PL101098B1 - Sposob konwersji aldozy w ketoze - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konwersji aldozy lub jej pochodnej w ketoze lub jej pochod¬ na w obecnosci jonu zawierajacego tlen, a zwlasz¬ cza sposób konwersji glikozy w fruktoze, mannozy w fruktoze, 6-fosforanglikazy w 6-fosforanfrukto- zy, maltozy w maltuloze, galaktozy w tagatoze i laktozy w laktuloze, oraz sposób prowadzenia innych, analogicznych reakcji, takich jak konwer¬ sja ksylozy w ksyluloze. Proces mozna prowadzic ewentualnie w obecnosci enzymu katalizujacego reakcje konwersji.W przypadku glikozy w fruktoze prowadzonej w obecnosci enzymu izomerazy glikozy, bardzo czesto stan równowagi osiaga sie w momencie gdy w fruktoze przejdzie 50—55°/o zawartej w srodo¬ wisku reakcji glikozy. Dotychczas nie byla moz¬ liwa konwersja glikozy w fruktoze na drodze nie katalizowanej przez enzymy reakcji, bez wytwa¬ rzania produktów ubocznych. Istnieje Wiele pu¬ blikacji, na przyklad opisy patentowe USA nr 2, 487, 121, 3, 432, 345, 3, 558, 355 i 3, 514, 327 oraz niemiecki opis patentowy nr 1, 163, 307 dotycza¬ cych nieenzymatycznej konwersji glikozy w fruk¬ toze. Wszystkie one opisuja procesy, w których wytwarzaniu fruktozy z czystego chemicznie sub- stratu na drodze nie katalizowanej przez enzymy reakcji towarzyszy alkaliczna degradacja oraz wzrost zawartosci produktów ubocznych. Z uwagi na to, jakikolwiek prowadzony dotad*na wieksza 30 29 skale proces wytwarzania fruktozy oparty byl na reakcji katalizowanej przez enzymy.W procesie konwersji enzymatycznej, w przy¬ padku wzrostu zawartosci fruktozy w srodowisku reakcji szybkosc jej wytwarzania zmniejsza sie.Z tego wiec wzgledu w przemyslowym procesie konwersji glikozy w fruktoze wydajnosc fruktozy optymalizuje sie przez równowazenie strat w pro¬ dukcji fruktozy zmniejszaniem szybkosci reakcji, w celu umozliwienia zwiekszenia zawartosci fruk¬ tozy w srodowisku reakcji.Prowadzony na skale przemyslowa proces moz¬ na optymalizowac wytwarzajac syrop, w którym zwykle 40% glikozy zostalo przeprowadzonych w fruktoze. W wiekszosci prowadzonych na drodze chemicznej procesów nieenzymatycznej konwersji glikozy w fruktoze, zawartosc fruktozy spada po osiagnieciu maksimum. Widac wiec, ze korzystne jest zwiekszenie zawartosci glikozy, która w spo¬ sób oplacalny mozna w wyniku reakcji przepro¬ wadzic w fruktoze. Mozna to osiagnac na drodze skutecznego usuwania fruktozy ze srodowiska reakcji, na przyklad przez dodanie do mieszaniny reagenta tworzacego z fruktoza silniejszy kom^ pleks niz z glikoza. Srodek taki moze posiadac dodatkowe wlasciwosci, które powoduja zwieksze¬ nie lub obnizenie predkosci reakcji. Proponowany¬ mi do tego celu reagentami sa zwiazki boranowe — patrz Y. Takasaki, Agr. Biol. Chem. 1971, 35 (9), 1371—5 i opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3 689 101 098101 098 362 (reakcja enzymatyczna) oraz J. F. Mandieino, J. Amer. Chem. Soc. 82, 1960, 4975 reakcja che¬ miczna). Równiez uzycie boranianów zapropono- iwali S. A. Barker, P. J. Somers i B. W. Hatt w brytyjskim opisie patentowym nr 1 369 185 i to zarówno w reakcji chemicznej jak i enzymatycz¬ nej.Mankamentami pierwszych sposród wymienio¬ nych wyzej propozycji dotyczacych zwiazków bo- ranowych jest ich toksycznosc stwarzajaca niebez¬ pieczenstwo dla zdrowia w przypadku znalezienia sie w produktach dopuszczonych jako srodki slo¬ dzace do konsumpcji.W przypadku boraniami benzenu wystepuje ograniczenie rozpuszczalnosci, co powoduje, ze zwiazek ten nie moze tworzyc kompleksów z cu¬ krem w stosunku 2:1, wskutek tego przy wyso¬ kich stezeniach cukru nie mozna uzyskac w pro¬ dukcie boranianu i równoczesnie wysokiego ste¬ zenia fruktozy (S. A. Barker, B. W. Hatt i P. J.Somers, Carbohydrates Res* 26 (1973) 41—53). Tak wiec reakcje prowadzace do uzyskania komplek¬ sów nie sa latwe do zastosowania w prowadzo¬ nych na skale przemyslowa procesach konwersji.W celu znalezienia procesu przemyslowego, w którym wzrasta stezenie fruktozy w wytwarzanym syropie niezbedne jest znalezienie takiego tworza¬ cego kompleksy reagenta, którego stosowaniu nie towarzysza wymienione wyzej mankamenty.Wedlug wynalazku, sposób konwersji aldozy lub jej pochodnej w ketoze lub jej pochodna, obej¬ mujacy wytworzenie roztworu wodnego aldozy lub jej pochodnej i przeprowadzenie izomeryzacji che¬ micznej lub enzymatycznej aldozy lub jej pochod¬ nej w ketoze lub jej pochodna, w warunkach izo¬ meryzacji aldozy w ketoze, w obecnosci czynnika tworzacego kompleks i oddzielenie produktu bc- Tabela gatego w ketoze lub jej pochodna, tym sie cha¬ rakteryzuje, ze jako czynnik tworzacy kompleks stosuje sie anion zawierajacy tlen lub mieszany kompleksowy anion zawierajacy tlen z germanem, lub ,cyna, tworzacy silniejszy kompleks z ketoza lub jej pochodna niz z aldoza lub jej pochodna.Szczególnie korzystnym czynnikiem tworzacym kompleks jest anion zawierajacy tlen lub miesza¬ ny kompleksowy anion zawierajacy tlen z germa¬ nem.Korzystnie, gdy pochodna aldozy jest fosforan aldozy lub glikozyIowa pochodna aldozy.Sposób wedlug wynalazku znajduje zastosowanie w róznych konwersjach, zwlaszcza w takich jak wyzej wymieniono, przy czym najkorzystniej jest stosowac go w konwersji glikozy lub mannozy w fruktoze. Konwersje mozna prowadzic w obecnosci enzymu jako katalizatora, dzieki czemu mozna uzyskac zlagodzenie warunków reakcji oraz inne korzysci takie jak selektywne dzialanie uzytego enzymu w kierunku tworzenia wylacznie jednego izomeru (D lub L) aldozy lub jej pochodnej.W przypadku prowadzenia konwersji enzyma¬ tycznej enzym moze znajdowac sie w roztworze lub moze byc osadzony na stalym podlozu takim jak zywa lub nieczynna komórka, lub jakikolwiek inny odpowiedni nosnik. Enzym moze wystepowac równiez w postaci rozpuszczalnej.Enzym typu izomerazy, odpowiedni do tego ro¬ dzaju konwersji (przyklady wymienione w Ta¬ beli A), w którym znajduje zastosowanie sposób wedlug wynalazku, moze skladac sie z jednej lub kilku serii enzymów dzialajacych w kolejno po sobie nastepujacych reakcjach.W niniejszym opisie termin ketoza oznacza ke- tuloze, patrz rozwazania na temat nomenklatury ketoz w „The Editorial Report on Nomenelature", Journal of the Chemical Society s. 5110, (1952).A | Konwersja f Enzym | Literatura \ 1 1 D-galaktoza ^ D-tagatoza 1 2 L-arabinoza ^ L-rybuloza 1 3 L-fukoza *=* L-fuculoza 1 4 L-ramnoza ±=? L-ramuloza 1 5 L-maimoza ^ L-fructoza 1 6 D-mannoza ^ D-fruktoza 7 D-glikoza ^ D-fruktoza 1 8 D-glicero ^ D-sedo- D-mannoheptoza heptuloza 1 9 D-likoza ^ D-ksyluloza 1 10 D-ksyloza ^ D-ksyluloza 1 11 L-ksyloza ^ L-ksyluloza 1 il'2 D-airafodnbza ^ D-rybuloza 13 5-fosforan ^ 5-fosfo- D-rybozy ran D-rybulozy 1 14 5-fosforan ^ 5-fosfo- f D-arabinozy ran D-rybulozy Izomeraza L-arabinozy (Izomeraza D-galaktozy) Jak w pkt 1 Izomeraza L-fukozy Izomeraza D-arabinozy Izomeraza L-ramnozy Izomeraza L-mannozy Izomeraza D-liksozy (Izomeraza D-mannozy) Izomeraza D-glikozy (Izomeraza D-ksylozy) Jak w pkt 6 Jak w pkt 6 Jak w pkt 7 Izomeraza L-ksylozy Jak w pkt 3 Izomeraza D- arabinozy J Biol Chem. 1971, 246, F 5102—6 1 Jak w pkt 1 t J Biol Chem, 1958, 230, [ 457 [ Methods Enzymol, 9, 597— —82, (1966) [ Carb Res, 1968, 8, 3444 | J Biol Chem, 218 (1956) 535 Biochem Biophys Acta, f (1969) 178, 376—9 |, J Biol Chem, 218, (1956) 535 [ Jak w pkt 6 [ Jak w pkt 7 1 Fed Proc, 19 (1960) 82 f Jak w pkt 3 | J Biol Chem, 1957, 226 65 l Methods Enzymol, 9, 585— 1 —8 (1966) l101098 c.d. tabeli A | Konwersja 3-fosforan ^ 3-fosfo- D-aldehydu ran dwuhydro- glicerynowego ksyacetonu - 16 6-fosforan ^ 6-fosforan | D-galaktozy D-tagatozy 17 6-fosforan ^ 6-fosforan D-glikozy D-fruktozy 18 6-fosforan ^ 6-fosforan D-mannozy D-fruktozy 19 6-fosforan ^ 6-fosforan D-glikozaminy D-fruktozy ^ En2ym * ' i Literatura • j Biochem J, 1968, 107, 775 I Biochem Biophys Res Comm, 1973," 52, 641—7 | J Biol Chem, 1973 248, 2219 J. Biol Chem, 196|8, 243, 5410—19 | Adv Enzymol, 43 491, (1075J | 40 W metodzie konwersji czynnik kompleksujacy mozna wprowadzac w dowolny dogodny sposób, np. w postaci kompleksu aldozy z anionem za¬ wierajacym tlen lub kompleksu pochodnej aldozy 20 .z anionem zawierajacym tlen lub tez w postaci soli lub zwiazku takiego, jak tlenek dajacy w warunkach metody konwersji aniony zawierajace tlen lub mieszane aniony kompleksowe zawiera¬ jace tlen. Czynnik kompleksujacy mtfzna równiez 25 wprowadzac w postaci anionu zawierajacego tlen zwiazanego poprzednio z polialkoholem lub Joni¬ tem badz tez z innym nierozpuszczalnym nosni¬ kiem tworzacym z czynnikiem kompleksujacym chelaty lub zawierajacym go jako jon o prze- 30 ciwnym znaku.Korzystnie mieszany -anion zespolony stanowi anion utworzony na skutek oddzialywan pomiedzy anionem zawierajacym tlen oraz german lub cyne a jonem innego pierwiastka grupy IV lub grupy V 3g albo VI.'Anion zawierajacy tlen lub mieszany anion zespolony korzystnie zawiera german. Szczególnie korzystne czynniki kompleksujace stanowia jony germanianowe lub poligermanianowe, stosowane w metodzie, jak na przyklad germanian sodowy lub dwutlenek germanu i stosowane w postaci roztworu, trwalych zwiazków chelatowych lub jprzeciwjonów w jonicie. W niektórych wypadkach mozna korzystnie stosowac jony mieszane takie jak i[GA(S04)2]2-, [HGeO*CP04)l2- lub zwiazki mleczanowo-germanowe, Lindberg i Swan podali (Acta Chem. Scand., 14, (1960), 1043^50), ze w trakcie rozdzialu elektro- foretycznego przy pH 10,7 kompleksy fruktozowo- -germanianowe róznia sie znacznie od komplek¬ sów glikozowo-germanianowych tym, ze pierwsze z nich maja w temperaturze 40°C ponad dwukrot¬ nie wiejksza ruchliwosc niz drugie. V. A. Nazaren- "ko i G. V. Flyantikova (Zh.' Neorgan. Khim, 8* (1963) 2271, 1370) podaja stale dysocjacji dla gliko¬ zy i fruktozy z jonami g;armanianowymi odpo¬ wiednio 8,3X!0-6 i l,04XilO"4. Podaja tez stale dy¬ socjacji jonu zespolonego glikozy i fruktozy z jo¬ nami germanianowymL Odpowiednio 3,54j10_* i 4,24.10-5.Nieoczekiwanie jest, ze jony germanianowe po¬ winny byc odpowiednimi odczynnikami przy kon¬ wersji glikozy do fruktozy pomimo ze: 1. Wykazano, ze germanian znajduje sie w rów- mowadze monogermanian ^ pieciogermanian ^ es 50 55 60 ^ siedmiogermanian, która jest przesunieta na prawo ze wzrostem stezenia germanu a na lewo ze wzrostem pH powyzej wartosci 9 rest i J. C. Harrisón, J. Chem. Soc, 1959, 2178— —2182). W metodzie prowadzonej w sposób eko¬ nomiczny -korzystnie jest stosowanie minimalnej masy zwiazku germanianowego przy maksymalnej szy^bkosci konwersji oraz unikniecie tworzenia sie produktów ubocznych na skutek rozpadu, zasado¬ wego. 2. Dwutlenek germanu i germanian sodowy ma¬ ja bardzo mala rozpuszczalnosc w wodzie — patrz P. J. Antikainen (Suomen Kenustilehti, 33b (1900) 38—40). Gulzian i Muller, J. Amer. Chem. Soc. 1932, 54, 3142, podaja dla Ge02 rozpuszczalnosc w wodzie równa 31—33 mM. Dla germanianu sodo¬ wego D. A. Everest i J. C. Harrisón, J. Chem. Soc.,, 1959, 2178, podaja rozpuszczalnosc równa 870 mM. 3. W srodowisku reakcji enzymatycznej konwer¬ sji glikozy do fruktozy znajduja sie na ogól jony magnezowe. Ortogermanian magnezowy (MgzG<*04) jest zwiazkiem bardzo trudno rozpuszczalnym w wodzie i stosowany jest do analitycznego oznacza¬ nia germanu — patrz J. H. Muller, J. Amer.Chem. Soc, 1923, s. 2493—2498. W opisanych wy¬ zej warunkach nie wytraca sie on z roztworu. 4. Izomeraza glikozy wymaga sterycznego do¬ pasowania D-glikozy (K. J. Schray i I. A. Rose, Bliochemietry 10 (1971) 1058—1062) a kompleks gli- kozowo-germanianowy, którego tworzenie sie stwierdzono, móglby szkodzic reakcji enzymatycz¬ nej hamujac ja czesciowo lub -calkowicie. Rzeczy¬ wiscie, bardziej odpowiednim zwiazkiem do kom- pleksowania jonami germanianowymi niz a-D-gli- koza jest pochodna l,2cis glikolowa a-D-gliko2y.. Mannoza tworzy, trwalsze kompleksy z jonami germanianowymi niz glikoza (J. J. Antikainen, Acta Chem. Scand., 13 (1959) 312).Konwersja glikozy do fruktozy -moze byc do¬ konana na drodze reakcji czysto chemicznej przy uzyciu zwiazku germanianowego, lub kompleksu cynianowego w celu przesuniecia stanów pseudó- równowagi opisanych przez S; A. Barkera, B. W.Hatta i P. J. iSomersa {Carb. Res, 26 01973) 41—53).Jednak korzystnie jest wykonywac ja na drodze reakcji enzymatycznej w obecnosci izcmerazy gli-/ kozy. Do konwersji tej moznaf' zastosowac dowol¬ na izomeraze glikozy, ale enzymy te róznia sie co do optymalnej wartosci pH i temperatury.101 098 7 Do korzystnych izomeraz naleza pochodzace z bakterii z rodzaju Aerobacor, Pteeudomonas, Lacto- bacillus tK. Yamanaka, Agr. Biol. Chem. 27, 1963, 265—270) Streptoimyices, Curtobacteriuim (opisane w zgloszonym przez mas równoczesnie Zgloszeniu Brytyjskim nr 13994/74), lub zwlaszcza Arthrofoac- ter (opisane w brytyjskim Opisie Patentowym nr 1328970. Korzystne sa równiez izomerazy glikozy pochodzace z drobnoustrojów termofili rozwijaja¬ cych sie w wyzszych temperaturach rodzaju Ter- moactinomyces, Termopolyspora, Termomohospora i Pseudonocardia takich jak opisane w Japonskiej Publikacji Patentowej nr 74/30588. Niektóre z wy¬ mienionych izomeraz glikozy wymagaja do osia¬ gniecia optymalnej aktywnosci obecnosci kobaltu.Konwersje glikozy do fruktozy mozna prowa¬ dzic w sposób ciagly przepuszczajac roztwór gli¬ kozy przez kolumne zawierajaca nieruchome zloze enzymu lub innego katalizatora. Unieruchomienie zloza enzymu korzystnie osiaga sie przez uzycie nieuszkodzonych klaczkowatych komórek drobno¬ ustrojów w sposób opisany w opisie brytyjskim nr 1368650. Czynnik kompleksujacy, np. zwiazek germanianowy lub cynianowy, moze znajdowac sie w roztworze przepuszczonym przez kolumne lub moze byc zawarty w nieruchomym zlozu en¬ zymu albo innego katalizatora bedacego w ko¬ lumnie. W tym ostatnim przypadku kolumne mozna wypelnic nieruchomym enzymem lub in¬ nym katalizatorem zmieszanym z czynnikiem kompleksujacym i jednorodnie rozproszonym w zlozu kolumny lub tez w kolumnie moga znajdo¬ wac sie na przemian warstwy nieruchomego en¬ zymu lub innego katalizatora oraz czynnika kom- pleksujacego oddzielone od siebie siatkami lub kratkami. Jesli czynnik kompleksujacy znajduje sie w kolumnie, umieszczony on jest w postaci nierozpuszczalnej, np. w formie zelu, zeolitu lub nieorganicznej lub organicznej pochodnej polime¬ rowej.Po konwersji glikozy do fruktozy mozna oddzie¬ lic fruktoze od mieszaniny zawierajacej czynnik kompleksujacy i usunac ja z ukladu badz to sama badz tez zmieszana z glikoza. Produktem otrzy¬ manym ta metoda jest fruktoza, syrop zawiera¬ jacy zmieszane ze soba glikoze i fruktoze albo za¬ równo fruktoza jak i syrop zawierajacy glikoze i fruktoze. Mozna zawrócic do obiegu sam czyn¬ nik kompleksujacy, czynnik razem z glikoza, albo razem z glikoza i skompleksowaffa glikoza. Roz¬ dzielenia i zawracania do obiegu mozna dokonac dowolnym stosownym sposobem. Dla szczególnie odpowiednie sposoby rozdzialu i zawracania do obiegu przebiegaja nastepujaco: a) Sposób polegajacy na przepuszczaniu surowego produktu konwersji glikozy do fruktozy przez ko¬ lumne wypelniona kationitem zawierajacym ka¬ tiony metalu II grupy ukladu okresowego oraz jony wodorowe. Powoduje to rozdzielenie suro¬ wego produktu na fruktoze, która sie odbiera ja¬ ko koncowy produkt tego sposobu, oraz glikoze zmieszana z czynnikiem kompleksujacym, które zawracane sa do obiegu. Korzystnymi jonami me¬ talu grupy II sa jony wapniowe. 8 b) Sposób polegajacy na przepuszczaniu suro¬ wego produktu konwersji glikozy do fruktozy naj¬ pierw przez kolumne wypelniona kationitem za¬ wierajacym kationy metalu I lub II grupy ukladu okresowegp, korzystnie zawierajacym jony sodowe^ Powoduje to rozdzielenie surowego produktu na dwie czesci, a mianowicie (1) syrop zawierajacy glikoze i fruktoze oraz (2) fruktoze zmieszana z czynnikiem kompleksujacym. Czesc (1) zostaje usunieta zas czesc (2) przepuszcza sie przez ko¬ lumne opisana wyzej w punkcie a) w celu oddzie¬ lenia fruktozy od czynnika kompleksujacego^ który nastepnie zostaje zawrócony do obiegu.Korzystnym dla obu sposobów a) i b) jonitem jest kationit na bazie sulfonowanego polistyrenu, zawierajacy srodek sieciujacy.Mozna tez stosowac inne sposoby polegajace na przyklad na rozkladzie kompleksu zawierajacego- fruktoze przy uzyciu polimeru „Borasorb" (Re¬ jestrowany Znak Handlowy) firmy Calbiochem Ltd. — polimeru zawierajacego dlugi lancuch grup hydroksylowych znajdujacych sie w polozeniu cis, polaczonych poprzez trzeciorzedowy atom azotu. z siecia dwuwinylobenzenowopolistyrenowa i sto¬ sowanego zwykle do absorpcji jonów boranowych — w celu otrzymania czystej fruktozy oraz czyn¬ nika kompleksujacego. Prowadzac reakcje przV uzyciu czynnika kompleksujacego stosowanego w- srodowisku reakcji w postaci roztworu, mozna go równiez zawracac do obiegu. Tak wiec jony ger- manianowe zatrzymane na polimerze „Borasorb" mozna wymywac przy pomocy zasady lub kwasu.Wszystkich tych czynnosci mozna uniknac sto¬ sujac czynnik kompleksujacy w postaci nierucho¬ mego zloza.Konwersje glikozy do fruktozy prowadzi sie ko¬ rzystnie w sposób ciagly przy uzyciu enzymu sto¬ sujac opisana wyzej kolumne wypelniona nieusz¬ kodzonymi, klaczkowatymi komórkami zawieraja¬ cymi enzym. W wypadku, gdy czynnik komplek¬ sujacy znajduje sie w mieszaninie reakcyjnej po¬ dawanej na kolumne, stezenie jego korzystnie wy¬ nosi od 200 mM do 800 mM, szczególnie korzystnie* od 500 mM do 600 mJM. Mieszanina reakcyjna za¬ silajaca kolumne korzystnie zawiera wodny roz¬ twór glikozy o stezeniu od 30% do 50%. wag. a reakcje prowadzi sie tak, by stezenie fruktozy w mieszaninie odbieranej z kolumny wynosilo od 40 do 85°/o, a zwlaszcza od 75 do 80%. Wartosc pH srodowiska reakcji korzystnie miesci sie w za¬ kresie od 6 do 10 z optimum aktywnosci wyste¬ pujacym przy pH okolo 8, a dokladnie przy pHT równym 7,8, lecz wartosci te sa rózne dla kazdego * rodzaju enzymu zas podane wartosci odnosza sie do enzymów pochodzacych z drobnoustrojów Arthfobacter. Stosowana temperatura korzystnie nalezy do zakresu 50 do 100°C, szczególnie ko¬ rzystnie miesci sie w zakresie od 45 do 80°C, pH wycieku ma na ogól nizsza wartosc niz roztworu wyjsciowego poniewaz wytworzona fruktoza ulega kompleksówaniu przez anion zawierajacy tlen.Oprócz glikozy i róznych zwiazków zawieraja¬ cych jony germanianowe mieszanina reakcyjna zawiera nastepujace skladniki w podanych ilos¬ ciach: jony Mg2 + w stezeniu okolo 4mM — ra- 40 45 50 55 60101 098 9 :zem z jonami chlorkowymi o równowaznym ste¬ zeniu oraz zasada sodowa dla wyrównania pH.Dla innych reakcji enzymatycznych (np. dla izo¬ merazy foisforanoglikozowej powodujacej konwer¬ sje 6-foaforanu glikozy do 6-fosforanu fruktozy, która najwieksza wydajnosc osiaga przy tempera¬ turze 25°C w obecnosci jonów germanianowych) warunki reakcji beda sie znacznie róznic i naj¬ lepsze z nich musza byc szukane dla kazdego en¬ zymu. Izomeraze glikozy 'mozna równiez stosowac do prowadzenia konwersji D-ksylozy do D-ksylu- lozy i jest ona odpowiednim zwiazkiem dla tej technologii a jony germanianowe powoduja |prze- suniecie równowagi w kierunku zwiekszenia wy¬ dajnoisói ksylulozy.Jako czynnik kompleksujacy jony germaniano- ^ve maja te przewage nad polecanymi dawniej zwiazkami boranowymi, ze jony germanianowe tworza z fruktoza silniejsze kompleksy i sa przy komp-eksowaniu zwiazkami bardziej stereoselek- tywnymi niz 'borany. Unika sie klopotów zwiaza¬ nych z toksycznoscia stosowanych zwiazków bc- Tanowych. W przeciwienstwie do kwasów areno- boranowych i(areneboronic acids), jony germania¬ nowe moga tworzyc germanianowo-fruktozowe polaczenia chelatowe o stosunku jonu germania- nowego do fruktozy równym 1 : 2 przez co zuzycie czynnika kompleksujacego jest bardziej ekono¬ miczne.Normalna optymalna wartosc pH dla enzymu moze nie byc najbardziej odpowiednia dla sposobu laczacego enzym oraz czynnik kompleksujacy. Tak wiec kazdy sposób obnizenia optymalnej wartosci pH dla enzymu, np. cUa izomerazy glikozy od pH 8,5 do pH 7 bedzie korzystny dla zmniejszenia kosztów usuwania barwy powstalej w trakcie reakcji enzymatycznej. Jest to nieoczekiwanie prawdziwe w przypadku izomerazy glikozy po¬ chodzacej z drobnoustrojów Arthrobacter i moze sie sprawdzac dla innych waznych enzymów. Ko¬ rzystna bedzie równiez mozliwosc obnizenia tem¬ peratury reakcji przy osiagnieciu tego samego procentu konwersji w tym samym czasie. Choc nie odgrywa ona roli w przypadku izomerazy glikozy pochodzacej z Arthrobacter, moze ona oszczedzac czas reakcji z powodu innej nieoczekiwanej zalety.Dodatek jonów germanianowych mianowicie po¬ woduje znaczny wzrost szybkosci poczatkowej konwersji glikozy do fruktozy tak, ze konwersje prowadzi sie w sposób ekonomiczny przy krót¬ szym czasie przebywania. Korzystne równiez jest to, ze jony germanianowe nie maja wplywu na trwalosc izomerazy glikozy pochodzacej z Arthro¬ bacter w okresie czasu objetym doswiadczeniem pod warunkiem, ze spadek wartosci pH towarzy¬ szacy tworzeniu fruktozy w obecnosci jonów ger¬ manianowych jest kompensowany.Na Fig. 2 rysunków przedstawiono procentowa zmiane skrecalnosci optycznej w wyniku tworze¬ nia kompleksu w funkcji wartosci pH dla kom¬ pleksów germainianowych glikozy, fruktozy i man- nozy. Jak widac, kompleks ifruktozowy tworzy sie przy nizszej wartosci pH niz glikozowy i manno- zowy.Przyklad I. Enzymatyczna konwersja glikozy do fruktozy.Przez kolumne o dlugosci 32 cm i srednicy we¬ wnetrznej 0,4 cm wypelniona klaczkowatymi nie- uszkodzonymi komórkami zawierajacymi izomeraze glikozy przepuszcza sie szereg wodnych roztworów glikozy o róznych stezeniach glikozy oraz jonów magnezowych i germanianowych. Dla porównania przepuszcza sie przez kolumne równiez odpowied¬ nie roztwory nie zawierajace germanianu. Procent konwersji glikozy do fruktozy w wycieku z ko¬ lumny mierzy sie przy pomocy autoanalizatora metoda rezorcynolowa. Reakcje prowadzi sie przy poczatkowej wartosci pH równej 8,5 w tempera¬ turze 60^C, przy stezeniu chlorku magnezowego w wodnych roztworach glikozy równym 0,004 mM.Przygotowujac roztwory glikozy o stezeniu do 100 mM, w celu zapobiezenia wytracania magnezu z roztworów wywolanego przez jony germaniano¬ we, za kazdym razem roztwory zawierajace jony germanianowe dodaje sie do roztworów glikozy wchodzacych do kolumny przed dodaniem chlorku magnezowego, poniewaz tworzacy sie w roztwo¬ rach kompleks glikozowo-germanianowy nie po¬ woduje wytracenia magnezu. Roztwory zawiera¬ jace jony germanianowe przygotowuje sie przez rozpuszczenie w wodzie dwutlenku germanu, do¬ danie stezonego roztworu zasady az do osiagnie¬ cia pH 10,5 a nastepnie dodanie roztworu glikozy a potem chlorku magnezowego. Wreszcie po do¬ prowadzeniu pH do wartosci 8,5 roztwór staje sie przezroczysty.Przygotowujac roztwory wyjsciowe o stezeniu germanianu równym 200 mM lub wyzszym do¬ daje sie dwutlenek germanu do 1 M roztworu glikozy tak, ze* po dodaniu w sposób nieciagly az do osiagniecia pH 8,5 germanian powoli przecho¬ dzi do roztworu. Po dodaniu chlorku magnezowe¬ go otrzymuje sie roztwór odrobine metny lecz wy¬ ciek z kolumny jest calkowicie przezroczysty. Wy¬ niki podane sa w Tabeli 1.Tabela 1 Stezenie glikozy (mM) 0,528 | 0,528 4,65 | 4,58 122 118 337 270 259 265 300 284 | 275 Stezenie jonów ger¬ manianowych (mM) 0 0 0 0 0 50 100 200 % konwersji glikozy do fruktozy 59 75 57 82 47,5 80,5 44,5 63 46+ 53 52 59,5 72,5* pH wycie¬ ku n.a n.a 8,3 8,1 7,0 6,8 6,8 6,7 6,5 6,3 6,0 6,4 7,2 Szybkosc przeplywu (ml/min) 0,12 0,12 | 0,10 0,10 | 0,11 0,11. ¦ 0,1.1 0,11 0,11 o,U 0,11 0,11 0,11 ' + w stanie równowagi 55,5% * w stanie równowagi 82°/o (koncowe pH 6,5) Z tabeli 1 wynika, ze w kazdym przypadku, gdy badano roztwory porównawcze nie zawierajace jo- 40 45 50 55 60101 098 11 nów germanianowych stezenie fruktozy bylo wiek¬ sze w obecnosci jonów germanianowych.Przyklad II. Enzymatyczna konwersja gliko- zy do fruktozy.W celu zbadania wplywu wyzszych stezen gli¬ kozy powtarza sie sposób postepowania jak w przykladzie 1 przy uzyciu kolumny o podobnych parametrach (tj. 30 %cm dlugosci, 0,4 cm srednicy wewnetrznej). W tym wypadku zmniejsza sie szybkosc przeplywu do 0,03 ml/min aby pozwolic na osiagniecie maksymalnego czasu kontaktu rów¬ nego 125 minut by osiagnac po kilku godzinach stan równowagi i notuje sie parametry stanu równowagi dla tych warunków. Po przyrzadzeniu mieszaniny za kazdym razem oznacza sie stezenie glikozy w celu skorygowania przed rozcienczeniem solami metali alkalicznych/magnezowymi. Wyniki podane sa w Tabeli 2.Tabela 2 12 Poczatkowe stezenie gli¬ kozy (% masa/obj.) 47,4 45,6 43,7 43,5 50,0 Stezenie jo¬ nów germa¬ nianowych (mM) 0 364 524 696 800 % fruktozy (masa/obj.) •25,6 32,0 ,0 36,5 39,7 % konweisii 54,0 70,0 80,0 84,0 79,4 Jak widac z wyników, obecnosc jonów germa¬ nianowych powoduje znaczne zwiekszenie °/o kon¬ wersji do fruktozy. Fruktoze oznacza sie metoda Chaplina-Kennedy'ego (Carbohydrate Res., 1975, 40, 227—33). Metoda ta na ogól daje wyzsze wy¬ niki niz metoda rezorcynolowas stosowana we wszystkich nastepnych przykladach dla fruktozy.W nastepnym doswiadczeniu, w którym ozna¬ czenie prowadzi sie metoda rezorcynolowa (Carbo¬ hydrate Res., 26, (1975) 41) prowadzonym na ko¬ lumnie o tych samych wymiarach, w temperaturze 60°C i przy pH 8,5 otrzymuje Sie nastepujace wy¬ niki dla róznych szybkosci przeplywu przez ko¬ lumne.Produkt o poczatkowym stezeniu glikozy rów¬ nym 4&,5°/o (tabela 2) poddaje sie rozdzielaniu na zywicy anionowowymieninej Jeol Ltd w formie 40 Szybkosc przeplywa (ml/min) 0,015 0,030 0,050 Zasilanie kolumny (z dodatkiem 4 mM MgCl) sama glikoza w ste¬ zeniu 51,2% (masa obj.) 53 42,5 36 % konwersj 47,8% (masa/obj.) 1 glikozy+800 mM germanianu | 74 69 50 do fruktozy | boranowej stosujac do rozdzielenia glikozy i fruk¬ tozy znajdujacych sie w produkcie elucje bufora¬ mi boranowyimi z gradientem stezenia eluentu (od 0,13 M boranu o pH 7 do 0,35 M boranu o pH 9,8). To samo rozdzielanie prowadzi sie równiez po usunieciu germanianu na kolumnie „BORA- SORB" (zastrzezony Znak Ochronny, patrz wy¬ zej). Bez uprzedniego usuniecia germanianu sto¬ sunek fruktozy do glikozy wynosi 3,31 : 1. Fruktoze, i glikoze oznacza sie metoda cysteina kwas §i§r- kowy. Jr Przyklad III. Chemiczna konwersja glikozyd do fruktozy.Czysto chemiczna konwersje glikozy do frukto¬ zy w obecnosci jonów germanianowych bada sie ogrzewajac do temperatury 60°C roztwór o pH 8,5 zawierajacy 50°/o (masa/obj) glikozy 4 mM soli magnezowej i 600 mM jonów germanianowych.Po uplywie róznych okresów czasu stwierdza sie rózne nastepujace stezenia fruktozy.Czas(min) °/o fruktozy 90 3,3 135 4.6 180 5,7 Doswiadczenie to powtarza sie w temperaturze 90°C przy stezeniu glikozy równym 48,4 — 50°/o a germanianu — 600 mM — 582 mM. °/o kon¬ wersji do fruktozy po uplywie róznych okresów czasu podane sa w Tabeli 3. Fruktoze oznacza sie metoda rezorcynolowa. W trakcie prowadzenia doswiadczenia w ogrzewanej syropowatej cieczy znajduje sie azot. We wszystkich przypadkach po¬ czatkowe pH mierzone w temperaturze 31°C zmniejsza sie i w momencie stwierdzenia tego faktu doprowadza sie ipH do wartosci poczatkowej. 1 48,4% (masa/obj.) glikozy. Po¬ czatkowe pH7,0. Nie dodawano | MgC12. 582 mM germanianu Czas (godz.) 0,5 1,0 . X5 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 % konwersji do fruktozy 2,0 3,8 4,7 6,8 7,4 7,8 8,3 8,7 Tal bela 3 50% (masa/obj.) glikozy. Poczatkowe pH 7,5. Nie dodawano MgC12. 600 mM germaniami Czas (godz.) 05 1,0 1,5 3,0 3,5 6,0 (koncowe pH6,37) 4 % konwersji do fruktozy 4,3 8,2 9,7 12,0 12,6 12,2 50% (masa/obj.) glikozy. Poczatkowe I pH 8,0. Nie dodawano MgC12. 600 mM germanianu [ Czas (godz.) 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 3,5 (pH 6,74) 4,0 4,5 % konwersji do [ fruktozy 9,1 12,5 14,4 ,2 ,45 ,4 18,3 1 18,3101 098 13 14 Podobne doswiadczenie prowadzi sie w obec¬ nosci dodanego MgC12. Wyniki otrzymane metoda rezorcynolowa podane sa w Tabeli 4.Nastepujace wyniki uzyskane przy uzyciu 1,245 M glikozy, 600 mM germaniami i 4 mM MgC12 ogrzewanych przy pH 8,5 do temperatury 90°C swiadcza o waznosci ilosciowego stosunku glikozy do germanianu.Czas (godz.) % konwer¬ sji do fruk¬ tozy Czas (godz.) % konwer-^ sji do fruk¬ tozy 0,5 19,8 3,66 46,1 1,0 31,6 4,33 48,5 1,5 36,2 6 48 2,0 38,6 6,5 45 2,5 38,6 (pH7, 48)1 Roztwór 55^/0 (masa/obj) glikozy, 600 mM ger¬ manianu i 0,004 M MgC12 o poczatkowym pH 7,5 ogrzewa sie przez 6 godzin w temperaturze 90°C i po tym czasie wykazuje on 13,7°/o konwersji do fruktozy oznaczonej metoda rezorcynolowa.Konwersja chemiczna glikozy do fruktozy za¬ chodzi przy niskich stezeniach germanianu w tem¬ peraturze 90°C i pH 8,5 oraz bez dodatku chlorku magnezowego bardzo powoli.Przyklad IV. Konwersja glikozy do frukto¬ zy przy uzyciu rozpuszczalnej izomerazy glikozy.Poczatkowe szybkosci reakcji z zastosowaniem izomerazy glikozy w formie rozpuszczalnej (200 \d) bada sie w temperaturze 60°C i przy pH 8,5 jako substrat biorac D-glikoze o stezeniu 0,5 mM z do- Tabela 4 1 50% (masa/obj.) glikozy. Po¬ czatkowe pH 8 0,004 mM MgC12 1 | 600 mM germanianu Czas (godz.) 2,17 2,83 333 4,0 (pH 6,37) 4,5 4,83 | 5,33 % konwersji do fruktozy 16,9 19,0 18,8 18,0 22,1 •23 22,7 50% (masa/obj.) glikozy. Poczatkowe pH 8,5 0,004 mM MgC12, 600 mM germanianu j Czas (godz.) 0,5 1,0 2,83 3,33 (pH 6,42) 4,5 ,0 % konwersji do fruktozy 19,5 28,5 29,8 27,2 34,3 ,5 50% (masa/obj.) glikozy. Poczatkowe 1 pH 9,0 0,004 mM MgC12, 600 mM germanianu | Czas (godz.) 0,5 1,0 2,0 2,33 2,67 (pH 6,98) 3,33 3,67 % konwersji do fruktozy ,3 ,2 ,7 36,7 ,8 36,2 1 100 mM glikozy | 10 mM germanianu | Czas (godz.) | % konwersji 0,5 1 1,5 2,67 3+ (pH 8,16) 3,5 4 4,5 ,5 6 7 7,5+ (pH 7,82) 8,5 9 3,5 7,6 ,7 18,2 18,8 21,5 24,2 ,6 27,5 29,1 ,3 31,8 31,9 33,4 34,6 + pH doprowadza sie do wartosci 8,5 1 20 mM mM | Czas (godz.) 0,5 1 1,5 2,5 3+ (pH 7,78) 3,5 4 + (pH 7,8) 6 7,5 8 9 glikozy germanianu | % konwersji 4,3 8,5 11,7 18,7 19,8 ,3 29,1 33,4 36,8 39,7 40,6 40,6 mM glikozy mM germanianu Czas (godz.) 0,5 1- 2 3+ (pH 8,22) 3,5 4 ,8+ (pH 8,0) 6 7 8 9 % konwersji 4,3 8,5 ,5 19,8 ,4 ,6 29,7 32,2 33,5 37,3 39,4 38,9 Otrzymany produkt poddaje sie po kilku godzi¬ nach rozdzielaniu (po uprzednim usunieciu ger¬ manianu oraz bez tego) na kolumnie boranowej.W trakcie wymywania w miejscu wyznaczonym dla fruktozy otrzymuje sie zasadniczo identyczne wartosci stezenia fruktozy równe 39,7°/«. 60 65 datkiem 4 mM MgC12 i 0,5 mM CoC12 znajduja¬ cych sie w ustalonych ilosciach w szeregu roz¬ tworach «(25 ml) zawierajacych rózne ilosci doda¬ nego germanianu. Roztwory oznacza sie automa¬ tyczna metoda rezorcynolowa. Bez germanianu 6,25 \ig fruktozy/min/ml enzymu, 0,5 mM germa-101 098 nianu, 8,75 \ig fruktozy/min/ml enzymu, 25 mM germanianu, 15 ^g fruktozy/min/ml enzym. Ozna¬ cza sie równiez °/o konwersji do fruktozy po 21 godzinach.Przyklad V. Konwersja mannozy do fruktozy.Roztwór zawierajacy 50% (masa/obj) mannozy, 4 mM MgC12 i 600 mM germaniami ogrzewa sie w temperaturze 90°C i przy pH 8,5. Stezenia fruk¬ tozy oznaczone metoda rezorcynolowa podane sa w Tabeli '5.Tabela Czas (min.) 60 120 150 170 (pH7,25 doprowadza sie z powrotem do wartosci 8,5) 260 280 % konwersji do fruktozy 3,44 6,42 13,4 ,4 ,9 ,4 ,6 | 20 16 koncowa wartosc pH oraz °/o konwersji do frukto¬ zy po uplywie róznych okresów czasu. Doswiad¬ czenie dzieli sie na trzy okresy.Po uplywie .pierwszego okresu trwajacego 43 go1- dziny roztwór wyjsciowy poddaje sie klarowaniu na drodze filtracji ma filtrze ze spiekanego szkla w celu usuniecia drobnego osadu tworzacego sie w roztworach glikozowo-germanianowych po u- plywie dluzszego czasu. Powoduje to wzrost ak¬ tywnosci, która troche zmalala. Po uplywie dru¬ giego okresu czasu od 43 do 102 godzin, dla po¬ lepszenia wyników zwieksza sie pH roztworu wyjsciowego do wartosci 7,8. Przy dluzszytm czasie przejscia przez kolumne, pH wycieku zwykle znacznie opada. Okazuje sie, ze mozna utrzymac przez dluzszy czas stopien konwersji na. 'poziomie wyzszym niz 70% o ile inie dopusci sie do zmniej¬ szenia wartosci pH wycieku z kolumny znacznie ponizej wartosci 7,0. Wyniki podane sa w Ta¬ beli 7A.Wplyw temperatury na stabilnosc bada sie sto¬ sujac te satma kolumne zawierajaca enzym co uzy¬ wana ipoprzednio. Wyniki podano w tabelach 7B Stezenie jonów garmania- nowych (mM) 200 100 50 12,5 6,25 0 Tabela 6 % konwersji | pH 10,5 84 81 82 89 76 62 pH 10,0 86 81 81 81 69 55 tH 9,5 84 77 77 78 64 48 pH 9,0 | pH 8,5 63 68 62 60 56 40 56 48 48 50 40 32 23 pH 8,0 48 40 40 39 29 pH 7,5 36 36 33 29 23 pH 7,0 1 1 32 29 23 22 22 22 | Przyklad VI. Konwersja glikozo-6-fosforanu do fruktozo-6-fosforanu.Prowadzi sie szereg doswiadczen stosujac sposób postepowania jak w przykladzie A przy uzciu 0,5 mM roztworu glukozo-6-fosforanu z dodatkiem róznych ilosci jonów gertmanianowych. Doswiad¬ czenia prowadzi sie w temperaturze 25°C przy róznych wartosciach pH. Uzywa sie enzymu Sigma Grade III otrzymanego z drozdzy (w postaci za¬ wiesiny krystalicznej), rozcienczonego 200 razy i poddanego przed uzyciem dializie wobec wody de¬ stylowanej w celu usuniecia soli buforowych.Otrzymany fruktozo-6-fosforan oznacza sie metoda rezorcynolowa.Uzyskany stopien konwersji w procentach po¬ dany jest w Tabeli 6.Jiak widac °/o konwersji wzrasta w obecnosci jo¬ nów germanianowych.Przyklad VII. Enzymatyczna konwersja gli- kozy do fruktozy — stabilnosc.Roztwór wyjsciowy o stezeniu 41,2% glikozy, 600 mM germaniami i 4 mM chlorku magnezowe- igo o poczatkowym pH równym 7,0 przepuszcza sie w sposób ciagly przez kolumne zawierajaca enzym podobna do tej jak w przykladzie 1. Oznacza sie 40 50 55 60 65 i 7C. Warunki reakcji podane sa w naglówkach rubryk.Stopien konwersji podany w tabeli 7B uzyskuje sie w stanie równowagi zas stopien konwersji po¬ dany w tabeli 7C uzyskuje sie na poczatku. Wy¬ niki podane w obu tabelach 7B i 7C wykazuja istnienie efektu kumulacji.Tabela 7A Czas (godz.) 1 2 17 1 43 54 | 102 126 150 174 | 198 Poczatkowa wartosc pH 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,8 7,8 7,8 7,8 Koncowa wartosc pH po przejsciu przez reaktor za¬ wierajacy enzym 6,6 ,6 ,5 ,8 ' 5,7 6,9 6,9 6,9 6,8 % konwersji do fruktozy 67,2 1 61,5 60,8* | 64,9 65,5** | 76,5 78,3 76,5 71,6 1 * koniec pierwszego okresu — nastepnie roz¬ twór wyjsciowy poddaje sie klarowaniu ** koniec drugiego okresu — nastepnie zwiek¬ sza sie wartosc poczatkowa pH.101 098 17 Tabela 7B Roztwór 44°/o (masa/obj.) glikozy + 4 mM MigC12 + 600 imM germaniami o pH równym 7,1 prze¬ puszczany przez enzym z szylbkoscia 0,05 ml/min 5 Temp. (°C) 55 ¦ .60. 65 70 75 80 85 Data r 26.11.75 26.11.75 26.11.75 27.11.75 27.11.75 27.11.75 27.11.75 % konwersji do fruktozy (enzym przemywany przed dwoma dniami) 69,2 73,4 75,1 71,5 72,1 75,0 60,5 | • Tabela 7C Roztwór 44% (masa/obj) glikozy + 4 mM MgC12 -h 60-0 mM germaniami o pH równym 7,1 prze-^ 2o puszczony, przez enzym z szybkoscia 0,16 ml/mi^ Temp.(°C) 1 55 60 65 70 75 80 1 85 Data 8.12.75 9.12.75 9.12.75 9.12.75 9.12.75 9.12.75 9.12.75 1 % konwersji do fruktozy (enzym prze¬ mywany przed 14 I dniami 22,7 ,1 31,8 34,1 ,8 32,4 ,6 Czas przepu¬ szczania przez kolumne w okreslonej temp. (godz.) 1,5 1,5 1,5 1,5 2,5 2 1,5 Laczny czas prze¬ puszcza¬ nia przez kolumne (godz.) 1,5 3 4,5 6 8,5 ,5 12 | Przyklad VIII. Chemiczna konwersja cu¬ krów. a) glikoza do fruktozy. Przygotowuje sie roz¬ twory glikozy (o stezeniu 55—60% masa/obj.) po¬ zbawione jonów germanianowych oraz zawierajace je w stezeniu 600 mM. Natychmiast po przygoto¬ waniu pobiera sie 50 ml cieczy, rozciencza do objetosci 5 ml i w tej postaci przechowuje w tem¬ peraturze —20°C az do wykonania analizy. Na¬ stepnie syropy te umieszcza sie w zamknietych kolbach w lodówce w temperaturze 4,5°C. Co¬ dziennie wstrzasa sie kolby a po uplywie czasu po¬ danego w tabeli 8A usuwa sie roztwory.Analizy wszystkich próbek wykonuje sie przez rozdzielenie na jonicie boranowym a piki anali¬ zuje sie automatycznie metoda cysteinu/kwas siar¬ kowy (Anal. Biochem., 26, i(1968)) p. 219). Daje sie zauwazyc, ze roztwór zawierajacy jony germania- nowe przybieral jedynie delikatny odcien bialy w okresie czasu objetym danymi z tabeli 8A zas roztwór pozbawiony jonów germanianowych przyj¬ mowal szybko barwe zielona, która poglebiala sie w czasie inkubacji. Wyniki podane sa w tabeli 8A. b) Wplyw inkubacji przy wartosci pH równej 12 i temperaturze 5°C w obecnosci jonów germania- aiowych oraz bez nich bada sie na pewnej liczbie cukrów. Otrzymane wyniki oraz najwazniejsze wa¬ runki doswiadczen w odniesieniu do roztworów fruktozy, mannozy, maltozy i 3-0-metylo-D-gliko- zy podane sa odpowiednio w tabelach 8B, 8C, 8D 40 45 50 55 60 65 18 Tabela 8A Czas przecho¬ wywania (dni) 0 14 23 27 1 " 31 Roztwory zawierajace jony germanianowe Utworzona fruktoza (masa/obj.) 2,1 17,8 - ,0 31,9* Pozostala glikoza (masa/ obj.) 51,8 40,3 34,2 26,9 Roztwory nie za- 1 wierajace jonów germanianowych | Utworzo¬ na frukto¬ za (masa/ obj.) 2,2 8,9 11,1 11,1** Pozostala glikoza (masa/ obj.) 48,7 44,6 ,2 ,6 * równowazne 54% konwersji. 3,1% mannozy.** Obecne 5% mannozy.Obecne tylko i 8E. We wszystkich przypadkach obecnosc germa¬ niami ma dwojakie dzialanie: a) hamuje on roz¬ klad cukrów i b) powoduje zmiane skladu mie¬ szaniny w stanie równowagi. Ze wzgledu na roz- .klad, liczby w tabelach nie daja w sumiie war¬ tosci 100%.Ta Poczatkowe stezenie D-fruktozy stezenie jonów germa¬ nianowych Znalezione sklad¬ niki (%) D-glukoza D-mannoza D-fruktoza Nieznany zwiazek a Nieznany zwiazek b bela 8B 52,1% masa/obj. brak 17 dni 36,4 22,8 27,8 + + + + + + + dni 42,3 24,3 21,2 + + + + + + + 50,5% 1 masa/obj. 600 mM 17 dni 18,1 26,7 51,2 + + | Tabela 8C Poczatkowe stezenie D- mannozy stezenie jonów germanianowych Znalezione zwiazki PL PL

Claims (22)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób konwersji aldozy lub jej pochodnej w ketoze lub jej pochodna, obejmujacy wytworze¬ nie roztworu wodnego aldozy lub jej pochodnej i przeprowadzenie izomeryzacji chemicznej lub en¬ zymatycznej aldozy lub jej pochodnej w ketoze lub jej pochodna, w warunkach izomeryzacji aldo¬ zy w ketoze, w obecnosci czynnika tworzacego kompleks i oddzielenie produktu bogatego w ke¬ toze lub jej pochodna, znamienny tym, ze jako czynnik tworzacy kompleks stosuje sie anion za¬ wierajacy tlen lub mieszamy kompleksowy anion zawierajacy tlen z germanem lub cyna, tworzacy silniejszy kompleks z ketoza lub jej pochodna niz z aldoza lub jej pochoidna.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mannoze lub glikoze przeprowadza sie w fruktoze.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze konwersje prowadzi sie w obecnosci enzymu jako katalizatora.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie enzym rozpuszczalny.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mannoze lub glikoze przeprowadza sie w fruktoze w obecnosci izomerazy glikozy.

6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze w celu uzyskania optymalnej aktywnosci izomera¬ zy glikozy konwersje prowadzi sie w obecnosci jonów kobaltu.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie enzym osadzony na i stalym podlozu, takim jak zywa lub nieczynna komórka lub" ja¬ kikolwiek inny odpowiedni nosnik.

8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik kompleksujacy wprowadza sie" do pro¬ cesu w postaci kompleksu aldozowo-anionowego z anionem zawierajacym tlen, lub w postaci po¬ chodnej kompleksu aldozowo-anionowego, lub w postaci soli lub tlenku lub innego zwiazku, który w warunkach reakcji tworzy aniony zawierajace tlen lub mieszane, kompleksowe aniony zawiera¬ jace tlen.

9. Sposób wedlug tasfcrz. 1, znamienny tym, ze czynnik, tworzacy kompleks wprowadza sie do procesu" w postac: uprzednio zwiazanego anionu zawierajacego tlen lub^ póliolu lub zywicowego wymieniacza jonowego lub innego nierozpuszczal¬ nego nosnika, który tworzy wiazania chelatówe z czynnikiem tworzacym kompleks lub zwiazany jest z nim wiazaniem jonowym.

10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 stosuje sie mieszany kompleksowy anion zawiera¬ jacy tlen, przy czym anion ten tworzy sie na drodze wzajemnego oddzialywania zawierajacego tlen anionu germanu lub cyny z jonem pierwiast¬ ka z IV grupy ukladu okresowego lub z jonem pierwiastka z grupy V lub VI.

11. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze oparty jest na izomeryzacji chemicznej bez udzia¬ lu enzymu.

12. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze stosuje sie izomeraze glikozy pochodzaca ze szcze¬ pu Aerobaetor, Pseudomonas, Lactobacillus, Curto- bacterium, Arthobacter, Thermoactinomyces, Ther- mopolyspora, Thermomonospora lub Fseudono- cardia.

13. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze stosuje sie izomeraze glikozy unieruchomiona w postaci klaczkowatych, nieuszkodzonych komórek mikrobów.

14. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik tworzacy kompleks stosuje sie w zawie¬ rajacym aldoze roztworze, który przepuszcza sie przez material zawierajacy enzym.

15. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wytworzona ketoze i/lub mieszanine zawierajaca ketoze i nieprzereagowana aldoze oddziela sie od czynnika tworzacego kompleks, który zawraca sie do obiegu ewentualnie z nieprzereagowana aldoza.

16. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze odzielanie przeprowadza sie przy uzyciu jednego lub kilku zywicowych wymieniaczy jonowych.

17. Sposób wedlug zastrz. 14, znamienny tym, ze glikoze przeprowadza isie w fruktoze w obecnosci izomerazy glikozy i czynnika tworzacego kompleks znajdujacego sie w roztworze w stezeniu w zakre¬ sie 200—800 moli.

18. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze glikoze przeprowadza sie w fruktoze w obecnosci izomerazy glikozy, wychodzac z wodnych roztwo¬ rów zawierajacych 30—51F/0 wagowych glikozy.

19. Sposób wedlug zastrz. 18, znamienny tym, ze konwersje prowadzi sie tak, aby stezenie fruktozy w roztworze koncowym wynosilo 40—85*/t.

20. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze konwersje prowadzi sie przy pH srodowiska re¬ akcji w zakresie 6—10.

21. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze konwersje prowadzi sie w temperaturze w zakre¬ sie ao-^iao^.

22. Sposób wedlug zastrz. 1, zHStfcnny tym, ze101 098 25 •glikoze przeprowadza sie w fruktoze w obecnosci Izomerazy glikozy, w srodowisku wodnym zawie- 26 rajacym 30—5(P/o wagowych glikozy oraz jony Mg2+. PROCENTOWA ZAWARTOSC FRUKTOZY W WYCIEKU Z KOLUMNY ZAWIERAJACEJ NIERUCHOME ZLOZE IZOMERYZAZY GLUKOZY W FUNKCJI CZASU PRZEBf- WANIA DLA RÓZNYCH ROZTWORÓW WYJSCIOWYCH roztwór wyjsciowy fruktozy roztwór wyjsciowy glikozy stezenie germaniami 600 mM brak germanianu 20 U) 60 60 100 110 FIG.l 1B0 220 260 300 Czas przebywania (w minutach) fruktoza glikoza mannoza l 5 6 7 6 9 W 11 PH PROCENTOWA ZMIANA SKRECALNOSCI OPTYCZNEJ W WYNIKU TWORZENIA KOMPLEKSU W FUNKCJI WARTOSCI pH DLA WZAJBWCH ODDZIALYWAN FRUKTOZY, GLIKOZY I MANNOZY Z JONAMI GERMANIANOWYMI FIG2. PL PL