CN113304172A - 一种转移因子口服溶液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种转移因子口服溶液的制备方法，在传统的工业化方法的基础上进行了改进，采用通常不易杀死病毒的较低温度(65～70℃)进行加热，在显著降低能耗、防止破坏物料中有效成分的同时能够有效杀灭脂包膜病毒，通过两次超滤可以有效去除非脂包膜病毒；采用升温‑保温‑降温的调配过程配合两次超滤，可以有效杀灭/去除物料中残留的病毒，同时能对其中的有效成分进行充分提取，有效保证了产品的安全性和有效性，能够适应原有工业生产线进行大批量物料的处理、无需更新设备，在保证生产效率的同时可有效节约成本，适于在传统化工生产线上推广使用。

Description

一种转移因子口服溶液的制备方法

技术领域

本发明属于工业化制药技术领域，特别涉及一种转移因子口服溶液的制备方法。

背景技术

转移因子由Lawrence于1949年从结核菌素通过人的血液传递中首次发现，可在个体间乃至种属间转移传递迟发型超敏反应或其它细胞介导的免疫反应，将供体的细胞免疫性传递给受体正常的淋巴细胞，使其获得供体细胞的免疫性。转移因子具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节机体特异、非特异性细胞免疫功能等作用，已在临床应用多年，疗效确切。转移因子是多肽-多核苷酸组成的复合物，一般认为猪脾转移因子溶液中含有多肽、游离氨基酸、核苷酸、多种碱基及核酸降解产物、前列腺素等物质，因此目前工业化生产转移因子大多是以猪脾为原料。然而，一旦供体猪只发生了病毒感染，原料脾脏中也可能携带有这些病毒，并可能在加工过程中残留在转移因子溶液内，进而影响使用的安全性。因此，如何在生产过程中进行有效进行病毒灭活、同时不影响转移因子的品质，并且能够适应大批量物料的工业化处理，成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种转移因子口服溶液的制备方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种转移因子口服溶液的制备方法，包括如下步骤：

S1：将猪脾用纯化水清洗，使用绞肉机将清洗过的猪脾绞碎并收集，加入纯化水、搅拌均匀后研磨，收集研磨液；

S2：将所述研磨液置于速冻冷库中，反复低温冻融三次；

通过反复冻融降低细胞膜稳定性，同时不会影响小分子物质的活性，从而能对活性物质进行充分提取；

S3：将解冻的物料边搅拌边升温，10min内升至65～70℃，保温15min，之后15min内降温至20℃以下，用1:1的稀盐酸调节物料的pH值至3.8～4.2，静置备用；

将物料升温至65～75℃，可以使蛋白质及部分有机物质通过温度范围的有效控制，对药液进行热变性、使有效物质溶出，同时能有效地去除/灭活病毒，且通过相关验证；在65～75℃保温15min，可以使其中的有效物质进一步分解，使大分子物质充分降解；之后，物料经过降温工序、降至20℃，使有效物质可以降解更加完全；

S4：低温下低速离心，收集上清液；

S5：对上清液进行两次超滤，两次超滤之间用20％NaOH调节pH至6.0～7.0，两次超滤之后收集超滤液并搅拌均匀，得到转移因子溶液；

通过两次超滤可以进一步去除上清液中残留的病毒，使消毒更加彻底；

S6：使用注射用水对所述转移因子溶液进行稀释，得到可用于分装的转移因子口服溶液。

进一步地，步骤S1的具体方法如下：

将猪脾缓化后用纯化水清洗三次，使用绞肉机将猪脾绞碎、收集、称重，每个不锈钢桶装量不超过8kg，之后加入绞碎脾重量1.5倍的纯化水，搅拌均匀，使用胶体磨研磨三次，收集研磨液备用。

上述方法可以对大批量物料进行充分研磨，在适应工业化生产条件的前提下有效提高原料处理的效率。

进一步地，步骤S2中，所述冻融过程中冷冻温度不高于125℃、时间不低于24h，缓化温度不高于40℃、时间不超过24h。

上述温度设置可以有效降低细胞膜稳定性，同时能确保有效成分的活性不受损失。

进一步地，步骤S3中，所述升温的方式是水浴加热，所述降温的方式是冰水降温，所述静置的时间不低于40min。

上述方法可以使升温和降温的过程较为温和而均匀，可以在传统的工业生产线上对物料进行处理，从而防止对有效成分的活性造成影响。

进一步地，步骤S4中，离心的条件为在0～5℃下、2800r/min离心60min。

进一步地，步骤S5中，先用单层绢布对上清液进行过滤，然后进行超滤，两次超滤的压力表示值均不超过0.1Mpa。

进一步地，步骤S5中，第一次超滤之前用纯化水冲洗、超滤之后用0.4％碱液封。

进一步地，步骤S6包括如下步骤：

浓配工序，用注射用水将所述转移因子溶液稀释至理论配液量的60％，并进行搅拌循环；

稀配工序，用40℃以下的注射用水补足药液体积，并进行搅拌循环，得到转移因子口服溶液。

进一步地，所述浓配工序的具体方法如下：

将所述转移因子溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤至浓配罐中，再经5000分子量超滤装置过滤到稀配罐中，超滤完毕后，将经过超滤的注射用水加入所述稀配罐中、至达到理论配液量的60％。

进一步地，所述稀配工序的具体方法如下：

对所述浓配工序得到的溶液进行搅拌循环10min，检测后用40℃以下的注射用水补足药液体积，用0.22μm的微孔滤膜过滤后搅拌循环10min，测定pH值为6.0～7.5，即得到所述转移因子口服溶液。

上述操作提供了在传统工业生产线的基础上、基于上述转移因子提取物制备口服溶液的最佳方法，应用该方法可得到浓度均匀、安全性高、稳定性好的口服溶液。

本发明的有益效果如下：本发明提供了一种转移因子口服溶液的制备方法，在传统的工业化方法的基础上进行了改进，采用通常不易杀死病毒的较低温度(65～70℃)进行加热，在显著降低能耗、防止破坏物料中有效成分的同时能够有效杀灭脂包膜病毒，通过两次超滤可以有效去除非脂包膜病毒；采用升温-保温-降温的调配过程配合两次超滤，可以有效杀灭/去除物料中残留的病毒，同时能对其中的有效成分进行充分提取，有效保证了产品的安全性和有效性，能够适应原有工业生产线进行大批量物料的处理、无需更新设备，在保证生产效率的同时可有效节约成本，适于在传统化工生产线上推广使用。

具体实施方式

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。需要说明的是，由于本方法是应用于大规模工业化生产线上，其中部分操作(例如调节pH值、定容体积等)的精确程度和要求略低于实验室水平，因此实施例中部分数值无法提供准确值、只能提供范围值，凡在给定范围内的数值均可认为符合该方法的规定。

实施例1

一种转移因子口服溶液的制备方法，包括如下步骤：

S1：将猪脾缓化后用纯化水清洗三次，使用绞肉机将猪脾绞碎、收集、称重，每个不锈钢桶装量不超过8kg，之后加入绞碎脾重量1.5倍的纯化水，搅拌均匀，使用胶体磨研磨三次，收集研磨液备用；

S2：将研磨液置于速冻冷库中，反复低温冻融三次，冷冻温度不高于125℃、时间不低于24h，缓化温度不高于40℃、时间不超过24h；

S3：将解冻的物料边搅拌边用90～100摄氏度水浴加热，10min内升温至65℃，保温15min，之后用冰水降温、15min内降温至15℃，用1:1的稀盐酸调节物料的pH值至4.0，静置备用；

S4：0～5℃下、2800r/min离心60min，收集上清液；

S5：用单层绢布对上清液进行过滤，然后进行超滤、压力表示值不超过0.1Mpa，对超滤液用20％NaOH调节pH至6.0～7.0，用单层绢布过滤后再次进行超滤、压力表示值不超过0.1Mpa，收集超滤液并搅拌均匀，得到转移因子溶液；

S6：使用注射用水对转移因子溶液进行稀释，得到可用于分装的转移因子口服溶液。

实施例2

一种转移因子口服溶液的制备方法，包括如下步骤：

S1：将猪脾缓化后用纯化水清洗三次，使用绞肉机将猪脾绞碎、收集、称重，每个不锈钢桶装量不超过8kg，之后加入绞碎脾重量1.5倍的纯化水，搅拌均匀，使用胶体磨研磨三次，收集研磨液备用；

S2：将研磨液置于速冻冷库中，反复低温冻融三次，冷冻温度不高于125℃、时间不低于24h，缓化温度不高于40℃、时间不超过24h；

S3：将解冻的物料边搅拌边用90～100摄氏度水浴加热，10min内升温至70℃，保温15min，之后用冰水降温、15min内降温至20℃，用1:1的稀盐酸调节物料的pH值至4.2，静置备用；

S4：0～5℃下、2800r/min离心60min，收集上清液；

S5：用单层绢布对上清液进行过滤，然后进行超滤、压力表示值不超过0.1Mpa，对超滤液用20％NaOH调节pH至6.0～7.0，用单层绢布过滤后再次进行超滤、压力表示值不超过0.1Mpa，收集超滤液并搅拌均匀，得到转移因子溶液；

S6：使用注射用水对转移因子溶液进行稀释，得到可用于分装的转移因子口服溶液。

实施例3

一种转移因子口服溶液的制备方法，包括如下步骤：

S1：将猪脾缓化后用纯化水清洗三次，使用绞肉机将猪脾绞碎、收集、称重，每个不锈钢桶装量不超过8kg，之后加入绞碎脾重量1.5倍的纯化水，搅拌均匀，使用胶体磨研磨三次，收集研磨液备用；

S2：将研磨液置于速冻冷库中，反复低温冻融三次，冷冻温度不高于125℃、时间不低于24h，缓化温度不高于40℃、时间不超过24h；

S3：将解冻的物料边搅拌边用90～100摄氏度水浴加热，10min内升温至68℃，保温15min，之后用冰水降温、15min内降温至18℃，用1:1的稀盐酸调节物料的pH值至3.8，静置备用；

S4：0～5℃下、2800r/min离心60min，收集上清液；

S5：用单层绢布对上清液进行过滤，然后进行超滤、压力表示值不超过0.1Mpa，对超滤液用20％NaOH调节pH至6.0～7.0，用单层绢布过滤后再次进行超滤、压力表示值不超过0.1Mpa，收集超滤液并搅拌均匀，得到转移因子溶液；

S6：浓配工序：将转移因子溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤至浓配罐中，再经5000分子量超滤装置过滤到稀配罐中，超滤完毕后，将经过超滤的注射用水加入稀配罐中、至达到理论配液量的60％；

稀配工序：对浓配工序得到的溶液进行搅拌循环10min，检测后用40℃以下的注射用水补足药液体积，用0.22μm的微孔滤膜过滤后搅拌循环10min，测定pH值为6.0～7.5，即得到转移因子口服溶液。

试验例1不同制备方法病毒灭活效果比较

一.指示病毒

1)脑心肌炎病毒(EMCV)，购自北京北纳创联生物技术研究所，溯源至ATCC，货号为ATCCVR-129B。

2)猪细小病毒(PPV)，购自中国兽医药品监察所菌种室，货号为CVCC AV31。

3)伪狂犬病毒(PRV)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，货号为CVCCAV24。

4)水疱性口腔炎病毒(VSV)，购自中国典型培养物保藏中心，货号为CCTCCGDV027。

5)牛呼肠孤病毒3型(ReoV-3)，购自中国典型培养物保藏中心，货号为CCTCCGDV070。

二、细胞毒性试验

指示病毒VSV和EMCV采用Vero细胞培养，PRV和PPV采用ST细胞培养，ReoV-3采用LLC-MK2细胞培养，因此将各样品进行10～100倍稀释，接种于Vero细胞或ST细胞或LLC-MK2细胞进行细胞毒性试验。表4-1结果表明：匀浆液和加热处理后的溶液50倍稀释度对Vero细胞和ST细胞生长均无影响，因此加热步骤指示病毒PRV和VSV的滴度最低检测限均为1.7logs；表4-2结果表明：一次超滤液10倍稀释度对Vero细胞、ST细胞和LLC-MK2细胞生长均无影响，因此超滤步骤指示病毒EMCV、PPV和ReoV-3的滴度最低检测限均为1.0logs。

表1加热步骤样品对细胞毒性对照及细胞空白对照检测结果

表2超滤步骤样品对细胞毒性对照及细胞空白对照检测结果

二、加热步骤对指示病毒的灭活效果

于2017年9月选取三批样品，分别经过研磨和三次冻融后得到匀浆液，分别用实施例1～3提供的步骤S3的方法对上述匀浆液进行处理，匀浆液流水解冻后，每个实验处理取出72ml的样品，置于91±1℃的恒温水浴锅中，用玻璃棒轻轻搅拌使其受热均匀，待样品温度升至所需的温度后分别转移至相应温度的水浴锅中，按照匀浆液:病毒(W:V)＝9:1的比例加入指示病毒，混匀后开始计时保温；另外设置如下对照例：

C1，细胞毒性对照：取适量匀浆液，将其倍比稀释后接种至细胞培养孔，测定不同稀释度对细胞的毒性；

C2，细胞毒性对照：取适量匀浆液，置于91±1℃恒温水浴锅中搅拌加热，待匀浆液温度升至65℃时转移至66±1℃恒温水浴锅中，开始计时，水浴静置保温15min后取出，用冰水降温至20℃以下后从中取适量倍比稀释后接种至细胞培养孔，测定不同稀释度对细胞的毒性

C3，病毒对照：考察10倍稀释后病毒本身的变化情况；

E，起始滴度对照：取适量匀浆液，按9:1(样品：病毒，V:V)比例加入指示病毒，混匀，立即从中取样50倍稀释后测定病毒滴度；

H，升温对照：取适量匀浆液，按9:1(样品：病毒，V:V)比例加入指示病毒，混匀后将其置于66±1℃恒温水浴锅中，待料液温度升至65℃时立即从中取样用预冷的培养基50倍稀释后测定病毒滴度，以考察升温至65℃的升温过程对病毒的影响；

B，未处理对照：将起始滴度对照组中取样后剩余染毒匀浆液室温放置，待试验组试验结束后从中取样50倍稀释后测定病毒滴度，以考察相同工艺时间内样品本身对病毒的影响；

S，终止效果验证对照：取经保温15min后的浆液，用预冷的培养基50倍稀释后，从中取适量按9:1(样品：病毒，V:V)比例加入指示病毒，从中取样50倍测定病毒滴度，以考察用预冷的培养基50倍稀释能否终止加热对指示病毒的灭活作用；

C4，细胞空白对照：用于测定病毒滴度时排除细胞自身的影响；

C5，加热条件对照，升温至72℃后进行保温，考察温度与灭菌效果的相关性；

C6，加热条件对照，升温至63℃后进行保温，考察温度与灭菌效果的相关性。

实验组和C5～C6均分别在0、5min、10min、15min处取样，结果如下表所示。

表3加热灭活样品中PRV滴度测定结果(重复检测两次)

表4加热灭活样品中VSV滴度测定结果(重复检测两次)

由表可知，在保温5min后，实验组各组样品中PRV和VSV滴度即降至检测限1.7logs以下、滴度平均下降值≥4.3logs，表明采用本申请提供的加热方法能够有效灭活脂包膜指示病毒PRV和VSV；C5的滴度变化趋势与实验组相同，表明小幅度提升加热温度对时杀毒效果不会明显提升；而C6在保温达到15min时滴度仍未降到1.7，表明即使小幅度地降低温度会严重影响灭菌效果。因此，考虑到节省能耗、降低资源和时间成本，本申请提供的65～70℃的加热条件可以认为是最佳选择。

三、超滤步骤对指示病毒的灭活效果

于2017年9月选取三批样品，分别经过研磨和三次冻融后得到匀浆液，采用实施例1提供的超滤方法进行一次超滤后，按照一次超滤液:病毒(V:V)＝100:1的比例加入指示病毒，混匀后采用北京旭邦膜设备有限责任公司的中空纤维超滤柱(膜面积为0.3M2)在0.1MPa压力下进行超滤，当滤出管滤出第一滴液体时开始计时，当滤出液体积达到3000mL时，超滤结束。记录超滤时间、滤出液体积和通量信息，分别在滤出500mL、1000mL、1500mL、2000mL和滤出终点3000mL时取样测定病毒滴度。另外设置如下对照例：

C1，细胞毒性对照：从2.2.1标记为TF(批次)的一次超滤液中取样3份，每份2mL，标记为C1-UF-STSW(批次)，其中两份测定一次超滤液本身对指示细胞的影响，另一份置于-25℃冰箱冷冻保存；

C2，病毒对照：取指示病毒EMCV 0.1mL，按1:100(病毒：培养基，V:V)比例加入培养基稀释，混匀后从中取样3份，每份0.5mL，用培养基10倍稀释后各取2mL，标记为C2-EMCV-UF-STSW(批次)，其中两份测定稀释后的病毒滴度，另一份置于-25℃冰箱冷冻保存；

E，起始滴度对照：取2.2.1中标记为TF(批次)的一次超滤液3.2L于3L烧杯中，按照100:1(样品：病毒，V:V)的比例加入EMCV32mL，用玻棒搅拌混匀后标记为EMCV-TF(批次)；立即从中取样3份，每份0.5mL，用培养基10倍稀释后各取2mL，标记为E-EMCV-UF-STSW(批次)。其中两份测定超滤前一次超滤液中的病毒滴度，并以此作为试验组病毒起始滴度，另一份置于-25℃冰箱冷冻保存；

B，未处理对照：从标记为EMCV-TF(批次)的染毒一次超滤液中取出30mL，室温静置，记录开始时间，待试验组超滤结束后，从中取样3份，每份0.5mL，用培养基10倍稀释后各取2mL，标记为B-EMCV-UF-STSW(批次)。其中两份测定相同工艺时间内一次超滤液本身对病毒的影响，另一份置于-25℃冰箱冷冻保存；

C3，细胞空白对照：用于测定病毒滴度时排除细胞自身的影响；

C4，超滤次数对照：超滤结束之后再进行一轮超滤，在最后一次超滤时按照实施例的取样方式进行取样。

结果如下表所示：

表5超滤去除病毒通量信息

表6超滤去除样品中EMCV滴度测定结果(重复检测两次)

表7超滤去除样品中PPV滴度测定结果(重复检测两次)

表8超滤去除样品中ReoV-3滴度测定结果(重复检测两次)

由表可知，一次超滤液加入指示病毒后，经膜面积为0.3M2的中空纤维超滤柱在0.1MPa压力下超滤，截留液中三种病毒滴度均大于样品起始滴度(-0.2logs)，表明指示病毒被超滤柱截留；在超滤过程中，三种病毒滴度均降至检测限1.0logs以下，滴度平均下降值≥4.3logs，超滤结束后，三种病毒滴度均降至检测限1.0logs以下，滴度平均下降值≥4.1log，表明本申请提供的超滤方法能够有效去除非脂包膜指示病毒EMCV、PPV以及ReoV-3；B组的病毒滴度未能显著减低，表明一轮超滤不能有效去除病毒。C4的变化趋势与实验组相同，表明进行两轮超滤已经能够满足去除病毒的需求。因此，考虑到降低经济和时间成本，本申请提供的超滤方法可以认为是最佳选择。

通过上述两种消毒方法结合，可以有效去除原料中的多种猪易感病毒，从而显著提高产品的安全性。

上述方法已被申请人应用于生产转移因子口服溶液(批文号为国药准字H23021810)的生产，可确保产品质量稳定、使用安全，且较传统方法显著降低了工艺成本。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种转移因子口服溶液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将猪脾用纯化水清洗，使用绞肉机将清洗过的猪脾绞碎并收集，加入纯化水、搅拌均匀后研磨，收集研磨液；

S2：将所述研磨液置于速冻冷库中，反复低温冻融三次；

S3：将解冻的物料边搅拌边升温，10min内升至65～70℃，保温15min，之后15min内降温至20℃以下，用1:1的稀盐酸调节物料的pH值至3.8～4.2，静置备用；

S4：低温下低速离心，收集上清液；

S5：对上清液进行两次超滤，两次超滤之间用20％NaOH调节pH至6.0～7.0，两次超滤之后收集超滤液并搅拌均匀，得到转移因子溶液；

S6：使用注射用水对所述转移因子溶液进行稀释，得到可用于分装的转移因子口服溶液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体方法如下：

将猪脾缓化后用纯化水清洗三次，使用绞肉机将猪脾绞碎、收集、称重，每个不锈钢桶装量不超过8kg，之后加入绞碎脾重量1.5倍的纯化水，搅拌均匀，使用胶体磨研磨三次，收集研磨液备用。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述冻融过程中冷冻温度不高于125℃、时间不低于24h，缓化温度不高于40℃、时间不超过24h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述升温的方式是水浴加热，所述降温的方式是冰水降温，所述静置的时间不低于40min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，离心的条件为在0～5℃下、2800r/min离心60min。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，先用单层绢布对上清液进行过滤，然后进行超滤，两次超滤的压力表示值均不超过0.1Mpa。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，第一次超滤之前用纯化水冲洗、超滤之后用0.4％碱液封。

8.如权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S6包括如下步骤：

浓配工序，用注射用水将所述转移因子溶液稀释至理论配液量的60％，并进行搅拌循环；

稀配工序，用40℃以下的注射用水补足药液体积，并进行搅拌循环，得到转移因子口服溶液。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述浓配工序的具体方法如下：

将所述转移因子溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤至浓配罐中，再经5000分子量超滤装置过滤到稀配罐中，超滤完毕后，将经过超滤的注射用水加入所述稀配罐中、至达到理论配液量的60％。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述稀配工序的具体方法如下：

对所述浓配工序得到的溶液进行搅拌循环10min，检测后用40℃以下的注射用水补足药液体积，用0.22μm的微孔滤膜过滤后搅拌循环10min，测定pH值为6.0～7.5，即得到所述转移因子口服溶液。