CN109563499A

CN109563499A - 一种新型热稳定果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶和使用其生产阿洛糖的方法

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Publication number: CN109563499A
Application number: CN201780041244.6A
Authority: CN
Inventors: 梁成才; 赵显国; 李英美; 金成俌; 赵成捘
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2037-06-30
Also published as: EP3480306A2; ES2950576T3; KR20180004023A; CN109563499B; PL3480306T3; WO2018004308A3; CA3027687C; EP3480306A4; JP2019522477A; US10907182B2; US20190225997A1; RU2019100788A3; RU2019100788A; EP3480306B1; CA3027687A1; KR20190038775A; AU2017287764B2; RU2733427C2; AU2017287764A1; WO2018004308A2

Abstract

本申请涉及包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的果糖‑6‑磷酸盐‑3‑差向异构酶、编码果糖‑6‑磷酸盐‑3‑差向异构酶的核酸和包含该核酸的转化体。另外，本申请涉及一种包含本申请的果糖‑6‑磷酸盐‑3‑差向异构酶用于生产阿洛糖的组合物，以及一种使用本申请的果糖‑6‑磷酸盐‑3‑差向异构酶用于生产阿洛糖的方法。

Description

一种新型热稳定果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶和使用其生产阿洛糖的方法

技术领域

本公开涉及果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶和使用其生产阿洛糖的方法。

背景技术

已知D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(EC 5.1.3.30)和D-塔格糖-3-差向异构酶(EC5.1.3.31)是能够通过D-果糖的3-差向异构化(C3-差向异构化)生产阿洛糖的酶。当使用上述酶通过单一酶反应由果糖生产阿洛糖时，果糖(即底物)和阿洛糖(即产物)之间存在一定水平的反应平衡(产物/底物＝约20％至35％)。因此，在使用单一酶反应生产高纯度的阿洛糖的情况下，需要从反应生成物中分离和移除高浓度果糖的附加纯化过程。

另一方面，Chan等人(2008.Biochemistry.47：9608-9617)报道了源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogene)的D-核酮糖-5-磷酸盐-3-差向异构酶(EC5.1.3.1)和源自大肠杆菌(E.coli)的D-阿洛糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶(EC5.1.3.-)，其能够进行D-果糖-6-磷酸盐和D-阿洛糖-6-磷酸盐的3-差向异构化；然而，这些酶不是热稳定的，因此不能在工业上使用。

发明内容

[技术问题]

本发明人已经进行了广泛的努力以开发一种能够在经济上和工业上提高转化为阿洛糖的速率的方法。因此，当通过由作为经济原料的蔗糖、淀粉或麦芽糖糊精转化为葡萄糖或葡萄糖-1-磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐和果糖-6-磷酸盐来生产阿洛糖-6-磷酸盐时，发现可以使用参与不可逆反应途径的阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶来生产阿洛糖。因此，考虑到能够用一锅法酶转化生产阿洛糖，其中可以同时使用参与阿洛糖生产途径的多种酶，并且可以显著增加转化为阿洛糖的速率，通过发现可应用于将果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐的途径的新型热稳定酶，本发明人已经完成了本公开。

[技术方案]

本公开的一个目的是提供一种由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶。

本公开的另一个目的是提供一种编码本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的核酸。

本公开的又一个目的是提供一种包含编码本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的核酸的转化体。

本公开的又一个目的是提供一种用于生产阿洛糖的组合物，其包含本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶、表达其的微生物或微生物的培养物。

本公开的又一个目的是提供一种使用本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶生产阿洛糖的方法。

[有益效果]

由于本公开的热稳定果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶是热稳定的，它可以用于开发工业上将果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐的途径，由于经济原料的使用，能够使用合成阿洛糖的途径进行，由于阿洛糖-6-磷酸盐的去磷酸盐化，能够生产阿洛糖，该去磷酸盐化是一种不可逆的反应途径；因此，可以显著提高转化为阿洛糖的速率。

另外，在使用本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶生产阿洛糖的方法中，能够简化或除去分离/纯化过程，因为由于转化为阿洛糖的速率增加，反应的生成物包括高浓度的阿洛糖，因此，生产方法的优点在于它简单且经济。

附图说明

图1显示了能够由淀粉(例如麦芽糖糊精)、蔗糖或葡萄糖生产阿洛糖的反应途径。

图2显示了通过蛋白质电泳(SDS-PAGE)分析本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶(E：FP3E)的分子量的结果。“M”代表蛋白质大小标记。

图3是显示本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶从果糖-6-磷酸盐到阿洛糖-6-磷酸盐的转化活性的图。

图4是显示本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶活性根据缓冲溶液和pH范围的图。

图5是显示本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶活性根据温度的图。

图6是显示在添加金属离子时本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶活性的图。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其它解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开的限制。

为了实现本公开的目的，本公开的一个方面提供了由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶。

另外，本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的多肽。例如，显而易见的是，具有某些序列的缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质落入本公开的范围内，只要它具有对应于由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的同源性并表现出对应功效即可。

另外，只要蛋白质具有对应于本公开的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的功效即可，并不排除能够通过SEQ ID NO：1的氨基酸序列的上游或下游的无意义序列添加而发生的突变，天然发生的突变或沉默突变。另外，包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白质也属于本公开的范围。

此外，果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶可以由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码，或果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶可以由与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的核苷酸序列编码，但并不限于此。基于密码子简并性，显而易见的是，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质或能够翻译成与上述蛋白质具有同源性的蛋白质的多核苷酸也可包括在本公开的范围内。

如本文所用，术语“同源性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且同源性可以表示为百分比。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。同源序列可以通过例如标准软件，特别是BLAST2.0(其计算例如得分、同一性、相似性等参数)或通过在限定的严格条件下比较Southern杂交实验中的序列以及限定合适的杂交条件在本领域技术范围内来确定，并且可以通过本领域技术人员已知的方法来确定(例如J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。如本文所用，术语“严格条件”是指旨在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，在文献(例如J.Sambrook等人，同上)中具体描述了这些条件。

在本公开中，可以调整严格条件以确定同源性。为了证实多核苷酸之间的同源性，可以使用对应于55℃的T_m值的低严格性杂交条件。例如可以使用5X SSC、0.1％SDS、0.25％牛奶和无甲酰胺；或者30％甲酰胺、5X SSC和0.5％SDS的条件。轻度严格性杂交条件对应于高T_m值；例如可以使用40％甲酰胺和5X或6X SSC。高严格性杂交条件对应于最高的T_m值；例如，可以使用50％甲酰胺和5X或6X SSC，但杂交条件并不限于上述示例。

尽管碱基之间的错配可能依赖于杂交的严格性，但是杂交需要两个核酸具有互补序列。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括基本上相似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。

具体地，可以使用杂交条件(包括55℃的T_m值的杂交步骤)并使用上述条件检测具有同源性的多核苷酸。另外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但并不限于此。本领域技术人员可以根据其目的适当地调整T_m值。

杂交多核苷酸的合适严格性依赖于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域已知的。随着两个核苷酸之间的相似性或同源性变得更大，具有这种序列的多核苷酸的杂交体的T_m值变得更大。多核苷酸杂交的相对稳定性(对应于较高的T_m值)按以下顺序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。本领域公开了杂交体(其长度大于100个核苷酸)的T_m值的计算公式(Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。为了与较短的多核苷酸(例如寡核苷酸)杂交，错配位置可能更重要，并且寡核苷酸的长度可决定其特异性(Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。

具体地，可以使用以下杂交条件检测多核苷酸：1)盐浓度低于500mM且温度为至少37℃的杂交步骤；在至少63℃用2X SSPE的洗涤步骤；2)盐浓度低于200mM且温度为至少为37℃的杂交步骤；或3)在63℃用2X SSPE进行杂交和洗涤步骤。

杂交核酸的长度可以是例如至少约10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸或至少30个核苷酸。另外，本领域技术人员可以依赖于探针的长度等因素根据需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。

本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶可以是源自栖热袍菌属(Thermotogasp.)的酶，并且具体地可以是源自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的酶，但并不限于此。

本公开的另一方面提供了编码本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的核酸。

本公开的又一方面提供了包含编码本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的核酸的转化体。

如本文所用，术语“转化”是指向宿主细胞中引入包括编码靶蛋白质的核酸的载体，从而能够在宿主细胞中表达由核酸编码的蛋白质的过程。对于转化的核酸，转化的核酸是否插入宿主细胞的染色体并位于其中或位于染色体外是无关紧要的，只要可以在宿主细胞中表达它即可，并且两种情况都包括在内。另外，核酸包括编码靶蛋白质的DNA和RNA。可以以任何形式插入核酸，只要它能够被引入宿主细胞中并在其中被表达即可。例如，可以以表达盒的形式将核酸引入宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒通常可包括与核酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外，可以将核酸原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列，但核酸并不限于此。

另外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动和介导编码本公开的靶蛋白质的核酸的转录的启动子序列与上述基因序列之间的功能性连接。

用于转化载体的本公开的方法包括将核酸引入细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适标准技术来进行。该方法的示例可包括电穿孔、磷酸盐钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂-DMSO技术等，但并不限于此。

作为宿主细胞，优选使用具有高效率引入DNA和高效率表达引入的DNA的宿主。例如，它可以是大肠杆菌(E.coli)，但并不限于此。

本公开的又一方面提供了用于生产阿洛糖的组合物，其包含本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶、表达本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的微生物或表达本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的微生物的培养物。

用于生产阿洛糖的本公开的组合物还可包含参与本公开的生产阿洛糖途径(参见图1)的酶、表达参与本公开的生产阿洛糖途径的酶的微生物或表达参与本公开的生产阿洛糖途径的酶的微生物的培养物。然而，这只是一个示例；也就是说，用于生产阿洛糖的本公开组合物中含有的酶和用于生产阿洛糖的底物不受限制，只要可以通过使用本公开的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶生产阿洛糖即可。

用于生产阿洛糖的本发明的组合物还可包含阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或表达阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物的培养物。

另外，用于生产阿洛糖的本公开的组合物还可包含：(a)(i)淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合，葡萄糖，葡萄糖-1-磷酸盐，葡萄糖-6-磷酸盐或果糖-6-磷酸盐；(ii)磷酸盐；(iii)阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶；(iv)葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；(v)磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和/或(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或(b)表达任何酶的微生物或表达任何酶的微生物的培养物，但并不限于此。

具体地，本公开的淀粉/麦芽糖糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.1)和α-葡聚糖磷酸化酶可以包括任何蛋白质，只要这些蛋白质是经历从磷酸盐到葡萄糖的磷酸转移，从而具有由淀粉或麦芽糖糊精生产葡萄糖-1-磷酸盐的活性的蛋白质即可。本公开的蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)可以包括任何蛋白质，只要它是经历从磷酸盐到葡萄糖的磷酸转移，从而具有由蔗糖生产葡萄糖-1-磷酸盐的活性的蛋白质即可。本公开的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)和异淀粉酶是用于淀粉糖化的酶，可以包括任何蛋白质，只要这些蛋白质是具有将淀粉或麦芽糖糊精转化为葡萄糖的活性的蛋白质即可。本公开的蔗糖酶(EC 3.2.1.26)可包括任何蛋白质，只要它是具有将蔗糖转化为葡萄糖的活性的蛋白质即可。本公开的磷酸葡萄糖变位酶(EC 5.4.2.2)可包括任何蛋白质，只要它是具有将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐的活性的蛋白质即可。葡萄糖激酶可包括任何蛋白质，只要它是能够将磷酸盐转移到葡萄糖，从而具有转化为葡萄糖-6-磷酸盐的活性的蛋白质即可。具体地，葡萄糖激酶可以是多磷酸盐依赖性葡糖激酶，更具体地，可以是由SEQ ID NO：5的氨基酸序列和SEQ ID NO：7的核苷酸序列组成的源自地热奇异球菌(Deinococcus geothermalis)的多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶，或者可以是由SEQ ID NO：6的氨基酸序列和SEQ ID NO：8的核苷酸序列组成的源自嗜热厌氧绳菌(Anaerolineathermophila)的多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶。本公开的葡萄糖-6-磷酸盐异构酶可包括任何蛋白质，只要它是具有将葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐的活性的蛋白质即可。本公开的阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶可包括任何蛋白质，只要它是具有将阿洛糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖的活性的蛋白质即可。更具体地，阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶可以是具有不可逆地将阿洛糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖的活性的蛋白质。

本公开的又一方面提供了一种用于生产阿洛糖的方法，其包括：通过使果糖-6-磷酸盐与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶、表达果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的微生物或表达果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的微生物的培养物反应，以将果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐。

本公开的生产方法还可包括在将本公开的果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐后，通过使阿洛糖-6-磷酸盐与阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物或表达阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶的微生物的培养物反应，以将阿洛糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖。

另外，本公开的生产方法还可包括在将本公开的果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐前，通过使葡萄糖-6-磷酸盐与葡萄糖-6-磷酸盐异构酶、表达葡萄糖-6-磷酸盐异构酶的微生物或表达葡萄糖-6-磷酸盐异构酶的微生物的培养物反应，以将葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐。

另外，本公开的生产方法还可包括在将本公开的葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐前，通过使葡萄糖-1-磷酸盐与磷酸葡萄糖变位酶、表达磷酸葡萄糖变位酶的微生物或表达磷酸葡萄糖变位酶的微生物的培养物反应，以将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

另外，本公开的生产方法还可包括在将本公开的葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐前，通过使葡萄糖与葡萄糖激酶、表达葡萄糖激酶的微生物或表达葡萄糖激酶的微生物的培养物和磷酸盐反应，以将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

另外，本发明的生产方法还可包括在将本公开的葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与磷酸盐和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶；表达磷酸化酶的微生物；或表达磷酸化酶的微生物的培养物反应，以将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖-1-磷酸盐。

另外，本公开的生产方法还可包括在将本公开的葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶；表达淀粉酶、支链淀粉酶或蔗糖酶的微生物；或表达淀粉酶、支链淀粉酶或蔗糖酶的微生物的培养物反应，以将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖。

本公开的生产方法还可包括通过使葡萄糖与4-α-葡聚糖转移酶、表达4-α-葡聚糖转移酶的微生物或表达4-α-葡聚糖转移酶的微生物的培养物反应，以将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糖糊精或蔗糖。

在本公开的生产方法中，可以在5.0至10.0的pH、50℃至90℃的温度下和/或1分钟至24小时内进行“反应”。具体地，可以在5.0至9.0的pH、5.0至8.0的pH、5.0至7.0的pH、5.0至6.0的pH、6.0至10.0的pH、6.0至9.0的pH、6.0至8.0的pH、6.0至7.0的pH、7.0至10.0的pH、7.0至9.0的pH、7.0至8.0的pH、8.0至10.0的pH、8.0至9.0的pH或9.0至10.0的pH下进行本公开的反应。另外，可以在55℃至90℃、60℃至90℃、60℃至75℃、65℃至75℃或60℃至70℃下进行本公开的反应。另外，本公开的反应可以进行1分钟至12小时、1分钟至6小时、1分钟至3小时、1分钟至1小时、5分钟至24小时、5分钟至12小时、5分钟至6小时、5分钟至3小时、5分钟至1小时、10分钟至24小时、10分钟至12小时、10分钟至6小时、10分钟至3小时或10分钟至1小时。

本公开的又一方面提供了一种用于生产阿洛糖的方法，其包括使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合和磷酸盐与(a)阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶；由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶；葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或(b)表达任何酶的微生物或微生物的培养物反应。

在下文中，将结合示例性实施方式详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，不应解释为限制本公开的范围。

实施例1：含有果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶基因的重组表达载体和转化的微生物的制备

为了发现新型热稳定果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶，从新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)中分离基因，然后生产重组表达载体和转化的微生物。

具体地，基于在Genbank中登记的新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的基因序列，选择预期编码果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶的基因fp3e。此后，基于其氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2)的信息，设计和合成正向引物(SEQ IDNO：3)和反向引物(SEQ ID NO：4)。使用新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)染色体DNA(基因组DNA)作为模板，用合成的引物进行聚合酶链式反应(PCR)。具体地，PCR在以下条件下进行总共25个循环：95℃变性30秒，55℃退火30秒，且68℃聚合2分钟。使用限制酶Nde和Xho将生成物插入用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的质粒载体pET21a(NovagenInc.)，然后构建重组表达载体并命名为CJ_tn_fp3e。通过常规转化方法(Sambrook等人，1989)将CJ_tn_fp3e转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以制备转化为包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的重组载体的微生物，并将其设计为大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e。

菌株大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e于2016年6月23日保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)并被分配登记号KCCM11848P，该培养中心是布达佩斯条约下的国际保藏机构。

实施例2：重组酶的制备

为了制备重组酶(下文称为FP3E)，将大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e接种到含有5mL LB液体培养基的培养管中，然后在37℃振荡培养箱中开始种子培养直至600nm处的吸光度达到2.0。将种子培养液接种到含有LB液体培养基的培养瓶中，并进行主培养。当600nm处的吸光度达到2.0时，添加1mM IPTG以诱导FP3E的表达/生产。在200rpm的搅拌速率和37℃的温度下进行种子培养和主培养。完成主培养时，将培养液在4℃以8000×g离心20分钟，然后回收细胞。将回收的细胞用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)洗涤两次，悬浮在相同的缓冲液中，然后用超声波细胞破碎器破碎细胞。将细胞碎片在4℃以13000×g离心20分钟，然后仅获得上清液。使用His-标签亲和层析从上清液中纯化FP3E。将纯化的重组酶溶液用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)透析，然后将生成物用于酶的特性分析。

通过SDS-PAGE分析证实分子量，结果发现纯化的FP3E的分子量为约25kDa(在图2中表示为“E”)。

实施例3：证实FP3E的活性

为了分析从果糖-6-磷酸盐到阿洛糖-6-磷酸盐的FP3E转化活性，将果糖-6-磷酸盐(50mM)悬浮于50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中，并向其中添加纯化的FP3E(0.1单位/mL)。此后，将生成物在70℃下反应1小时。

由于目前不存在阿洛糖-6-磷酸盐的参考物质，因此不可能确定是否产生了阿洛糖-6-磷酸盐。因此，在使用植酸酶(其为阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶)将阿洛糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖后，根据阿洛糖的生产测量转化活性。具体地，在完成反应时，添加植酸酶(10单位/mL)，然后在37℃下反应1小时以使底物(例如果糖-6-磷酸盐)和产物(例如阿洛糖-6-磷酸盐)都去磷酸化。此后，通过HPLC分析果糖和阿洛糖。使用Aminex HPX-87C柱(Bio-radInc.)进行HPLC分析，同时使反应产物在流动相中以0.5mL/min的流速在80℃下流动。通过折射率检测器检测果糖和阿洛糖。

结果是在FP3E的反应产物中检测到果糖和阿洛糖(图3)，因此证实了FP3E具有通过果糖-6-磷酸盐的3-差向异构化生产阿洛糖-6-磷酸盐的活性(图3)。

实施例4：根据pH、温度和金属离子的添加证实FP3E的活性

4-1.根据pH证实活性

为了研究pH对FP3E的影响，将纯化的FP3E(0.1单位/mL)添加到悬浮于50mM缓冲液的果糖-6-磷酸盐(50mM)中，然后在70℃反应10分钟，所述缓冲液具有各种pH(pH 4.0-7.0，柠檬酸钠；pH 6.0至8.0，磷酸钾：pH 7.0至9.0，Tris-HCl)。此后，在与实施例3相同的条件下使生成物与植酸酶反应，并通过HPLC定量分析阿洛糖。

结果是证实了FP3E在7.0至8.0的pH下显示出最大活性，并且与最大活性相比，FP3E在非常宽的pH范围(5.0至10.0)下保持70％或更高的活性(图4)。

实施例4：根据pH、温度和金属离子的添加证实FP3E的活性

4-1.根据pH证实活性

4-3.根据金属离子的添加证实活性

为了研究金属离子的添加对FP3E活性的影响，将每种金属离子(如NiSO₄、CuSO₄、MnSO₄、CaCl₂、ZnSO₄、MgSO₄、MgCl₂、FeSO₄、NaCl、LiCl和KCl)添加到悬浮于50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)的果糖-6-磷酸盐(50mM)中至终浓度为0.5mM。为了除去金属离子，向其中添加通过用10mM EDTA处理透析的FP3E(0.1单位/mL)，然后将生成物在70℃反应10分钟。此后，在与实施例3相同的条件下使生成物与植酸酶反应，并通过HPLC定量分析阿洛糖。

结果是当添加Ca和Cu离子时，FP3E的活性略微增加，但当添加其它金属离子时，酶活性几乎没有变化。因此，证实了FP3E不是金属酶(图6)。

虽然已经参考特定的说明性实施方式描述了本公开，但是本公开所属领域的技术人员将理解，本公开可以以其它特定形式实施而不脱离本公开的技术精神或必要特征。因此，上述实施方式在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。此外，本公开的范围由所附权利要求而不是详细描述所限定，并且应当理解的是，源自本公开的含义和范围及其等同物的所有修改或变化都包括在所附权利要求的范围内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 一种新型热稳定果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶和使用其生产阿洛糖的方法

<130> OPA17109

<150> KR 10-2016-0082543

<151> 2016-06-30

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶

<400> 1

Met Met Val Lys Ile Ala Ala Ser Ile Leu Ala Cys Asp Leu Ala Arg

1 5 10 15

Leu Ala Asp Glu Val Lys Arg Val Glu Glu His Ile Asp Met Val His

20 25 30

Phe Asp Val Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Ile Ser Phe Gly Leu

35 40 45

Pro Val Leu Lys Ala Leu Arg Lys Glu Thr Ser Leu Pro Ile Ser Val

50 55 60

His Leu Met Ile Thr Asn Pro Glu Asp Tyr Val Asp Arg Phe Val Glu

65 70 75 80

Glu Gly Ala Asp Met Val Ala Val His Tyr Glu Thr Thr Pro His Leu

85 90 95

His Arg Ile Val His Arg Ile Lys Asp Leu Gly Ala Lys Ala Phe Val

100 105 110

Ala Leu Asn Pro His Thr Pro Val Phe Leu Leu Ser Glu Ile Ile Thr

115 120 125

Asp Val Asp Gly Val Leu Val Met Ser Val Asn Pro Gly Phe Ser Gly

130 135 140

Gln Arg Phe Ile Ala Arg Ser Leu Glu Lys Ile Arg Ser Leu Lys Lys

145 150 155 160

Met Ile Arg Asp Leu Gly Leu Glu Thr Glu Ile Met Val Asp Gly Gly

165 170 175

Val Asn Glu Glu Asn Ala Ser Ile Leu Ile Lys Asn Gly Ala Thr Ile

180 185 190

Leu Val Met Gly Tyr Gly Ile Phe Lys Asn Glu Asn Tyr Val Glu Leu

195 200 205

Val Arg Ser Ile Lys Gln Glu Arg Gly Glu Ser Ala Gly

210 215 220

<210> 2

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶

<400> 2

atgatggtaa agatcgccgc ttcaatcctt gcgtgtgatc ttgcaagact cgccgatgag 60

gtaaaaaggg tggaagaaca catagacatg gttcacttcg atgtcatgga tggacacttc 120

gttccgaaca tctcgttcgg attgcccgtt ctcaaagccc tgagaaaaga aaccagcctt 180

cctataagtg ttcatctgat gatcacaaat ccagaggact atgtggaccg tttcgtggaa 240

gagggagcgg acatggtggc ggtccactac gagacaacgc cgcaccttca caggatagtg 300

cacaggataa aggatctcgg ggcgaaggcg ttcgtcgccc tcaacccaca cacaccggtt 360

tttctcctgt ctgagatcat aacggatgtg gatggcgtac tcgtgatgag tgtgaacccg 420

ggcttttctg gtcagagatt cattgcaagg agtctggaaa aaataaggag tctgaagaag 480

atgataaggg atctgggact cgaaacggag atcatggtcg atggtggtgt caacgaagaa 540

aacgcttcta tcttaataaa gaacggtgcg acgatccttg taatggggta cggtatcttc 600

aaaaacgaaa actatgtgga actggtgaga tccatcaagc aggaaagagg ggaatctgct 660

ggctga 666

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

ggaacatatg atggtaaaga tcgccgcttc aatc 34

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 4

catactcgag cttcccctct cctatct 27

<210> 5

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 5

Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr

1 5 10 15

Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu

35 40 45

Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys

50 55 60

Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val

65 70 75 80

Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe

100 105 110

Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala

115 120 125

Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly

130 135 140

Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu

165 170 175

Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu

180 185 190

Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr

195 200 205

Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly

210 215 220

Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr

225 230 235 240

Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile

245 250 255

Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp

260 265 270

<210> 6

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 6

Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala

20 25 30

Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val

35 40 45

Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg

50 55 60

Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr

65 70 75 80

Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu

85 90 95

Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp

100 105 110

Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys

115 120 125

Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu

130 135 140

Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu

145 150 155 160

Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln

165 170 175

Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His

180 185 190

Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly

195 200 205

Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu

210 215 220

Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val

225 230 235 240

Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala

245 250

<210> 7

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 7

atgctggcag ccagtgacag cagccagcat ggcgggaagg ctgttacgct atctcccatg 60

agcgtgatcc tcgggattga cataggtggg agcggcatca agggggcccc tgtggacacg 120

gcaaccggga agctggtggc cgagcgccac cgcatcccca cgcccgaggg cgcgcaccca 180

gacgcggtga aggacgtggt ggttgagctg gtgcggcatt ttgggcatgc ggggccagtc 240

ggcatcactt tccctggcat cgtgcagcac ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300

aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360

accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg cgaggttcgg ggccggggca 420

ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480

tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540

cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600

tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660

tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720

acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780

atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813

<210> 8

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸盐依赖性葡萄糖激酶

<400> 8

atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60

gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120

gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180

tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240

gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300

tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360

tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420

gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480

attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540

acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600

tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660

tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720

ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762

Claims

1.果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

2.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶。

3.一种转化体，其包含根据权利要求2所述的核酸。

4.一种用于生产阿洛糖的组合物，其包含根据权利要求1所述的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包含阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包含：

(a)(i)淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合；(ii)磷酸盐；(iii)阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶；(iv)葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；(v)磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或

(b)表达任何所述酶的微生物或所述微生物的培养物。

7.一种用于生产阿洛糖的方法，其包括：通过使果糖-6-磷酸盐与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物反应，以将果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述果糖-6-磷酸盐转化为所述阿洛糖-6-磷酸盐后，通过使阿洛糖-6-磷酸盐与阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物反应，以将阿洛糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述果糖-6-磷酸盐转化为阿洛糖-6-磷酸盐前，通过使葡萄糖-6-磷酸盐与葡萄糖-6-磷酸盐异构酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物反应，以将葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐前，通过使葡萄糖-1-磷酸盐与磷酸葡萄糖变位酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物反应，以将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-6-磷酸盐转化为果糖-6-磷酸盐前，通过使葡萄糖与葡萄糖激酶、表达其的微生物或所述微生物的培养物和磷酸盐反应，以将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与磷酸盐和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶；表达其的微生物；或所述微生物的培养物反应，以将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖-1-磷酸盐。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐前，通过使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶；表达其的微生物；或所述微生物的培养物反应，以将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合转化为葡萄糖。

14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，所述反应在5.0至10.0的pH、50至90℃的温度下和/或1分钟至24小时内进行。

15.一种用于生产阿洛糖的方法，其包括使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合和磷酸盐与(a)阿洛糖-6-磷酸盐磷酸酶；由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸盐-3-差向异构酶；葡萄糖-6-磷酸盐异构酶；磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖激酶；和α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或(b)表达任何所述酶的微生物或所述微生物的培养物反应。