ungefähr 10 an, und allmählich wurde die Färbung stark.
Andererseits wurde jedoch die Menge des so herausgewaschenen Proteins langsam geringer.
Bei der praktischen Durchführung wurde von Zeit zu Zeit ein Tropfen der entstehenden
Lösung in 1 ml 0,6 M Trichloressigsäurelösung gegeben, um das Vorhandensein und
die Konzentration von Protein zu hestimmen. Nach dem Auftreten von Protein wurde
die proteinhaltige farblose Fraktion in einem Behälter gesammelt. Dann wurde die
Fraktion vom Auftreten der Färbung an bis zum Ausbleiben des Proteins in einem anderen
Behälter gesammelt. Das in der farblosen Lösung enthaltene Protein stellte ungefähr
700/0 insgesamt herausgewaschenen Proteins dar und
bestand fast ganz aus reiner Protease.
Ungefähr 30°/o Protein, welche in der verbleibenden gefärbten Fraktion enthalten
waren, bestanden zum größten Teil aus Protease, der Gehalt an färbenden Stoffen
betrug jedoch nur ein Fünftel der in der verwendeten Ausgangsenzymlösung vorhandenen
Menge. Die farblose Fraktion wurde mit Ammoniumsulfat ausgesalzen (Sättigung 0,6).
Das ausgesalzene Produkt wurde mit 75%igem Aceton gewaschen, um das Ammoniumsulfat
zu entfernen, und in einer wässerigen Lösung von 0,02 M Natriumaeetat aufgelöst.
Nachdem zu der Lösung Aceton entsprechend 60 °/o zugesetzt und 1 oder 2 Stunden
gekühlt wurde, entstanden nadelförmige Kristalle. Nachdem diese in 0,01 M Natriumacetatlösung
aufgelöst und in der gleichen Art rekristallisiert worden waren, wurden sie in 0,01
M Natriumacetat dialysiert und anschließend lyophilisiert.
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Das entstandene Produkt war ein weißes Pulver, das sich für lange
Zeit als stabil erwies. Das Pulver war bei der Elektrophorese und anderen physikalischen
und chemischen Prüfungen absolut gleichförmig. Es hat sich bei verschiedenen proteolytischen
Verfahren herausgestellt, daß das Produkt eine Enzymaktivität besitzt, welche 1,5-
bis 5mal so hoch ist wie die einer gleichen Menge von kristallinem Trypsin.
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Protease konte auch aus der im Anschluß an die farblose Fraktion
herausgewaschenen gefärbten Fraktion auskristallisiert werden. Jedoch enthielt diese
Fraktion einen färbenden Stoff mit hoher Affinität zur Protease, so daß eine farblose
Protease schwer zu erhalten war. Bei Anwendung der weiter unten beschriebenen Entfärbungsmethode
ließen sich jedoch vollkommen farblose Kristalle erzielen.
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Die Enzymaktivitäten und die Ausbeute aus den jeweiligen Fraktionen
des obigen Experimentes sind in der nachstehenden Tabelle wiedergegeben:
| Fraktion Menge Enzymaktivität Gesamte |
| Enzymaktivität Färbungsgrad |
| ml T.U./ml T. U. |
| Ursprüngliche Enzymlösung .... 5000 0,073 365 + + +++ + ++ |
| Durchgelaufene Enzymlösusig ... 5000 0,002 10 + + |
| Erste Waschung mit Wasser .... 5000 0,004 20 ++++ |
| Waschung mit 400/oigem Azeton . 2000 0,001 2 + + |
| Zweite Waschung mit Wasser . . . 5000 0 0 + |
| Eluat 1 (farblos) ............... 4200 0,003 13 - |
| Eluat 2 (farblos) ............... 2600 0,080 208 - |
| Eluat 3 (gefärbt) 3100 3100 0,018 56 + |
| Kristalle aus Eluat 2 ........... 16 g 7,5 T. U./g 120 - |
| Halbgereinigtes Produkt*) ..... 15 g 60 T. U./g 90 + |
*) Das halbgereinigte Produkt der vorstehenden Tabelle wurde durch Auflösen des
Acetonniedersdilages aus der Mutterlauge zusammen mit dem ausgesalzenen Produkt
aus der gefärbten Waschlösung in 0,02 M Natriumacetat, Dialysieren und anschließendei
Lyophilisieren erhalten.
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Beispiel 2 Reinigung von Bac.-natto-Proetase mit Duolite C-10 Duolite
C-10 (60 bis 150 Maschen), welches in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt
worden war, wurde mit einer Phosphat-Pufferlösung, welche 0,1 lil Na+ enthielt,
auf einen Wert von 6,5 gepuffert und in eine Kolonne von 5 cm Durchmesser und 75
cm Höhe gebracht. Nachdem ungefähr 30 1 einer Kultur einer Gattung von Bac.-natto
(deren Enzymaktivität pro Milliliter etwa 0,01 T.U. betrug und welche auf einen
pH-Wert von 6,5 eingestellt war)
mit einer Geschwiiidigkeit von 1 1 pro Stunde durch
diese Kolonne geleitet worden war, war fast die gesamte Protease adsorbiert. Die
Kolonne wurde mit Wasser und mit 40%igem Aceton wie im Beispiel 1 gewaschen, und
die gleiche Pufferlösung wurde zum Auswaschen hindurchgeleitet. Man erhielt nach
praktisch dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 3 1 einer farblosen Proteasenfraktion
und 4,5 1 einer leicht gefärbten Proteasenfraktion, wobei die erste Fraktion etwa
60 ovo und die zweite Fraktion etwa 40°/o des insgesamt ausgewaschenen Enzyms enthielt.
Aus der ersten Fraktion wurde das Enzym ausgesalzen und
mit Aceton
gefällt und dann in sehr konzentrierten Zustand gebracht, worauf es in etwa 55 0/obigem
Aceton kristallisiert wurde. Diese Kristalle hatten ebenso wie die Enzyme von Beispiel
1 Nadelform, zeigten jedoch starke Tendenz, sich während der Kristallisation rosettenförmig
zusammenzulagern, und unterschieden sich deshalb im Außeren deutlich von denen im
Beispiel 1. Aus diesen Kristallen ließ sich ein farbloses und stabiles Pulver von
reiner Protease durch Lyophilisation nach der Dialyse gewinnen. Durch Fällung mit
Aceton und anschließendes Lyophilisieren kann man aus der Kristallmutterlauge und
der gefärbten Fraktion ein leicht gefärbtes und stabiles Enzympulver mit hemerkenswert
hohem Reinheitsgrad gewinnen.
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Beispiel 3 Reinigung von Papain mit Duolite CS-101 Duolite CS-101
(Na-Form) mit einer Teilchengröße von 60 bis 150 Maschen in gequollenem Zustand
wurde nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 auf einen pH-Wert von 6,0 gepuffert
und in eine Kolonne von 2 cm Durchmesser und 30 cm Höhe gehracht. Durch Extrahierung
von 5 g handelsüblichem Papainpulver mit 500 ml 0,02 M wässeriger Natriumcyanidlösung,
Einstellung des p-Wertes auf 6,5 und anschließendes Filtrieren wurde eine klare
Lösung hergestellt. Nach dem Hindurchleiten der Lösung durch die Kolonne mit einer
Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml pro Stunde war das gesamte Papain in der Kolonne
adsorbiert. Die Kolonne wurde mit etwa 1000 ml einer 0,02M Natriumphosphat-Pufferlösung
mit einem p11-Wert von 6,0 gewaschen. Dann wurde eine Pufferlösung, welche einen
pE-Wert von 8,0 hesaß und 0,02 M Natriumcyanid, 0,2 M Natriumacetat und 0,2M Dinatriumphosphat
enthielt, mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml pro Stunde durch die Kolonne
gegeben. Dabei wurde zunächst nur sehr wenig Enzym herausgewaschen, jedoch nach
etwa einer Stunde wurde Papain in hochkonzentriertem und farblosem Zustand gelöst.
Der pH-Wert dieser papainhaltigen Fraktion war 5,8 bis 6,2. Die reinen Papainkristalle
konnten nach dem üblichen Verfahren aus dieser Fraktion in hoher Ausheute gewonnen
werden, indem die Lösung durch Aussalzen konzentriert, auf einen pH-Wert von 6,5
eingestellt und gekühlt wurde.
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Beispiel 4 (a) Reinigung von Bac.-subtilis-Protease mit Kaken-Resin
I Die Protease von Bac.subtilis konnte unter Verwendung von Kaken-Resin I nach dem
gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 gereinigt werden. Jedoch war in diesem Falle
die Konzentration der ausgewaschenen Lösung an Enzym zwei- bis dreimal so niedrig
wie im Beispiel 1. Ferner betrug die Menge der gefärbten Fraktion etwa das Doppelte
von der im Beispiel 1.
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Demnach sind die hier verwendeten Harze nicht so wirksam wie Duolite
C-10.
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(h) Reinigung von drei anderen Arten der Bac.-subtilis-Protease als
der im Beispiel 1 beschriebenen mit Duolite C-10 Drei Arten von Bac.-subtilis-Protease,
welche aus Züchtungen stammten, die sich von der Züchtung im Beispiel 1 und 4 (a)
unterschieden, konnten durch Verwendung von Duolite C-10 nach dem gleichen Verfahren
wie im Beispiel 1 gereinigt und kristallisiert werden. wohei fast die gleichen Resultate
erzielt wurden.
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Duolite C-10 ist erfindungsgemäß zur Reinigung aller Arten von Bac.-subtilis-Protease
als verwendbar anzusehen.
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(c) Reinigung der Protease von Beispiel 4 (b) mit den Harzen von Beispiel
4 (a) Das Verfahren der Reinigung und sein Ergebnis stimmten praktisch mit dem von
Beispiel 4 (a) überein.
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(d) Reinigung von Papain mit Duolite C-10 Die Reinigung wurde in
der gleichen Art wie im Beispiel 3 durchgeführt, jedoch war die Menge des Enzyms,
welche pro Einheit dieses Harzes behandelt werden konnte, nur ungefähr halb so groß
wie die bei Duolite CS-101, und außerdem war der Reinheitsgrad der herausgewaschenen
Protease etwas geringer als dort.
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(e) Reinigung von Papain mit dem Harz von Beispiel 4 (a) Das Reinigungsverfahren
stimmte mit dem von Beispiel 4 (d) überein. jedoch war die Kapazität des Harzes
und die Reinheit des herausgewaschenen Enzyms niedriger als im Beispiel 4 (d).
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B. Entfärbung von Proteasen mit Ionenaustauscherharzen Fast alle färbenden
Stoffe, die nicht nur in Proteasen, sondern ganz allgemein in Enzymen auftreten,
sind elektrisch positiv oder negativ oder bilden amphotere Elektrolyte. Sie können
deshalb unter entsprechenden Bedingungen von geeigneten Ionenaustauscherharzen adsorbiert
werden. Die Enzyme selbst sind amphotere Elektrolyte, aber sie können nur auf grobporösen
Ionenaustauscherharzen adsorbiert werden, da sie hochmolekulare Substanzen darstellen.
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Ferner stellt bei solchen hochmolekularen Proteinen die Adsorption
einen spezifischen und ziemlich komplizierten Mechanismus dar, welcher nicht als
einfache Ionenaustauschadsorption betrachtet werden kann.
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Deshalb giht es nur wenige lonenaustauscherharze, welche Protease
adsorbieren, und es ist leicht, Ionenaustauscherharze zu ermitteln, welche ohne
Adsorption von Enzymen die färbenden Bestandteile adsorhierein können. Eingehende
Untersuchungen haben ergehen, daR die in verschiedenen Proteasen vorhandenen färbenden
Stoffe sowohl durch Anionen- als auch durch Kationenaustauscherharze mehr oder weniger
gut adsorbiert werden, solange diese in gewissem Grade grobporös sind. Jedoch gibt
es nur verhältnismäßig wenig Harze. welche diese färbenden Stoffe sehr wirksam adsorbieren,
Proteasen jedoch überhaupt nicht zurückhalten. Zur Entfärbung solcher Proteasenlösungen
sind von den Kationenaustauscherharzen mittelporöse Phenolpolymere geeignet, deren
Ionenaustauschradikale durch Phenoxyessigsäure gebildet werden (vom Wissenschaftlichen
Forschungsinstitut hergestellt und im nachfolgenden als Kaken-Resin If bezeichnet),
während unter den Anionaustauscherharzen grobporöse Phenolpolymere, deren Ionenaustauschradikale
aus primären, sekundären und tertiären Aminen bestehen (DuoliteA-2, Duolite A-7),
sowie mittelporöse Styrolpolymere, bei denen quaternäre Ammoniumgruppen die lonenaustauschradikale
darstellen (AmberlitcIRA-411). in Frage kommen. Die verwendbaren Harze können also
entweder Kationen-oder Anionenharze sein, und die Stärke der Azidität und Basizität
ist nicht entscheidend. Es folgen zur Veranschaulichung einige Ausführungsheispiele.
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Beispiel 5 Entfärbung einer Bae.-subtilis-Protease mit Kaken-Resin
II Einige der Eiationenaustauscherharze des Wissenschaftlichen Forschungsinstituts
adsorbieren Protease von Bac.subtilis, wie es im Beispiel 4 (a) beschrieben ist,
während andere diese Fähigkeit nicht zeigen. Die letzteren werden zur Entfärbung
verwendet. Diese Harze und andere Kationenaustauscherharze, welche hauptsächlich
aus Phenolpolymerisaten bestehen, wie z. B. Duolite S-30. Duolite C-10 und Duolite
C-3, sind im allgemeinen stärker befähigt, färbende Stoffe aus Lösungen hoher Salzkonzentration
zu adsorbieren als aus Lösungen niedriger Salzkonzentration, unabhängig von einer
Adsorbierung der Proteasen.
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(a) Entfärbung einer Kulturlösung 5 1 Kulturlösung wurden bis zu
einer Konzentration von I M mit Ammoniumsulfat versetzt und auf einen pH-Wert von
6,5 eingestellt. Nach Behandlung mit NaOH und HC1 und Pufferung mit iM Ammoniumsulfat
auf PH 6,5 wurde Kaken-Resin II (Korngröße 60 bis 150 Maschen) in eine Kolonne mit
5 cm Durchmesser und 50 cm Höhe gefüllt. Die obige Lösung wurde mit einer Durchsatzgeschwindigkeit
von 200 ml pro Stunde durch die Kolonne gegeben.
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Die zuerst durchgelaufene Lösung war vollkommen farblos, aber die
nachfolgende Lösung wurde allmählich etwas farbig. Nachdem die gesamte Menge durchgelaufen
war, wurde die Kolonne mit etwa 11 1 M Ammoniumsulfat gewaschen. Die Waschlösung
und die durchgelaufene Lösung wurden miteinander vermischt. Obwohl die so behandelte
Lösung mehr als 950/0 der gesamten in der Kultur oder der ursprünglichen Enzymlösung
vorhandenen Protease enthielt, nahm die Farbe bis auf weniger als den zehnten Teil
ab. Durch Aussalzen dieser Lösung unter Zugabe von Ammoniumsulfat erhielt man ein
pulverförmiges Enzym sehr niedrigen Färbungsgrades, welches zur Herstellung von
Nahrungsmitteln geeignet war.
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(h) Entfärbung eines ausgesalzenen Präparates Das aus einer Kulturlösung
ausgesalzene Produkt wurde in der etwa fünffachen Menge Wasser aufgelöst. Die Lösung
wurde auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht und durch die gleiche Kolonne wie ohen
geleitet. Dabei ließ sich eine fast vollkommene Entfärhung erzielen. Nachdem das
Produkt dialysiert, mit Aceton gefällt und lyophilisiert war, lag ein fast farbloses
Enzympulver vor.
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(c) Entfärbung einer gefärbten Fraktion aus Beispiel 1 oder Beispiel
4 (a) Durch Entfärbung einer gefärbten Fraktion, welche durch die Behandlung mit
Duolite C-10 oder Kaken-Rein 1 nach Beispiel 1 oder Beispiel 4 (a) erhalten wurde,
nach der gleichen Methode wie im Beispiel 5 (a) und anschließende Trocknung konnte
ein farbloses reines Enzym mit ungefähr 90°/o Reinheit erzielt werden.
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Beispiel 6 Entfärbung eines Bac.-subtilis-Enzympräparates mit Duolite
A-2 Duolite A-2 ist ein grobporöses Anionenaustauscherharz und adsorbiert Proteasen
überhaupt nicht, besitzt jedoch eine bemerkenswerte Fähigkeit, melaminähnliche färbende
Stoffe zu adsorbieren. Diese melaminähnlichen färbenden Stoffe sind amphoter und
besitzen
deshalb uilter geeigneten Bedingungen (insbesondere des pE-Wertes) Affinität
sowohl zu Kationen- als auch zu Anionenaustauscherharzen. Dieses Harz ist in der
Cl-Form am stärksten zur Adsorbierung färbender Stoffe befähigt. Die Aufrechterhaltung
der Cl-Form kann jedoch unter Umständen den pII-Wert der Enzymlösung während der
Entfärbungsbehandlungen herabsetzen und so das Enzym inaktivieren. Vorzugsweise
wird deshalb das Harz in einer Form benutzt, in der der Essigsäureradikalzustand
und der Hydroxylradikalzustand gut ausgeglichen sind.
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(a) Entfärbung von Bac.-subtilis-Protease Die Enzymlösung wurde auf
einen pI-Wert 7,5 bis 8,0 eingestellt. Das Harz (Duolite A-2) mit einer Maschenzahl
von 60 bis 150 wurde zunächst mit der etwa fünffachen Menge 2 N NaO H behandelt
und mit Wasser gewaschen. Durch Waschen mit der zehnfachen Menge 2 N Essigsäure
wurde das Harz in die Essigsäureradikalform umgewandelt. Das Harz wurde dann mit
der etwa doppelten Menge einer 0,2M Ammonium-Acetat-Pufferlösung mit einem PH Wert
7,5 gewaschen, dann in der fünffachen Menge der gleichen Pufferlösung suspendiert
und durch Zufügung von 300/oigem wässerigem Ammoniak sorgfältig auf einen p-Wert
von 7,5 gebracht. Nachdem das Harz mit der fünffachen Menge der beschriebenen Pufferlösung
gewaschen war, um es vollkommen abzupuffern, wurde es in eine Kolonne gefüllt, deren
Durchmesser sich zur Höhe -wie 1 : 5 verhielt. Die Enzymlösung wurde mit einer Geschwindigkeit
von 10 ml pro Stunde und qcm des Kolonnenquerschnittes durch die Kolonne durchgegeben.
Die Menge des zur vollständigen Entfärbung der Enzymlösung erforderlichen Harzes
hing wesentlich von den in der ursprünglichen Enzymlösung enthaltenen färbenden
Stoffen ab. Jedoch konnten mit einer Menge von ungefähr einem Viertel des im Beispiel
5 verwendeten Kationenaustauscherharzes des Wissenschaftlichen Forschungsinstitutes
zufriedenstellende Resultate erzielt werden. Die gefärbte Lösung, welche in dem
vorstehend beschriebenen Adsorptions-Auswasch-Prozeß anfiel, konnte ebenfalls auf
die gleiche Art vollständig entfärbt werden. Es konnte gezeigt werden, daß hierbei
günstigere Resultate als im Falle von Beispiel 5 erzielt wurden.
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Beispiel 7 (a) Entfärbung von Bac.-subtilis-Protease mit Duolite
C-3 Die Entfärbung einer Kultur und ausgesalzener Lösungen wurde in der gleichen
Art wie im Beispiel 5 (a) und 5 (b), jedoch mit Duolite C-3 vorgenommen. Dabei war
die Entfärbungskapazität dieses Harzes um ein Mehrfaches geringer als die der in
den Beispielen 5 (a) und 5 (b) verwendeten Harze.
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(b) Entfärbung von Bac.-subtilis-Protease mit Duolite C-62 Die Entfärbung
wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 7 (a) durchgeführt, jedoch war die Kapazität
dieses Harzes geringer als bei Duolite C-3.
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(c) Entfärbung von Bac.-subtilis-Protease mit Duolite S-30 Als der
Entfärbungsprozeß mit Duolite S-30 in der gleichen Weise wie im Beispiel 5 (a) und
5 (b) durchgeführt wurde, war der Entfärbungseffekt zwei- oder dreimal besser als
im Beispiel 5 (a) und 5 (b). Jedoch wurden beträchtliche Mengen der Protease auf
dem
Harz adsorbiert, und das adsorbierte Enzym war, soweit festgestellt
werden konnte, auf keine Art in aktivem Zustand auszuwaschen.
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(d) Entfärbung von Bac.-subtilis-Protease mit Duolite A-7 Die Entfärhungsbehandlung
mittels Duolite A-7 und ihr Ergehnis stimmen praktisch mit Beispiel 6 überein.
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(e) Entfärbung von Bac.-subti 1 is-Protease mit Amberlite IRA-411
Die Entfärbung wurde wie im Beispiel 5 durchgeführt. Die Entfärbungskapazität dieses
Harzes war in frischem Zustand etwa halb so groß wie die von Duolite A-2, jedoch
war eine brauchbare Regenerierung des einmal benutzten Harzes sehr schwierig.
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(f) Entfärbung von Bac.-natto-Protease Die Entfärbung der Kulturlösung
von Bac.-natto-Protease mit dem im Beispiel 5 henutzten Harz mit Duolite C-62. Duolite
C-3, Duolite S-30, Duolite A-2, Duolite A-7 und mit Amberlite IRA-411 wurde entsprechend
der in den Beispielen 5, 7 (a), 7(b), 7 (c), 6, 7 (d) und 7 (e) durchgeführt. Die
Ergebnisse waren fast die gleichen wie in den entsprechenden Beispielen.
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(g) Entfärbung von TAKA-Diastase Die Entfärbung von TAKA-Diastase-I
ösung wurde mit dem im Beispiel 5 verwendeten Harz sowie mit Duolite A-2 in der
gleichen Weise wie im Beispiel 5 bzw. 6 durchgeführt. Dabei ließ sich eine außerordentlich
gute Entfärbung erzielen, ohne daß Verluste an der in der Diastase enthaltenen Protease
eiiitraten. Jedoch war die Entfärbungskapazität dieser Harze etwas niedriger als
bei der Entfärbung von Bac.-subtilis-Präparaten, und verglichen mit diesen Enzymen
konnte keine vollständige Entfärbung erzielt werden.