RU2733427C2 - Новая термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза и способ получения аллюлозы с ее использованием - Google Patents
Новая термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза и способ получения аллюлозы с ее использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2733427C2 RU2733427C2 RU2019100788A RU2019100788A RU2733427C2 RU 2733427 C2 RU2733427 C2 RU 2733427C2 RU 2019100788 A RU2019100788 A RU 2019100788A RU 2019100788 A RU2019100788 A RU 2019100788A RU 2733427 C2 RU2733427 C2 RU 2733427C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phosphate
- allulose
- fructose
- glucose
- microorganism
- Prior art date
Links
- LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N D-allulose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 52
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 52
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 52
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 18
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 18
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 18
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 18
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 17
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 17
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 17
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 16
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 16
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 16
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims description 13
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims description 13
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 12
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 claims description 12
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 11
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 11
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 10
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 claims description 9
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 8
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 claims description 8
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 claims description 8
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 claims description 8
- 108010085781 maltodextrin phosphorylase Proteins 0.000 claims description 8
- 108050004944 Alpha-glucan phosphorylases Proteins 0.000 claims description 7
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010043943 Starch Phosphorylase Proteins 0.000 claims description 7
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 7
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 7
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 7
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108010043797 4-alpha-glucanotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100040894 Amylo-alpha-1,6-glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 3
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 3
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108030002106 D-psicose 3-epimerases Proteins 0.000 description 2
- 108030002100 D-tagatose 3-epimerases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108060007030 Ribulose-phosphate 3-epimerase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 102000004688 ribulosephosphate 3-epimerase Human genes 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000410435 Anaerolinea thermophila Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- 108091010849 D-allulose-6-phosphate 3-epimerases Proteins 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-NGJCXOISSA-N D-psicose 6-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-NGJCXOISSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000959949 Deinococcus geothermalis Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 description 1
- 102100030999 Phosphoglucomutase-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241001135650 Thermotoga sp. Species 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructopyranose Chemical compound OC[C@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-HSUXUTPPSA-N keto-D-fructose 6-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01063—Polyphosphate--glucose phosphotransferase (2.7.1.63)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
- C12Y504/02—Phosphotransferases (phosphomutases) (5.4.2)
- C12Y504/02002—Phosphoglucomutase (5.4.2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к применению фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для получения аллюлозы. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для получения аллюлозы, содержащей фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению, и к способу получения аллюлозы с использованием фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению. Изобретение позволяет получать аллюлозу с высокой степенью эффективности. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразе и способу получения аллюлозы с ее использованием.
Предшествующий уровень техники
D-псикозо-3-эпимераза (ЕС 5.1.3.30) и D-тагатозо-3-эпимераза (ЕС 5.1.3.31) известны, как ферменты, способные продуцировать аллюлозу посредством 3-эпимеризации (С3-эпимеризации) D-фруктозы. Когда аллюлозу получают из фруктозы с помощью единственной ферментативной реакции с использованием вышеуказанных ферментов, существует определенный уровень равновесия между фруктозой (то есть субстратом) и аллюлозой (то есть продуктом) (продукт/субстрат = примерно 20%-35%). Поэтому в случае получения аллюлозы высокой чистоты с использованием единственной ферментативной реакции, требуется дополнительный процесс очистки для выделения и удаления высокой концентрации фруктозы из продукта реакции.
С другой стороны Chan et а/. (2008. Biochemistry. 47:9608-9617) сообщили о D-рибулозо-5-фосфат-3-эпимеразе (ЕС 5.1.3.1), полученной из Streptococcus pyogenes, и D-аллюлозо-6-фосфат-3-эпимеразе (ЕС 5.1.3.-), полученной из Е. coli, которые способны осуществлять 3-эпимеризацию D-фруктозо-6-фосфата и D-аллюлозо-6-фосфата; однако эти ферменты не являются термостабильными и, следовательно, не могут использоваться в промышленности.
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать способ, который может экономически и в промышленном масштабе увеличивать скорость превращения в аллюлозу. В результате этого, когда аллюлозо-6-фосфат получают посредством превращения сахарозы, крахмала или мальтодекстрина, которые являются дешевым сырьем, в глюкозу или в глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат, было обнаружено, что аллюлоза может быть получена с использованием аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, участвующей в необратимой реакции. Следовательно, учитывая, что можно производить аллюлозу с помощью однореакторных ферментативных превращений, в которых можно одновременно использовать множество ферментов, участвующих в производстве аллюлозы, и при этом скорость превращения в аллюлозу может быть значительно увеличена, авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение открытием нового термостабильного фермента, который может быть применен к способу превращения фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат.
Техническое решение
Целью настоящего изобретения является обеспечение фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение трансформанта, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение композиции для получения аллюлозы, которая содержит фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу, или культуру указанного микроорганизма.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения аллюлозы с использованием фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению.
Полезные эффекты
Так как термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза по настоящему изобретению является термостабильной, она может быть использована для промышленного способа превращения фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат, можно продолжить использование этого способа для синтеза аллюлозы благодаря использованию дешевого сырья, и производство аллюлозы является возможным благодаря дефосфорилированию аллюлозо-6-фосфата, которое представляет собой необратимую реакцию; таким образом, скорость превращения в аллюлозу может быть значительно увеличена.
Кроме того, в способе получения аллюлозы с использованием фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению, процесс выделения/очистки может быть упрощен или исключен, поскольку продукт реакции включает высокую концентрацию аллюлозы благодаря увеличению скорости превращения в аллюлозу и, таким образом, способ производства является выгодным благодаря простоте и экономичности.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показана реакция, при которой возможно получение аллюлозы из крахмала (например, мальтодекстрина), сахарозы или глюкозы.
На Фиг. 2 приведены результаты анализа молекулярной массы фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы (Е: FP3E) по настоящему изобретению посредством электрофореза белка (SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия)). "М" представляет маркер размера белка.
На Фиг. 3 представлен график, показывающий конверсионную эффективность фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению при превращении фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат.
На Фиг. 4 представлен график, показывающий активность фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению, в зависимости от буферного раствора и диапазона рН.
На Фиг. 5 представлен график, показывающий активность фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению, в зависимости от температуры.
На Фиг. 6 представлен график, показывающий активность фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению при добавлении иона металла.
Лучший вариант осуществления изобретения
Далее подробно описано настоящее изобретение. При этом каждое из объяснений и примерных воплощений, раскрытых здесь, можно применять к другим объяснениям и примерным воплощениям. То есть все комбинации различных факторов, раскрытых здесь, относятся к объему настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не должен быть ограничен конкретным раскрытием, представленным здесь.
Для решения задачи настоящего изобретения, в одном аспекте настоящего описания предложена фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Кроме того, фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза по настоящему изобретению может содержать полипептид, имеющий гомологию с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, составляющую по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97% или 99%. Например, очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, содержащий делецию, модификацию, замену или добавление некоторых последовательностей, попадает в объем настоящего изобретения при условии наличия гомологии и эффективности, соответствующей гомологии и эффективности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Кроме того, при условии, что белок обладает эффективностью, соответствующей эффективности фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению, которая состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, он может иметь мутации, которые происходят путем добавления бессмысленной последовательности выше или ниже аминокислотной последовательности SEQ ID N0: 1, природные мутации или молчащие мутации. Кроме того, белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, также входит в объем настоящего изобретения.
Кроме того, фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, или фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза может кодироваться нуклеотидной последовательностью, имеющей гомологию с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97% или 99%, но не ограниченной этим. Учитывая вырожденность кода, очевидно, что белки, которые состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или полинуклеотиды, которые можно транслировать в белки, имеющие гомологию с вышеуказанными белками, также могут быть включены в объем настоящего изобретения.
Используемый здесь термин "гомология" относится к степени соответствия с данной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, и гомология может быть выражена в виде процента. В настоящем описании гомологичная последовательность, имеющая активность, которая идентична или подобна активности данной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, выражается как "% гомологии". Гомологичная последовательность может быть определена посредством, например, стандартного программного обеспечения, в частности, программы BLAST 2.0, которая вычисляет такие параметры, как балл, идентичность, сходство и т.д., или посредством сравнения последовательностей с помощью Саузерн-гибридизации при определенных жестких условиях, и определение соответствующих условий гибридизации в пределах знаний специалиста в данной области техники, и могут быть определены с помощью метода, хорошо известного специалистам в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Используемый здесь термин "жесткие условия" относится к условиям, которые предназначены для обеспечения специфичной гибридизации между полинуклеотидами. Например, эти условия конкретно описаны в литературе (например, J. Sambrook et al., выше).
В настоящем описании жесткие условия могут быть адаптированы для определения гомологии. Для подтверждения гомологии между полинуклеотидами могут быть использованы условия гибридизации низкой жесткости, соответствующие значению Tm, равному 55°С. Например, могут быть использованы условия 5Х SSC, 0,1% SDS, 0,25% молока и отсутствие формамида; или могут быть использованы условия 30% формамида, 5Х SSC и 0,5% SDS. Могут быть использованы условия гибридизации средней жесткости, которые соответствуют высоким значениям Tm; например, 40% формамида и 5Х или 6Х SSC. Могут быть использованы условия гибридизации высокой жесткости, которые соответствуют высоким значениям Tm; например, 50% формамида и 5Х или 6Х SSC, но условия гибридизации не ограничиваются приведенными выше примерами.
Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя возможны несоответствия между основаниями в зависимости от жесткости гибридизации. Термин "комплементарный" используется для описания соотношения между нуклеотидными основаниями, которые способны к гибридизации друг с другом. Например, что касается ДНК, аденозин является комплементарным тимину, и цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, настоящее изобретение может также включать по существу сходные последовательности нуклеиновых кислот, а также выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, комплементарные всей последовательности.
Более конкретно, полинуклеотид, имеющий гомологию, может быть определен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm 55°С и использовании вышеописанных условий. Кроме того, значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими. Специалисты в данной области могут соответствующим образом подобрать значение Tm в соответствии с задачей.
Соответствующая жесткость гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов, при этом вариабельные области хорошо известны в данной области техники. Чем больше сходство или гомология между двумя нуклеотидами, тем больше значение Tm для гибридов полинуклеотидов, имеющих такую последовательность. Относительная стабильность для гибридизации полинуклеотидов (соответствует более высокому значению Tm) уменьшается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Формула расчета значений Tm для гибридов, длина которых превышает 100 нуклеотидов, опубликована в области техники (Sambrook et аl., выше, 9.50-9.51). Для гибридизации более коротких полинуклеотидов, например, олигонуклеотидов, положение несоответствия может быть более важным, и длина олигонуклеотидов может определять их специфичность (Sambrook et аl., выше, 11.7-11.8).
В частности, полинуклеотиды могут быть определены с использованием следующих условий гибридизации: 1) стадия гибридизации с концентрацией соли ниже 500 мМ и при температуре по меньшей мере 37°С; и стадия промывки при температуре по меньшей мере 63°С с 2Х SSPE; 2) стадия гибридизации с концентрацией соли ниже 200 мМ и при температуре по меньшей мере 37°С; или 3) обе стадии гибридизации и промывки при 63°С с 2Х SSPE.
Длина гибридизации нуклеиновой кислоты может составлять, например, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, 15 нуклеотидов, 20 нуклеотидов или, по меньшей мере, 30 нуклеотидов. Кроме того, специалисты в данной области техники могут подобрать необходимую температуру и концентрацию соли для промывающего раствора в зависимости от таких факторов, как длина зонда.
Фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза по настоящему изобретению может представлять собой фермент, полученный из Thermotoga sp., и, в частности, может представлять собой фермент, полученный из Thermotoga neapolitana, но не ограничивается ими.
В другом аспект настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен трансформант, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению.
Используемый здесь термин "трансформация" относится к процессу введения в клетку-хозяина вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-мишень, благодаря чему обеспечивается возможность экспрессии белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, в клетке-хозяине. Для трансформированной нуклеиновой кислоты не имеет значения, вставлена ли нуклеиновая кислота в хромосому клетки-хозяина и расположена в ней или находится вне хромосомы, при условии, что она экспрессируется в клетке-хозяине, и поэтому включены оба случая. Кроме того, в состав нуклеиновой кислоты входят ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Нуклеиновая кислота может быть вставлена в любой форме при условии, что она может быть введена в клетку-хозяина и экспрессирована в ней. Например, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все необходимые элементы, необходимые для экспрессии. Экспрессионная кассета может, как правило, включать промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, сигнал терминации транскрипции, домен, связывающий рибосому и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина как таковая и быть функционально связанной с последовательностью, необходимой для ее экспрессии в клетке-хозяине, но нуклеиновая кислота не ограничена этим.
Кроме того, используемый здесь термин "функционально связанный", относится к функциональной связи между последовательностью промотора, который инициирует и содействует осуществлению транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок по настоящему изобретению, и вышеупомянутой последовательностью гена.
Способ по настоящему изобретению для трансформации вектора включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку и может быть осуществлен путем выбора подходящей стандартной методики, известной в данной области техники, в соответствии с клеткой-хозяином. Примеры способа могут включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO4), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекции, метод с использованием полиэтиленгликоля (PEG), метод с использованием ДЭАЭ-декстрана, метод с использованием катионных липосом, метод литий ацетат-ДМСО и т.д., но не ограничиваются этим.
В качестве клетки-хозяина предпочтительно использовать клетку, обладающую высокой эффективностью введения ДНК и высокой эффективностью экспрессии введенной ДНК. Например, это может быть Е, coli, но не ограничивается этим.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для получения аллюлозы, содержащая фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению, или культуру указанного микроорганизма, экспрессирующего фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению.
Композиция по настоящему изобретению для получения аллюлозы может дополнительно содержать фермент, вовлеченный в путь продуцирования аллюлозы (см. Фиг. 1) по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий указанный фермент, вовлеченный в путь продуцирования аллюлозы по настоящему изобретению, или культуру указанного микроорганизма, экспрессирующего указанный фермент, вовлеченный в путь продуцирования аллюлозы по настоящему изобретению. Однако это всего лишь пример; то есть нет ограничения фермента, который должен содержаться в композиции по настоящему изобретению для получения аллюлозы, и субстрата, используемого для получения аллюлозы, при условии, что аллюлоза может быть получена с использованием фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению.
Композиция по настоящему изобретению для получения аллюлозы может, кроме того, содержать аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, микроорганизм, экспрессирующий аллюлозо-6-фосфатфосфатазу или культуру микроорганизма, экспрессирующего аллюлозо-6-фосфат фосфатазу.
Кроме того, композиция по настоящему изобретению для получения аллюлозы может дополнительно содержать: (а) (1) крахмал, мальтодекстрин, сахарозу или их комбинацию, глюкозу, глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат или фруктозо-6-фосфат; (2) фосфат; (3) аллюлоо-6-фосфатфосфатазу; (4) глюкозо-6-фосфатизомеразу; (5) фосфоглюкомутазу или глюкокиназу; и/или (6) α-глюканфосфорилазу, фосфорилазу крахмала, фосфорилазу мальтодекстрина, фосфорилазу сахарозы, α-амилазу, пуллуланазу, изоамилазу, глюкоамилазу или сахаразу; или (б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных указанных ферментов, но не ограничивается ими.
В частности, фосфорилаза крахмала/мальтодекстрина (ЕС 2.4.1.1) и α-глюканфосфорилаза по настоящему изобретению могут включать любые белки при условии, что они представляют собой белки, которые осуществляют перенос фосфорила от фосфата к глюкозе, таким образом, обладают активностью продуцирования глюкозо-1-фосфата из крахмала или мальтодекстрина. Фосфорилаза сахарозы (ЕС 2.4.1.7) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок осуществляет перенос фосфорила от фосфата к глюкозе, таким образом, обладая активностью продуцирования глюкозо-1-фосфата из сахарозы. α-Амилаза (ЕС 3.2.1.1), пуллуланаза (ЕС 3.2.1.41), глюкоамилаза (ЕС 3.2.1.3) и изоамилаза по настоящему изобретению, которые представляют собой ферменты для превращения крахмала в сахар, могут включать любые белки, если они являются белками, имеющими активность превращения крахмала или мальтодекстрина в глюкозу. Сахараза (ЕС 3.2.1.26) по настоящему изобретению может включать любой белок, если этот белок обладает активностью превращения сахарозы в глюкозу. Фосфоглюкомутаза (ЕС 5.4.2.2) по настоящему изобретению может включать любой белок, если он является белком, обладающим активностью превращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат. Глюкокиназа может включать любой белок, если он является белком, способным переносить фосфат на глюкозу, тем самым обладая активностью превращения в глюкозо-6-фосфат. В частности, глюкокиназа может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой и более конкретно может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой, полученной из Deinococcus geothermalis и состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO :5, которая кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7, или может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой, полученной из Anaerolinea thermophila, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, которая кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8. Изомераза глюкозо-6-фосфата по настоящему изобретению может включать любой белок, если этот белок имеет активность превращения глюкозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат.Аллюлозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению может включать любой белок, если этот белок имеет активность превращения аллюлозо-6-фосфата в аллюлозу. Более конкретно, аллюлозо-6-фосфатфосфатаза может представлять собой белок, обладающий активностью необратимого превращения аллюлозо-6-фосфата в аллюлозу.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения аллюлозы, включающий: превращение фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат путем взаимодействия фруктозо-6-фосфата с фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразой, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, микроорганизмом, экспрессирующим фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу, или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу.
Способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать превращение аллюлозо-6-фосфата в аллюлозу путем взаимодействия аллюлозо-6-фосфата с аллюлозо-6-фосфатфосфатазой, микроорганизмом, экспрессирующим аллюлозо-6-фосфат фосфатазу, или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, после превращения фруктозо-6-фосфата по настоящему изобретению в аллюлозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения по настоящему изобретения может дополнительно включать превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат путем взаимодействия глюкозо-6-фосфата с глюкозо-6-фосфатизомеразой, микроорганизмом, экспрессирующим глюкозо-6-фосфатизомеразу, или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего глюкозо-6-фосфатизомеразу, перед превращением фруктозо-6-фосфата по настоящему изобретению в аллюлозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения по настоящему изобретения может дополнительно включать превращение глюкозо-1-фосфат в глюкозо-6-фосфат путем взаимодействия глюкозо-1-фосфат с фосфоглюкомутазой, микроорганизмом, экспрессирующим фосфоглюкомутазу, или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего фосфоглюкомутазу, перед превращением глюкозо-6-фосфат по настоящему изобретению в фруктозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения по настоящему изобретения может дополнительно включать превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат путем взаимодействия глюкозы с глюкокиназой, микроорганизмом, экспрессирующим глюкокиназу, или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего глюкокиназу, и фосфатом, перед превращением глюкозо-6-фосфата по настоящему изобретению во фруктозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения по настоящему изобретения может дополнительно включать превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозо-1-фосфат путем взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с фосфатом и α-глюканфосфорилазой, фосфорилазой крахмала, фосфорилазой мальтодекстрина или фосфорилазой сахарозы; микроорганизмом, экспрессирующим указанную фосфорилазу; или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего фосфорилазу, перед превращением глюкозо-1-фосфат по настоящему изобретению в глюкозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения по настоящему изобретения может дополнительно включать превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозу путем взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с α-амилазой, пуллуланазой, глюкоамилазой, сахаразой или изоамилазой; микроорганизмом, экспрессирующим амилазу, пуллуланазу или сахаразу; или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего амилазу, пуллуланазу или сахаразу, перед превращением глюкозы по настоящему изобретению в глюкозо-6-фосфат.
Способ получения по настоящему изобретения может дополнительно включать превращение глюкозы в крахмал, мальтодекстрин или сахарозу путем взаимодействия глюкозы с 4-α-глюканотрансферазой, микроорганизмом, экспрессирующим 4-α-глюканотрансферазу, или культурой указанного микроорганизма, экспрессирующего 4-α-глюканотрансферазу.
В способе получения по настоящему изобретению "взаимодействие" можно осуществлять при рН от 5,0 до 10,0, при температуре от 50°С до 90°С и/или в течение от 1 минуты до 24 часов. В частности, взаимодействие по настоящему изобретению может проводиться при рН от 5,0 до 9,0, рН от 5,0 до 8,0, рН от 5,0 до 7,0, рН от 5,0 до 6,0, рН от 6,0 до 10,0, рН от 6,0 до 9,0, рН от 6,0 до 8,0, рН от 6,0 до 7,0, рН от 7,0 до 10,0, рН от 7,0 до 9,0, рН от 7,0 до 8,0, рН от 8,0 до 10,0, рН от 8,0 до 9,0 или рН от 9,0 до 10,0. Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить при температуре от 55°С до 90°С, от 60°С до 90°С, от 60°С до 75°С, от 65°С до 75°С или от 60°С до 70°С. Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить в течение от 1 минуты до 12 часов, от 1 минуты до 6 часов, от 1 минуты до 3 часов, от 1 минуты до 1 часа, от 5 минут до 24 часов, от 5 минут до 12 часов, от 5 минут до 6 часов, от 5 минут до 3 часов, от 5 минут до 1 часа, от 10 минут до 24 часов, от 10 минут до 12 часов, от 10 минут до 6 часов, от 10 минут до 3 часов или 10 минут до 1 часа.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения аллюлозы, включающий взаимодействие крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации и фосфата с (а) аллюлозо-6-фосфатфосфатазой; фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразой, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; глюкозо-6-фосфатизомеразой; фосфоглюкомутазой или глюкокиназой; и α-глюканфосфорилазой, фосфорилазой крахмала, фосфорилазой мальтодекстрина, фосфорилазой сахарозы, α-амилазой, пуллуланазой, изоамилазой, глюкоамилазой, или сахаразой; или (б) микроорганизмом, экспрессирующим любой из указанных ферментов или культурой указанного микроорганизма.
Способ осуществления изобретения
Ниже настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на типичные воплощения. Однако раскрытые здесь типичные воплощения предназначены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение рекомбинантного экспрессирующего вектора, содержащего ген фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы и трансформированного микроорганизма
Для получения новой термостабильной фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы, был выделен ген из Thermotoga neapolitana, термофильного микроорганизма, а затем были получены рекомбинантный экспрессирующий вектор и трансформированный микроорганизм.
В частности, на основе последовательностей гена из Thermotoga neapolitana, зарегистрированных в Genbank, был выбран ген fp3e, который, как предполагается, кодирует фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу. После этого, на основании информации о аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2), были разработаны и синтезированы прямой праймер (SEQ ID NO: 3) и обратный праймер (SEQ ID NO: 4). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с синтезированными праймерами, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК Thermotoga neapolitana (геномную ДНК). Конкретно, при проведении ПЦР выполняли 25 циклов при следующих условиях: денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 68°С в течение 2 минут. Полученный продукт встраивали в рЕТ21а (Novagen Inc.), который представляет собой плазмидный вектор для экспрессии в Е. coli, с использованием рестрикционных ферментов Nde и Xho, а затем сконструированный рекомбинантный экспрессирующий вектор и названный как CJ_tn_fp3e. CJ_tn_fp3e трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3) посредством обычного метода трансформации (Sambrook et аl. 1989) для получения микроорганизма, трансформированного рекомбинантным вектором, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, который назван как Е. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_fp3e.
Штамм E.coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e был депонирован в Корейский центр культур микроорганизмов (КССМ), который является международным депозитарным органом в соответствии с Будапештским договором, 23 июня 2016 года, и ему был присвоен номер доступа КССМ11848Р.
Пример 2: Получение рекомбинантного фермента
С целью получения рекомбинантного фермента (далее называемый FP3E), Е. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_fp3e инокулировали в культуральную пробирку, содержащую 5 мл жидкой среды LB, а затем инициировали культуру для посева в инкубаторе для встряхивания при 37°С вплоть до достижения значения поглощения 2,0 при 600 нм. Раствор культуры для посева инокулировали в культуральную колбу, содержащую жидкую среду LB и получали основную культуру. Когда поглощение при 600 нм достигало 2,0, добавляли 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактозид) для индукции экспрессии/продукции FP3E. Культивирование посевной культуры и основной культуры проводили при скорости перемешивания 200 об/мин при температуре 37°С. После завершения получения основной культуры культуральный раствор центрифугировали при 4°С при 8,000×g в течение 20 минут и затем извлекали клетки. Полученные клетки дважды промывали 50 мМ трис-HCl-буфером (рН 7,0), суспендировали в том же буфере и затем клетки разрушали с использованием ультразвукового разрушителя клеток. Клеточный дебрис центрифугировали при 4°С при 13000 × g в течение 20 минут, а затем получали только супернатант.FP3E выделяли из супернатанта с использованием His-tag аффинной хроматографии. Очищенный раствор рекомбинантного фермента подвергали диализу с использованием 50 мМ трис-HCl-буфера (рН 7,0), и затем полученные продукты использовали для анализа свойств фермента.
Молекулярную массу подвергали SDS-PAGE анализу, и в результате было обнаружено, что молекулярная масса очищенного FP3E составляла примерно 25 кДа (обозначенная, как "Е" на Фиг. 2).
Пример 3: Определение активности FP3E
Для анализа активности превращения FP3E из фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат (50 мМ) суспендировали в 50 мМ Tris-HCI буфера (рН 7,0) и к нему добавляли очищенный FP3E (0,1 ед./мл). После этого полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 1 часа.
Из-за отсутствия референсного материала аллюлозо-6-фосфата, в настоящее время невозможно определить, продуцируется ли аллюлозо-6-фосфат.Следовательно, после превращения аллюлозо-6-фосфата в аллюлозу с использованием фитазы, которая представляет собой аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, измеряли активность превращения в соответствии с продукцией аллюлозы. В частности, после завершения реакции добавляли фитазу (10 ед./мл) и затем подвергали взаимодействию при 37°С в течение 1 часа для дефосфорилирования как субстрата, например, фруктозо-6-фосфата, так и продукта, например, аллюлозо-6-фосфата. После этого фруктозу и аллюлозу анализировали методом ВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ осуществляли с использованием колонки Aminex НРХ-87С (Bio-rad Inc.), при пропускании продукта реакции в мобильной фазе при скорости потока 0,5 мл/мин при 80°С.Фруктозу и аллюлозу обнаруживали с помощью детектора показателя преломления.
В результате фруктоза и аллюлоза были обнаружены в продукте реакции FP3E (Фиг. 3), и, таким образом, было подтверждено, что FP3E обладает способностью продуцировать аллюлозо-6-фосфат путем 3-эпимеризации фруктозо-6-фосфата (Фиг. 3).
Пример 4: Определение активности FP3E в зависимости от рН, температуры и добавления иона металла
4-1. Определение активности в зависимости от рН
Для определения влияния рН на FP3E, очищенный FP3E (0,1 ед./мл) добавляли к фруктозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере с различными pHs (рН 4,0-7,0, цитрат натрия; рН 6,0-8,0, фосфат калия: рН 7,0-9,0, Tris-HCl), и затем подвергали реакции при 70°С в течение 10 минут. После этого полученные продукты реагировали с фитазой при тех же условиях, что и в Примере 3 и аллюлозу количественно анализировали с помощью ВЭЖХ.
В результате было подтверждено, что FP3E проявляет максимальную активность при рН 7,0-8,0, и что FP3E сохраняет 70% или более активности в очень широком диапазоне рН (5,0-10,0) по сравнению с максимальной активностью (Фиг. 4).
4-3. Определение активности в зависимости от добавления иона металла
Чтобы исследовать влияние добавления иона металла на активность FP3E, каждый из ионов металла (например, NiSO4, CuSO4, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, MgSO4, MgCl2, FeSO4, NaCl, LiCl и KCl) добавляли к фруктозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ трис-HCl-буфере (рН 7,0) до конечной концентрации 0,5 мМ. Для удаления ионов металлов к нему добавляли FP3E (0,1 ед./мл), который подвергали диализу путем обработки 10 мМ EDTA, и затем полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут. После этого полученные продукты подвергали взаимодействию с фитазой при тех же условиях, что и в Примере 3, и аллюлозу количественно анализировали с помощью ВЭЖХ.
В результате активность FP3E была слегка увеличена при добавлении ионов Са и Cu, но при добавлении ионов других металлов изменения активности фермента практически не наблюдалось. Таким образом, было подтверждено, что FP3E не является металлоферментом (Фиг. 6).
Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные иллюстративные воплощения, специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, будет понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах, не отступая от технического характера или существенных признаков настоящего изобретения. Следовательно, вышеописанные воплощения считаются иллюстративными, а не ограничивающими. Кроме того, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не подробным описанием, и следует понимать, что все модификации или вариации, полученные из значения и объема настоящего изобретения и его эквивалентов, включены в объем прилагаемой формулы изобретения.
Claims (14)
1. Применение фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для получения аллюлозы.
2. Трансформированный микроорганизм для получения аллюлозы, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
3. Композиция для получения аллюлозы, содержащая фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по п. 1, микроорганизм, экспрессирующий фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или культуру указанного микроорганизма, дополнительно содержащая:
а) (1) крахмал, мальтодекстрин, сахарозу или их комбинацию; (2) фосфат; (3) аллюлозо-6-фосфатфосфатазу; (4) глюкозо-6-фосфатизомеразу; (5) фосфоглюкомутазу или глюкокиназу; и/или (6) α-глюканфосфорилазу, фосфорилазу крахмала, фосфорилазу мальтодекстрина, фосфорилазу сахарозы, α-амилазу, пуллуланазу, изоамилазу, глюкоамилазу или сахаразу; или
б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных ферментов, или культуру указанного микроорганизма.
4. Композиция по п. 3, дополнительно содержащая аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, микроорганизм, экспрессирующий аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, или культуру указанного микроорганизма.
5. Способ получения аллюлозы, включающий: превращение фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат путем взаимодействия фруктозо-6-фосфата с фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразой, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, микроорганизмом, экспрессирующим фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или культурой указанного микроорганизма.
6. Способ по п. 5, дополнительно включающий превращение аллюлозо-6-фосфата в аллюлозу путем взаимодействия аллюлозо-6-фосфата с аллюлозо-6-фосфатфосфатазой, микроорганизмом, экспрессирующим аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, или культурой указанного микроорганизма, после превращения фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат.
7. Способ по п. 5, дополнительно включающий превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат путем взаимодействия глюкозо-6-фосфата с глюкозо-6-фосфатизомеразой, микроорганизмом, экспрессирующим глюкозо-6-фосфатизомеразу, или культурой указанного микроорганизма, перед превращением фруктозо-6-фосфата в аллюлозо-6-фосфат.
8. Способ по п. 7, дополнительно включающий превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат путем взаимодействия глюкозо-1-фосфата с фосфоглюкомутазой, микроорганизмом, экспрессирующим фосфоглюкомутазу, или культурой указанного микроорганизма, перед превращением глюкозо-6-фосфата в фруктозо-6-фосфат.
9. Способ по п. 7, дополнительно включающий превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат путем взаимодействия глюкозы с глюкокиназой, микроорганизмом, экспрессирующим глюкокиназу, или культурой указанного микроорганизма, и фосфатом, перед превращением глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат.
10. Способ по п. 8, дополнительно включающий превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозо-1-фосфат путем взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с фосфатом и α-глюканфосфорилазой, фосфорилазой крахмала, фосфорилазой мальтодекстрина или фосфорилазой сахарозы; микроорганизмом, экспрессирующим α-глюканфосфорилазу, фосфорилазу крахмала, фосфорилазу мальтодекстрина или фосфорилазу сахарозы; или культурой указанного микроорганизма, перед превращением глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат.
11. Способ по п. 9, дополнительно включающий превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозу путем взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с α-амилазой, пуллуланазой, глюкоамилазой, сахаразой или изоамилазой; микроорганизмом, экспрессирующим α-амилазу, пуллуланазу, глюкоамилазу, сахаразу или изоамилазу; или культурой указанного микроорганизма, перед превращением глюкозы в глюкозо-6-фосфат.
12. Способ по любому из пп. 5-11, где взаимодействие осуществляют при pH от 5,0 до 10,0, при температуре от 50°C до 90°C и/или в течение времени от 1 минуты до 24 часов.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20160082543 | 2016-06-30 | ||
| KR10-2016-0082543 | 2016-06-30 | ||
| PCT/KR2017/006985 WO2018004308A2 (ko) | 2016-06-30 | 2017-06-30 | 신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019100788A3 RU2019100788A3 (ru) | 2020-07-30 |
| RU2019100788A RU2019100788A (ru) | 2020-07-30 |
| RU2733427C2 true RU2733427C2 (ru) | 2020-10-01 |
Family
ID=60787012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019100788A RU2733427C2 (ru) | 2016-06-30 | 2017-06-30 | Новая термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза и способ получения аллюлозы с ее использованием |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10907182B2 (ru) |
| EP (1) | EP3480306B1 (ru) |
| JP (1) | JP6817343B2 (ru) |
| KR (2) | KR101966530B1 (ru) |
| CN (1) | CN109563499B (ru) |
| AU (1) | AU2017287764B2 (ru) |
| BR (1) | BR112018077188B1 (ru) |
| CA (1) | CA3027687C (ru) |
| ES (1) | ES2950576T3 (ru) |
| MX (1) | MX2018016114A (ru) |
| PL (1) | PL3480306T3 (ru) |
| RU (1) | RU2733427C2 (ru) |
| WO (1) | WO2018004308A2 (ru) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3480306B1 (en) * | 2016-06-30 | 2023-06-07 | Cj Cheiljedang Corporation | Novel heat-resistant fructose-6-phosphate-3-epimerase and method for producing allulose by using same |
| WO2018039505A1 (en) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia Llc (Ntess) | Novel protic or phosphate-based ionic liquids useful for lignocellulosic processing |
| CN110088277B (zh) * | 2016-12-14 | 2024-10-11 | 博努莫斯有限责任公司 | D-阿洛酮糖的酶法生产 |
| CN108251468A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-07-06 | 南京朗奈生物技术有限公司 | 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺 |
| KR102233375B1 (ko) | 2018-12-11 | 2021-03-31 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 싸이코스-6-인산의 탈인산화 효소, 이를 포함하는 싸이코스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 싸이코스 제조방법 |
| KR102138862B1 (ko) * | 2019-03-08 | 2020-07-30 | 씨제이제일제당 주식회사 | 알룰로스를 생산하는 스태필로코커스 속 미생물 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 |
| KR102256624B1 (ko) * | 2019-03-19 | 2021-05-26 | 주식회사 삼양사 | 인산화당 에피머 효소 |
| KR102080886B1 (ko) * | 2019-05-21 | 2020-02-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 부반응성이 낮은 리불로스-인산 3-에피머화 효소의 모티프 및 이를 포함하는 효소 |
| BR112021024211A2 (pt) * | 2019-05-31 | 2022-03-08 | Bonumose Inc | Produção enzimática de frutose |
| KR102453774B1 (ko) * | 2019-10-28 | 2022-10-12 | 주식회사 삼양사 | 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이의 용도 |
| WO2021086010A1 (ko) * | 2019-10-28 | 2021-05-06 | 주식회사 삼양사 | 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이의 용도 |
| KR102509561B1 (ko) * | 2020-12-21 | 2023-03-14 | 주식회사 삼양사 | 높은 기질 특이성을 갖는 탈인산화 효소 단백질 및 이의 용도 |
| CN114790469B (zh) * | 2021-01-26 | 2024-03-26 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种酶促合成阿洛酮糖的方法 |
| EP4431614A1 (de) | 2023-03-15 | 2024-09-18 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von wässerigen lösungen enthaltend d-psicose oder l-psicose |
| EP4464786A1 (de) | 2023-05-15 | 2024-11-20 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von wässerigen lösungen enthaltend d-psicose oder l-psicose |
| AR132151A1 (es) | 2023-03-15 | 2025-05-28 | Annikki Gmbh | Procedimiento para la preparación de una solución acuosa que contiene d-psicosa |
| EP4520839A2 (de) | 2023-03-15 | 2025-03-12 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend d-psicose |
| EP4464785A1 (de) | 2023-05-15 | 2024-11-20 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von d-talitol, d-tagatose und d-psicose |
| WO2024236043A1 (de) | 2023-05-15 | 2024-11-21 | Annikki Gmbh | Verfahren zur herstellung von d-talitol, d-tagatose und d-psicose |
| KR20250095788A (ko) * | 2023-12-19 | 2025-06-27 | 대상 주식회사 | 항시발현용 신규 프로모터, 이를 포함하는 목적 단백질 발현 시스템 및 이를 이용하여 알룰로스를 제조하는 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10037611A1 (de) * | 2000-08-02 | 2002-02-14 | Degussa | Neue für das rpe-Gen kodierende Nuleotidsequenzen |
| CN101177672A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-14 | 江南大学 | 微生物转化d-果糖制备d-阿洛酮糖的菌种和方法 |
| RU2553537C2 (ru) * | 2008-12-16 | 2015-06-20 | Терранол А/С | Микроорганизм, экспрессирующий ксилозоизомеразу |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100744479B1 (ko) * | 2005-06-01 | 2007-08-01 | 씨제이 주식회사 | 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법 |
| CN102382867A (zh) * | 2010-09-06 | 2012-03-21 | 黄卫东 | 一种胞外酶催化糖合成方法 |
| KR20140080282A (ko) * | 2012-12-20 | 2014-06-30 | 주식회사 삼양제넥스 | Ｄ-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 과당으로부터 사이코스의 제조방법 |
| KR101610911B1 (ko) | 2013-05-09 | 2016-04-08 | 주식회사 삼양사 | L-리불로스 5-인산 4-에피머화 효소를 이용한 과당에서 타가토스 생산 |
| JP6774875B2 (ja) * | 2013-09-03 | 2020-10-28 | ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ | Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用 |
| PL3298127T3 (pl) | 2015-05-22 | 2022-05-30 | Archer Daniels Midland Company | Zastosowanie enzymów epimerazy do konwersji fruktozy do allulozy |
| EP3480306B1 (en) | 2016-06-30 | 2023-06-07 | Cj Cheiljedang Corporation | Novel heat-resistant fructose-6-phosphate-3-epimerase and method for producing allulose by using same |
-
2017
- 2017-06-30 EP EP17820584.5A patent/EP3480306B1/en active Active
- 2017-06-30 BR BR112018077188-0A patent/BR112018077188B1/pt active IP Right Grant
- 2017-06-30 ES ES17820584T patent/ES2950576T3/es active Active
- 2017-06-30 PL PL17820584.5T patent/PL3480306T3/pl unknown
- 2017-06-30 JP JP2018567065A patent/JP6817343B2/ja active Active
- 2017-06-30 CN CN201780041244.6A patent/CN109563499B/zh active Active
- 2017-06-30 WO PCT/KR2017/006985 patent/WO2018004308A2/ko unknown
- 2017-06-30 AU AU2017287764A patent/AU2017287764B2/en active Active
- 2017-06-30 CA CA3027687A patent/CA3027687C/en active Active
- 2017-06-30 KR KR1020170083757A patent/KR101966530B1/ko active Active
- 2017-06-30 US US16/314,067 patent/US10907182B2/en active Active
- 2017-06-30 MX MX2018016114A patent/MX2018016114A/es unknown
- 2017-06-30 RU RU2019100788A patent/RU2733427C2/ru active
-
2019
- 2019-03-29 KR KR1020190037301A patent/KR102042044B1/ko active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10037611A1 (de) * | 2000-08-02 | 2002-02-14 | Degussa | Neue für das rpe-Gen kodierende Nuleotidsequenzen |
| CN101177672A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-14 | 江南大学 | 微生物转化d-果糖制备d-阿洛酮糖的菌种和方法 |
| RU2553537C2 (ru) * | 2008-12-16 | 2015-06-20 | Терранол А/С | Микроорганизм, экспрессирующий ксилозоизомеразу |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NCBI GENBANK accession no. * |
| NCBI GENBANK accession no. ACM23082.1, 30.01.2014. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112018077188B1 (pt) | 2022-09-06 |
| CN109563499B (zh) | 2022-08-12 |
| RU2019100788A3 (ru) | 2020-07-30 |
| CA3027687C (en) | 2022-07-05 |
| AU2017287764A1 (en) | 2018-12-20 |
| KR20180004023A (ko) | 2018-01-10 |
| US10907182B2 (en) | 2021-02-02 |
| KR101966530B1 (ko) | 2019-04-08 |
| KR20190038775A (ko) | 2019-04-09 |
| MX2018016114A (es) | 2019-10-14 |
| JP2019522477A (ja) | 2019-08-15 |
| BR112018077188A2 (pt) | 2019-06-25 |
| EP3480306B1 (en) | 2023-06-07 |
| CA3027687A1 (en) | 2018-01-04 |
| EP3480306A4 (en) | 2020-03-11 |
| JP6817343B2 (ja) | 2021-01-20 |
| US20190225997A1 (en) | 2019-07-25 |
| WO2018004308A3 (ko) | 2018-02-22 |
| EP3480306A2 (en) | 2019-05-08 |
| CN109563499A (zh) | 2019-04-02 |
| AU2017287764B2 (en) | 2021-01-21 |
| WO2018004308A2 (ko) | 2018-01-04 |
| ES2950576T3 (es) | 2023-10-11 |
| RU2019100788A (ru) | 2020-07-30 |
| PL3480306T3 (pl) | 2023-11-06 |
| KR102042044B1 (ko) | 2019-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2733427C2 (ru) | Новая термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза и способ получения аллюлозы с ее использованием | |
| EP3480304B1 (en) | A novel thermostable tagatose-6-phosphate phosphatase and a method for producing tagatose using the same | |
| RU2727903C1 (ru) | Новая d-псикозо-3-эпимераза и способ получения d-псикозы с ее использованием | |
| KR20180004025A (ko) | 고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법 | |
| KR102063908B1 (ko) | 신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 | |
| KR20190068470A (ko) | 신규한 사이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 | |
| US20210261939A1 (en) | A Novel D-Psicose 3-Epimerase and Method for Producing D-Psicose Using the Same | |
| KR102055875B1 (ko) | 신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 | |
| EP4053274A1 (en) | Fructose-6-phosphate 3-epimerase and use thereof | |
| US20220372535A1 (en) | Fructose-6-phosphate 3-epimerase and use thereof |