JP6824298B2 - タガトース−６−リン酸特異的で新規な耐熱性のホスファターゼ及びそれを用いたタガトース製造方法 - Google Patents

タガトース−６−リン酸特異的で新規な耐熱性のホスファターゼ及びそれを用いたタガトース製造方法 Download PDF

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Description

本出願は、タガトース−６−リン酸ホスファターゼ及びそれを用いたタガトース製造方法に関する。
従来、単一酵素変換反応を用いたタガトース生産方法として、アラビノースイソメラーゼ（L-arabinose isomerase）を用いてガラクトース（D-galactose）からタガトース（D-tagatose）を製造する方法、及びＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase）を用いてフルクトース（D-fructose）からタガトースを製造する方法が報告されているが、このような単一酵素変換反応は基質と産物間に一定レベルの反応平衡（reaction equilibrium）が存在する（産物／基質＝約２０％〜５０％）。よって、前記単一酵素変換反応を用いて高純度のタガトースを製造する場合、反応結果物から高濃度の基質を分離して除去する追加精製工程が必要である。
一方、複合酵素変換反応を用いたタガトース生産方法として、ヘキソキナーゼ（Hexokinase, EC 2.7.1.1）を用いてフルクトースとＡＴＰ（Adenosine triphosphate）からフルクトース−６−リン酸（D-fructose-6-phosphate）を生産するステップと、フルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼ活性を有するフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ（D-fructose-1, 6-bisphosphate-aldolase, EC 4.1.2.13）を用いて前記フルクトース−６−リン酸をタガトース−６−リン酸（D-tagatose-6-phosphate）に変換するステップと、ホスファターゼ（phosphatase）としてフィターゼ（phytase）を用いてタガトース−６−リン酸からタガトースを生産するステップとを含む製造方法が報告されている（特許文献１及び２）。しかし、前記複合酵素反応はリン酸基の供与化合物として高価なＡＴＰが必要であり、アデニンヌクレオチド（adenine nucleotides）であるＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰは物理化学的（熱やｐＨなど）安定性が高くないため工程適用に限界があり、フィターゼは基質が多様なため不可逆的反応を誘導するので、タガトースの製造収率を高めるのに限界がある。
韓国登録特許第１０−１６２７９２１号公報 韓国登録特許第１０−１６２０９０４号公報
J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 Sambrook et al., supra, 11.7-11.8
本発明者らは、経済的原料を用いてタガトースを高い収率で生産する方法を開発すべく鋭意努力した。その結果、経済的原料であるスクロース、デンプン又はマルトデキストリンからグルコース（glucose）又はグルコース−１−リン酸（glucose-1-phosphate）、グルコース−６−リン酸（glucose-6-phosphate）及びフルクトース−６−リン酸への変換を経てタガトース−６−リン酸（tagatose-6-phosphate）を生産すると、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼが不可逆反応経路でタガトース−６−リン酸の脱リン酸化を行うので、タガトース生産経路に関与する複数の酵素を同時に使用可能な同時酵素反応（one-pot enzymatic conversions）によりタガトースを生産することができ、タガトースへの変換率を著しく向上させることを確認し、本出願を完成するに至った。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸ホスファターゼ（tagatose-6-phosphate phosphatase）を提供することを目的とする。
また、本出願は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼをコードする核酸を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼをコードする核酸を含む形質転換体を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼ、前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物、又は前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物の培養物を含むタガトース生産用組成物を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼを用いたタガトース製造方法を提供することを目的とする。
本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼは、耐熱性があるので産業的にタガトースを生産することができ、不可逆反応経路により高濃度でタガトースを生産することができ、経済的原料であるスクロース、デンプン又はマルトデキストリンを原料として用いて同時酵素反応によりタガトースを生産することができる。よって、高純度のタガトースを製造するための工程を単純化することができるので、製造工程が簡単かつ経済的であるという利点がある。
デンプン（例えば、マルトデキストリン）、スクロース又はグルコースからタガトースを製造する反応経路、及びそれに関与する酵素を示す模式図である。 本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼ（Ｅ：Ｔ６ＰＰ）の分子量をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した結果を示す図である。Ｍはタンパク質のサイズマーカー（size marker）であり、ＣＥは形質転換体破砕上清である。 本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼのタガトース−６−リン酸からタガトースへの変換活性を示す図である。 本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼの緩衝液及びｐＨによる活性の変化を示す図である。 本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼの温度による活性の変化を示す図である。 本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼの金属イオン添加による活性の変化を示す図である。 本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼのタガトース−６−リン酸に対する基質特異性を示す図である。
以下、本出願について具体的に説明する。一方、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
本出願の目的を達成するために、本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸ホスファターゼ（tagatose-6-phosphate phosphatase）を提供する。
本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼには、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有するポリペプチドが含まれてもよい。例えば、前記相同性を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
また、本出願の配列番号１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸ホスファターゼに対応する活性を有するタンパク質であれば、配列番号１のアミノ酸配列の前後の無意味な配列追加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質も本出願に含まれる。
さらに、これらに限定されるものではないが、前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼは、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよく、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよい。コドンの縮退（codon degeneracy）により配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれと相同性を有するタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドも本出願に含まれることは言うまでもない。
前記「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。本出願において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％相同性」と表される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１、２）で決定される。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。例えば、このような条件は非特許文献１に具体的に記載されている。
本出願における前記ストリンジェントな条件は、相同性を確認するために調節されてもよい。ポリヌクレオチド間の相同性を確認するために、５５℃のＴｍ値に対応する、低ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件が用いられてもよい。例えば、５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク及び無ホルムアミド、又は３０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳの条件が用いられてもよい。温和なストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は高いＴｍ値に対応し、例えば５Ｘ又は６ＸＳＳＣを有する４０％ホルムアミドが用いられてもよい。高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は最も高いＴｍ値に対応し、例えば５０％ホルムアミド、５Ｘ又は６ＸＳＳＣ条件が用いられてもよい。しかし、前記例に限定されるものではない。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられる。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似した核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップを含むハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であるが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きいほど、その配列を有するポリヌクレオチドのハイブリッドに対するＴｍ値はさらに大きくなる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍ値に対応する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に減少する。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドにおいて、Ｔｍ値の計算式は公知である（非特許文献３参照）。より短いポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチ位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（非特許文献４参照）。
具体的には、ポリヌクレオチドは、５００ｍＭ塩より低く、少なくとも３７℃のハイブリダイゼーションステップ、及び少なくとも６３℃の２ＸＳＳＰＥにおける洗浄ステップを含むハイブリダイゼーション条件を用いて検知することができる。前記ハイブリダイゼーション条件は、２００ｍＭ塩より低く、少なくとも３７℃のハイブリダイゼーションステップを含んでもよい。あるいは、前記ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄ステップの両方において、６３℃及び２ＸＳＳＰＥを含んでもよい。
ハイブリダイゼーション核酸の長さは、例えば少なくとも約１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチドであってもよい。また、当業者であれば、温度及び洗浄溶液の塩濃度をプローブの長さなどの要素により必要に応じて調節することができる。
本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼは、サーモトガ（Thermotoga）属由来の酵素であってもよく、具体的にはサーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）由来の酵素であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願の他の態様は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼをコードする核酸を提供する。
本出願のさらに他の態様は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼをコードする核酸を含む形質転換体を提供する。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記核酸がコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換された核酸は、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含むものである。また、前記核酸は、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記核酸は、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記核酸は、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記核酸に作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記核酸は、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的タンパク質をコードする核酸の転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を用いることが好ましく、例えば大腸菌を用いてもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼ、前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物、又は前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物の培養物を含むタガトース生産用組成物を提供する。
前記タガトース生産用組成物は、本出願のタガトース製造経路（図１参照）に関与する酵素、前記タガトース製造経路に関与する酵素を発現する微生物、又は前記タガトース製造経路に関与する酵素を発現する微生物の培養物をさらに含んでもよい。しかし、これらは例示的なものであり、本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼを用いてタガトースを生産できるものであれば、本出願のタガトース生産用組成物に含まれる酵素やタガトース生産に用いられる基質は限定されない。
本出願のタガトース生産用組成物は、（ａ）（ｉ）デンプン、マルトデキストリン、スクロースもしくはその組み合わせ、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸又はタガトース−６−リン酸、（ｉｉ）ホスフェート（phosphate）、（ｉｉｉ）フルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼ、（ｉｖ）グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、（ｖ）ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及び／又は（ｖｉ）α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物をさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願のデンプン／マルトデキストリンホスホリラーゼ（starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1）及びα−グルカンホスホリラーゼは、ホスフェート（phosphate）をグルコースにリン酸化転移させてデンプン又はマルトデキストリンからグルコース−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のスクロースホスホリラーゼ（sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7）は、ホスフェートをグルコースにリン酸化転移させてスクロースからグルコース−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のデンプン液化酵素であるα−アミラーゼ（α-amylase, EC 3.2.1.1）、プルラナーゼ（pullulanase, EC 3.2.1.41）、グルコアミラーゼ（glucoamylase, EC 3.2.1.3）及びイソアミラーゼ（isoamylase）は、デンプン又はマルトデキストリンをグルコースに変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のスクラーゼ（sucrase, EC 3.2.1.26）は、スクロースをグルコースに変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のホスホグルコムターゼ（phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2）は、グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。グルコキナーゼ（glucokinase）は、グルコースにリン酸を転移させてグルコース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。具体的には、前記グルコキナーゼは、ポリリン酸依存性グルコキナーゼであってもよく、より具体的には、アミノ酸配列番号５及び塩基配列番号７のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼ、又はアミノ酸配列番号６及び塩基配列番号８のＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼであってもよい。本出願のグルコース−６−リン酸−イソメラーゼは、グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のフルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼは、フルクトース−６−リン酸をタガトース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。
本出願のタガトース生産用組成物は、Ｍｇ、Ｍｎ及びＺｎからなる群から選択される金属のイオン又は塩をさらに含んでもよい。具体的には、本出願の金属の塩は、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４からなる群から選択される金属の塩であってもよい。
本出願のさらに他の態様は、タガトース−６−リン酸に本出願のタガトース−６−リン酸ホスファターゼ、前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物、又は前記タガトース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、タガトース−６−リン酸をタガトースに変換するステップを含むタガトース製造方法を提供する。
本出願の製造方法は、タガトース−６−リン酸をタガトースに変換するステップの前に、フルクトース−６−リン酸（fructose-6-phosphate）にフルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼ、前記フルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼを発現する微生物、又は前記フルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記フルクトース−６−リン酸をタガトース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
また、前記製造方法は、本出願のフルクトース−６−リン酸をタガトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−６−リン酸（Glucose-6-phosphate）にグルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、前記グルコース−６−リン酸−イソメラーゼを発現する微生物、又は前記グルコース−６−リン酸−イソメラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
さらに、前記製造方法は、本出願のグルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−１−リン酸（Glucose-1-phosphate）にホスホグルコムターゼ、前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物、又は前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
さらに、前記製造方法は、本出願のグルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース（Glucose）にグルコキナーゼ、前記グルコキナーゼを発現する微生物、又は前記グルコキナーゼを発現する微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
さらに、前記製造方法は、本出願のグルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼ、前記α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼを発現する微生物、又は前記α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼを発現する微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコース−１−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
さらに、前記製造方法は、本出願のグルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼ又はイソアミラーゼを接触させるか、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼ又はイソアミラーゼを発現する微生物を接触させるか、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼ又はイソアミラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコースに変換するステップをさらに含んでもよい。
前記製造方法は、グルコースに４−α−グルカノトランスフェラーゼ、前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを発現する微生物、又は前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコースをデンプン、マルトデキストリン又はスクロースに変換するステップをさらに含んでもよい。
前記製造方法において、前記「接触」は、ｐＨ５．０〜８．０で、温度６０℃〜９０℃で、及び／又は１分〜２４時間行うことができる。具体的には、本出願の接触は、ｐＨ６．０〜８．０、ｐＨ６．５〜８．０、又はｐＨ６．５〜７．５で行うことができる。また、本出願の接触は、６０℃〜９０℃、７０℃〜９０℃、又は７５℃〜８５℃で行うことができる。さらに、本出願の接触は、１分〜１２時間、１分〜６時間、１分〜３時間、１分〜１時間、５分〜２４時間、５分〜１２時間、５分〜６時間、５分〜３時間、５分〜１時間、１０分〜２４時間、１０分〜１２時間、１０分〜６時間、１０分〜３時間、又は１０分〜１時間行うことができる。
また、本出願の接触は、Ｍｇ、Ｍｎ及びＺｎからなる群から選択される金属のイオン又は塩の存在下で行うことができる。具体的には、本出願の金属の塩は、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４からなる群から選択される金属の塩であってもよい。
本出願のさらに他の態様は、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせ、及びホスフェートに、（ａ）タガトース−６−リン酸ホスファターゼ、フルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼ、グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及びα−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物を接触させるステップを含むタガトース製造方法を提供する。
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
タガトース−６−リン酸ホスファターゼの遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換微生物の作製
新規な耐熱性のタガトース−６−リン酸ホスファターゼ（D-tagatose-6-phosphate phosphatase）を見出すために、好熱性微生物であるサーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）から遺伝子を分離し、組換え発現ベクター及び形質転換微生物を作製した。
具体的には、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているサーモトガ・ネアポリタナ遺伝子配列を対象にタガトース−６−リン酸ホスファターゼと予想される遺伝子ｔ６ｐｐを選択し、そのアミノ酸配列（配列番号１）及び塩基配列（配列番号２）情報に基づいて正方向プライマー（forward primer, 配列番号３）及び逆方向プライマー（reverse primer, 配列番号４）を設計して合成した。前記合成したプライマーを用いて、サーモトガ・ネアポリタナ染色体ＤＮＡ（genomic DNA）を鋳型とし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び６８℃で２分間の重合で行い、前記反応を２５回繰り返した。制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを用いて、大腸菌発現用プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（Novagen社）に挿入し、組換え発現ベクターを作製してｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｔｎ＿ｔ６ｐｐと命名した。通常の形質転換方法（参照：Sambrook et al. 1989）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に前記ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｔｎ＿ｔ６ｐｐを形質転換し、配列番号２の塩基配列を含む組換えベクターで形質転換された微生物を作製し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｔ６ｐｐと命名した。
前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｔ６ｐｐ菌株をブダペスト条約に基づいて２０１６年６月２３日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託番号ＫＣＣＭ１１８５０Ｐとして寄託した。
組換え酵素の作製
組換えタガトースホスファターゼ（以下、Ｔ６ＰＰ）を作製するために、ＬＢ液体培地５ｍｌを含む培養チューブにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｔ６ｐｐを接種し、６００ｎｍでの吸光度が２．０になるまで３７℃の振盪培養器で種菌培養を行った。その後、ＬＢ液体培地を含む培養フラスコに種菌培養を行った培養液を接種して本培養を行い、６００ｎｍでの吸光度が２．０になったら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＴ６ＰＰの発現生産を誘導した。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度２００ｒｐｍ、温度３７℃で行った。培養終了後、培養液を８，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌体を回収した。前記回収した菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液で２回洗浄し、同じ緩衝液に懸濁して超音波細胞破砕機で細胞を破砕した。細胞破砕物を１３，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して上清のみ回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて前記上清からＴ６ＰＰを精製した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分子量を確認した結果、前記精製したＴ６ＰＰの分子量は約２９ｋＤａであった（図２ａにＥで示す）。
Ｔ６ＰＰのタガトース変換活性の確認
Ｔ６ＰＰのタガトース−６−リン酸からタガトースへの変換活性の分析のために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に５０ｍＭタガトース−６−リン酸を懸濁し、それに０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製したＴ６ＰＰと１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加して７０℃で１０分間反応させ、その後ＨＰＬＣを用いて反応結果物を分析した。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＸ−８７Ｈ（Bio-Rad社）カラムを用いて、６０℃で５ｍＭ硫酸を移動相として０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して行い、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒでタガトースとタガトース−６−リン酸を検出した。
その結果、Ｔ６ＰＰの反応結果物からタガトースが生成されることが確認された（図３）。
ｐＨ、温度及び金属イオン添加によるＴ６ＰＰの活性確認
４−１．ｐＨによる活性確認
Ｔ６ＰＰに対するｐＨの影響を調査するために、様々なｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０のクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜７．０の酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０のリン酸カリウム、ｐＨ７．０〜９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ）に懸濁された５０ｍＭタガトース−６−リン酸に０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製されたＴ６ＰＰを添加して７０℃で１０分間反応させた。その後、実施例３と同じ分析条件でＨＰＬＣを用いてタガトースを定量分析した。
その結果、Ｔ６ＰＰは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（特に、ｐＨ７．０）で最大活性を示し、ｐＨ５．０〜８．０にわたる非常に広範囲で最大活性の８０％以上の活性を示した（図４）。
４−２．温度による活性確認
温度によるＴ６ＰＰの活性分析のために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に懸濁された５０ｍＭタガトース−６−リン酸に０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製されたＴ６ＰＰを添加して４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃で１０分間反応させた。その後、実施例３と同じ分析条件でＨＰＬＣを用いてタガトースを定量分析した。
その結果、Ｔ６ＰＰは、７０℃〜９０℃で高い活性を示し、特に８０℃で最大活性を示した（図５）。
４−３．金属イオン添加による活性確認
金属イオン添加がＴ６ＰＰの活性に及ぼす影響を調査するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に懸濁された５０ｍＭタガトース−６−リン酸に各金属イオン（ＮｉＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣｏＳＯ４及びＡＰＯ）を最終濃度０．５ｍＭで添加した。次に、金属イオンの除去のために、１０ｍＭ ＥＤＴＡで処理して透析したＴ６ＰＰを０．１ｕｎｉｔ／ｍｌで添加して７０℃で１０分間反応させた。その後、実施例３と同じ分析条件でＨＰＬＣを用いてタガトースを定量分析した。
その結果、Ｔ６ＰＰは、Ｍｇイオンを添加すると活性が最も増加し、ＭｎイオンやＺｎイオンを添加しても活性が増加することが確認された（図６）。
Ｔ６ＰＰの基質特異性の分析
Ｔ６ＰＰがタガトース−６−リン酸に対して基質特異性を有するか否かを確認するために、様々なリン酸化糖に対するＴ６ＰＰの活性を分析した。基質として５０ｍＭのグルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸及びタガトース−６−リン酸をそれぞれ用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液及び１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製されたＴ６ＰＰを添加して７０℃で１時間反応させ、その後実施例３と同じ分析条件でＨＰＬＣを用いて各糖及びリン酸化糖を定量分析した。
その結果、Ｔ６ＰＰは、タガトース−６−リン酸に対してのみ脱リン酸活性を有することが確認された（図７）。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Figure 0006824298

Claims (12)

  1. タガトースを製造するための配列番号１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸ホスファターゼ（tagatose-6-phosphate phosphatase）の使用であって、該タガトース−６−リン酸ホスファターゼの基質がタガトース−６−リン酸である、使用。
  2. (i) 配列番号１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸ホスファターゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物、および
    (ii) タガトース−６−リン酸
    を含むタガトース生産用組成物であって、該タガトース−６−リン酸ホスファターゼの基質がタガトース−６−リン酸であるタガトース生産用組成物。
  3. 該タガトース生産用組成物は、
    （ａ）（ｉ）デンプン、マルトデキストリン、スクロースもしくはその組み合わせ、（ｉｉ）ホスフェート（phosphate）、（ｉｉｉ）フルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼ、（ｉｖ）グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、（ｖ）ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及び（ｖｉ）α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は
    （ｂ）該項目（ａ）の酵素の少なくとも１つを発現する微生物、もしくは該微生物の培養物をさらに含む、請求項２に記載のタガトース生産用組成物。
  4. タガトース−６−リン酸に配列番号１のアミノ酸配列からなるタガトース−６−リン酸ホスファターゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物を接触させることにより、タガトース−６−リン酸をタガトースに変換するステップを含むタガトース製造方法。
  5. 該方法は、タガトース−６−リン酸をタガトースに変換するステップの前に、フルクトース−６−リン酸（fructose-6-phosphate）にフルクトース−６−リン酸−４−エピメラーゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物を接触させることにより、該フルクトース−６−リン酸をタガトース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項４に記載のタガトース製造方法。
  6. 該方法は、該フルクトース−６−リン酸をタガトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−６−リン酸（Glucose-6-phosphate）にグルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物を接触させることにより、該グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項５に記載のタガトース製造方法。
  7. 該方法は、該グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−１−リン酸（Glucose-1-phosphate）にホスホグルコムターゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物を接触させることにより、該グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項６に記載のタガトース製造方法。
  8. 該方法は、該グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース（Glucose）にグルコキナーゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、該グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項６に記載のタガトース製造方法。
  9. 該方法は、該グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、該デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコース−１−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項７に記載のタガトース製造方法。
  10. 該方法は、該グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼもしくはイソアミラーゼ、それを発現する微生物、又は該微生物の培養物を接触させることにより、該デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項８に記載のタガトース製造方法。
  11. 該接触は、ｐＨ５．０〜８．０で、温度６０℃〜９０℃で、及び／又は１分〜２４時間行う、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のタガトース製造方法。
  12. 該接触は、Ｍｇ、Ｍｎ及びＺｎからなる群から選択される金属のイオン又は塩の存在下で行う、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のタガトースの製造方法。
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