JP2019522477A - 新規な耐熱性のフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼ及びそれを用いたアルロース製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
フルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼの遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換微生物の作製
新規な耐熱性のフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼを見出すために、好熱性微生物であるサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)から遺伝子を分離し、組換え発現ベクター及び形質転換微生物を作製した。
組換え酵素の作製
組換え酵素(以下、FP3E)を作製するために、LB液体培地5mlを含む培養チューブにE.coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3eを接種し、600nmでの吸光度が2.0になるまで37℃の振盪培養器で種菌培養を行った。その後、LB液体培地を含む培養フラスコに種菌培養を行った培養液を接種して本培養を行った。その後、600nmでの吸光度が2.0になったら、1mM IPTGを添加してFP3Eの発現産生を誘導した。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度200rpm、温度37℃で行った。培養終了後、培養液を8,000×g、4℃で20分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を50mM Tris−HCl(pH7.0)緩衝液で2回洗浄し、同じ緩衝液に懸濁して超音波細胞破砕機で細胞を破砕した。細胞破砕物を13,000×g、4℃で20分間遠心分離して上清のみ回収し、His−tagアフィニティークロマトグラフィーを用いて前記上清からFP3Eを精製した。精製した組換え酵素液を50mM Tris−HCl(pH7.0)緩衝液で透析して酵素の特性分析に用いた。
FP3Eの活性確認
FP3Eのフルクトース−6−リン酸からアルロース−6−リン酸への変換活性の分析のために、50mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液に50mMフルクトース−6−リン酸を懸濁し、それに0.1unit/mlの精製したFP3Eを添加して70℃で1時間反応させた。
pH、温度、金属イオン添加によるFP3Eの活性確認
4−1.pHによる活性確認
FP3Eに対するpHの影響を調査するために、様々なpHの50mM緩衝液(pH4.0〜7.0のクエン酸ナトリウム,pH6.0〜8.0のリン酸カリウム,pH7.0〜9.0のTris−HCl)に懸濁された50mMフルクトース−6−リン酸に0.1unit/mlの精製されたFP3Eを添加して70℃で10分間反応させた。その後、実施例3と同じ条件でフィターゼと反応させ、次いでHPLCを用いてアルロースを定量分析した。
pH、温度、金属イオン添加によるFP3Eの活性確認
4−1.pHによる活性確認
FP3Eに対するpHの影響を調査するために、様々なpHの50mM緩衝液(pH4.0〜7.0のクエン酸ナトリウム,pH6.0〜8.0のリン酸カリウム,pH7.0〜9.0のTris−HCl)に懸濁された50mMフルクトース−6−リン酸に0.1unit/mlの精製されたFP3Eを添加して70℃で10分間反応させた。その後、実施例3と同じ条件でフィターゼと反応させ、次いでHPLCを用いてアルロースを定量分析した。
金属イオン添加がFP3Eの活性に及ぼす影響を調査するために、50mM Tris−HCl(pH7.0)緩衝液に懸濁された50mMフルクトース−6−リン酸に各金属イオン(NiSO4、CuSO4、MnSO4、CaCl2、ZnSO4、MgSO4、MgCl2、FeSO4、NaCl、LiCl及びKCl)を最終濃度0.5mMで添加した。次に、金属イオンの除去のために、10mM EDTAで処理して透析したFP3Eを0.1unit/mlで添加して70℃で10分間反応させた。その後、実施例3と同じ条件でフィターゼと反応させ、次いでHPLCを用いてアルロースを定量分析した。
Claims (15)
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼ(fructose-6-phosphate-3-epimerase)。
- 請求項1に記載のフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼをコードする核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含む形質転換体。
- 請求項1に記載のフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むアルロース(allulose)生産用組成物。
- 前記組成物は、アルロース−6−リン酸ホスファターゼ(allulose-6-phosphate phosphatase)、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物をさらに含む、請求項4に記載のアルロース生産用組成物。
- 前記アルロース生産用組成物は、
(a)(i)デンプン、マルトデキストリン、スクロースもしくはその組み合わせ、(ii)ホスフェート(phosphate)、(iii)アルロース−6−リン酸ホスファターゼ、(iv)グルコース−6−リン酸−イソメラーゼ、(v)ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及び(vi)α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は
(b)前記項目(a)の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物をさらに含む、請求項4に記載のアルロース生産用組成物。 - フルクトース−6−リン酸(fructose-6-phosphate)に配列番号1のアミノ酸配列からなるフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、フルクトース−6−リン酸をアルロース−6−リン酸(allulose-6-phosphate)に変換するステップを含むアルロース製造方法。
- 前記方法は、前記フルクトース−6−リン酸をアルロース−6−リン酸に変換するステップの後に、アルロース−6−リン酸にアルロース−6−リン酸ホスファターゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記アルロース−6−リン酸をアルロースに変換するステップをさらに含む、請求項7に記載のアルロース製造方法。
- 前記方法は、前記フルクトース−6−リン酸をアルロース−6−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−6−リン酸(glucose-6-phosphate)にグルコース−6−リン酸−イソメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−6−リン酸をフルクトース−6−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項7に記載のアルロース製造方法。
- 前記方法は、前記グルコース−6−リン酸をフルクトース−6−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−1−リン酸(glucose-1-phosphate)にホスホグルコムターゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−1−リン酸をグルコース−6−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項9に記載のアルロース製造方法。
- 前記方法は、前記グルコース−6−リン酸をフルクトース−6−リン酸に変換するステップの前に、グルコース(glucose)にグルコキナーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記グルコースをグルコース−6−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項9に記載のアルロース製造方法。
- 前記方法は、前記グルコース−1−リン酸をグルコース−6−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコース−1−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項10に記載のアルロース製造方法。
- 前記方法は、前記グルコースをグルコース−6−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼもしくはイソアミラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項11に記載のアルロース製造方法。
- 前記接触は、pH5.0〜10.0で、温度50℃〜90℃で、及び/又は1分〜24時間行う、請求項7〜13のいずれか一項に記載のアルロース製造方法。
- デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせ、及びホスフェートに、(a)アルロース−6−リン酸ホスファターゼ、配列番号1のアミノ酸配列からなるフルクトース−6−リン酸−3−エピメラーゼ、グルコース−6−リン酸−イソメラーゼ、ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及びα−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は(b)前記項目(a)の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物を接触させるステップを含むアルロース製造方法。
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