CN106552264A - 一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂及其制作方法。其采用的步骤为：选取健康牦牛的新鲜脾脏，去除脂肪、被膜及内部结缔组织后，冰冻保存，将冻存的牦牛脾脏取出融化，用组织捣碎机绞碎，加等重量的无菌三蒸水后，用高速组织捣碎机高速匀浆2 次，每次 10min，制备好的匀浆液置‑ 20℃ 冰冻，反复冻融5 次，最后一次融化后以离心，取上清，将上清置透析袋内，用无热原的冷生理盐水在 0～4℃ 环境下透析过夜，收集袋外透析液经滤膜过滤除菌，无菌分装后冰冻保存。本产品进入机体后，能迅速发挥其效应，并持续数月甚至更长，有效提高了疫苗的免疫抗体水平，能快速、完全被机体吸收，且无任何残留，机体注射本产品后增重明显，羊精神活泼。

Description

一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂及其制作方法

一、技术领域：

本发明涉及生物学免疫技术领域，具体涉及一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂及其制作方法。

二、背景技术：

羊痘是人类发现的最早的动物疾病之一，其发现历史可以追溯到公元2世纪在中国，羊痘又被称为“羊天花”，其病原为羊痘病毒。世界动物卫生组织(OIE)将羊痘定为必须申报的动物疾病，而我国将其列为一类传染病。羊痘病原属于痘病毒科(poxiridae)，脊索动物痘病毒亚科(chordopoxvirade)，羊痘病毒属(capripoxvirus)成员。羊痘病毒属包含3个成员，分别是绵羊痘病毒(SPV)、山羊痘病毒(GPV)、结节性皮肤病病毒(lumpy skindisease virus，LSDV)，其中SPV主要感染绵羊，GPV感染山羊，而LSDV则主要感染牛，可以通过接触及节肢动物进行传播。三者之间在血清上呈交叉反应，但在自然条件下一般不会发生交叉感染。羊痘在全球的流行范围比较广，危害性比较大，主要表现为较高的幼畜死亡率，以及对动物皮肤，特别是皮用动物皮毛的损害。随着国际贸场日新月异的发展频繁，羊痘的传播范围也在逐年扩大。由于羊痘爆发所带来的贸易限制，给以放牧为主要经济来源的国家和地区以及这些地区的牧民，带来了巨大的经济损失。羊痘目前尚无特效的治疗方法，主要仍以免疫接种为主要预防措施，一旦发生感染，并无特效药物，且不同品种的绵羊对疫苗的免疫效果不尽一致。

目前常用疫苗主要有两类：灭活苗和弱毒苗。灭活苗只能提供短期保护，不利于在生产中应用；弱毒苗的安全性则受到质疑，有潜在散毒的危险性，可能导致一些动物发生疾病和死亡。亚单位疫苗和基因缺失疫苗的发展趋势虽备受青睐，但用于临床还需假以时日。一般来说，SPV和GPV具有宿主特异性，在一定时间发生的病例几乎总是只发生于绵羊或山羊中的一种动物，而不是同时发生于两种宿主。然而，两种病毒会时时跨越物种传播障碍，在不同宿主群体发生感染，只是发生于天然宿主的感染表现得更严重。而且绵羊痘疫苗或山羊痘疫苗只能诱发产生对山羊或绵羊的部分交叉保护力。

青海地处青藏高原腹地，畜牧业是青海农牧业的主体产业。青藏高原高寒缺氧的自然生态环境，孕育出了牦牛、藏羊等独具特色的优势畜种，成为青海省各族牧民赖以为生的生产资料和生活资料。据2014年资料显示，全省共存栏藏羊达1400万只、约占中国藏羊存栏的46％。

三、发明内容

本发明的提供一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂及其制作方法，其可协同疫苗作用，提高机体细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，并延长抗体高峰期，使之维持更长的时间。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：所述的制作方法为：选取牦牛的新鲜脾脏，绞碎匀浆，反复冻融后冷冻离心，取上清液透析、冰冻、解冻、过滤后制成成品。

具体的制作方法为选取屠宰后的牦牛新鲜脾脏，去除脂肪、被膜及内部结缔组织后，冰冻保存，将冻存的牦牛脾脏取出融化，用组织捣碎机绞碎，加等重量的无菌三蒸水后，用高速组织捣碎机高速匀浆2次，每次10min，制备好的匀浆液置-20℃冰冻，反复冻融5次，最后一次融化后以3000r/min离心30min，取上清液，将上清液置透析袋内，用无热原的冷生理盐水在0～4℃环境下透析过夜，收集袋外透析液即为制备的转移因子，经滤膜过滤除菌，无菌分装后冰冻保存。

所述的高速组织捣碎机的转速为12000r/min。

所述的组织捣碎匀浆过程采用间歇方式，即每次匀浆3分钟停止10分钟。

所述的透析袋截留分子量为10KD。

所述的牦牛来源为青藏高原牦牛。

所述的增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法制备的生物性免疫制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1.本产品进入机体后，能迅速发挥其效应，并持续数月甚至更长，有效提高了疫苗的免疫抗体水平，能快速、完全被机体吸收，且无任何残留，机体(羊)注射本产品后增重明显，羊精神活泼。

2、本产品使用途径为肌肉注射，可选择部位随意，且与疫苗同时进入机体效果最佳，最佳注射量为2mL/只。

3、本产品作为一种新型免疫促进剂，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、增强机体免疫机能，提高机体抵抗力和减少免疫抑制、免疫麻痹、免疫失败、免疫不全、免疫应激发生的比例，且其无毒、无抗原性、无种属特异性，除作为免疫佐剂外，还可用于疾病的辅助治疗，疗效显著。

四、具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的详细说明：

一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法为：从屠宰车间选取屠宰后的健康牦牛新鲜脾脏，(健康牦牛为青藏高原特有物种牦牛)并经检视脾脏无病变、色泽正常后，除去脾脏表面脂肪、被膜及内部的结缔组织后，冰冻保存，将冻存的牦牛脾脏取出融化，用组织捣碎机绞碎，加等重量的无菌三蒸水后，用高速组织捣碎机高速(12000r/min)匀浆2次，每次10min。制备好的匀浆液置-20℃冰冻，反复冻融5次。最后一次融化后以3000r/min离心30min，取上清液，将上清液置透析袋内(截留分子量为10KD)，用无热原的冷生理盐水在0～4℃环境下透析过夜，收集袋外透析液即为制备的转移因子，经滤膜过滤除菌，无菌分装后冰冻保存。

组织捣碎匀浆过程采用间歇方式，即每次匀浆3分钟停止10分钟。

本发明所含活性成分均来自动物免疫细胞，生物活性因子进入藏羊体内后，其作用的靶细胞均为藏羊免疫细胞，不仅可激活淋巴细胞E受体，增加E玫瑰花环的形成数目，而且还可将免疫信息通过TF转移给受体淋巴细胞，使细胞获得这种免疫信息而产生识别特异性抗原的受体，当有该种抗原存在时，这种特异性识别受体就会与特异性抗原结合而触发受体细胞活化，从增强淋巴细胞的活性而导致其高度分化增殖，协同疫苗，显著提高免疫接种羊的体液免疫应答能力。

本发明使用后见效快，机体免疫应答期大大缩短，2-3周后抗体的产生就可达到高峰期，且维持时间很长。

本发明为生物活性成分，经注射途径进入机体效果最佳，因此直接肌肉注射是保证本产品发挥最佳效果的前提。本产品经肌肉注射在增强藏羊羊痘疫苗免疫抗体时，效果明显。

实验：

选取60只藏羊进行了抗体水平检测试验。试验羊随机分为对照组(注射疫苗)，实验组1(先连续注射3d本发明制剂后注射疫苗)，实验组2(疫苗与本发明制剂同时注射)，实验组3(先注射疫苗后连续注射本发明制剂3d)，各实验组中本发明制剂分为三个剂量组(1mL，2mL，4mL)，每小组5只，注射转移因子浓度为0.1μg/mL。各试验组和对照组分别于首免前1d，首免后第7d、14d、21d、28d、35d由颈静脉采血，采用ELISA试剂盒(由中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测羊痘抗体水平。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验羊

由青海省湟中县世彦养殖场提供，同品种藏羊选取60只随机分为4组，每组15只。试验羊采取统一的日粮配方和饲养管理，专人负责记录各种试验数据。1.1.2羊痘疫苗

羊痘疫苗，青海生物药品厂生产，批准文号:兽药生字(2011)010121003，生产批号:201420，规格:100头份/瓶。

羊痘疫苗稀释液，青海生物药品厂生产，批准文号:兽药生字(2011)010121004，生产批号:201412，规格:100头份/瓶。

1.1.3本发明制剂

实验室保存的本发明制剂冻干粉，称取1g冻干粉溶于1L灭菌生理盐水中，浓度为1μg/mL。

1.1.4羊痘抗体检测试剂

羊痘间接ELISA抗体检测试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。

1.2方法

1.2.1试验设计

羊痘疫苗常规种1只份/只，本发明制剂注射液具体用量、用法如下：

对照组:皮下注射羊痘疫苗

实验组1:先肌肉注射本发明制剂，连续3d，再注射羊痘疫苗，发明制剂注射剂量分为3组，分别为1mL、2mL、4mL，每小组5只羊。

实验组2:肌肉注射发明制剂同时注射羊痘疫苗，连续3d，发明制剂注射剂量分为3组，分别为1mL、2mL、4mL，每小组5只羊。

实验组3:先注射羊痘疫苗，再肌肉注射发明制剂，连续3d，发明制剂注射剂量分为3组，分别为1mL、2mL、4mL，每小组5只羊。

1.2.2采血、分离血清

各试验组和对照组分别于首免前1d，首免后第7d、14d、21d、28d，颈静脉采血，分离血清。用羊痘间接ELISA试剂盒检测羊痘抗体水平。

1.2.3 ELISA检验

1.2.3.1加样

待检血清 将待检血清用血清样品稀释液1:100稀释，纵向加两个复孔，每孔100μL

对照 每块酶标版需要设置标准阴性阳性血清对照。标准阴性血清设2孔，标准阳性血清设2孔，每孔直接加入100μL(注：阴阳性血清已做稀释，直接使用)；空白对照设2孔，每孔加100μL样品稀释液

1.2.3.2孵育

加样完毕后放置于37℃温箱内孵育1h。

1.2.3.3洗涤

取出酶标版，甩干，用洗涤液(1×PBST)洗涤3次，在吸水纸上甩干。

1.2.3.4酶结合物

用血清稀释液将兔抗羊—HRP结合物按1:300稀释，每孔加入100uL；置于37℃温箱内孵育1h。

1.2.3.5洗涤

取出酶标版，甩干，用洗涤液(1×PBST)洗涤3次，在吸水纸上甩干。

1.2.3.6显色

每孔加入底物(TMB)溶液100μL，置37℃避光静置10分钟。

1.2.3.7终止

每孔加入50uL终止液。

1.2.3.8测定

在酶标仪450nm波长处，测定酶标版的每孔光吸收值。OD值≥0.25时判定为阳性，＜0.25时判定为阴性。(说明书说明OD值≥0.25时判定为阳性)

2.1各组羊痘抗体水平结果

如表1—表4所示。

表1对照组抗体水平

注：OD≥0.25判定为阳性

从表1看，注射疫苗后7d即可产生抗体，呈逐渐上升趋势，表示疫苗免疫有效。

表2实验组1抗体水平

注:OD≥0.25判定为阳性

从表2看，首免7d各剂量组即可产生抗体，呈逐渐上升趋势，2mL剂量组效果明显。

表3实验组2抗体水平

注：OD≥0.25判定为阳性

由表3看出，nTF与疫苗同时注射后7d，各剂量组均能快速产生抗体，随后抗体水平逐渐上升，到35d时阳性率达到100％。

表4实验组3抗体水平

注：OD≥0.25判定为阳性

由表4看出，注射nTF 7d后，各剂量组均能产生抗体，但4mL剂量组抗体水平不高，直到35d其抗体水平才上升到与其他剂量组相近。

综合表1～表4，3个实验组都产生了抗体，实验组1抗体水平增长平稳，2ml剂量组效果最佳；实验组2虽然7d时有阴性，但7d后抗体水平增长显著，21d后趋于平稳，抗体产生的效果最为明显，其中以2ml剂量组抗体水平增长最明显；实验组3虽然都产生了抗体，但同对照组相对比并无显著的差异，随时间变化21d至35d 4mL剂量组对羊痘疫苗抗体水平有抑制作用。说明发明制剂对羊痘疫苗抗体产生有增强作用，但发明制剂在注射时需要选择合适剂量，不是注射量越高效果越好，高剂量反而会抑制抗体的产生。

结果表明，与对照组比较，实验组1、2、3与羊痘疫苗联合应用的免疫作用都是明显的，但实验组3，4mL剂量组随免疫时间增长反而抑制其抗体水平，其增效作用的排序为实验组2＞实验组1＞实验组3。说明发明制剂可作为羊痘疫苗的免疫增效剂，筛选最佳注射量为2mL。

Claims (7)

1.一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：所述的制作方法为：选取牦牛的新鲜脾脏，绞碎匀浆，反复冻融后冷冻离心，取上清液透析、冰冻、解冻、过滤后制成成品。

2.根据权利要求1所述的一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：具体的制作方法为选取屠宰后的牦牛新鲜脾脏，去除脂肪、被膜及内部结缔组织后，冰冻保存，将冻存的牦牛脾脏取出融化，用组织捣碎机绞碎，加等重量的无菌三蒸水后，用高速组织捣碎机高速匀浆2 次，每次 10min，制备好的匀浆液置- 20℃ 冰冻，反复冻融5次，最后一次融化后以3000 r/ min 离心30 min，取上清液，将上清液置透析袋内，用无热原的冷生理盐水在 0～4℃ 环境下透析过夜，收集袋外透析液即为制备的转移因子，经滤膜过滤除菌，无菌分装后冰冻保存。

3.根据权利要求2所述的一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：所述的高速组织捣碎机的转速为12000 r/ min。

4.根据权利要求3所述的一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：所述的组织捣碎匀浆过程采用间歇方式，即每次匀浆3分钟停止10分钟。

5.根据权利要求4所述的一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：所述的透析袋截留分子量为10KD 。

6.根据权利要求4所述的一种增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法，其特征在于：所述的牦牛来源为青藏高原牦牛。

7.如权利要求1所述的增强羊痘疫苗抗体的生物性免疫制剂的制作方法制备的生物性免疫制剂。