CN103212062B - 一种猪脾转移因子注射液的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种猪脾转移因子注射液的制备方法，包括：将检验合格的猪脾脏预处理后，初绞1～3遍；将初绞的猪脾脏精绞研磨1.5～8分钟，制成匀浆；在所述匀浆中加入甲醛溶液灭活；将灭活的匀浆反复冻融6～10次；将反复冻融的匀浆经离心分离、过滤与超滤，得到半成品；向检验合格的半成品中加入注射用水，得到成品。本发明工艺简单，成本低，可大大缩短生产周期，周期为4天，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率。

Description

一种猪脾转移因子注射液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物制品的制备方法，特别是涉及一种猪脾转移因子注射液的制备方法。

背景技术

现代集约化养殖业，常发性、多发性传染病种类繁多，应用疫苗接种免疫预防各种传染病成为养殖业成败的关键。疫苗免疫效果受外因和内因多种因素的影响，外因有疫苗质量、保管和使用方法等，关键是内因，主要是机体抗病力和对疫苗的反应，尤其是机体的免疫系统功能状态。影响机体免疫系统功能状态的因素很多，如某些疾病、应激、抗生素的应用、营养不良等都能使机体的免疫系统功能下降或抑制而影响免疫效果。开发应用动物免疫增强剂改善机体特异性、非特异性免疫系统功能，提高疫苗免疫效果，增强机体抗感染能力已日益引起人们的重视。

转移因子（Transfer factor）是动物体内有免疫活性的T淋巴细胞所释放的多种因子中一种能够转移免疫致敏信息的因子，它能够特异性地将供体某一细胞免疫功能转移给受体动物，非特异性地增强受体动物免疫功能，是一种新型的免疫激发剂。

传统生产方法生产猪脾转移因子注射液，原料经预处理、绞碎、匀浆、反复冻融、离心、透析、离心、过滤等工艺制成，经传统生产工艺加工会破坏原材料的生物活性成分，有效成分利用率低，且生产周期长，至少需要7天。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪脾转移因子注射液的制备方法，以解决上述工艺生物活性成分被破坏，有效成分利用率低和生产周期长的问题。

技术方案如下：

一种猪脾转移因子注射液的制备方法，包括：

将检验合格的猪脾脏预处理后，初绞1～3遍；

将初绞的猪脾脏精绞研磨1.5～8分钟，制成匀浆；

在所述匀浆中加入甲醛溶液灭活；

将灭活的匀浆反复冻融6～10次；

将反复冻融的匀浆经离心分离、过滤与超滤，得到半成品；

向检验合格的半成品中加入注射用水，得到成品。

进一步，所述预处理过程中，将猪脾脏解冻融化后，用剪刀剪去脂肪，再用浓度为0.5～1.5%氯化钠溶液清洗2～3次。

进一步，所述精绞过程中，将初绞的猪脾与纯化水按1:1～3的比例混合，置于胶体磨中研磨。

进一步，所述灭活过程中，甲醛溶液的加入量占匀浆总量的0.1～0.2%。

进一步，所述灭活条件为，37～42℃下灭活18～24小时，中间间隔4～6小时震摇1次。

进一步，所述离心分离过程中，将反复冻融的匀浆置管式分离机中，将冻融的匀浆，室温下以16000～20000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。

进一步，所述过滤过程中，将离心分离得到的上清液先经0.43～0.46μm的微孔滤膜第一次过滤，再用0.20～0.26μm的微孔滤膜第二次过滤。

进一步，所述超滤使用截留分子量为5000～6000道尔顿超滤膜。

进一步，将检验合格的猪脾脏去除脂肪，用浓度为0.9%氯化钠溶液清洗3次，于绞肉机中初绞1遍；将初绞的猪脾脏与纯化水按1:1.5的比例混合，于胶体磨中研磨5分钟，制成匀浆；向匀浆中加入匀浆总量0.1%的甲醛溶液，37℃灭活24小时，间隔5小时震摇1次；将灭活的匀浆置于-20℃冷库反复冻融8次，融化温度不得超过37℃；将离心分离得到的上清液先用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，最后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤。

进一步，半成品中加入注射用水后，加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3～7.5之间。

本发明的有益效果：

（1）本发明生产的猪脾转移因子注射液主要成分为低分子活性多肽和核糖，是一种低分子肽—核苷酸复合物，而不是蛋白质。

（2）本发明所用原料、仪器取材容易，工艺简单，成本低，可大大缩短生产周期，周期为4天，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率，为满足工业化大规模生产提供了可行途径。

（3）本发明生产的猪脾转移因子注射液应用安全，过量使用也无毒副作用，无药物残留；活性高，临床用量小，见效快，使用后24～36小时就可发挥作用，效果可持续7天以上。

（4）本发明生产的猪脾转移因子注射液能增强动物免疫功能，提高机体抗感染能力；不仅可用于预防，也可用于病毒感染引起的疾病的紧急辅助治疗；配合疫苗同时使用，增强疫苗免疫效果，并且可以弥补疫苗接种后，抗体产生的时间空缺。

（5）传统工艺中离心分离多采用4℃，6000r/min离心15min，收集上清液。本发明的改进工艺中应用管式分离机，克服了制备过程中原料粘度大，颗粒小，比重差小，絮状物多等问题；且加工材料原有生物活性成分主要为多肽、氨基酸，本发明工艺有效的保护了加工材料原有生物活性成分不被破坏；同时采用室温下16000～20000r/min高速连续离心的方法，极大的节省了人力物力，增加了产量，每天产量可达2吨，约2000L，提高了收益率，1kg脾脏大约出1.8L半成品，适用于工业化大规模推广应用。

具体实施方式

本实施例中以猪脾脏为原料，经剪摘、称量清洗、初绞、精绞、灭活、冻融、离心分离、澄清过滤与超滤等过程制成转移因子注射液半成品，传统生产方法将原料经预处理、绞碎、匀浆、反复冻融、离心、透析、离心、过滤过程制成，本发明更注重了对离心分离过程、初绞次数、精绞时间、甲醛灭活终浓度、冻融次数的控制。半成品经检验合格后，调整含量、pH值进一步制成转移因子注射液成品。

实施例1：猪脾转移因子注射液的制备方法

一种猪脾转移因子注射液的制备方法，具体步骤如下：

S1：猪脾脏的收集与检验；

原料选取标准化生猪养殖、屠宰企业收集猪脾脏，标准化生猪养殖、屠宰企业，此屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合中华人民共和国国家标准GB/T17236-1998《生猪屠宰操作规范》规定，卫生要求应符合《肉类加工卫生规范》GB12649的规定。本实施例所用原料——猪脾脏来自山东得利斯集团，符合猪脾脏原料地及屠宰要求。

猪脾脏经外观检验、卫生检验、病原微生物检验，检验合格后方可用作原料。猪脾脏外观检验，健康猪脾脏应呈扁长条形，色泽均匀一致，呈暗红色或棕红色，无充血、结节、出血点及肿胀等病灶，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色、浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质等现象，有猪脾脏固有的气味。卫生检验，包括细菌总数检验，大肠杆菌最可能数（Most probable number，MPN）检验，霉菌总数检验。细菌检验中标准细菌总数应＜104/g为合格；大肠杆菌最可能数检验，标准大肠杆菌MPN＜150万/g为合格；霉菌总数＜100个/克为合格。病原微生物检验，包括口蹄疫病毒检验，猪瘟病毒、猪细小病毒检验。口蹄疫病毒检验采用乳鼠检查法；猪瘟病毒、猪细小病毒采用外源病毒检查法。

S2：剪摘：将解冻融化的猪脾脏去掉装袋，按猪脾脏原料标准中外观项要求，严格挑选，并用镊子夹住脂肪，用剪刀剪去。

S3：清洗：将剪摘后的原料用浓度为0.5%氯化钠溶液清洗2次。

S4：初绞：将猪脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞2遍，并用洁净物料桶盛装。

S5：精绞：将初绞的猪脾与纯化水按1:1的比例混合，置于胶体磨装料斗中，按胶体磨操作规程将其研磨1.5分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。

S6：灭活：按匀浆总量的0.2%加甲醛溶液，42℃灭活18小时，间隔4小时震摇1次。

S7：冻融：将灭活的匀浆，置-18℃冷库反复冻融6次，融化温度不得超过37℃。

S8：离心分离：将冻融的匀浆置管式分离机中，室温以18000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。

S9：澄清过滤与超滤：上清液用0.43μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.20μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为6000道尔顿超滤膜进行超滤，即得转移因子注射液半成品。超滤液在-20℃以下，保存期为12个月。

S10：半成品检验：半成品经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20℃保存备用。

S11：成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于50μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3～7.5之间，混匀，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。

实施例2：猪脾转移因子注射液的制备方法

一种猪脾转移因子注射液的制备方法，具体步骤如下：

S1：猪脾脏的收集与检验；

原料选取标准化生猪养殖、屠宰企业收集猪脾脏，标准化生猪养殖、屠宰企业，此屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合中华人民共和国国家标准GB/T17236-1998《生猪屠宰操作规范》规定，卫生要求应符合《肉类加工卫生规范》GB12649的规定。本实施例所用原料——猪脾脏来自山东得利斯集团，符合猪脾脏原料地及屠宰要求。

猪脾脏经外观检验、卫生检验、病原微生物检验，检验合格后方可用作原料。猪脾脏外观检验，健康猪脾脏应呈扁长条形，色泽均匀一致，呈暗红色或棕红色，无充血、结节、出血点及肿胀等病灶，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色、浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质等现象，有猪脾脏固有的气味。卫生检验，包括细菌总数检验，大肠杆菌最可能数（Most probable number，MPN）检验，霉菌总数检验。细菌检验中标准细菌总数应＜104/g为合格；大肠杆菌最可能数检验，标准大肠杆菌MPN＜150万/g为合格；霉菌总数＜100个/克为合格。病原微生物检验，包括口蹄疫病毒检验，猪瘟病毒、猪细小病毒检验。口蹄疫病毒检验采用乳鼠检查法；猪瘟病毒、猪细小病毒采用外源病毒检查法。

S2：剪摘：将解冻融化的猪脾脏去掉装袋，按猪脾脏原料标准中外观项要求，严格挑选，并用镊子夹住脂肪，用剪刀剪去。

S3：清洗：将剪摘后的原料用浓度为0.9%氯化钠溶液清洗3次。

S4：初绞：将猪脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞1遍，并用洁净物料桶盛装。

S5：精绞：将初绞的猪脾与纯化水按1:1.5的比例混合，置于胶体磨装料斗中，按胶体磨操作规程将其研磨5分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。

S6：灭活：按匀浆总量的0.1%加甲醛溶液，37℃灭活24小时，间隔5小时震摇1次。

S7：冻融：将灭活的匀浆，置-20℃冷库反复冻融8次，融化温度不得超过37℃。

S8：离心分离：将冻融的匀浆置管式分离机中，室温以16000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。

S9：澄清过滤与超滤：上清液用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，即得转移因子注射液半成品。超滤液在-20℃以下，保存期为12个月。

S10：半成品检验：半成品经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20℃保存备用。

S11：成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于50μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3～7.5之间，混匀，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。

实施例3：猪脾转移因子注射液的制备方法

一种猪脾转移因子注射液的制备方法，具体步骤如下：

S1：猪脾脏的收集与检验；

原料选取标准化生猪养殖、屠宰企业收集猪脾脏，标准化生猪养殖、屠宰企业，此屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合中华人民共和国国家标准GB/T17236-1998《生猪屠宰操作规范》规定，卫生要求应符合《肉类加工卫生规范》GB12649的规定。本实施例所用原料——猪脾脏来自山东得利斯集团，符合猪脾脏原料地及屠宰要求。

猪脾脏经外观检验、卫生检验、病原微生物检验，检验合格后方可用作原料。猪脾脏外观检验，健康猪脾脏应呈扁长条形，色泽均匀一致，呈暗红色或棕红色，无充血、结节、出血点及肿胀等病灶，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色、浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质等现象，有猪脾脏固有的气味。卫生检验，包括细菌总数检验，大肠杆菌最可能数（Most probable number，MPN）检验，霉菌总数检验。细菌检验中标准细菌总数应＜104/g为合格；大肠杆菌最可能数检验，标准大肠杆菌MPN＜150万/g为合格；霉菌总数＜100个/克为合格。病原微生物检验，包括口蹄疫病毒检验，猪瘟病毒、猪细小病毒检验。口蹄疫病毒检验采用乳鼠检查法；猪瘟病毒、猪细小病毒采用外源病毒检查法。

S2：剪摘：将解冻融化的猪脾脏去掉装袋，按猪脾脏原料标准中外观项要求，严格挑选，并用镊子夹住脂肪，用剪刀剪去。

S3：清洗：将剪摘后的原料用浓度为1.5%氯化钠溶液清洗3次。

S4：初绞：将猪脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞3遍，并用洁净物料桶盛装。

S5：精绞：将初绞的猪脾与纯化水按1:3的比例混合，置于胶体磨装料斗中，按胶体磨操作规程将其研磨8分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。

S6：灭活：按匀浆总量的0.15%加甲醛溶液，40℃灭活20小时，间隔6小时震摇1次。

S7：冻融：将灭活的匀浆，置-19℃冷库反复冻融10次，融化温度不得超过37℃。

S8：离心分离：将冻融的匀浆置管式分离机中，室温以20000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。

S9：澄清过滤与超滤：上清液用0.46μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.23μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为5500道尔顿超滤膜进行超滤，即得转移因子注射液半成品。超滤液在-20℃以下，保存期为12个月。

S10：半成品检验：半成品经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20℃保存备用。

S11：成品制备：将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml，核糖含量不少于50μg/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3～7.5之间，混匀，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。

实施例4：初绞次数对半成品的影响

传统工艺中初绞次数一般为3次，经反复研究确定初绞次数为1次，极大的节省了人力物力。

本实施例中，将猪脾脏使用绞肉机进行不同次数的重复绞碎，每组绞碎的脾脏样品设置3个平行样，其他生产工艺按照实施例2的步骤执行，不同绞碎次数生产出的半成品含量检测结果见表1。

表1

实验品	脾脏重复绞碎次数	多肽含量（mg/ml）	核糖含量(μg/ml)
				样品1	1次	2.16±0.42	72.16±1.89
样品2	2次	2.19±0.10	71.36±0.79
				样品3	3次	2.18±0.02	72.03±1.91

注：以上结果均是用“统计产品与服务解决方案”软件（Statistical Product and Service Solutions，SPSS）分析软件得出的结果，当P＞0.05时，表示与差异不显著；当0.01＜P＜0.05时，表示与差异显著；当P＜0.01时，表示与差异极显著。

结果分析：从检测结果分析，样品1、样品2、样品3，各组之间差异均不显著。因此，得出结论：增加初绞的次数对转移因子注射液半成品含量无影响。根据试验结果，确定初绞次数为1次。

实施例5：精绞时间对半成品的影响

传统工艺中并未确切提及精绞时间的问题，在本发明的改进工艺中经反复研究精绞时间对半成品含量的影响，最终确定精绞时间为5分钟，节省了生产时间和成本。

本实施例中，将初绞后的猪脾脏使用胶体磨进行不同时间循环处理，每组样品设置3个平行样，其他生产工艺按照实施例2的步骤执行，不同循环时间生产出的半成品含量检测结果见表2。

表2

循环时间（mins）	多肽含量（mg/ml）	核糖含量(μg/ml)
			1.5	1.65±0.49	60.47±0.70
5	2.16±0.41	78.40±2.64
			8	2.18±0.11	79.88±1.01

注：以上数据均是用SPSS分析软件得出的结果，当P＞0.05时，表示与差异不显著；当0.01＜P＜0.05时，表示与差异显著；当P＜0.01时，表示与差异极显著。

结果分析：从检测结果分析，第1组与2组、3组之间，P值均＜0.05，差异显著；2、3组之间P值＞0.05，表明两组之间差异不显著。由此得出结论：根据试验结果，确定5分钟为精绞脾脏时胶体磨最适循环时间。

实施例6：甲醛灭活对半成品的影响

传统工艺中关于甲醛灭活的终浓度一般为0.05%，本发明的改进工艺中甲醛灭活的终浓度为0.1%，结果显示0.1%的甲醛终浓度灭活更完全彻底，对产品活性亦无影响。

本实施例中，为验证甲醛对猪脾脏外源微生物的灭活效果，新鲜猪脾脏经检验无菌及无外源病毒，采取添加指示细菌（大肠杆菌K88、K99、987P）和病毒（猪细小病毒）后的灭活试验，生产工艺按照实施例2的步骤执行。结果表明，0.1%以上浓度甲醛对精绞液中添加的指示微生物能完全彻底灭活，对产品活性亦无影响。确定0.1%为猪脾转移因子注射液中精绞液外源病毒的甲醛灭活浓度。

①试验设计

本实施例中，在《中国兽药典》2010年版（三部）规定的生物制品允许的甲醛残留量范围内，设置了4种不同的甲醛浓度，以检验不同浓度甲醛对脾脏精绞后匀浆液的外源微生物灭活效果。

②灭活效果检测

细菌灭活效果检测，按“中华人民共和国食品卫生检验法――微生物部分”进行，对添加细菌逐个进行细菌计数。猪细小病毒使用荧光抗体技术进行检验。

③方法

实验分为灭活组和对照组，灭活组：分别在每一份精绞液中加入甲醛，使其终浓度为0.05%、0.1%、0.2%，然后再添加指示细菌和病毒，充分混匀后，室温下放置24小时其间振摇数次。对照组不加甲醛溶液只加指示细菌和病毒，其他组份同灭活组。实验结果见表3～6。

④试验结果

表30.05%甲醛溶液对精绞液中添加指示菌的灭活效果

表40.1%甲醛溶液对精绞液中添加指示菌的灭活效果

表50.2%甲醛溶液对精绞液中添加指示菌的灭活效果

从表3～5中可以看出，终浓度0.05%的甲醛可以部分灭活精绞液中的指示细菌，但灭活不彻底，依然有部分活菌残留在精绞液中；终浓度0.1%以上的甲醛可以彻底灭活精绞液中的指示细菌，活菌计数结果为0。据此，我们选定终浓度0.1%为精绞液中甲醛的外源微生物灭活浓度。

表6不同浓度甲醛对精绞液中猪细小病毒（指示病毒）的灭活效果

表6结果表明：0.05%～0.2%各浓度的甲醛均可有效灭活精绞液中的外源指示病毒。因此，对于灭活外源病毒，可任意选用以上各种终浓度甲醛.

终浓度为0.05%的甲醛虽然能大量减少指示细菌的数量，但仍有大量细菌未被灭活；而随着甲醛浓度的提高，终浓度0.1%以上的甲醛，指示细菌全部被灭活。依据《中国兽药典》2010年版（三部）规定甲醛残留量不得超过0.2%，0.2%为甲醛残留量的上限。考虑到后续工艺中没有单独针对甲醛的去除工艺，且甲醛为毒性物质，过多残留可能造成较大应激。0.1%的甲醛浓度足以灭活指示细菌和病毒，因此确定0.1%甲醛浓度为猪脾转移因子注射液生产工艺中脾脏精绞后的甲醛灭活终浓度。

实施例7：冻融次数对半成品的影响

传统工艺中对冻融次数并未特别说明，存在争议，为此本实施例研究了冻融次数对半成品含量的影响。

本发明研究了如下冻融次数的不同试验组，以摸索生产工艺中最佳的脾脏匀浆液的冻融次数，从而最大限度获得高收率。其他生产工艺按照实施例2的步骤执行，提取液检测结果见表7。

表7冻融次数对多肽和核糖含量的影响

冻融次数	多肽（mg/ml）	核糖（μg/ml）
			2	0.81±0.17	35±4.23
4	0.94±0.15	45±5.21
			8	1.9±0.23	70±6.23
10	1.9±0.22	69±6.19

结果分析：从2次冻融开始，随着冻融次数的增加，多肽和核糖含量逐渐提高，冻融次数与提取液含量呈正相关；冻融次数增加到8次以上后，多肽和核糖含量并不随冻融次数的增加而提高，第8、10次冻融组之间差异不显著，与其他组别均差异显著。

经过8次冻融后5批产品多肽和核糖含量的检测结果见表8。

表88次冻融的5批中试产品的多肽和核糖含量测定

批号	多肽（mg/ml）	核糖（μg/ml）	冻融次数
				201001281	2.16	59.34	8
201002131	2.14	60.56	8
				201003151	1.87	63.10	8
201004251	1.92	62.45	8
				201005231	2.04	61.79	8

由表8可以得出结论：8次反复冻融为转移因子注射液生产工艺中脾脏匀浆液的最佳冻融次数。

实施例8：半成品检验方法

1、性状：本发明生产的半成品外观性状为微黄色澄明液体，符合转移因子注射液的外观性状。

2、pH值：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，本发明生产的半成品pH值在6.3～7.5之间，符合相关规定。

3、无菌检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，检测结果表明，本发明生产的半成品无菌生长。

4、含量测定：

①多肽含量：按福林酚法进行，每1ml应不少于1.5mg，上本发明生产的半成品多肽含量为2.03mg/ml。

②核糖含量：按核糖含量测定法进行，每1ml应不少于50μg，本发明生产的半成品核糖含量为64.21μg/ml。

5、蛋白质含量：取本发明生产的半成品2ml，加20%磺基水杨酸溶液2ml，混匀，未发生混浊或沉淀现象，说明蛋白反应均成阴性，本发明生产的半成品中不含大分子蛋白质。

6、鉴别检验：

①取本发明生产的半成品1ml，加茚三酮试液数滴，加热，溶液显蓝紫色，说明氨基酸鉴别反应为正反应。

②取本发明生产的半成品，根据含量测定结果，加水制成每1ml中含多肽20μg的溶液，按现行《中华人民共和国兽药典》分光光度法进行测定，在251nm的波长处有最大吸收。在251nm与280nm波长处吸收度的比值大于1.9。说明半成品中含有多肽和核苷酸。

7、高分子量物质检测：用高效液相色谱法，按现行《中国兽药典》附录进行测定。小于胰岛素峰保留时间的峰，按峰面积归一化法计算，不得过5.0%，说明本发明生产的半成品中无高于分子量6000的大分子。

实施例9：成品检验方法

1、性状：本发明生产的猪脾转移因子注射液为微黄色澄明液体，符合转移因子注射液的外观性状。

2、pH值：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，本发明生产的猪脾转移因子注射液的pH值在6.3～7.5之间，符合规定。

3、无菌检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，本发明生产的猪脾转移因子注射液无菌生长。

4、支原体检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检验，本发明生产的猪脾转移因子注射液无支原体生长。

5、外源病毒检验：按照现行《中华人民共和国兽药典》非禽源细胞及其制品的检验方法进行检验，本发明生产的猪脾转移因子注射液无外源病毒污染。

6、安全检验：

①用豚鼠和小鼠检验

用体重350～450g的豚鼠2只，每只皮下注射本发明生产的猪脾转移因子注射液2.0ml；用体重18～22g的小鼠5只，每只皮下注射0.5ml，连续观察7日，均未出现因注射本转移因子注射液引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。

②用猪检验

用30～40日龄的仔猪2头，各两侧耳根后分点肌肉注射本发明生产的猪脾转移因子注射液4ml，逐日观察14日，均未出现因注射本品引起的毒性反应。

7、含量测定：

①多肽含量：按福林酚法进行，每1ml应不少于1.5mg，本发明生产的猪脾转移因子注射液中多肽含量为1.89mg/ml。

②核糖含量：按核糖含量测定法进行，每1ml应不少于50μg，本发明生产的猪脾转移因子注射液中核糖含量为62.16μg/ml。

8、鉴别检验

①取本发明生产的猪脾转移因子注射液1ml，加茚三酮试液数滴，加热，溶液显蓝紫色，说明氨基酸鉴别反应为正反应。

②取本发明生产的猪脾转移因子注射液，根据含量测定结果，加水制成每1ml中含多肽20μg的溶液，按现行《中华人民共和国兽药典》分光光度法进行测定，在251nm的波长处有最大吸收。在251nm与280nm波长处吸收度的比值大于1.9。说明半成品中含有多肽和核苷酸。

9、游离氨基酸测定：采用高效液相色谱法，按现行《中国兽药典》附录进行测定。每1ml中游离氨基酸的量不得少于2.0mg，本发明生产的猪脾转移因子注射液中游离氨基酸含量为2.87mg/ml。

10、活力测定：取本发明生产的猪脾转移因子注射液适量，按T细胞活性测定法—脱E受体法测定，供试品管的E玫瑰花结百分率与对照管的E玫瑰花结百分率之差应不低于10.0%，上述所得成品E玫瑰花环百分率比对照管分别增加13.8%和12.6%。

11、甲醛残留量测定：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，甲醛含量不得超过0.2%，上述所得本品甲醛残留量为0.11%。

12、最小装量：按照现行《中华人民共和国兽药典》进行测定，本发明生产的猪脾转移因子注射液均符合规定。

实施例10：本发明转移因子注射液对提高猪机体疫苗免疫效果的试验研究

本实施例以实施例2的生产工艺试制了3批转移因子注射液，批号为201001281，201002131，201003151，用以进行验证转移因子注射液提高猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟疫苗免疫效果。整个试验共分为两部分：猪繁殖与呼吸综合征疫苗试验及猪瘟疫苗试验。每一部分分组均为：疫苗1组，空白对照1组，3个批次产品低、中、高剂量组（9组），共11组，每组均为5头。两部分试验共使用实验猪110头。试验结果表明：转移因子注射液能够显著提高猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫水平。其中，转移因子注射液中、高剂量组免疫效果要优于低剂量组；中、高剂量组之间无显著差异。

1材料和方法

1.1材料

①转移因子注射液，由山东信得科技股份有限公司以实施例2的生产工艺生产，规格：15ml：多肽：不低于22.5mg；核糖：不低于750μg，批号201001281、201002131、201003151。

②试验动物：35日龄仔猪165头。

③猪瘟弱毒疫苗（脾淋源，政府采购专用）由北京信得威特科技有限公司提供，批号201002003；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXR-1A株）购自广东大华农动物保健品股份有限公司，批号201004121。

④猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，购自中国农科院兰州兽医研究所；猪繁殖与呼吸综合征检测试剂盒，法国LSI公司。

1.2方法

1.2.1实验动物分组

猪瘟疫苗分组：

10头35日龄仔猪，分为2组，每组5头，一组为空白对照组，另一组为疫苗对照组，全部试验共用空白对照组、疫苗对照组。

45头35日龄仔猪分为9组，每组5头，分别注射3个批次的转移因子注射液，每个批次又分为低、中、高剂量组，共计9组。

猪繁殖与呼吸综合征疫苗分组：

20头35日龄仔猪，分为2组，每组10头，分别为空白对照组与疫苗对照组。全部试验共用空白对照组与疫苗对照组。

90头35日龄仔猪分为9组，每组10头，分别注射3个批次的转移因子注射液，每个批次分为低、中、高剂量组，共计9组。

试验设计方案见表9、10。

表9猪瘟兔化弱毒疫苗免疫设计方案

组别	试验方法	接种方法	数量（头）
				空白对照组	同疫苗剂量一致的生理盐水	颈部肌肉注射	5
疫苗对照组	猪瘟兔化弱毒疫苗1头份	颈部肌肉注射	5
				低剂量组	猪瘟兔化弱毒疫苗1头份+0.1ml/kg b.w.转移因子注射液	颈部肌肉注射	15
中剂量组	猪瘟兔化弱毒疫苗1头份+0.2ml/kg b.w.转移因子注射液	颈部肌肉注射	15
				高剂量组	猪瘟兔化弱毒疫苗1头份+0.4ml/kg b.w.转移因子注射液	颈部肌肉注射	15

表10猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫设计方案

1.2.2疫苗抗体水平的测定

猪瘟疫苗分组操作：分别在疫苗免疫前和免疫后第30、60、90d采血分离血清，猪瘟兔化弱毒疫苗抗体水平由中国农业科学院兰州兽医研究所提供的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒测定，抗体效价以1:8，1:32，1:64等表示，取整数进行软件统计分析。

猪繁殖与呼吸综合征疫苗分组操作：在首免后30、60、90天采血，分离血清测定样本的阳性合格率。本试验采用猪繁殖与呼吸综合征（美洲毒株）ELISA抗体检测试剂盒（法国进口），按照试剂盒说明书操作。IRPC>20判定为阳性，IRPC≤20判定为阴性。

1.2.4统计分析

采用SPSS13.0软件进行统计分析。

2结果

表11转移因子注射液提高猪瘟弱毒疫苗抗体滴度的结果（log2）（n=5）

注：结果以mean±SD表示，*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组相比；#P＜0.05，##P＜0.01与疫苗对照组相比。

表12转移因子注射液对猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫效果的影响（n=10）

由表11可见，首免30天后，3批转移因子注射液，中、高剂量组与疫苗对照组间抗体滴度差异极显著（P＜0.01），低剂量组与对照组之间无显著性差异（P＞0.05）；首免后60d和90d，中、高剂量组与疫苗对照组间抗体滴度差异极显著（P＜0.01），低剂量组与对照组差异不显著。

由表12可见，3批转移因子注射液，在配合猪繁殖与呼吸综合征活苗免疫后，低、中、高剂量组同疫苗对照组比较，均提高了猪繁殖与呼吸综合征疫苗的抗体阳性率。中、高剂量组在提高抗体阳性率上要优于低剂量组。

结论：①试验结果显示：适宜剂量的转移因子注射液能显著提高猪瘟疫苗抗体滴度。转移因子注射液低剂量组与疫苗对照组比较，差异不显著；中、高剂量组与疫苗对照组比较，差异显著。

②试验结果显示：应用转移因子注射液以后，显著提高了猪繁殖与呼吸综合征疫苗猪群的抗体阳性率。其中低剂量组与疫苗对照组比较差异较小；中、高剂量组与疫苗对照组比较差异显著；中、高剂量组之间无显著差异，提示中剂量的转移因子注射液是提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗抗体效价水平的适宜剂量。

本发明生产的猪脾转移因子注射液质量稳定，活性高，不为胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶所破坏，注射及口服均可；临床用量小，见效快，持续时间长，作用不具种属特异性，可交叉用于各种动物：不具抗原性，长期应用也不刺激机体产生抗体，产品应用安全，无任何毒副作用：无任何药物残留。转移因子口服溶液能够增强动物免疫功能，提高抗感染能力，疫苗接种时同时使用，促进疫苗免疫效果。

Claims (8)

1.一种猪脾转移因子注射液的制备方法，包括：

将检验合格的猪脾脏预处理后，初绞1～3遍；

将初绞的猪脾脏精绞研磨1.5～8分钟，制成匀浆；

在所述匀浆中加入甲醛溶液灭活，所述甲醛溶液的加入量占所述匀浆总量的0.1～0.2％；

将灭活的匀浆反复冻融6～10次；所述灭活条件为，37～42℃下灭活18～24小时，中间间隔4～6小时震摇1次；

将反复冻融的匀浆经离心分离、过滤与超滤，得到半成品；

向检验合格的半成品中加入注射用水，得到成品。

2.如权利要求1所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：所述预处理过程中，将猪脾脏解冻融化后，用剪刀剪去脂肪，再用浓度为0.5～1.5％氯化钠溶液清洗2～3次。

3.如权利要求2所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：所述精绞过程中，将初绞的猪脾与纯化水按1:1～3的比例混合，置于胶体磨中研磨。

4.如权利要求3所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：所述离心分离过程中，将反复冻融的匀浆置管式分离机中，将冻融的匀浆，室温下以16000～20000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。

5.如权利要求4所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：所述过滤过程中，将离心分离得到的上清液先经0.43～0.46μm的微孔滤膜第一次过滤，再用0.20～0.26μm的微孔滤膜第二次过滤。

6.如权利要求5所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：所述超滤使用截留分子量为5000～6000道尔顿超滤膜。

7.如权利要求6所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：将检验合格的猪脾脏去除脂肪，用浓度为0.9％氯化钠溶液清洗3次，于绞肉机中初绞1遍；将初绞的猪脾脏与纯化水按1:1.5的比例混合，于胶体磨中研磨5分钟，制成匀浆；向匀浆中加入匀浆总量0.1％的甲醛溶液，37℃灭活24小时，间隔5小时震摇1次；将灭活的匀浆置于-20℃冷库反复冻融8次，融化温度不得超过37℃；将离心分离得到的上清液先用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，再用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，最后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤。

8.如权利要求1所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于：半成品中加入注射用水后，加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3～7.5之间。