NO142527B - Fremgangsmaate for omdannelse av aldoser til ketoser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for omdannelse av en aldose eller et aldosederivat til en ketose eller et ketosederivat i nærvær av et oksyanion og spesielt for omdannelse av glukose til fruktose, mannose til fruktose, glukose-6-fosfat til fruktose-6-fosfat, maltose til maltulose, galaktose til tagatose og laktose' til laktulose og for andre analoge reaksjoner som f.eks. omdannelsen av xylose til xylulose. Fremgangsmåten kan utføres i nær- eller fravær av et enzym for katalysering av omdannelsen.

Når omdannelsen av glukose til fruktose utføres i nærvær av et enzym, glukose-isomerase, oppnås likevekt svært ofte når 50 til 55% av glukosen i reaksjonsmediet er omdannet til fruktose. Hittil har det ikke vært mulig å omdanne glukose til fruktose ved hjelp av en ikke-enzymisk reaksjon uten fremstilling av biprodukter. Det finnes en rekke publikasjoner, eksempelvis US-patenter nr. 2 487 121, 3 432 345, 3 558 355 og 3 514 327 og tysk patent 1 163 307, som gjelder ikke-enzymisk omdannelse av glukose til fruktose og som alle beskriver fremgangsmåter hvori den fremstilte fruktose følges av alkaliske nedbrytnings- og andre produkter som oppstår ved den rene kjemiske og ikke-enzymisks reaksjonen. På grunn av dette er enhver produksjon av fruktose i stor skala til dags dato basert på en enzym-katalysert reaksjon.

I enzymomdannelses-fremgangsmåten minsker reaksjonshastigheten for dannelse av fruktose etterhvert som mengden fruktose i det enzymiske reaksjonsmedium øker. Derfor optimeres fruktose-utbyttet i en kommersiell fremgangsmåte for omdannelse av glukose til frukto.se v»d å balansere et tap i fruktosefremstilling mot den minskede reaksjonshastighet, hvorved mengden fruktose i reaksjonsmediet kan økes. En kommersiell fremgangsmåte kan optimeres slik at den fremstiller en sirup i hvilken typisk 40% av glukosen er omdannet til fruktose. I de fleste kjemiske, ikke-enzymiske omdannelser av glukose til fruktose faller mengden tilstedeværende fruktose etter å ha nådd et maksimum.

Det er klart at det er fordelaktig å øke andelen glukose som økonomisk kan omdannes til fruktose under reaksjonen.

Dette kan oppnås ved effektiv fjerning av fruktose fra reaksjonsmediet ved innføring av et reagens i mediet som danner et sterkere kompleks med fruktose enn med glukose, selv om det kompleksdannende midlet kan ha tilleggsegenskaper som kan øke eller minske reaksjonshastigheten. Reagenser som er foreslått for dette formål er boratforbindelser - se Y. Takasaki, Agr. Biol. Chem. 1971, 55(9), 1371-5 og US patent 3 689 362 (enzym-reaksjon) og J. F. Mendicino, J. Amer. Chem. Soc. 1960, 4975 (kjemisk reaksjon) . Også aren-boronater er foreslått av S. A. Barker, P.J. Somers og B.W. Hatt i britisk patent 1 369 185 for både kjemiske

og enzym-reaksjoner. Ulemper ved disse tidligere forslag er når det gjelder boratforbindelser, at disse er toksiske og kan inne-bære en helsefare i et produkt som er tenkt anvendt som søtnings-middel i næringsmidler for humankonsum og, når det gjelder ben-zenboronat, har dette begrenset løselighet, kan ikke danne kom-plekser i et forhold 2:1 mellom sukker og boronat og høye konsentrasjoner av fruktose i produktet kan ikke oppnås med høye sukker-konsentrasjoner (S. A. Barker, B.W. Hatt og P.J. Somers, Carbo-hydrates Res., 26 (1973), 41-53). Disse kompleksdannende reaksjoner er således ikke lette å anvende ved kommersielt drevne omdannelsesfremgangsmåter. For å utvikle en kommersiell frem-gangsmåte hvori andelen fruktose i den fremstilte sirup økes, er det nødvendig å finne et kompleksdannende reagens som ikke har slike ulemper i forbindelse med bruken av det.

I følge foreliggende oppfinnelse skaffes en fremgangsmåte for kjemisk eller enzymatisk omdannelse av en aldose eller et aldosederivat til en ketose eller et ketosederivat i nærvær av et kompleksdannende middel, og fremgangsmåten karakteriseres ved at det som kompleksdannende middel anvendes et oksyanion eller blandet komplekstoksyanion av germanium eller tinn som danner et sterkere kompleks med ketosen eller ketosederivatet enn med aldosen eller aldosederivatet.

I følge foreliggende oppfinnelse skaffes også en fremgangsmåte for omdannelse av en aldose eller et aldosederivat til en ketose eller et ketosederivat, hvori omdannelsen finner sted i nærvær av et kompleksdannende middel som er et oksyanion eller et blandet komplekst oksyanion av germanium som danner et sterkere kompleks med ketosen eller ketosederivatet enn med aldosen eller aldosederivatet.

Det er meget hensiktsmessig at det som aldosederivat anvendes et aldosefosfat eller et glykosylderivat av en aldose.

Mens oppfinnelsen er anvendbar på et vidt område av omdannelser og spesielt til de omdannelser som er beskrevet ovenfor, anvendes den med størst nytte ved omdannelsen av glukose til mannose til fruktose. Under en omdannelse kan en enzymkatalysator være til stede når dette gjør det mulig å anvende midlere reak-sjonsbetingelser eller har andre fordeler, som f.eks. den selektive virkning av det anvendte enzym på bare en isomer (D eller L) av aldosene eller aldosederivatet. Når det utføres en enzym-katalysert omdannelse, kan enzymet være til stede i oppløsning eller i en immobilisert form på en fast matrise som kan være en levende celle, en inaktivert celle eller en annen passende bærer. Enzymet kan også foreligge i løselig form. Enzymer av isomerase-typen som er egnet for omdannelser av den type (eksempler er oppført i tabell A) som oppfinnelsen er anvendbar på, kan omfatte en eller flere serier av enzymer som er medvirkende i del-reaksjoner.

I foreliggende beskrivelse skal uttrykket ketose bety

en ketulose, se diskusjonen av nomenklaturen for ketoser i "The Editorial Report on Nomenclature", Journal of the Chemical So-ciety, p 5110, (1952).

Det kompleksdannende reagens kan innføres i omdannelses-prosessen på enhver egnet måte, f.eks. som et aldose-anion-kompleks eller et derivat av et aldose-anion-kompleks eller som et salt eller en forbindelse som f.eks. et oksyd som danner oksyanioner eller blandede komplekse oksyanioner under betingelsene for om-dannelsesfremgangsmåten. Det kompleksdannende reagenset kan også innføres som et oksyanion som tidligere var holdt på en polyol eller en ionevekslerharpiks eller en annen uløselig bærer som chelaterer med det kompleksdannende midlet eller har det kompleksdannende midlet som en mot-ion.

Det blandede, komplekse oksyanionet dannes hensiktsmessig ved påvirkning av et oksyanion av germanium eller tinn på et ion av et annet element fra gruppe IV eller et element fra gruppe V eller VI. Fortrinnsvis inneholder oksyanionet eller det blandede, komplekse oksyanionet germanium. Spesielt egnede kompleksdannende reagenser er germanat- eller poly-germanationer, innbefattet i fremgangsmåten som f.eks. natriumgermanat eller germaniumdioksyd, og anvendt i oppløsning, som immobiliserte che-later eller som mot-ioner på ionevekslerharpikser. Blandede ioner som f.eks. [ GeC>2 (S04) 2] 2~, [ HGeC>2 (P04) ] 2~ eller laktat-germanium-forbindelser kan med fordel anvendes i enkelte tilfeller.

Det er kjent fra Lindberg og Swan, Acta Chem Scand, 14,

(1960), 1043-50, at fruktose-germanatkomplekser er meget forskjellige fra glukose-germanatkomplekser når de separeres ved elektro-forese ved pH 10,7, og det førstnevnte har mere enn dobbelt så stor mobilitet ved 40°C enn det andre. V.A. Nazarenko og G.V. Flyantikova (Zh Neorgan Khim, 8 (1963) 2271, 1370) gjengir ioni-seringskonstanter for glukose og fruktose med germanat på -6 -4

8,3 x 10 og 1,04 x 10 respektive. De angir videre instabili-tetskonstanter for glukose og fruktose med germanat på 3,54 x 10<-2>

_5

og 4,24 x 10 respektive.

Det er overraskende at germanationer skulle være bruk-bare som reagenser ved omdannelsen av glukose til fruktose av følgende grunner. 1. Det er vist at germanat foreligger som en monogermanat pentagermanat ^ ^heptagermanat-likevekt som går mot høyre ved økende germaniumkonsentrasjon og til venstre ved økning av pH til pH over 9 (D. A. Everest og J.C. Harrison, J. Chem. Soc., 1959, s. 2178-2182). For å oppnå en økonomisk fremgangsmåte er det foretrukket å ha en minimalmengde av germanatforbindelser for å gi maksimal omdannelsesgrad så vel som for å unngå fremstilling av alkalisk nedbrytningsbiprodukter. 2. Germaniumdioksyd og natriumgermanat har meget begrenset løselighet i vann - se P.J. Antikainen (Suomen Kemistilehti, 33B

(1960) 38-40). Gulzian og Muller, J. Amer. Chem. Soc. 1932, 54, 3142 angir 31-33 raM for GeO^ i vann. D.A. Everest og J.C. Harrison, J.Chem. Soc., 1959, 2178, angir 870 mM for natriumgermanat. 3. Magnesiumioner er vanligvis til stede i reaksjonsmedia som anvendes i glukose- til fruktose-omdannelser med enzymer. Magnesiumortogermanat (Mg2Ge04) er ekstremt uløselig i vann og anvendes ved den analytiske bestemmelse av germanium - se J. H. Muller, J. Amer. Chem. Soc, 1923, s. 2493-2498. Under de betingelser som er angitt nedenfor ble det ikke utfelt fra løsningen.

4. Glukose-isomerase har et sterisk behov for a-D-glukose

(K. J. Schray og I. A. Rose, Biochemistry 10 (1971) 1058-1062) og- glukosegermanat-komplekset, som dannes på kjent måte, kunne ha innvirket på enzymreaksjonen ved å hindre den delvis eller helt. Faktisk er 1,2-cisglykolen av a-D-glukose bedre egnet for kompleksdannelse med germanat enn a-D-glukose. 5. Mannose kompleksdannes sterkere enn glukose med germanat (P. J. Antikainen, Acta Chem. Scand., 13 (1959) 312).

Omdannelsen av glukose til fruktose kan utføres ved

hjelp av en rent kjemisk reaksjon under anvendelse av germanat-forbindelser eller stannat-kompleks for å forskyve pseudo-likevekten som er beskrevet av S A Barker, B W Hatt og P J Somers

(Carb Res, 26 (1973) 41-53). Den utføres imidlertid fortrinnsvis som en enzym-katalysert reaksjon i nærvær av glukose-isomerase. Ethvert glukose-isomerase-enzym kan anvendes ved omdannelsen, men disse enzymer varierer når det gjelder deres optimale pH og temperatur. Egnede isomeraser omfatter de som oppnås fra bakterier av slektene Aerobacter, Pseudomonas, Lactobacillus (K Yamanaka, Agr. Biol Chem, 27, 1963, 265-270) Streptomyces, Curtrobacterium (som beskrevet i britisk patent 1.451.273), eller, spesielt,

Arthrobacter (som beskrevet i britisk patent 1328 970). Glukose-isomeraser fra de termofile mikroorganismene av slektene Thermo-actinomyces, Thermopolyspora, Thermomonospora og Pseudonocardia, hvilke er beskrevet i japansk patentpublikasjon 74/30588, er også egnet. Noen av de ovennevnte glukoseisomerasene behøver kobolt-ioner for å oppnå optimal aktivitet.

Omdannelsen av glukose til fruktose kan utføres kontinuerlig ved å føre en glukoseløsning gjennom en kolonne som inneholder det immobiliserte enzymet eller en annen katalysator. Fortrinnsvis immobiliseres enzymet ved å holdes i flokkulerte, hele mikrobielle celler på den måten som er beskrevet i britisk patent 1 368 650. Det kompleksdannende reagenset, f.eks. germanat-

eller stannat-forbindelser, kan være til stede i den løsning som føres inn i kolonnen eller være sammen med det immobiliserte enzymet eller katalysatoren på kolonnen. I det siste tilfellet kan kolonnen pakkes med immobilisert enzym eller annen katalysator som er iblandet reagenset og homogent fordelt over kolonnen eller alternativt kan kolonnen inneholde alternerende lag av immobilisert

enzym eller annen katalysator og reagens adskilt ved hjelp av nett eller gitter. Når reagenset er til stede i kolonnen er det

i uløselig form, f.eks. i gelform, som en zeolitt eller som et uorganisk eller organisk polymert derivat.

Etter omdannelse av glukose til fruktose kan fruktose separeres fra blandingen som inneholder det kompleksdannende reagens og fjernes fra systemet enten alene eller i blanding med glukose. Produktet ved fremgangsmåten er fruktose, en glukose/ fruktosesirup eller både fruktose og en glukose/fruktosesirup.

Det kompleksdannende middel alene, sammen med glukose eller sammen med glukose og kompleksdannet glukose kan resykleres. Separasjon og resyklering kan utføres i følge enhver egnet metode. To spesielt egnede metoder for separering og resyklering er som følger: a) En metode hvori start-produktet ved glukose/fruktose-omdannelsen føres gjennom en kolonne som inneholder en kationvekslerharpiks med kationiske mot-ioner av et metall fra gruppe II i det periodiske systemet og hydrogenioner. Dette deler det opprinnelige produktet i fruktose, som fjernes som sluttproduktet ved fremgangsmåten, og glukose pluss det kompleksdannende midlet som resykleres. Metallionene fra gruppe II er fortrinnsvis kalsium-ioner. b) En metode hvori start-produktet ved glukose/fruktose-omdannelsen først føres gjennom en kolonne som inneholder en kationvekslerharpiks med kationiske mot-ioner av et metall fra gruppe I eller II i det periodiske systemet, fortrinnsvis natriumioner. Dette deler det opprinnelige produktet i to deler, nemlig 1) en sirup som inneholder glukose og fruktose og 2) fruktose pluss det kompleksdannende midlet. Del 1) fjernes mens del 2) føres gjennom en kolonne som beskrevet under a) ovenfor for å skille fruktose fra det kompleksdannende midlet, hvoretter det sistnevnte resykleres.

I begge metoder a) og b) ovenfor er harpiksen fortrinnsvis en kjernesulfonert polystyren-kationvekslerharpiks som inneholder et tverrbindingsmiddel.

Alternative andre metoder kan anvendes som f.eks. nedbrytning av det fruktose-holdige komplekset ved å bruke "Borasorb"

(registrert varemerke)solgt av Calbiochem Ltd. - en polymer omfattende en lang kjede av cis-hydroksylgrupper bundet ved et

tertiært N-atom til et polystyren-divinylbenzen-gitter og vanligvis brukt for å absorbere borat - slik at fruktose og det kompleksdannende middel oppnås. Dersom reaksjonen gjennomføres med det kompleksdannende reagens i oppløsning i reaksjonsmediet, kan dette reagens også resykleres. Det germanat som absorberes på "Borasorb" kan således elueres med alkali eller syrer. Alle disse manipulasjoner kan unngås dersom det kompleksdannende middel

(f.eks. germanat) anvendes i immobilisert form.

Omdannelsen av glukose til fruktose gjennomføres fortrinnsvis enzymatisk og kontinuerlig ved å bruke en kolonne med flokkulerte, hele celler som inneholder enzymene som beskrevet ovenfor. Når reagenset forefinnes i det reaksjonsmedium som kommer inn i kolonnen foreligger det fortrinnsvis i konsentrasjoner mellom 200 mM og 800 mM, spesielt 500 og 600 mM. Reaksjonsmediet som kommer inn i kolonnen inneholder fortrinnsvis 30 til 50% vekt/volum glukose i vandig løsning og reaksjonen gjennomføres slik at konsentrasjonen av fruktose i det medium som forlater kolonnen er mellom 40 og 85%, spesielt 75 og 80%. Reak-sjonsmediets pH er fortrinnsvis i området 6 til 10 og optimal aktivitet opptrer i området av pH 8, spesielt ved pH 7,8, men varierer noe med enzymarten, idet de foran angitte verdier gjelder enzymer oppnådd fra Arthrobacter-organismer. Arbeidstempera-turen ligger fortrinnsvis i området 50 til 100°C, spesielt i området 45 til 80°C. Eluatets pH er vanligvis lavere enn mate-løsningens fordi produktet fruktose danner kompleks med oksyanionet.

Ved siden av glukose og forskjellige slags germanat-ioner inneholder reaksjonsmediet hensiktsmessig følgende bestand-deler i følgende forhold: Mg 2+-ioner i en konsentrasjon av ca. 4 mM - med kloridioner av ekvi valent konsentrasjon og NaOH for justering av pH

For andre enzymreaksjoner (f.eks. fosfoglukoisomerase

som omdanner glukose-6-fosfat til fruktose-6-fosfat og hvor øket utbytte av produktet er funnet ved 25°C i nærvær av germanat-forbindelser) vil reaksjonsbetingelsene være meget forskjellige og må optimeres for hvert enzym. Glukose-isomerase kan også anvendes for omdannelse av D-xylose til D-xylulose og er et egnet valg for denne teknologi hvor germanat forskyver likevekten i favør av øket xyluloseutbytte.

Anvendelse av germanat.-i one r som kompleksdannende middel har fordeler fremfor bruken av boratforbindelser, slik som angitt tidligere, idet germanat-forbindelser danner sterke kom-plekser med fruktose og er mere selektive stereokjemisk enn borat ved dannelse av sukkerkomplekser. Toksisitetsproblemer som er forbundet med anvendelse av boratforbindelser unngås.

Til forskjell fra aren-boronsyrer kan germanat danne et 1:2 germanat-fruktose-chelat og således kan det økonomiseres med bruken av kompleksdannende middel.

Det normale optimum for enzymet alene behøver ikke være optimum for den kombinerte enzym/kompleksdannende middel-fremgangsmåte. Således vil enhver evne til å senke optimalt pH for et enzym, f.eks. for glukose-isomerase fra 8,5 til 5, være fordelaktig ved at det reduserer utgiftene til å fjerne farge som fremkommer under enzymprosessen. Dette er uventet tilfelle ved Arthrobacter glukose-isomerase og kan være tilfelle med andre viktige enzymer. Likeledes vil evnen til å redusere arbeids-temperaturen og allikevel oppnå den samme prosentvise omdannelse på samme reaksjonstid også være fordelaktig. Mens dette ikke er tilfelle med Arthrobacter glukose-isomerase, er det mulig å spare arbeidstid på grunn av en annen uventet fordel. Tilset-ningen av germanat øker tydelig startreaksjonshastigheten ved omdannelsen av glukose til fruktose slik at det oppnås økonomiske omdannelser med kortere oppholdstid. Videre er det heldig at germanat ikke utøver noen instabiliseringseffekt på Arthrobacter glukose-isomerase i løpet av den undersøkte tid, forutsatt at pH-fallet som følger fremstillingen av fruktose i nærvær av germanat er forbedret.

Fig. 2 av tegningene viser prosentvis forandring av optisk rotasjon som resultat av kompleksdannelse mot pH for germanatkomplekser med glukose, fruktose og mannose. Som det kan sees dannes fruktosekomplekset ved lavere pH enn glukose-

og mannose-kompleksene.

Oppfinnelsen skal illustreres ved følgende eksempler:

EKSEMPEL 1

Enzymatisk omdannelse av glukose til fruktose.

En serie vandige glukoseløsninger inneholdende forskjellige konsentrasjoner av glukose sammen med magnesiumioner for germanat-ioner ble ført gjennom en 32 cm lang kolonne med 0,4 cm indre diameter som var pakket med flokkulerte, hele celler inneholdende glukose-isomerase. Tilsvarende løsninger uten germanat ble også ført gjennom kolonnen for sammenlikningsformål. Prosentvis omdannelse av glukose til fruktose i eluatet fra kolonnen ble målt på en Autoanalyser ved bruk av resorcinol-metoden. Reaksjonene ble utført ved et start-pH på 8,5 og ved en temperatur av 60°C, idet det var en konsentrasjon av 0,004 M magnesiumklorid i den vandige glukoseløsningen.

For fremstilling av glukoseløsninger opp til 100 mM, for å unngå at germanationene forårsaker utfelning av magnesium fra løsningen, ble alltid løsninger inneholdende germanationer tilsatt til glukoseløsningene som førtes inn i kolonnen før magne-siumkloridet, siden magnesium ikke utfelles av glukose-germanat-komplekset som dannes i løsningene. Løsningene som inneholdt germanat-ioner ble fremstilt ved å suspendere germaniumdioksyd i vann, tilsette en konsentrert alkaliløsning inntil pH nådde 10,5 og deretter tilsette glukoseløsning fulgt av magnesiumklorid. Ved sluttjustering av pH til 8,5 ble løsningen klar.

For fremstilling av substratløsninger som inneholdt

200 mM germanat eller mere, ble germaniumdioksydet tilsatt til IM glukoseløsning slik at germanatet gikk langsomt i oppløsning ved periodevis tilsetning av alkali til pH 8,5. En svakt tåket løsning ble oppnådd etter tilsetning av magnesiumklorid, men eluatet fra kolonnen var helt klar.

Resultatene er angitt i tabell 1.

Som det kan sees av tabell 1 ble i hvert tilfelle frukt-osekonsentrasjonen i løsningene øket i nærvær av germanat-ioner, sammenlignet med løsninger uten germanat-ioner.

EKSEMPEL 2

Enzymatisk omdannelse av glukose til fruktose.

Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt ved bruk av en kolonne av lignende dimensjoner (dvs. 30 cm lang og med 0,4 cm indre diameter) for å studere virkningen av høyere glukosekonsentrasjoner. I dette tilfelle ble strømningshastigheten redusert til 0,03 ml/min for å gi en maksimums-oppholdstid på 125 minutter for å oppnå likevekt i løpet av flere timer, og likevektsverdien ved disse betingelser ble opptegnet. Glukosekonsentrasjonen ble alltid bestemt etter at blandingen var laget for å korrigere for fortynnelse med alkali/magnesiumsalter.

Resultatene er angitt i tabell 2.

Som det kan sees av resultatene ga nærværet av germanat-ioner en kraftig økning i omdannelsen av glukose til fruktose.

Fruktose ble bestemt ved hjelp av Chaplin-Kennedy-metoden (Carbohydrate Res., 1975, 40, 227-33). Denne metode har en tendens til å gi høyere resultater enn resorcinolmetoden som ble brukt i alle senere eksempler for bestemmelse av fruktose.

I et ytterligere forsøk som ble analysert ved hjelp av resorcinol-metoden (Carbohydrate Res., 26 (1975) 41) ved å bruke en kolonne med samme dimensjoner ved 60°C og pH 8,5, ble følgende resultater oppnådd ved bruk av forskjellige strømningshastigheter på kolonnen.

Produktet fra den opprinnelige glukosekonsentrasjonen på 43,5 i tabell 2 ovenfor ble fraksjonert på Jeol Ltd anionveks-lerharpiks i boratformen ved å bruke en gradienteluering med boratbuffere (0,13 M borat pH7 til 0,35M borat pH 9,8) for å gjennomføre en adskillelse av glukose og fruktose i produktet. Den samme separasjon ble også utført etter å ha fjernet germanat på en kolonne av "Borasorb" (registrert varemerke, se ovenfor). Forholdet mellom fruktose og glukose var 3,31:1 uten tidligere fjernelse av germanat. Fruktose og glukose ble bestemt ved hjelp av cystein-svovelsyre-metoden.

EKSEMPEL 3

Kjemisk omdannelse av glukose til fruktose.

Den rent kjemiske omdannelse av glukose til fruktose

i nærvær av germanat-ioner ble gjennomført ved å oppvarme en løsning inneholdende 50% vekt/volum glukose, 4 mM magnesiumsalt og 600 mM germanat-ioner til 60°C ved pH 8,5. De funne fruktose-konsentrasjonene etter forskjellige tider var som følger:

Forsøket ble gjentatt ved 90°C med en glukosekonsentrasjon på 48,4-50% vekt/volum og en germanatkonsentrasjon på 600-582 mM. Prosentvis omdannelse til fruktose oppnådd etter forskjellige tidsrom er angitt i tabell 3. Fruktose ble bestemt etter resorcinol-metoden. Nitrogen var til stede i den oppvar-mede sirup under hele forsøket. I alle tilfeller falt det opprinnelige pH som var målt ved 31°C og ble rejustert til det opprinnelige pH ved den angitte tid.

Lignende forsøk ble utført i nærvær av tilsatt MgCl2. Resultater oppnådd med resorcinol-metoden er oppført i tabell 4.

Følgende resultater oppnådd med 1,245M glukose, 600 mM germanat og 4 mM MgCl2 oppvarmet ved pH 8,5 og ved 90°C illu-strerer betydningen av forholdet glukose:germanat.

Det produkt som ble oppnådd noen få tirner senere ble skilt (med og uten tidligere fjernelse av germanat) på en borat-kolonne. I hovedsak lignende verdier av 39,7% fruktose ble oppnådd ved eluering ved den kalibrerte stilling for fruktose.

En løsning med 55% vekt/volum glukose, 600 mM germanat, 0,004 M MgCl2 som var oppvarmet ved 90°C og med opprinnelig pH på 7,5 viste etter 6 timer en omdannelse på 13,7% til fruktose etter bestemmelse ved resorcinol-metoden.

Den kjemiske omdannelsen av glukose til fruktose gikk meget langsomt ved lave germanatkonsentrasjoner ved 90°C og pH 8,5 uten tilsetning av magnesiumklorid.

EKSEMPEL 4

Omdannelse av glukose til fruktose ved hjelp av

løselig glukose- isomerase.

De start-reaksjonshastigheter ved bruk av glukose-isomerase i løselig form (200^ul) ble undersøkt ved 60°C og pH 8,5 med substrat D-glukose ved 0,5 mM og tilsatt 4 mM MgSl2 og 0,5 mM CoCl2 konstant i en serie løsninger (25 ml) inneholdende forskjellige mengder tilsatt germanat. Løsningene ble undersøkt ved hjelp av den automatiserte resorcinol-metoden.

Intet, 6,25^ug fruktose/min./ml enzym

0,5 mM germanat, 8,75yug fruktose/min./ml enzym 2 5 mM germanat, 15^ug fruktose/min./ml enzym

Den prosentvise omdannelse til fruktose etter 21 timer ble også bestemt.

Intet, 43% omdannelse, 0,5 mM, 51% omdannelse, 25 mM, 62% omdannelse .

' EKSEMPEL 5

Omdannelse av mannose til fruktose.

En løsning inneholdende 50% vekt/volum mannose, 4 mM MgCl2 og 600 mM germanat ble oppvarmet til 90°C og pH 8,5. Konsentrasjonene av fruktose som ble bestemt ved resorcinol-metoden er oppført i tabell 5.

EKSEMPEL 6

Omdannelse av qlukose- 6- fosfat til fruktose- 6- fosfat.

Ved anvendelse av teknikken fra eksempel 1 ble en serie forsøk utført ved anvendelse av en 0,5 mM løsning av glukose-6-fosfat til hvilken det ble tilsatt forskjellige mengder germanat-ioner. Forsøkene ble utført ved 25°C og ved en serie forskjellige pH-verdier. Det enzym som ble brukt var Sigma Grade III fra gjær (krystallisk suspensjon), som ble fortynnet 200 ganger og dialysert mot destillert vann for å fjerne buffer-salter før bruken. Fremstilt fruktose-6-fosfat ble bestemt ved hjelp av resorcinol-metoden.

De oppnådde prosentuelle omdannelser er oppført i tabell 6.

Som det kan sees øket % omdannelse i nærvær av germanat-ioner.

EKSEMPEL 7

Enzymatisk omdannelse av glukose til fruktose - stabilitet.

En mateløsning inneholdende 41, 2% glukose, 600 mM germanat og 4 mM magnesiumklorid ved et start-pH på 7,0 ble ført kontinuerlig gjennom en enzymkolonne lik den i eksempel 1. Slutt-pH og % omdannelse til fruktose ble målt etter forskjellige tidsintervaller. Forsøket ble delt i tre perioder.

Etter en første periode på 43 timer ble mateløsningen klarnet ved sintret filtrering for å fjerne det svake bunnfallet som har tendens til å dannes i glukose/germanat-løsninger etter-lengre perioder. Dette ledet til en økning av aktiviteten som hadde falt svakt. Etter en andre periode som varte fra 43 timer til 102 timer ble mateløsningens pH øket til 7,8 med fordel-aktige resultater. Eluatets pH har tendens til å falle merkbart etter lange passeringstider gjennom kolonnen. Det viser seg at omdannelser over 70% kan bibeholdes i en forlenget periode dersom pH i kolonne-eluatet ikke tillates å falle under 7,0. Resultatene er oppført i tabell 7A.

Slutt på første periode - mateløsningen så klarnet

44Slutt pa andre periode - start-pH så hevet

Virkningene av forskjellige temperaturer på stabili-teten ble målt ved bruk av en lignende enzymkolonne som den som ble brukt ovenfor. Resultatene er oppført i tabellene 7B og 7C. Reaksjonsbetingelsene er oppført i headingene av tabellene. I tabell 7B er omdannelsen den som er oppnådd ved likevekt, mens omdannelsen oppført i tabell 7C er den som er oppnådd opprinnelig. I begge tabeller 7B og 7C viser resultatene den kumulative e ffekten.

EKSEMPEL 8

Kjemisk omdannelse av sukkere

a) Glukose til fruktose.

Glukoseløsninger (55-60 vekt/volum) ble fremstilt både

med og uten innblanding av 600 mM germanat ved pH 12 ved 20°C. Like etter fremstillingen ble 50-ul alikvoter tatt ut, fortynnet til 5 ml og så o lagret ved en temperatur av -20 OC inntil den be-høvdes for analyse. Sirupene ble så plassert i korkede flasker i et kjøleskap ved 4,5°C. Flaskene ble rystet daglig og alikvoter ble tatt ut ved de tidsintervaller som er vist i tabell 8A. Alle prøver ble analysert ved separasjon på en ionevekslerharpiks med borat og toppene ble bestemt ved automatisk cystein/ svovelsyrebestemmeIse (Anal Biochem., 26, (1968), s. 219). Det ble bemerket at den løsningen som inneholdt germanat bare ut-viklet en svak forandring av den hvite fargen under hele den perioden som dekkes av tabell 8A, mens den germanatfrie løs-ningen raskt fikk en grønnfarge som ble mere intens under in-kuberingen.

Resultatene er oppført i tabell 8A.

Ekvivalent med 54% omdannelse. Bare 3,1% mannose til stede.

44 5% mannose til stede.

b) Effekten av inkubering ved pH 12 og 5°C i nærvær og fravær av germanationer ble undersøkt med en rekke sukkere. De oppnådde

resultatene og grunnbetingelsene når det gjelder løsninger av fruktose, mannose, maltose, og 3-0-metyl-D-glukose er oppført i

tabellene 8B, 8C, 8D og 8E respektive. I alle tilfeller har nærværet av germanationer to virkninger, a) det forsinker de-struksjon av sukkere og b) det forandrer sammensetningen av like-vektsblandingen. I tabellene adderer ikke tallene opp til 100% på grunn av nedbrytning.

<4> Beregnet som m.vekt med 0,5 molar glukose-respons +0,5 molar fruktose-respons.

Kjent for å være meget alkali-labil

44

Beregnet med henvisning til fruktose-respons.

EKSEMPEL 9

Enzymatisk omdannelse av xylose til xylulose

Det ble laget en xylose-løsning som inneholdt 44% vekt/volum xylose og 4 mM MgCl2 ved pH 7,0 og den ble ført gjennom den glukose-isomerase-kolonnen som ble brukt i de foregående eksempler for omdannelse av glukose til fruktose (kolonnetemp.

= 60°C og strømningshastighet = 0,05 ml/min.). På lignende måte ble en løsning som inneholdt 44% xylose, 4 mM MgCl2 og 600 mM germanationer ført gjennom kolonnen ved pH 7,0.

Etter 2 timers forløp ble fraksjonene oppsamlet og separert på en ionevekslerharpiks i boratform. En kontroll-xylosestandard ble også ført gjennom kolonnen som sammenligning. En automatisk utgave av cystein/H2S04-bestemmelsen av pentoser ble anvendt for å analysere toppene i den rekkefølge de kom ut av kolonnen. Bestemmelsen reagerer også med pentuloser, og produkt-xylulosen fra den xyloseløsning som var ført gjennom enzymkolonnen var klart synlig.

På grunn av at en standard xylulose for kalibrerings-formål ennå ikke er tilgjengelig ble reaksjonsgraden bestemt ved å sammenligne arealene under toppene. Dette forhold mellom dannet xylulose og total xylose og xylulose var 41:100, men når germanationer er til stede er forholdet 58:100.

EKSEMPEL 10

Omdannelse av glukose til fruktose under

anvendelse av stannat- ioner

To mate løsninger inneholdende 44,6% glukose og 4 mM MgCl2 ved pH 8,5 ble ført gjennom den glukose-isomerase-kolonnen som ble brukt i tidligere eksempler. En løsning inneholdt ikke stannat-ioner mens den andre inneholdt 600 mM stannat-ioner oppnådd fra krystallisk Na-^SnO^ * 3H20. Resultatene er vist i tabell 9.

Prøver fra reaktorkolonne-eluatet ga ikke ytterligere fruktose når det ble blandet med mere glukose, hvilket indikerer at aktiv glukose-isomerase ikke hadde sivet ut fra reaktorkolonnen.

EKSEMPEL 11

Enzymatisk omdannelse av glukose til fruktose:

Effekt av pH og germanatmengder.

a) To serier av forsøk ble utført ved anvendelse av en glukose-isomerase-kolonne (lengde 31 cm, diameter 4 cm) lik den som ble

brukt i tidligere eksempler. Hver serie sammenlignet resultater oppnådd ved bruk av rnateløsninger omfattende glukose og 4 mM

MgCl2 med og uten 600 mM germanat. Strømningshastigheten gjennom kolonnen var 0,05 l/min. og temperaturen for enzymet var 60°C. Start-pH for mateløsningene ble variert mellom forskjellige for-søk i hver serie og slutt-pH for eluatet ble målt. Resultatene er oppført i tabell 10.

b) To forsøksserier ble utført ved bruk av en glukose-isomerase-kolonne lik den som ble brukt i tidligere eksempler. Mateløs-ningene omfattet 50% vekt/volum nominell glukosekonsentrasjon. 4 mM MgCl2 og 200 og 600 mM germanat respektive i de forskjellige seriene. Forsøkene ble utført ved forskjellige pH-verdier. En sammenligningsserie av forsøk ble utført under anvendelse av løs-ninger uten germanat. I alle forsøkene ble løsningene pumpet gjennom kolonnen med immobilisert enzym med en strømningshastig-het på 0,05 ml/min. (75 min. nominell oppholdstid) Resultatene er vist i tabell 11.

EKSEMPEL 12

Enzymatisk omdannelse av glukose til fruktose - reversibilitet

Løsninger av glukose til fruktose med de karbohydrat-konsentrasjoner som er vist i tabell 12 ble fremstilt. De løs-ninger som skal inneholde germanat ble fremstilt ved å oppløse utveide mengder GeC^ i alikvoter av disse løsninger ved omrøring i små mengder av 50%-ig NaOH-løsning. Alikvoter av MgCl2-løs-ning ble tilsatt til disse løsninger til en sluttkonsentrasjon av 4 mM og pH i alle løsninger ble justert til 8,5 ved 25°C.

Løsningene ble pumpet med de strømningshastigheter som er vist gjennom enzymkolonnen (30 x 0,4 cm) ved 60°C. Mengden fruktose i kolonne-eluatet ble bestemt etter fortynning. For kalibrering ble det fremstilt siruper med 0,55% vekt/volum som ble ført gjennom hele analysesystemet. For å sjekke startmeng-den glukose i matesirupene ble prøvene og kalibreringsstandard-sirupene fortynnet 2 x 10 4 manuelt og analysert ved hjelp av cystein-svovelsyre-metoden. Resultatene er oppført i tabell 12 og er vist grafisk i fig. 1 av tegningene, som klart viser at uten nærvær av germanat ligger likevekten mellom 52 og 53% fruktose enten det startes med glukose- eller fruktosematesirup og ligger mellom 74 og 79% i nærvær av 600 mM germanat, igjen utgående fra enten glukose eller fruktose som matesirup.

EKSEMPEL 13

Enzymatisk omdannelse av glukose til fruktose - konsentrasjonsavhengighet

En serie løsninger inneholdende 600 mM germanat og 4 mM MgCl2, men med forskjellige glukosekonsentrasjoner ble ført gjennom en kolonne av glukose-isomerase lik den som ble brukt i tidligere eksempler ved en temperatur av 60°C. Resultatene er vist i tabell 13.

4

Fra et tidligere forsøk.

Kjemisk omdannelse av melibiose

Den kjemiske omdannelse av melibiose (6-0-a-D-galakto-pyranosyl-D-glukose) ble studert i nærvær og fravær av 324 mM germanat ved pH 12,0 og ved 4°C. Konsentrasjonen av melibiose i startløsningen var 51,6% vekt/volum. Resultatene er vist i tabell 14.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for kjemisk eller enzymatisk omdannelse av en aldose eller et aldosederivat til en ketose eller et ketosederivat i nærvær av et kompleksdannende middel, karakterisert ved at det som kompleksdannende middel anvendes et oksyanion eller et blandet, komplekst oksyanion av germanium eller tinn som danner et sterkere kompleks med ketosen eller ketosederivatet enn med aldosen eller aldosederivatet .

2. Fremgangsmåte for omdannelse av en aldose eller et aldosederivat til en ketose eller et ketosederivat som angitt i krav 1, karakterisert ved at omdannelsen finner sted i nærvær av et kompleksdannende middel som er et oksyanion eller et blandet, komplekst oksyanion av germanium som danner et sterkere kompleks med ketosen eller ketosederivatet enn med aldosen eller aldosederivatet.