CN114790469B - 一种酶促合成阿洛酮糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶促合成阿洛酮糖的方法。采用包含D‑葡萄糖单元的二糖、多糖或其任意混合物为原料，将糖类通过多酶级联反应转化为阿洛酮糖，其中所述方法涉及由6‑磷酸3‑异构酶(A6PE)催化将果糖6‑磷酸(F6P)转化为阿洛酮糖6‑磷酸(A6P)。有些热稳定性高的阿洛酮糖6‑磷酸3‑差向异构酶，不仅具有催化果糖6‑磷酸转化为阿洛酮糖6‑磷酸的活性，同时具有催化果糖和阿洛酮糖相互转化的活性。为了避免反应后期会出现阿洛酮糖浓度逐渐降低，果糖浓度逐渐提高的现象发生，本发明通过延长催化反应路径，显著提高了阿洛酮糖的得率和产量。
Description
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种酶促合成阿洛酮糖的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种低热量天然甜味剂，其甜度为蔗糖的70％，但能量仅为蔗糖的10％，可作为蔗糖替代品应用于食品领域，从而缓解由于糖的过度摄入导致的肥胖、糖尿病等慢性病的发生。此外，D-阿洛酮糖还被证明具有降血糖的作用，在治疗神经退行性疾病和动脉粥样硬化等疾病方面也具有很高的医疗价值。2012年，食品和药物管理局(FDA)批准阿洛酮糖作为食品添加剂，并将其指定为公认安全的(GRAS)，因此D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。
目前，D-阿洛酮糖主要采用生物转化法通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(EC5.1.3.30)的果糖3位差向异构制备(WO 2014049373)。当使用上述酶通过单一酶反应由果糖生产阿洛糖时，果糖(即底物)和阿洛酮糖(即产物)之间存在一定水平的反应平衡(产物/底物＝约20％至35％)。因此，在使用单一酶反应生产高纯度的阿洛酮糖的情况下，需要从反应生成物中分离和移除高浓度果糖的附加纯化过程。因此较高的原料成本、昂贵的产物和副产物分离成本以及相对较低的产物收率而限制了其应用。
另有研究，采用淀粉及其衍生物为原料，通过多酶级联反应制备阿洛酮糖(中国专利文献CN 109563499A、CN 110088277A、CN 110300800A、CN 111819278A)。理论上，此方案可以在相对较低浓度的磷酸盐存在下生产阿洛酮糖，其中磷酸盐可再循环，并且/或者所述方法不需要使用三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸盐源，而且在任一反应步骤中都不需要使用昂贵的烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD(H))辅酶。因此，该阿洛酮糖生产途径具有原料来源广泛且价格便宜、产物得率高、产品分离容易的优点。但是，此方案需要筛选高效稳定的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶和专一性且稳定性好的阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶。本发明人针对整个途径筛选阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的过程中，发现有些热稳定性高的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，例如中国专利文献CN110300800A中提到的从热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571)获得的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(Uniprot Code：D9TQJ4；Genbank No.WP_013298194)以及来源于热袍菌(Thermotogae bacterium)的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(Uniprot Code：A0A3D6DDL0；SEQ IN NO.1)存在较为严重的副反应，即这些酶具有单糖差向异构活性且这种酶活性随着阿洛酮糖浓度的增高而增大，故而在反应后期会出现阿洛酮糖浓度大幅下降，而副产物果糖大量增多的现象。针对这一问题，需要提出一种使阿洛酮糖产量不断增高的解决方案，扩大适宜于多酶级联反应制备阿洛酮糖的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的种类，以利于在工业中推广这种方法。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种酶促合成阿洛酮糖的方法，采用包含D-葡萄糖单元的二糖、多糖或其任意混合物为原料，将这些原料通过多酶级联反应转化为阿洛酮糖，其中所述方法涉及由6-磷酸3-异构酶(A6PE)催化将果糖6-磷酸(F6P)转化为阿洛酮糖6-磷酸(A6P)的步骤，以及由阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)催化将所述A6P转化为阿洛酮糖的步骤。本发明人发现：有些热稳定性高的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，不仅具有催化果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖6-磷酸的活性，同时具有催化果糖和阿洛酮糖相互转化的活性。为了避免反应后期会出现阿洛酮糖浓度逐渐降低，果糖浓度逐渐提高的现象发生，本发明在合成阿洛酮糖后，当阿洛酮糖浓度由高速增长转变为增加缓慢或开始下降时(此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％)，增加了2个步骤：(1’)果糖异构化生成葡萄糖；(2’)葡萄糖和聚磷酸生成葡萄糖6-磷酸，葡萄糖6-磷酸进而参与反应步骤(3)-(5)，最终生成阿洛酮糖。另外，为了使淀粉中的葡萄糖单元尽可能多的转化为葡萄糖1-磷酸，本发明还可以向延长反应中增加(3’)步骤，加入α-4葡萄糖苷转移酶，它可以将步骤(1)生成的短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，同时释放副产物葡萄糖，而该长链的寡聚糖又可被步骤(1)的淀粉磷酸化酶重新利用，从而提高淀粉的利用率。因此，本发明的方法，能够显著提高阿洛酮糖的得率和产量。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，提供一种酶促合成阿洛酮糖的方法，所述方法包括：
(1)将底物和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)，所述底物为包含D-葡萄糖单元的二糖、多糖或其任意混合物，该步骤采用能将底物和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸的酶催化；
(2)将葡萄糖1-磷酸与葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2，PGM)、表达该酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，以将葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)；
(3)将葡萄糖6-磷酸与磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase，EC5.3.1.9，PGI)、表达该酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，以将葡萄糖6-磷酸转化为果糖6-磷酸(F6P)；
(4)果糖6-磷酸与阿洛酮糖6-磷酸-3-差向异构酶(Allulose-6-phosphate3-epimerase，EC 5.1.3.-，A6PE)、表达该酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，以将果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖6-磷酸(A6P)；
(5)阿洛酮糖6-磷酸与能够脱磷酸基团的酶、表达该酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，脱磷酸基团，生成阿洛酮糖(Allulose)；
(6)加入葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，EC 5.3.1.5,GI)、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物，使果糖异构化生成葡萄糖；
(7)加入聚磷酸盐和聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(Polyphosphate glucokinase，EC2.7.1.63，PPGK)、表达该酶的微生物、或所述微生物的培养物，使葡萄糖和聚磷酸生成葡萄糖6-磷酸，葡萄糖6-磷酸进而参与反应步骤(3)-(5)，最终生成阿洛酮糖。
根据本发明，上述酶促合成阿洛酮糖的方法，还包括以下步骤：
(8)加入α-4葡萄糖苷转移酶(4-α-glucanotransferase，EC 2.4.1.25，4GT)、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物，使反应过程中生成的二糖或多糖发生糖苷转移，生成能够被步骤(1)中酶利用的长链多糖；同时，该反应中生成副产物葡萄糖，进一步参与步骤(7)催化的反应，最终被转化为阿洛酮糖。
根据本发明，上述步骤(1)-(5)所使用的酶在反应开始时加入，步骤(6)-(7)或步骤(6)-(8)用到的酶在反应开始一段时间后加入，例如，可以根据对反应的监测结果进行，反应开始后会监测到阿洛酮糖浓度快速增长，当监测到反应体系中阿洛酮糖的浓度由快速增长转变为增加缓慢，或开始下降时，此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％，再加入步骤(6)-(7)或步骤(6)-(8)中所使用的酶。
根据本发明，所述酶促合成阿洛酮糖的方法为“一锅法”。
根据本发明，因为硫酸根离子对反应体系存在严重抑制，故而上述反应体系中优选不能含有高浓度的硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐，优选的，所述反应体系中硫酸根离子的浓度低于50mM，更为优选的，所述反应体系中不含硫酸根离子；
根据本发明，所述催化反应可以在无ATP、无NAD(H)的条件下进行。
根据本发明，步骤(1)所述反应体系中底物的浓度为1-500g/L，进一步优选为1-200g/L。
根据本发明，步骤(1)所述包含D-葡萄糖单元的二糖为蔗糖，采用蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,EC 2.4.1.7，SP)；表达其的微生物；或所述微生物的培养物催化，将其和磷酸盐转化为G1P。优选地，所述蔗糖磷酸化酶可以来源于青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis，UniProt编号A0ZZH6)、热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum，UniProt编号D9TT09)等。
根据本发明，步骤(1)所述包含D-葡萄糖单元的多糖选自淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物，采用淀粉磷酸化酶(α-glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1，αGP)；表达其的微生物；或所述微生物的培养物催化，将其和磷酸盐转化为G1P。优选地，所述淀粉或淀粉衍生物选自可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖。优选地，所述淀粉磷酸化酶可以来源于大肠杆菌(Uniprot编号A0A0A0HB49)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima，Uniprot编号G4FEH8)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum，Uniprot编号A3DCB6)等。
根据本发明，步骤(1)所述包含D-葡萄糖单元的多糖还选自纤维素、纤维素衍生物或其任意混合物，采用纤维多糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase，EC 2.4.1.49，CDP)和纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20，CBP)；表达这两种酶的微生物；或所述微生物的培养物催化，将其和磷酸盐转化为G1P。优选地，所述纤维多糖磷酸化酶可以来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，UniProt编号A3DJQ6)、梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium，UniProt编号P77846)等；纤维二糖磷酸化酶可以来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，UniProt编号A3DC35)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana，UniProt编号B9K7M6)等。
在优选的实施方案中，当淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物中含有α-1,6糖苷键(例如，可溶性淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖)时，本发明的方法还包括采用异淀粉酶(isoamylase,EC 3.2.1.68，IA)；表达其的微生物；或所述微生物的培养物水解底物中α-1,6-糖苷键的反应步骤。优选地，所述异淀粉酶可以来源于硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii，UniProt编号Q973H3)、黄杆菌(Flavobacterium sp.，UniProt编号O32611)等。
根据本发明，步骤(1)中反应体系中将底物转化为G1P的酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(2)所述葡萄糖磷酸变位酶可以来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，Uniprot编号A3DEW8)、极端嗜热古生菌(Thermococcuskodakarensis，UniProt编号Q68BJ6)等。优选地，反应体系中葡萄糖磷酸变位酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(3)所述磷酸葡糖异构酶可以来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum，Uniprot编号A3DBX9)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Uniprot编号Q5SLL6)等。优选地，反应体系中磷酸葡糖异构酶的浓度为0.1-100U/mL，更优选为1-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(4)所述的阿洛酮糖6-磷酸-3-差向异构酶包含与SEQID NO:1或2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％序列的同源性、相似性或同一性的氨基酸序列，并且在翻译后可以表现出所需的酶活性。优选地，反应体系中阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(5)所述的脱磷酸基团的酶为具有底物特异性的阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶(allulose 6-phosphate phosphatase，A6PP)。优选地，阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶可以来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus，UniProt编号A0LR15)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis NCTC 9343UniProt编号Q5LGR4)、热纤梭菌(Clostridium thermocellu，UniProt编号A3DC21)等。优选的，所述洛酮糖6-磷酸磷酸酶来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellu，UniProt编号A3DC21)。优选地，反应体系中能够脱磷酸基团的酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(6)所述的葡萄糖异构酶可以来自链霉菌(Streptomyces murinus，UniProt编号P37031)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana，UniProt编号P45687)等。优选地，反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(7)所述的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶可以来源于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，UniProt编号P9WIN1)、嗜热甲虫菌(Thermobifida fusca，UniProt编号Q47NX5)等。优选地，反应体系中聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
在优选的实施方案中，步骤(8)所述的α-4-葡萄糖苷转移酶可以来源于嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis，UniProt编号O32462)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，UniProt编号L8AG91)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum，UniProt编号Q59266)等。优选地，反应体系中α-4葡萄糖苷转移酶的浓度为0.1-100U/mL，进一步优选为0.2-20U/mL。
根据本发明，上述反应体系中还可含有磷酸盐、镁盐和聚磷酸盐。
优选地，反应体系中磷酸盐的浓度为1-150mM，进一步优选为2-50mM，更优选为10-30mM。
优选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种、两种或者更多种的任意混合物。更优选地，磷酸盐来自于磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠。
优选地，反应体系中镁离子的浓度为1-150mM，进一步优选为10-80mM。
优选地，所述镁盐为氯化镁、碳酸镁、硝酸镁。更优选为氯化镁。
优选地，反应体系中聚磷酸盐的浓度为1-150mM，进一步优选为10-80mM。
优选地，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等。更优选为六偏磷酸钠。
根据本发明，优选地，上述反应体系中还含有缓冲液。本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。优选地，缓冲液为磷酸盐缓冲液。所述缓冲液pH范围为5.0-9.0，优选的，所述pH范围为6.0-7.5。
根据本发明，所述反应在一定温度下进行，所述反应温度为37℃-85℃，优选的，所述反应温度为50℃-65℃。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种酶促合成阿洛酮糖的方法，本发明人发现：有些热稳定性高的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，不仅具有催化果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖6-磷酸的活性，同时具有催化果糖和阿洛酮糖相互转化的活性。为了避免反应后期会出现阿洛酮糖浓度逐渐降低，果糖浓度逐渐提高的现象发生，本发明通过延长催化反应路径，提高了产品的得率。如图5所示，在酶促合成阿洛酮糖的反应路径开始时，淀粉磷酸化酶水解淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物，释放葡萄糖1-磷酸后，最终产物是麦芽糖。为了使淀粉中的葡萄糖单元尽可能多的转化为葡萄糖1-磷酸，本发明还向延长反应体系中添加α-4葡萄糖苷转移酶，它可以将反应中生成的短链的寡聚糖聚合成为长链的寡聚糖，同时释放副产物葡萄糖，而该长链的寡聚糖又可被淀粉磷酸化酶重新利用，从而提高淀粉的利用率。通过添加葡萄糖异构酶和聚磷酸依赖型葡萄糖激酶能够催化副产物果糖和葡萄糖被转化为葡萄糖6-磷酸，进而被转化为阿洛酮糖。这些催化步骤的增加，既能抑制阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶单糖差向异构活性，阻止产物阿洛酮糖被转化为果糖，又能提高阿洛酮糖的得率。例如，以275mM可溶性淀粉为底物，在无细胞反应体系中，阿洛酮糖的产量为214mM，副产物果糖和葡萄糖的浓度仅分别为21和15mM，阿洛酮糖对底物的得率为77.8％；在全细胞反应体系中，以275mM可溶性淀粉为底物，副产物果糖和葡萄糖的浓度仅分别为19mM和13mM。阿洛酮糖对底物的得率为80％。因此，本发明的方法，能够显著提高阿洛酮糖的得率和产量。
此外，本发明提供的方法中使用的酶大多来源于嗜热菌。这些热稳定性酶可以经受糖生产过程的加热步骤，其使进行转化过程的细胞裂解物内包含的有害活性失活。此热失活步骤降低微生物污染对生产运行产生负面影响的机会。
附图说明
图1：SDS-PAGE检测蛋白A6PE表达情况。其中，TmA6PE来源于热袍菌(Thermotogaebacterium)，其UniProt编码为A0A3D6DDL0；TtA6PE源于热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571)，其UniProt编码为D9TQJ4；T为菌体破碎液总蛋白；S为菌体破碎液上清液；H为破碎液上清液经一定温度孵育后，离心获得的纯酶。
图2：SDS-PAGE检测各酶的纯化效果。其中αGP为淀粉磷酸化酶，PGM为葡萄糖磷酸变位酶，PGI为磷酸葡糖异构酶，A6PE为阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，A6PP为阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶，IA为异淀粉酶，4GT为α-4-葡萄糖苷转移酶，PPGK为聚磷酸依赖型葡萄糖激酶，M：Marker。
图3：A6PE和CtA6PP催化果糖6-磷酸生成阿洛酮糖液相谱图。
图4：A6PE具有催化果糖和阿洛酮糖相互转化的单糖异构活性。(A)来源于TmA6PE(UniProt编码为A0A3D6DDL0)单糖异构活性液相谱图；(B)TtA6PE(UniProt编码为D9TQJ4)单糖异构活性液相谱图。
图5：由淀粉及其衍生物制备阿洛酮糖的转化体外酶催化途径的示意图。其中αGP为淀粉磷酸化酶，PGM为葡萄糖磷酸变位酶，PGI为磷酸葡糖异构酶，A6PE为阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，A6PP为阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶，IA为异淀粉酶，4GT为α-4-葡萄糖苷转移酶，PPGK为聚磷酸依赖型葡萄糖激酶，GI为葡萄糖异构酶。葡萄糖异构酶能够催化副产物果糖生成葡萄糖，葡萄糖会进一步被聚磷酸依赖型葡萄糖激酶转化为葡萄糖6-磷酸，进而被转化为阿洛酮糖，从而克服阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶单糖异构活性造成的产物浓度下降。
图6：由淀粉制备阿洛酮糖体外五步多酶催化反应。
图7：添加4GT、PPGK和GI对淀粉制备阿洛酮糖体外多酶催化反应的影响。
图8：由275mM淀粉制备阿洛酮糖体外多酶催化反应。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
定义与说明：
如本文中所用的，术语“同源性”或“同一性”表示两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，其可以表示为百分比。
术语“同源性”和“同一性”经常可互换使用。
通过标准比对算法确定保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性，并且可以与所用程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上同源或相同的序列通常均沿目标全长多核苷酸或多肽的至少约50％、60％、70％、80％或90％在中等严格性或高严格性下杂交。还考虑了在杂交多核苷酸中包含简并密码子以代替密码子的多核苷酸。
可以利用已知的计算机算法如“FASTA”程序，采用例如，如Pearson等人.(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中的默认参数，来确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否为同源的、相似的或相同的。可选地，可以利用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人.,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或更新的版本)的Needle程序中实施的，来确定序列同源性、相似性或同一性。其他的程序包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide toHuge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994，和[CARILLO等人.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可以使用NCBI数据库的BLAST工具来确定同源性、相似性或同一性。也可以使用其他可商购获得的或公开获得的程序如ClustalW。
可以例如，通过利用G A P计算机程序(例如，N e e d l e m a n等人.,(1 9 70)J.Mol.Biol.48:443，如由Smith和Waterman所修订的,Adv.Appl.Math(1981)2:482)比较序列信息，来确定多核苷酸或多肽的百分比同源性、相似性或同一性。简言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两条序列中的较短一条中符号的总数。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(包含对于相同的值1和对于不同的值0)，和Gribskov等人.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权的比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编辑,Atlas Of Protein Sequence And Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所描述的；(2)对于每个空位的3.0的罚分，和对于每个空位中的每个符号的另外的0.10的罚分(或者空位开放罚分10.0，空位扩展罚分0.5)；以及(3)对于最后的空位无罚分。因此，如本文中所用的术语“同源性”或“同一性”指示多肽或多核苷酸之间的比较。
本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本文所用的选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本文中所用的，术语“载体”是指用于将碱基核酸克隆和/或转移到宿主细胞中的任何媒介物。载体可以是复制子，另一个DNA区段可以连接至该复制子，以引起所连接区段的复制。“复制子”是指任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体或病毒)，其作为体内DNA复制的自主单元发挥功能，即能够在其自身的控制下复制。术语“载体”可以包括用于在体外、离体或体内将核酸引入宿主细胞中的病毒和非病毒媒介物。术语“载体”还可以包括微环DNA。具体地，包含编码根据本申请的方法各步骤所需的各种酶的核酸的载体可以是pET20b-TmαGP、pET20b-TkPGM、pET20b-TtcPGI、pET20b-TmA6PE、pET20b-CtA6PP、pET20b-Tl4GT、pET20b-TfuPPGK和pET20b-StIA。
如本文中所用的，术语“转化”是指将包含编码目标蛋白质的核酸的载体引入宿主细胞中，以在宿主细胞中表达核酸编码的蛋白质。转化的核酸可以插入和位于宿主细胞的染色体中，或者可以在染色体外存在，只要其可以在宿主细胞中表达即可。核酸包括编码目标蛋白质的DNA和RNA。可以以任何形式引入核酸，只要其可以被引入宿主细胞中并在宿主细胞中表达即可。例如，可以将核酸以表达盒(其为包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体)的形式引入宿主细胞中，但是其形式不限于此。通常，表达盒包括可操作地连接至核酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合域和翻译终止信号。表达盒可以为可自我复制的表达载体的形式。可以将核酸原样引入宿主细胞中，并可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列。
如本文中所用的，术语“可操作地连接”是指起始和介导编码本申请的目标蛋白质的核酸转录的启动子序列与基因序列的之间的功能连接。
可以使用将核酸引入细胞中的任何转化方法。可以根据宿主细胞的类型，通过本领域已知的合适的标准技术进行转化方法。这样的转化方法的实例包括但不限于：电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法和醋酸锂-DMSO方法。
宿主细胞优选是高效引入DNA且引入的DNA以高水平表达的宿主细胞。宿主细胞的实例包括但不限于：属于棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢菌属(Bacillus)和沙雷氏菌属(Serratia)的微生物的细胞。具体地，宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。
本发明的转化子可以是：大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-TmαGP、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-TkPGM、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-TtcPGI、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-TmA6PE、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-CtA6PP、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-Tl4GT、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-TfuPPGK、大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-SmGI或大肠杆菌BL21(DE3)/pET20b-StIA。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1含有阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶基因的重组表达载体的构建和酶的表达纯化
根据基因Uiprot数据库提供的氨基酸序列信息，采用基因合成的方式获得来源于热袍菌(Thermotogae bacterium)的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(TmA6PE，Uniprot编号A0A3D6DDL0)和来源于热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumDSM 571)的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(TtA6PE，Uniprot编号D9TQJ4)的DNA编码序列片段，该DNA片段针对大肠杆菌进行密码子优化。随后，采用Simple Cloning(You C,ZhangXZ,Zhang Y-HP.2012.Simple cloning via direct transformation of PCR product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-5.)的方法，将上述基因克隆至pET20b载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TmA6PE和pET20b-TtA6PE。质粒pET20b-A6PE通过氯化钙法转入大肠杆菌BL21(DE3)中。
重组菌株接种于液体LB培养基中，当600nm处的吸光度达到0.8-1.0时，添加0.1mMIPTG以诱导A6PE的表达。添加诱导剂后继续于30℃下培养8-10小时，离心收集菌体。收集的菌体采用缓冲液重悬，后经高压匀浆破碎获得菌体破碎液。菌体破碎液在一定温度下孵育一段时间后，离心获得上清液，即为A6PE纯酶液，蛋白质纯化的结果如图1所示。
由图1可知，相比于TtA6PE，TmA6PE可溶性表达水平更高，且由于TmA6PE来源菌热袍菌(Thermotogae bacterium)最适生长温度为80℃，而TtA6PE来源菌热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571)的最适生长温度仅为60℃，故而TmA6PE具有更高的热稳定性。没有特别说明，以下实施例所用到的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶均为TmA6PE。
实施例2淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶、α-4-葡萄糖苷转移酶、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、葡萄糖异构酶和异淀粉酶的制备
淀粉磷酸化酶来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima MSB8，Uniprot编号O33831)、葡萄糖磷酸变位酶来源于极端嗜热古生菌(Thermococcus kodakarensis，Uniprot编号Q68BJ6)、磷酸葡糖异构酶来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8，Uniprot编号Q5SLL6)、阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶来源于热纤梭菌(Clostridiumthermocellu，Uniprot编号A3DC21)、α-4-葡萄糖苷转移酶来源于嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis DSM 5473，Uniprot编号O32462)、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶来源于嗜热甲虫菌(Thermobifida fusca YX，Uniprot编号Q47NX5)、异淀粉酶来源于硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii str.7，Uniprot编号Q973H3)，葡萄糖异构酶来源于链霉菌(Streptomyces murinus，UniProt编号P37031)，通过基因合成的方式合成上述DNA片段，采用Simple Cloning(You C,Zhang XZ,Zhang Y-HP.2012.Simple cloning via directtransformation of PCR product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillussubtilis.Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-5.)的方法，将上述基因克隆至pET20b载体(Novagen,Madison,WI)中，分别获得相应的表达载体pET20b-TmαGP、pET20b-TkPGM、pET20b-TtcPGI、pET20b-CtA6PP、pET20b-Tl4GT、pET20b-TfuPPGK、pET20b-StIA和pET20b-SmGI。重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并进行了纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。
葡萄糖异构酶购自诺维信(Novozymes)，产品名称为Sweetzyme IT Extra.
以下实施例3-7涉及的酶均为本实施例获得的酶。
实施例3阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(A6PE)的活性测定
为了测试A6PE转化果糖6-磷酸到阿洛酮糖6-磷酸的活性，构建了以下反应体系：100mM HEPES buffer(pH 7.0)中添加5mM MgCl2、10mM果糖6-磷酸、适量的TmA6PE酶液和CtA6PP酶液，50℃下反应10分钟。通过高压液相色谱检测产物组成，确定产物为阿洛酮糖。高压液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱(Bio-Rad)，5mM硫酸溶液为流动相，流速0.6mL/min，柱温60℃，采用示差折光检测器检测信号。由HPLC谱图可知(图3)，产物中有阿洛酮糖出现，证明TmA6PE具有催化果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖6-磷酸的活性，其在50℃的比酶活为17U/mg。
实施例4阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶具有单糖差向异构活性
为了测试A6PE具有催化阿洛酮糖与果糖相互转化的活性，构建了以下反应体系：100mM HEPES buffer(pH 7.0)中添加5mM MgCl2、500mM阿洛酮糖、适量的A6PE酶液，50℃下反应一段时间。其中A6PE为TmA6PE或TtA6PE。加入终浓度0.5％的硫酸终止反应。样品采用HPLC进行检测。高压液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱(Bio-Rad)，5mM硫酸溶液为流动相，流速0.6mL/min，柱温60℃，采用示差折光检测器检测信号。
由HPLC图谱可知(图4A，4B)，来源于热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum DSM 571)的TtA6PE和热袍菌(Thermotogae bacterium)的TmA6PE均具有单糖差向异构活性。
实施例5由淀粉制备阿洛酮糖的体外多酶催化反应
由淀粉制备阿洛酮糖体外多酶催化反应路径如图5所示。
将含有275mM经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、5mM氯化镁、30mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，10U/mL淀粉磷酸化酶、10U/mL葡萄糖磷酸变位酶、10U/mL磷酸葡糖异构酶、10U/mL阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶、10U/mL阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的1.0mL反应混合物在55℃下孵育24h。采用HPLC检测产物。反应4小时，阿洛酮糖的产量达到最高为131mM，随后产量不断下降。而副产物果糖的产量随着时间延长不断增加。反应24小时，副产物果糖的产量增加至96mM，而阿洛酮糖的产量下降至86mM(图6)。
实施例6延长催化反应路径，提高产品得率
为了提高产品得率，降低或抑制副反应的发生，本实施例测定了添加不同酶组合对产物得率提高的效果。
将含有55mM经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、5mM氯化镁、10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，2U/mL淀粉磷酸化酶、2U/mL葡萄糖磷酸变位酶、2U/mL磷酸葡糖异构酶、2U/mL阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶、2U/mL阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的1.0mL反应混合物在55℃下孵育。每隔1小时采样一次，采用HPLC检测样品中各产物的浓度。高压液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱(Bio-Rad)，5mM硫酸溶液为流动相，流速0.6mL/min，柱温60℃，采用示差折光检测器检测信号。当阿洛酮糖浓度由高速增长转变为增加缓慢或开始下降时(此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％)，向反应体系中加入0.4U/mLα-4-葡萄糖苷转移酶、和/或0.4U/mL聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、和/或4U/mL葡萄糖异构酶。当反应体系中添加聚磷酸依赖型葡萄糖激酶时，应同时加入10mM六偏磷酸钠和10mM氯化镁，继续反应至24小时。
如图7所示，单独添加4GT，能够提高阿洛酮糖的产量，但副产物果糖和葡萄糖也有所提高。同时添加4GT和PPGK，阿洛酮糖的产量进一步提高，副产物葡萄糖明显减少，果糖浓度有所提高。而同时添加4GT、PPGK和GI，阿洛酮糖的产量达到最高，几乎无副产物葡萄糖，果糖的浓度也明显下降。证明，同时添加4GT、PPGK和GI能够最大化提高阿洛酮糖得率。
实施例7提高淀粉浓度获得高浓度阿洛酮糖
将含有275mM经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、5mM氯化镁、30mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，10U/mL淀粉磷酸化酶、10U/mL葡萄糖磷酸变位酶、10U/mL磷酸葡糖异构酶、10U/mL阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶、10U/mL阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的1.0mL反应混合物在55℃下孵育。每隔1小时采样一次，采用HPLC检测样品中各产物的浓度。高压液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱(Bio-Rad)，5mM硫酸溶液为流动相，流速0.6mL/min，柱温60℃，采用示差折光检测器检测信号。当阿洛酮糖浓度由高速增长转变为增加缓慢或开始下降时(此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％)，向反应体系中添加2U/mLα-4-葡萄糖苷转移酶、2U/mL聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、20U/mL葡萄糖异构酶、60mM六偏磷酸钠和60mM氯化镁，继续反应至24小时。
反应24小时，阿洛酮糖的产量为214mM，副产物果糖和葡萄糖的浓度仅分别为21和15mM。阿洛酮糖对底物的得率为77.8％(图8)。
实施例8全细胞催化淀粉制备阿洛酮糖
将表达淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶、阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶、α-4-葡萄糖苷酶、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、葡萄糖异构酶的大肠杆菌全细胞，在60-70℃热处理15-30分钟，获得全细胞催化剂。
将含有275mM经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、5mM氯化镁、30mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，10U/mL淀粉磷酸化酶全细胞、10U/mL葡萄糖磷酸变位酶全细胞、10U/mL磷酸葡糖异构酶全细胞、10U/mL阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶全细胞、10U/mL阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶全细胞的1.0mL反应混合物在55℃下孵育。每隔1小时采样一次，采用HPLC检测样品中各产物的浓度。高压液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱(Bio-Rad)，5mM硫酸溶液为流动相，流速0.6mL/min，柱温60℃，采用示差折光检测器检测信号。当阿洛酮糖浓度由高速增长转变为增加缓慢或开始下降时(此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％)，向反应体系中添加2U/mLα-4-葡萄糖苷转移酶全细胞、2U/mL聚磷酸依赖型葡萄糖激酶全细胞、20U/mL葡萄糖异构酶、60mM六偏磷酸钠和60mM氯化镁，继续反应至24小时。
反应24小时，阿洛酮糖的产量为220mM，副产物果糖和葡萄糖的浓度仅分别为19mM和13mM。阿洛酮糖对底物的得率为80％。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种酶促合成阿洛酮糖的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> 热袍菌(Thermotogae bacterium)
<400> 1
Met Lys Val Asn Phe Ser Ala Ser Leu Met Cys Ala Asp Phe Ser Asn
1 5 10 15
Leu His Glu Gln Leu Leu Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Thr Arg Ile
20 25 30
His Tyr Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Thr Leu Gly
35 40 45
Pro Asp Ile Ala Phe Ala Leu Ile Glu Lys Thr Ser Met Glu Phe Asp
50 55 60
Ala His Leu Met Val Ala Asn Pro Ser Thr Ile Ile Asp Arg Phe Leu
65 70 75 80
Glu Val Pro Phe Ala Ser Val Thr Leu His Ile Glu Ala Val Gln Asn
85 90 95
Glu Val Phe Arg Leu Phe Glu Lys Ile Asn Ser His Gly Val Lys Cys
100 105 110
Gly Ile Ala Leu Ser Pro Ala Thr Pro Val Ser Met Leu Glu His Val
115 120 125
Ile Ser Arg Val Gln Arg Val Thr Val Met Ser Val Asp Pro Gly Phe
130 135 140
Ala Gly Gln Lys Phe Ile Pro Glu Val Leu Glu Lys Ile Asp Arg Leu
145 150 155 160
Asp Glu Ile Arg Arg Lys Lys Ala Leu Asn Phe Glu Ile Glu Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Val Asn Lys Lys Thr Leu Pro Glu Ile Leu Lys His Pro Val
180 185 190
Asp Trp Leu Val Leu Gly Thr Ser Gly Leu Phe Gly His Pro Gln Gly
195 200 205
Leu Lys Val Ala Val Lys Glu Leu Arg Glu Leu Ile Glu Asn Arg Ile
210 215 220
Lys Thr
225
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> 热解糖嗜热杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum )
<400> 2
Met Lys Tyr Leu Phe Ser Pro Ser Leu Met Cys Met Asn Leu Ile Lys
1 5 10 15
Leu Asn Glu Gln Ile Ser Val Leu Asn Ser Lys Ala Asp Phe Leu His
20 25 30
Val Asp Ile Met Asp Gly His Phe Val Lys Asn Ile Thr Leu Ser Pro
35 40 45
Phe Phe Ile Glu Gln Ile Lys Ser Tyr Val Asn Ile Pro Ile Asp Ala
50 55 60
His Leu Met Val Glu Asn Pro Gly Asp Tyr Ile Glu Ile Cys Glu Lys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Ser Phe Ile Thr Ile His Ala Glu Thr Ile Asn Arg Glu
85 90 95
Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Lys Ser His Gly Leu Met Val Gly
100 105 110
Ile Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Ile Ser Glu Ile Lys His Tyr Ile
115 120 125
Asn Lys Ile Asp Lys Ile Thr Ile Met Thr Val Asp Pro Gly Phe Ala
130 135 140
Gly Gln Pro Phe Ile Pro Glu Val Leu Glu Lys Ile Arg Asp Leu Lys
145 150 155 160
Arg Leu Lys Asp Asp Asn Asn Tyr Asn Tyr Leu Ile Glu Ala Asp Gly
165 170 175
Ser Cys Asn Lys Asn Thr Phe Gln Val Leu Lys Asp Ala Gly Cys Lys
180 185 190
Val Phe Val Leu Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Leu Ser Asp Asp Leu
195 200 205
Gly Lys Ala Trp Glu Ile Met Ile Gly Asn Phe Asn Gly
210 215 220
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellu)
<400> 3
Met Ile Lys Tyr Lys Ala Val Phe Phe Asp Phe Asp Tyr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ser Ser Lys Ala Val Ile Glu Cys Ile Asn Tyr Ala Leu Gln Lys
20 25 30
Met Gly Tyr Pro Glu Ser Ser Pro Glu Ser Ile Cys Arg Thr Ile Gly
35 40 45
Leu Thr Leu Ala Glu Ala Phe Lys Ile Leu Ser Gly Asp Thr Ser Asp
50 55 60
Ser Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gln Tyr Phe Lys Glu Arg Ala Asp Leu
65 70 75 80
Val Met Cys Asp Arg Thr Val Met Tyr Ser Thr Val Glu Cys Val Leu
85 90 95
Lys Lys Leu Lys Lys Ala Asp Val Lys Thr Gly Ile Val Ser Thr Lys
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115 120 125
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165 170 175
Lys Asn Ala Gly Val Asp Phe Val Ala Val Leu Thr Gly Thr Thr Gly
180 185 190
Ala Asn Glu Phe Ser Glu Tyr Asn Pro Gly Ala Val Ile Glu Asp Leu
195 200 205
Ser Gly Leu Leu Asp Met Phe Met Leu
210 215
Claims (23)
1.一种酶促合成阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将底物和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸，所述底物为包含D-葡萄糖单元的二糖、多糖或其任意混合物，该步骤采用能将底物和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸的酶催化；
(2)将葡萄糖1-磷酸与葡萄糖磷酸变位酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物反应，以将葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸；
(3)将葡萄糖6-磷酸与磷酸葡糖异构酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物反应，以将葡萄糖6-磷酸转化为果糖6-磷酸；
(4)果糖6-磷酸与来源于热袍菌的阿洛酮糖6-磷酸-3-差向异构酶TmA6PE、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物反应，以将果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖6-磷酸(A6P)，所述TmA6PE的Uniprot编号A0A3D6DDL0；
(5)阿洛酮糖6-磷酸与能够脱磷酸基团的酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物反应，脱磷酸基团，生成阿洛酮糖；
(6)加入葡萄糖异构酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物，使果糖异构化生成葡萄糖；
(7)加入聚磷酸和聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物，使葡萄糖和聚磷酸生成葡萄糖6-磷酸，然后，重复进行步骤(3)-(5)，最终生成阿洛酮糖；
上述步骤(1)-(5)所使用的酶在反应开始时加入，步骤(6)-(7)用到的酶在反应开始一段时间后加入，根据对反应的监测结果进行，反应开始后会监测到阿洛酮糖浓度快速增长，当监测到反应体系中阿洛酮糖的浓度由快速增长转变为增加缓慢，或开始下降时，此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％，再加入步骤(6)-(7)中所使用的酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶促合成阿洛酮糖的方法还包括以下步骤：
(8)加入α-4-葡萄糖苷转移酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物，使反应过程中生成的二糖或多糖发生糖苷转移，生成能够被步骤(1)中酶利用的长链多糖；同时，该反应中生成副产物葡萄糖，进一步参与步骤(7)催化的反应，最终被转化为阿洛酮糖；
所述步骤(6)-(8)用到的酶在反应开始一段时间后加入，根据对反应的监测结果进行，反应开始后会监测到阿洛酮糖浓度快速增长，当监测到反应体系中阿洛酮糖的浓度由快速增长转变为增加缓慢，或开始下降时，此时阿洛酮糖对底物淀粉的得率低于50％，再加入步骤(6)-(8)中所使用的酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶促合成阿洛酮糖的方法为“一锅法”。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述每一步骤的反应体系中含有的硫酸根离子的浓度低于50mM。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应体系中不含硫酸根离子。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述每一步骤的反应在无ATP、无NAD(H)的条件下进行。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述包含D-葡萄糖单元的二糖为蔗糖，采用蔗糖磷酸化酶、表达该的微生物或所述微生物的培养物催化，将所述二糖和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸；所述蔗糖磷酸化酶来源于青春双歧杆菌，其UniProt编号为A0ZZH6；或来源于热解糖嗜热杆菌，其UniProt编号为D9TT09；
或者，
步骤(1)所述包含D-葡萄糖单元的多糖选自淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物，采用淀粉磷酸化酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物催化，将所述多糖和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸；所述淀粉或淀粉衍生物选自可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖；所述淀粉磷酸化酶来源于大肠杆菌，其Uniprot编号为A0A0A0HB49、或来源于海栖热袍菌，其Uniprot编号为G4FEH8、或来源于热纤维梭菌，其Uniprot编号为A3DCB6；
或者，
步骤(1)所述包含D-葡萄糖单元的多糖选自纤维素、纤维素衍生物或其任意混合物，采用纤维多糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶、表达这两种酶的微生物或所述微生物的培养物催化，将所述包含D-葡萄糖单元的多糖和磷酸盐转化为葡萄糖1-磷酸；所述纤维多糖磷酸化酶来源于热纤梭菌，其UniProt编号为A3DJQ6、或来源于梭状芽孢杆菌，其UniProt编号为P77846；纤维二糖磷酸化酶来源于热纤梭菌，其UniProt编号为A3DC35、或来源于新阿波罗栖热袍菌，其UniProt编号为B9K7M6；
或者，
步骤(1)中，当淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物中含有α-1,6糖苷键时，还包括采用异淀粉酶、表达该酶的微生物或所述微生物的培养物水解底物中α-1,6-糖苷键的反应步骤；所述异淀粉酶来源于硫化叶菌，其UniProt编号为Q973H3、或来源于黄杆菌，其UniProt编号为O32611；
步骤(1)的反应体系中将底物转化为G1P的酶的浓度为0.1-100U/mL。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应体系中将底物转化为G1P的酶的浓度为0.2-20U/mL。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述磷酸葡糖异构酶来源于热纤梭菌，其Uniprot编号为A3DBX9、或来源于嗜热栖热菌，其Uniprot编号为Q5SLL6，反应体系中磷酸葡糖异构酶的浓度为1-20U/mL。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的反应体系中阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的浓度为0.2-20U/mL。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的脱磷酸基团的酶为具有底物特异性的来源于热纤梭菌的阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶，其UniProt编号为A3DC21，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；反应体系中能够脱磷酸基团的酶的浓度为0.2-20U/mL。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的葡萄糖异构酶来自链霉菌，其UniProt编号为P37031、或来自新阿波罗栖热袍菌，其UniProt编号为P45687；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为0.2-20U/mL。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(7)所述的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶来源于结核分支杆菌，其UniProt编号为P9WIN1、或来源于嗜热甲虫菌，其UniProt编号为Q47NX5；反应体系中聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.2-20U/mL。
14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(8)所述的α-4-葡萄糖苷转移酶来源于嗜热高温球菌，其UniProt编号为O32462、或者来源于枯草芽孢杆菌，其UniProt编号为L8AG91、或者来源于丁酸梭菌，其UniProt编号为Q59266；反应体系中α-4葡萄糖苷转移酶的浓度为0.2-20U/mL。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有磷酸盐、镁盐或聚磷酸盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种、两种或者更多种的任意混合物；反应体系中磷酸盐的浓度为1-150mM。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，磷酸盐来自于磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠；反应体系中磷酸盐的浓度为10-30mM。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述镁盐为氯化镁、碳酸镁、硝酸镁；反应体系中镁离子的浓度为为10-80mM。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，反应体系中所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠、多聚磷酸钠；聚磷酸盐的浓度为10-80mM。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有缓冲液，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液之一，所述缓冲液pH范围为5.0-9.0。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述缓冲液pH范围为6.0-7.5。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反应温度为37oC-85oC。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述反应温度为50oC-65oC。
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