CN108619177A - 褐藻多酚的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种褐藻多酚的制备方法及其用途，包括如下步骤：将褐藻在温度为‑30～‑40℃的条件下进行冻结，冷冻15～20天后取出，在室温下解冻直至褐藻温度达到0～1℃；将解冻后的褐藻放入离心机离心，去除水分；将有机溶剂加入到去除水分后的褐藻中，避光浸提1～12小时后抽滤，得到浸提液；将浸提液于30～40℃条件下浓缩，直至溶液中沉淀量不再增加，过滤除去沉淀得第一滤液，待用；将第一滤液于5～20℃低温结晶5～10h，过滤，得第二滤液；将第二滤液中加入脂溶性溶剂，进行液液萃取后，留取脂溶性溶剂层；将所述脂溶性溶剂层在20～30℃浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，获得褐藻多酚。
Description
技术领域
本发明涉及天然物质制备领域，具体涉及一种褐藻多酚的制备方法及其用途。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis)是一种以骨组织退化、骨量减少和易发生骨折为特征的慢性骨病，破骨细胞和成骨细胞功能失衡是导致这一病理过程的直接原因，主要表现为慢性腰背疼痛、腰背畸形和骨折，中老年人易患，随人类社会的老龄化，骨质疏松症发病率不断增加。数据统计显示，全球约有2亿女性患有骨质疏松症，在老年人中尤为普遍，60-70岁之间的女性，约1/3患有骨质疏松症；80岁或以上的女性，约2/3患有骨质疏松症，在中国，骨质疏松症患者总人数已超过7000万。骨质疏松与机体的衰老密切相关，且氧化应激与机体的衰老密切相关。氧化应激(OS)作为骨质疏松的一个危险因子已受研究人员的高度重视。
褐藻中褐藻多酚是天然抗氧化成分，具强抗氧化能力和无毒副作用，是值得开发的新型海洋功能性产品。现有技术中从褐藻提取褐藻多酚提取效率低，原料利用率低，并且并无对褐藻多酚用于治疗骨质疏松的相关研究。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种原料利用率高、提取效率高的褐藻多酚的提取方法，及将褐藻多酚用于制备治疗骨质疏松的用途。
本发明提供一种褐藻多酚的制备方法，包括如下步骤：
将褐藻在温度为-30～-40℃的条件下进行冻结，冷冻15～20天后取出，在室温下解冻直至褐藻温度达到0～1℃；
将解冻后的褐藻放入离心机离心，去除水分；
将有机溶剂加入到去除水分后的褐藻中，避光浸提1～12小时后抽滤，得到浸提液；
将浸提液于30～40℃条件下浓缩，直至溶液中沉淀量不再增加，过滤除去沉淀得第一滤液；
将第一滤液于5～20℃低温结晶5～10h，过滤，得第二滤液；
将第二滤液中加入脂溶性溶剂，进行液液萃取后，留取脂溶性溶剂层；
将所述脂溶性溶剂层在20～30℃浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，获得褐藻多酚。
本发明另一方面还提供如上述方法制备的褐藻多酚用于制备预防或治疗骨质疏松的的食品、保健品或药品的用途。
本发明提供的褐藻多酚的制备方法，经济实用，原料利用率高、提取效率高。将褐藻多酚用于制备预防或治疗骨质疏松的的食品、保健品或药品，治疗和预防效果显著，为骨质疏松患者提供了一种新的预防和治疗途径。
附图说明
图1是本发明实施例5中不同浓度裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞骨结节形成影响情况。
图2是本发明实施例6中不同浓度裙带菜褐藻多酚对10μmol/L地塞米松(Dex)诱导的斑马鱼幼鱼头骨骨形成的影响。
具体实施方式
下面结合参考附图对本发明的方案进行详细解释，本领域技术人员将会理解，下面示例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供一种褐藻多酚的制备方法，包括如下步骤：
将褐藻在温度为-30～-40℃的条件下进行冻结，冷冻15～20天后取出，在室温下解冻直至褐藻温度达到0～1℃；
将解冻后的褐藻放入离心机离心，去除水分；
将有机溶剂加入到去除水分后的褐藻中，避光浸提1～12小时后抽滤，得到浸提液；
将浸提液于30～40℃条件下浓缩，直至溶液中沉淀量不再增加，过滤除去沉淀得第一滤液；
将第一滤液于5～20℃低温结晶5～10h，过滤，得第二滤液；
将第二滤液中加入脂溶性溶剂，进行液液萃取后，留取脂溶性溶剂层；
将所述脂溶性溶剂层在20～30℃浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，获得褐藻多酚。
根据本发明的实施例，所述将有机溶剂加入到褐藻中，所述有机溶剂为甲醇、丙酮或80～85％的乙醇水溶液。
根据本发明的实施例，所述褐藻包括水云、海带、鹿角菜、裙带菜、羊栖菜、马尾藻的一种或多种。优选的，所述褐藻为裙带菜。
根据本发明的实施例，所述脂溶性溶剂为二氯甲烷、正已烷、环已烷、乙醚中的一种或多种。
根据本发明的实施例，将解冻后的褐藻放入离心机离心，所述离心机的转速为1200～2000rpm。
根据本发明的实施例，抽滤浸提液时，反复浸提抽滤，直至浸提液为无色，合并浸提液。
本发明另一方面还提供上述方法制备的褐藻多酚用于制备预防或治疗骨质疏松的的食品、保健品或药品的用途。
根据本发明的实施例，所述褐藻多酚添加的浓度为1.5～200μg/mL。
根据本发明的实施例，所述褐藻多酚添加的浓度为1.5～100μg/mL。
根据本发明的实施例，所述褐藻多酚添加的浓度为3～50μg/mL。
实施例1
将新鲜裙带菜在温度为-40℃的条件下进行冻结，冷冻15天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至裙带菜中心温度达到1℃后即完成冻融过程；将裙带菜放入离心机，于转速为2000rpm的条件下离心10min去除水分；通过反复冻融和离心3次，控制裙带菜水分含量为60％。称取100g裙带菜放入1000mL三角烧杯中，加入85％(V/V)乙醇水溶液300mL，用保鲜膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，抽滤。继续向上述浸提处理的裙带菜中再次加入85％(v/v)乙醇水溶液300mL，用保险膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，抽滤。多次避光浸提直至提取液无色，合并滤液。滤液于40℃下浓缩，浓缩时当溶液中逐步出现大量沉淀，滤过；取上述滤液继续于40℃下浓缩，直至溶液中析出红色固体，将滤液于5℃低温结晶5h，过滤得滤液。再向上滤液中加入一定量正己烷进行萃取，直至正己烷层液体无色；将正己烷30℃浓缩，直至溶液中有黄绿色固体析出，即为褐藻多酚。
使用紫外-可见分光光度计对得到的裙带菜褐藻多酚进行200-800nm全波长扫描，以甲醇做空白参照。结果表明，裙带菜褐藻多酚甲醇溶液在760nm处吸收峰值最大，该结果与褐藻多酚鉴定相关文献的报道一致，说明提取的物质为褐藻多酚。
实施例2
将新鲜羊栖菜在温度为-30℃的条件下进行冻结，冷冻20天后取出，在室温条件下进行空气解冻直至羊栖菜中心温度达到1℃后即完成冻融过程；将羊栖菜放入离心机，于转速为1200rpm的条件下离心20min去除水分；通过反复冻融和离心2次，控制羊栖菜水分含量为60％。称取100g羊栖菜放入1000mL三角烧杯中，加入80％(V/V)乙醇水溶液300mL，用保鲜膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，抽滤。继续向上述浸提处理的羊栖菜中再次加入80％(v/v)乙醇水溶液300mL，用保险膜封住三角烧杯口，避光浸提1小时，抽滤。多次避光浸提直至提取液无色，合并滤液。滤液于40℃下浓缩，浓缩时当溶液中逐步出现大量沉淀，滤过；取上述滤液继续于40℃下浓缩，直至溶液中析出红色固体，将滤液于20℃低温结晶10h，过滤得滤液。再向上滤液中加入一定量环已烷进行萃取，直至环已烷层液体无色；将环已烷30℃浓缩，直至溶液中有黄绿色固体析出，即为褐藻多酚。
实施例3
通过MTT法检测实施例1中制备的褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞生长的促进作用。
实验过程：细胞以2×104/cm2的密度接种入96孔板，第一孔为空白调零。细胞接种24h后，加入不同浓度的褐藻多酚产品，使终浓度分别是：1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200μg/mL。于加药后24、48和72h进行检测，实验结束前4h加20μL的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，5mg/mL)，继续在37℃，5％CO2条件下孵育4h，吸取培养液后加二甲基亚砜150μL，振摇至结晶完全溶解后于酶标仪检测其吸光度，检测波长570nm，参考波长630nm。
实验结果：见表1。
表1：不同浓度裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞增殖的影响情况。
表1显示了裙带菜褐藻多酚有较好的促进胎鼠头盖骨成骨细胞增殖的作用，裙带菜褐藻多酚从12.5μg/mL至100μg/mL的浓度组有明显的促进胎鼠头盖骨成骨细胞增殖的作用(P<0.05)，与对照组相比，各个浓度组都能促进细胞增殖，这种作用可以持续到72h。
实施例4
利用碱性磷酸酶检测试剂盒测定实施例1中制备的裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞中ALP活性促进作用。
实验过程：细胞以2×104/cm2的密度接种入48孔板中。细胞接种24h后，加入不同浓度的褐藻多酚产品，使终浓度分别是：1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200μg/mL。于药物作用第3、5、7天测定细胞ALP含量。测定时去掉培养液，PBS冲洗，加入细胞裂解液200μL，冻融30min，然后超声裂解20min，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化镁和6mmol/LPNPP的反应液400μL，37℃放置0.5h，然后用0.1mol/L的NaOH 100μL终止反应，在酶标仪于405nm波长下测定OD值。样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L)。
实验结果：见表2。
表2：不同浓度裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。
表2裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响(n＝5)
Note：▲P<0.05vs对照
碱性磷酸酶(ALP)是反映成骨细胞分化早期活性的特异指标，ALP在成骨细胞分化早期处于一个上升的过程，其表达量的多少能反映成骨细胞的分化程度和功能状态。表2显示了不同浓度裙带菜褐藻多酚作用不同时间后，对胎鼠头盖骨成骨细胞中ALP活性的影响情况。裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞碱性磷酸酶表达有促进作用。与对照组相比，药物作用3天没有促进碱性磷酸酶表达的作用，50mg/L至200mg/L的药物浓度组作用3天反而抑制胎鼠头盖骨成骨细胞碱性磷酸酶的表达(P<0.05)。药物作用5天可以促进胎鼠头盖骨成骨细胞碱性磷酸酶表达，与对照组相比，1.5625mg/L至50mg/L浓度的药物都可促进碱性磷酸酶表达(P<0.05)，第7天时药物促进酶表达的作用更加明显，3.125mg/L至100mg/L浓度的药物都可促进碱性磷酸酶表达(P<0.05)。结果表明裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞碱性磷酸酶表达有促进作用。
实施例5
通过茜素红染色法考查实施例1中制备的裙带菜褐藻多酚对胎鼠头盖骨成骨细胞骨结节形成及数量的影响情况。
实验过程：采用维生素C和p-甘油磷酸钠诱导新生大鼠成骨细胞成熟矿化，在提取产品处理20天后，取尽12孔板各孔培养上清液后，用PBS冲洗培养板2次，95％乙醇固定10min，用PBS再冲洗3次，各孔均加入0.1％茜素红1mL，于37℃下放置30min，蒸馏水冲洗、甩干。于光镜下观察，以红染、边界清晰、短径大于100μm为标准。
实验结果：见图1。
骨结节是成骨细胞分化成熟形成多层叠加的结节样结构，同时骨结节是衡量成骨细胞分化晚期活性的指标，是细胞外基质矿化期的特征。图1显示了浓度为3.125、6.25、12.5、25和50μg/mL的裙带菜褐藻多酚作用20天后，对维生素C和β-甘油磷酸钠诱导胎鼠头盖骨成骨细胞成熟矿化骨结节形成影响情况。图1中显示，裙带菜褐藻多酚能够促进新生大鼠成骨细胞骨结节形成。
实施例6
通过茜素红染色法检测实施例1中制备的裙带菜褐藻多酚对斑马鱼幼鱼头骨骨形成的影响。
实验过程：将斑马鱼幼鱼10μmol/L地塞米松Dex模型暴露于含不同浓度裙带菜褐藻多酚的培养基质中，斑马鱼通过皮肤和腔道吸收药物。将培养至9～10d的斑马鱼胚胎置于MS-222中麻醉致死，去除MS-222溶液，加入4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，然后使用茜素红S对斑马鱼进行染色。用ZEISS荧光倒置显微镜观察茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用AxioVisionRel.4.6成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置。用专业图像分析软件Imageproplus6.0计算茜素红染色区域面积和累积光密度。
实验结果：见图2及表3。
表3：裙带菜褐藻多酚对斑马鱼矿化面积和累积光密度值的影响。
Note：▲P<0.05vs DMSO；*P<0.05vs 10μmol/L Dex
如图2和表3所示，DMSO组矿化面积、累积光密度与空白对照组相比，差异无统计学意义。与DMSO组相比，10μmol/L地塞米松Dex模型组的斑马鱼骨骼茜素红染色面积和累积光密度明显减少(P<0.05)。与模型组相比较，裙带菜褐藻多酚可以增加斑马鱼骨骼茜素红染色面积和累积光密度。3.125μg/ml至12.5μg/ml浓度的裙带菜褐藻多酚都可以对抗地塞米松引起的骨矿化面积和累积光密度的下降，使骨矿化面积和累积光密度增加(P<0.05)。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案所做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种褐藻多酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将褐藻在温度为-30～-40℃的条件下进行冻结，冷冻15～20天后取出，在室温下解冻直至褐藻温度达到0～1℃；
将解冻后的褐藻放入离心机离心，去除水分；
将有机溶剂加入到去除水分后的褐藻中，避光浸提1～12小时后抽滤，得到浸提液；
将浸提液于30～40℃条件下浓缩，直至溶液中沉淀量不再增加，过滤除去沉淀得第一滤液；
将第一滤液于5～20℃低温结晶5～10h，过滤，得第二滤液；
将第二滤液中加入脂溶性溶剂，进行液液萃取后，留取脂溶性溶剂层；
将所述脂溶性溶剂层在20～30℃浓缩，直至溶液中析出黄绿色固体，获得褐藻多酚。
2.根据权利要求1所述的褐藻多酚的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、丙酮或80～85％的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的褐藻多酚的制备方法，其特征在于，所述褐藻包括水云、海带、鹿角菜、裙带菜、羊栖菜、马尾藻的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的褐藻多酚的制备方法，其特征在于，所述脂溶性溶剂为二氯甲烷、正已烷、环已烷、乙醚中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的褐藻多酚的制备方法，其特征在于，将解冻后的褐藻放入离心机离心，所述离心机的转速为1200～2000rpm。
6.根据权利要求1所述的褐藻多酚的制备方法，其特征在于，抽滤浸提液时，反复浸提抽滤，直至浸提液为无色，合并浸提液。
7.根据权利要求1所述方法制备的褐藻多酚用于制备预防或治疗骨质疏松的的食品、保健品或药品的用途。
8.根据权利要求7所述的褐藻多酚的用途，其特征在于，所述褐藻多酚添加的浓度为1.5～200μg/mL。
9.根据权利要求8所述的褐藻多酚的用途，其特征在于，所述褐藻多酚添加的浓度为1.5～100μg/mL。
10.根据权利要求9所述的褐藻多酚的用途，其特征在于，所述褐藻多酚添加的浓度为3～50μg/mL。
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