CN105586288B - 一株高效降解琼胶多糖的海洋杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋杆菌G4，该菌株为Marinobacter adhaerens，保藏编号：CGMCC No.11016。该菌株具有稳定高产β‑琼胶酶的能力，能够高效降解琼胶多糖，生成新琼四糖。经过48h驯化培养后的菌株G4菌液，其上清液的酶活可达323.48U/mL。本发明同时提供了利用海洋杆菌G4制备β‑琼胶酶粗酶的方法，该方法具有快速、简便的特点。另外，本发明还提供了一种利用海洋杆菌G4产β‑琼胶酶粗酶制备新琼四糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种能够高效降解琼胶多糖的海洋杆菌属细菌。
背景技术
琼胶是江蓠、石花菜等大型经济红藻中的主要组成成分，被广泛应用于生化、临床、医药和食品等领域。但琼胶(多糖)需要特异性酶进行降解的特性成为阻碍大型经济海藻进一步高值化和能源化利用的瓶颈。
琼胶酶是一类可特异性降解琼胶多糖的酶，目前已发现的琼胶酶根据其酶解糖苷键的不同，主要分为α-琼胶酶(作用位点为α-1,3糖苷键)和β-琼胶酶(作用位点为β-1,4糖苷键)两类。根据琼胶酶序列和功能分析结果可将其分为六大类glycosidic hydrolase(GH)family，分别为GH16、GH50、GH86、GH96、GH117和GH118.其中GH96和GH117类琼胶酶为α-琼胶酶，其酶解产物为琼胶四糖、琼胶六糖或D-galactose和3,6-anhydro-L-galactose；其它类琼胶酶皆为β-琼胶酶，其酶解产物为新琼十糖、新琼八糖、新琼六糖、新琼四糖和新琼二糖。不同微生物的琼胶酶酶解产生的琼胶寡糖不同，有的是单一的寡糖，有的则是两种寡糖的混合物。
目前糖生物学及糖化学领域的研究表明海藻低聚糖具有许多良好的生物学活性，在新药和保健品开发等领域具有广泛的应用价值。在海藻低聚糖的制备方面，琼胶低聚糖的特异性酶降解制备法因效率高、专一性强、反应条件温和作用时间短等优势成为近年来的主要研究方向，但由于特异性琼胶酶目前仍存在产量低、分离难度大、低聚糖产生量低等问题，使其在工业生产中的应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效降解琼胶多糖的海洋杆菌，以及利用该菌株制备琼胶酶和琼胶寡糖的方法。
本发明提供一株能够高效降解琼胶多糖的海洋杆菌菌株G4，该菌株为Marinobacter adhaerens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.11016，保藏日期：2015年6月24日。
该海洋杆菌筛选自富含琼胶的大型野生海藻藻体，依次经过筛选源(藻体)的富集培养、菌群的驯化培养、单菌落的分离步骤，以及菌株的反复分离纯化步骤后获得。该海洋杆菌为革兰氏阴性，细胞外部形态呈短杆状(图1)，其16SrDNA序列见序列表1，图2为根据16SrDNA序列构建的海洋杆菌G4及其相关种的系统发育树。该菌株具有稳定高产β-琼胶酶的能力，能够高效降解琼胶多糖，生成新琼四糖。菌株在2216E固体培养基上培养48h后即可在琼脂平板上形成明显凹陷，用卢戈氏碘液对琼脂平板染色，可清晰反衬出凹陷的浅色或无色的溶解圈或液化圈(图3)。
本发明还提供一种利用所述海洋杆菌G4制备β-琼胶酶粗酶的方法。具体如下：
(1)将活化的海洋杆菌G4接种至添加有微生物生长所必需的碳源和氮源的海水中培养数天；
(2)收集菌液，离心后取上清液，采用(NH4)2SO4盐析沉淀法提取胞外蛋白，为使蛋白充分沉淀，可将上清液低温静置过夜后再离心收集蛋白沉淀；
(3)将获得的蛋白沉淀用中性缓冲液复溶，即获得含有β-琼胶酶的粗酶液。
为了提高细菌生物量，获得更好的培养效果，上述步骤(1)中所述添加有微生物生长所必需的碳源和氮源的海水优选2216E海水培养基；进一步地，培养基中可含有0.07％～0.15％(w/v)的琼脂，琼脂可起到诱导作用，在一定程度上提高产酶量。另外，上述步骤(1)中的培养温度为25～35℃，培养方式优选振荡培养，培养时间至少为48h。
上述步骤(2)中用于沉淀胞外蛋白的所述(NH4)2SO4的饱和度为65～80％。
上述步骤(3)中用于蛋白沉淀复溶的中性缓冲液优选pH6～8的PBS磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
为了获得进一步浓缩的粗酶液，同时充分去除溶液中的(NH4)2SO4以提高酶活性，所述β-琼胶酶粗酶的制备方法还包括后续步骤(4)：使用截留分子量≥10KD的超滤离心管对由上述步骤(3)获得的粗酶液进行离心浓缩。优选采用型号为Ultra-15的超滤离心管(截留分子量为10KD)进行离心浓缩，离心浓缩时的离心力为4000～5000g。
上述步骤(2)或步骤(3)获得的粗酶液可通过低温冷冻干燥处理形成蛋白粉末，以便于使用或冻存。
本发明还提供一种利用所述海洋杆菌G4产β-琼胶酶粗酶制备新琼四糖的方法。具体如下：(1)将β-琼胶酶粗酶和琼脂底物加入pH6～8的磷酸盐缓冲液中，30～40℃下恒温反应至少24h；(2)加入适量体积比为25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，以去除反应后溶液中残留的蛋白质；(3)将溶液离心至液面出现分层，吸取最上层清液，加入乙醇以促使寡糖产物沉淀，最后离心收集沉淀。μm
上述步骤(3)中，用于促使寡糖沉淀的乙醇在上清液中的终浓度以70％～90％(v/v)为宜，最后离心收集沉淀时的离心力为10000g。
本发明的有益效果在于：提供了一株海洋杆菌Marinobacter adhaerens CGMCCNo.11016，该菌株具有稳定高产β-琼胶酶的能力，能够高效降解琼胶多糖，生成新琼四糖；经过48h驯化培养后的菌株G4菌液，其上清液的酶活可达323.48U/mL。通过所述海洋杆菌G4可快速、简便地制备β-琼胶酶粗酶，并且利用获得β-琼胶酶粗酶可快速、专一地制备新琼四糖。
附图说明：
图1海洋杆菌G4经革兰氏染色后的光镜形态观察图。
图2根据16SrDNA序列构建的海洋杆菌G4及其相关种的系统发育树示意图。
图3琼脂平板上因海洋杆菌G4的降解作用而形成的凹陷溶解圈或液化圈。
图4海洋杆菌G4胞外蛋白的SDS-PAGE电泳及Agarase activity staining酶谱分析图，图中泳道1为Marker(分子量：14.4～97.4KD)，泳道2为菌株G4胞外蛋白的SDS-PAGE电泳结果，泳道3为琼脂平板Agarase activity staining分析结果。
图5β-琼胶酶粗酶不同处理时间的寡糖产物TLC分析图，图中泳道A、B、C分别为新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖，泳道1、2、3分别为酶解6、12、24h后的寡糖产物。
本发明提供的海洋杆菌菌株G4(Marinobacter adhaerens)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.11016，保藏日期：2015年6月24日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。
1.海洋杆菌菌株G4(Marinobacter adhaerens)的筛选：
(1)富集培养：选取鼠尾藻、石花菜或江蓠等富含琼胶的大型野生海藻藻体作为筛选源，将10g海藻样品研磨粉碎后加入到100mL富集培养基中，30℃静置培养1周；
(2)驯化培养：取10mL经富集培养后的菌液，接种到100mL驯化培养基中，30℃振荡培养至少48h；
(3)分离纯化：将驯化培养后的菌液按照稀释涂布平板法涂布于2216E固体培养基上，30℃培养48h后选择在琼脂平板上形成明显的溶解圈的单菌落，采用常规微生物分离方法进行反复分离纯化，直至获得纯菌株G4。
上述富集及驯化过程中所用到的培养基的组分及配比如下：
富集培养基：琼脂粉0.3g,海水100mL；
驯化培养基：琼脂粉0.3g,NaCl3.0g，MgSO4·7H2O0.05g，NaNO30.2g，K2HPO40.1g，FeSO4·7H2O0.002g,CaCl20.02g,用蒸馏水定容至100mL，调节pH值至7.6。
菌株G4在2216E固体培养基上的菌落呈乳白色、湿润光滑、边缘整齐、圆形，培养48h后的菌落周围可形成明显凹陷的溶解圈，表明菌株G4具有高效降解琼胶多糖的能力。菌株G4经鉴定为海洋杆菌Marinobacter adhaerens菌株。
2.菌液上清液酶活性的测定：
取经过上述驯化培养后的G4菌液，离心后取上清液，用DNS法进行酶活性测定，测定结果表明上清液中的酶活可达323.48U/mL。
3.琼胶酶粗酶的制备及电泳、质谱分析：
(1)将活化的海洋杆菌G4接种至含0.15％(w/v)琼脂的海水中，35℃振荡培养48h，使细菌生长达到稳定期，处于稳定期的菌株生长状态良好，细胞密度较大，相应的OD600值达到1.315。
(2)收集菌液，5000g离心15min后取上清液，以饱和度为80％的(NH4)2SO4盐析沉淀胞外蛋白，4℃静置过夜后再经10000g离心20min获得蛋白沉淀；
(3)将蛋白沉淀用pH7.5的Tris-HCl缓冲液重新溶解并转移至截留分子量为10KD的超滤离心管中，5000g离心浓缩至蛋白溶液的终体积为浓缩前的一半，即获得含有β-琼胶酶的粗酶液；
(4)将粗酶液通过冷冻干燥机处理获得蛋白粉末；
(5)对获得的粗酶蛋白进行SDS-PAGE和Native-PAGE(浓缩胶浓度5％，分离胶浓度12％)电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝-R250染液对SDS-PAGE胶染色，Native-PAGE胶用于Agarase activity staining酶谱分析：将Native-PAGE胶贴敷在含1.0％琼脂糖的平板表面，使其充分贴合，35℃下温育3小时，最后用卢戈氏碘液对平板染色并测定平板上未被着色的透明条带的相对位置，透明条带所在位置对应具有琼胶降解能力的蛋白所在的区域。结果表明：具有琼胶降解能力的蛋白处于分子量为55kDa和48kDa的区域(图4)，对相应区域的蛋白条带进行MS质谱分析，鉴定结果表明具有琼胶降解能力的蛋白中含有β-琼胶酶。
4.利用海洋杆菌G4产β-琼胶酶粗酶制备寡糖：
(1)将含有含有β-琼胶酶的粗酶液或蛋白粉末和琼脂底物加入pH7.4的PBS缓冲液中，35℃下恒温水浴24h；
(2)加入适量体积比为25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，以去除反应后溶液中残留的蛋白质；
(3)将溶液在10000g下离心10min，取最上层清液，加入乙醇至终浓度为终浓度为90％(v/v)，10000g离心10min后收集寡糖产物沉淀。
5.寡糖产物的TLC分析：
参照上述方法制备寡糖，仅变更步骤(1)中的酶解时间(即恒温水浴时间)，将获得的寡糖产物进行TLC分析，结果如图5所示，酶解时间为6、12以及24h的寡糖产物均为新琼四糖。
Claims (8)
1.一株高效降解琼胶多糖的海洋杆菌Marinobacter adhaerens G4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11016。
2.利用保藏号为CGMCC No.11016的菌株Marinobacter adhaerens G4制备β-琼胶酶粗酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将活化的海洋杆菌G4接种至添加有微生物生长所必需的碳源和氮源的海水中培养数天；
(2)收集菌液，离心后取上清液，采用(NH4)2SO4盐析沉淀法提取胞外蛋白；
(3)将获得的蛋白沉淀用中性缓冲液复溶。
3.根据权利要求2所述的β-琼胶酶粗酶制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，用于沉淀胞外蛋白的(NH4)2SO4的饱和度为65～80％，并且在加入所述(NH4)2SO4后，将上清液低温静置过夜后再通过离心收集蛋白沉淀。
4.根据权利要求2或3所述的β-琼胶酶粗酶制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中用于蛋白沉淀复溶的中性缓冲液为pH6～8的PBS磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求4所述的β-琼胶酶粗酶制备方法，其特征在于：还包括步骤(4)：使用截留分子量为10KD的超滤离心管对由所述步骤(3)复溶获得的粗酶液进行离心浓缩。
6.根据权利要求5所述的β-琼胶酶粗酶制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中用于离心浓缩的超滤离心管选择型号为Ultra-15、截留分子量为10KD的超滤离心管，离心浓缩处理时的离心力为4000～5000g。
7.利用保藏号为CGMCC No.11016的菌株Marinobacter adhaerens G4产β-琼胶酶粗酶制备新琼四糖的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将所述β-琼胶酶粗酶和琼脂底物加入pH6～8的磷酸盐缓冲液中，30～40℃下恒温反应至少24h；
(2)加入适量体积比为25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀；
(3)将溶液离心至液面出现分层，吸取最上层清液，加入乙醇，离心收集沉淀产物。
8.根据权利要求7所述的新琼四糖制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，乙醇在上清液中的终浓度为70％～90％(v/v)；离心收集沉淀产物时，相应离心力为10000g。
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| 一株产琼胶酶细菌的分离、鉴定及其琼胶酶基本性质;马芮萍 等;《微生物学报》;20141231;第54卷(第5期);全文 * |
| 海洋细菌Marinobacter adhaerens HY-3 分离鉴定及对中肋骨条藻的化感作用;王洪斌 等;《环境科学》;20130131;第34卷(第1期);全文 * |
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