CN104480175A - 一种酶解卵白蛋白的方法及酶解产物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶解卵白蛋白的方法，包括如下步骤，(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；(2)对(1)步酶解后的混合物加热，过滤去除未酶解的卵白蛋白残渣；(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。本发明的优点在于，木瓜乳汁中简便、低成本、高纯度地提取出了木瓜肽酶，并且木瓜肽酶是一种天然生物活性物质，采用该肽酶对卵白蛋白进行酶解，能够得到分子量约为500-1000的小分子寡肽和氨基酸，酶解率高，并且得到的小分子寡肽和氨基酸可以作为制备治疗肝病的药物使用，也能够进一步促进机体和皮肤的吸收。
Description
技术领域
本发明属于生物酶解的技术领域，具体是一种酶解卵白蛋白的方法及酶解产物的应用。
背景技术
卵白蛋白是卵白中属于白蛋白部分的蛋白质。通常指的是其主要成分(约占卵白的65％)的卵清蛋白(Al bumi n)。除此外卵白中还存在着少量(约14％)的称为伴清蛋白(Conal bumin)的白蛋白，但是卵白蛋白在应用时不易直接被机体和皮肤吸收，必须将它水解成氨基酸和多肽才能被机体吸收。
现有技术中有很多方法将卵白蛋白酶解，例如采用酸或碱的方法来水解卵白蛋白，但是现有的这种方法往往会发生水解后氨基酸被全部或部分破坏，例如：用酸水解卵白蛋白时常造成丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸的部分破坏，色氨酸全部破坏，当用碱水解时可引起精氨酸及胱氨酸的部分及全部破坏，影响氨基酸的利用，无论用酸水解或碱水解都增加了分离纯化工作的难度并造成环境污染，本公司在93年时开发出了一种比较先进的酶解方法，具体见专利申请号为93112571.5，发明名称为“一种酶解保健液-酶解卵白蛋白溶液”的专利文件，但是，该专利公开的方法虽然解决的酸、碱酶解的缺陷，可是仍达不到酶解出最佳的小分子肽，为了更精确的获得小分子多肽，最大限度地使机体吸收，扩大受用人群，所以还需要开发出新的酶解方法。
发明内容
为了解决现有技术中酸、碱方法破坏卵白蛋白中氨基酸的技术缺陷、以及采用木瓜蛋白酶仍得不到最佳的小分子多肽的问题，本发明公开了一种新的酶解卵白蛋白的方法及酶解产物的应用，进一步改进了酶解方法， 得到最佳的小分子多肽，并且发现了酶解产物新的用途。
实现上述目的，所采用的技术方案为，本发明公开的一种酶解卵白蛋白的方法，包括如下步骤，(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；
(2)对(1)步酶解后的混合物加热，去除未酶解的卵白蛋白残渣；
(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。木瓜乳汁中存在多种酶，主要含有四种半胱氨酸酶:木瓜蛋白酶、木瓜肽酶、木瓜凝乳蛋白酶A和B。除此之外，还含有溶菌酶，Ⅱ型几丁质酶和脂肪酶等，各种酶的氨基酸序列不同，其生化性质也有很大差别。本发明经过试验，最终采用木瓜肽酶将卵白蛋白酶解，将原先分子量约为37000-49000的卵白蛋白，酶解后最大限度的得到小分子的寡肽和氨基酸，不仅解决了用酸、碱酶解对氨基酸的破坏问题，与现有技术中采用木瓜蛋白酶对卵白蛋白进行酶解后对比，木瓜蛋白酶酶解产物中最小的分子量的肽为八肽物质，其分子量约为960左右，另外含有的肽分子量约为6×104，本发明酶解产物中含有分子量约为500-1000的小分子寡肽和氨基酸酶解产物，8肽以下含量大于50％，其中5肽含量接近20％，由此可以看出，本发明酶解方法能够得到5肽的物质，并且最小分子量为500，所以采用该酶解产物可以进一步的促进人体皮肤或肠胃的吸收，并且经该方法得到的酶解产物还被验证了有新的用途。
进一步的，步骤(1)提取木瓜肽酶的方法为：①将木瓜粉溶解于0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中；
②向①步混合液中加入硫酸铵，使混合液的饱和度达到0.45，放置12-16h后抽滤，将上清液体用质量浓度0.1MNaCl溶液透析；
③将②步得到的透析液上柱CM Sepharose，用质量浓度为0.05－1.0MNaCl进行梯度洗脱，收集最后流出的液体；
④向③步得到的液体加入硫酸铵直至溶液饱和度达到0.85，放置 12-16h后抽滤，将得到的沉淀用质量浓度0.05M NaCl溶液透析。将透析液冷冻干燥即可得到木瓜肽酶粉末。
木瓜肽酶的分离纯化不易操作，本发明选择该方法将木瓜肽酶提取出来，提取的纯度最高，操作方法最为简便。
优选的，步骤(2)中卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水的质量比为100:5-10:1-2.5:2000。所选择的质量配比在成本最低的条件下，酶解的最为充分。
优选的，步骤(2)中酶解温度为45-65℃，PH为6-7，酶解时间为12-24h，该参数条件正好可以使卵蛋白充分酶解为小分子多肽和氨基酸。
进一步的，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白残渣的具体方法为，酶解后将温度加热至90-100℃变性5-10分钟，使蛋白酶失活，将酶解产物过滤，得到上清液。
进一步的，步骤(4)灭菌的具体方法为，向经步骤(3)处理后的酶解产物中加入质量浓度为0.02-0.05％的抗氧化剂，搅拌均匀后，在温度为121-125℃条件下进行湿热灭菌，所采用的抗氧化剂为维生素C与焦亚硫酸钠按照质量配比10:0.5-1的混合物。
本发明发现，经该酶解方法得到的卵白蛋白酶解产物，能够作为作为制备治疗肝硬化、肝炎、糖尿病药物的应用。采用一种天然活性物质，使原来分子量较大的、不易被人体直接吸收的卵白蛋白，水解成一种含有易被人体吸收的小分子寡肽和氨基酸的酶解产物，得到的酶解产物无毒副作用，并且经试验发现该酶解产物助于肝合成白蛋白，还因为得到的分子量约为500-1000的小分子多肽可修复组织肝细胞，所以对肝硬化、肝炎、以及对化疗后造成的免疫功能减退及白细胞下降具有修复及提高的作用；糖尿病患者有糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱，特别是蛋白质分解代谢增加，多数有低白蛋白血症，容易出现感染，本发明得到的酶解产物通过调节蛋白质的分解代谢，从而将脂肪、蛋 白质代谢的紊乱调节正常的代谢，以此作为制备治疗糖尿病的药物，对治疗糖尿病有很好的效果。
综上，本发明的有益效果是，从木瓜乳汁中简便、低成本、高纯度地提取出了木瓜肽酶，并且木瓜肽酶是一种天然生物活性物质，采用该肽酶对卵白蛋白进行酶解，能够得到分子量约为500-1000的小分子寡肽和氨基酸，酶解率高，并且得到的小分子寡肽和氨基酸可以作为制备治疗肝病的药物使用，也能够进一步促进机体和皮肤的吸收。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明内容作出进一步的说明。在没有特殊说明下，操作方法都是采用的本领域技术人员公知的方法。
实施例一：(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；
(2)对(1)步酶解后的混合物加热，过滤去除未酶解的卵白蛋白残渣；
(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。
以下通过几种酶解的试验对比，对本发明选择木瓜肽酶作为酶解的溶媒进行说明，对比效果如下：
| 木瓜蛋白酶 | 酶解产物中8肽以下含量小于10％ |
| 木瓜凝乳酶 | 酶解产物中8肽以下含量20-30％％ |
| 木瓜肽酶 | 酶解产物中8肽以下含量大于50％ |
实施例二：发明公开的一种酶解卵白蛋白的方法，包括如下步骤，(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；
所采用的木瓜肽酶是用如下方法得到的：①将木瓜粉溶解于0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中；
②向①步混合液中加入硫酸铵，使混合液的饱和度达到0.45，放 置12-16h后抽滤，将上清液体用质量浓度0.1MNaCl溶液透析，这里的饱和度是指每1升中加入固体硫酸铵258克，饱和度正好达到0.45；
③将②步得到的透析液上柱CM-Sepharose，然后用质量浓度为0.05－1.0M NaCl溶液进行梯度洗脱，收集最后流出的液体，采用0.05－1.0M NaCl溶液进行梯度洗脱，梯度洗脱通常是采用自动梯度混合器，收集最后流出的组分；
④向③步得到的液体加入硫酸铵直至溶液饱和度达到0.85，这里的饱和度是指每1升中加入固体硫酸铵559克，正好使液体饱和度达到0.85，放置12-16h后抽滤，将得到的沉淀用质量浓度0.05M NaCl溶液透析。将透析液冷冻干燥即可得到木瓜肽酶粉末。
(2)对(1)步酶解后的混合物加热，去除未酶解的卵白蛋白渣滓；
(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。
本实施例中优选采用的提取木瓜肽酶的方法，提取率最高，以下仅列举出示例，来说明选择提取木瓜肽酶方法所进行的试验：
木瓜粉一般是木瓜乳汁干燥得到的，所以从木瓜乳汁会提取出多种不同种类的酶，以下仅列举出几种酶，对卵白蛋白酶解后的产物举例说明，进一步明确本发明选择木瓜肽酶为最合适的酶解反应物：
| 木瓜蛋白酶 | 酶解产物中8肽以下含量小于10％ |
| 木瓜凝乳酶 | 酶解产物中8肽以下含量20-30％％ |
| 木瓜肽酶 | 酶解产物中8肽以下含量大于50％ |
优选的，步骤(2)中卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水采用如下质量比100:5:1:2000进行混合，继而发生酶解反应。采用该质量比在成本最低的条件下，水解率较高，并且残渣较少，对比试验验证如下：
优选的，酶解最适温度为45-65℃，PH为6-7，酶解时间为12-24h。
优选的，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白残渣的具体方法为，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白残渣的具体方法为，酶解后将温度加热至90-100℃变性5-10分钟，将酶解产物过滤，得到上清液。
进一步的，步骤(4)灭菌的具体方法为，向经步骤(3)处理后的酶解产物中加入质量浓度为0.02-0.05％的抗氧化剂，搅拌均匀后，在温度为121-125℃条件下进行湿热灭菌，所采用的抗氧化剂为焦亚硫酸钠与维生素C按照质量配比10:0.5的混合物。
本发明还发现了经过本发明方法得到的酶解产物的新用途，一是可以作为制备治疗肝硬化药物的应用，以下借助选取的部分试验病例，说明酶解产物作为制备治疗肝硬化药物的治疗作用：
临床消化科60列肝硬化患者，其中男性42例，女性18例，随机分为两组，每组30例。一组为试验组服用酶解卵白蛋白，另一组为对照组服用蒸馏水。服用方法为每日3次，每次10毫升，疗程4周。服用期见停用利尿药，未输血及静脉注射白蛋白，以消除其对疗效的影响。最后综合评定疗效，结果见下表：
| 组别 | 显效 | 好转 | 无效 | 合计 |
| 实验组 | 16 | 9 | 5 | 30 |
| 对照组 | 2 | 4 | 24 | 30 |
验证结果发现本发明最后得到的酶解产物含有5肽的物质，这些 小分子的多肽有助于肝合成白蛋白，所以对于治疗肝硬化有良好的效果。
本发明得到的酶解产物二是还可以作为制备治疗肝炎药物的应用，以下列举出部分病例用以说明，酶解物作为制备治疗肝炎药物的治疗作用，选取50例肝炎患者，随机分为两组，每组25例。一组为试验组服用酶解卵白蛋白，另一组为对照组服用蒸馏水。服用方法为每日3次，每次10毫升，疗程4周。最后综合评定疗效，结果见下表：
| 组别 | 显效 | 好转 | 无效 | 合计 |
| 实验组 | 15 | 4 | 6 | 25 |
| 对照组 | 0 | 0 | 25 | 25 |
本发明酶解产物中8肽以下含量大于50％，其中5肽含量接近20％，这些小分子的多肽和氨基酸，对肝炎病毒有吞噬作用，并且能够通过合成肝白蛋白，起到修复组织作用。
最后，本发明的酶解产物还可以通过调节蛋白质的代谢，辅助治疗糖尿病，以下是酶解产物作为制备治疗糖尿病药物所起到的治疗作用的试验例：
糖尿病患者有糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱，特别是蛋白质分解代谢增加，多数有低白蛋白血症，容易出现感染。我们将26例糖尿病患者随机分为2组，一组为蒸馏水对照组。一组为酶解卵蛋白口服液治疗组。每日3次，每次20毫升，连续4周。结果表明，治疗组血浆总蛋白、白蛋白及球蛋白均有显著增加，对照组无变化，见下表：
与治疗前相比，**P＜0.01；*P＜0.05
实施例三：发明公开的一种酶解卵白蛋白的方法，包括如下步骤，(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；
所采用的木瓜肽酶是用如下方法得到的：①将木瓜粉溶解于0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中；
②向①步混合液中加入硫酸铵，使混合液的饱和度达到0.45，放置12-16h后抽滤，将上清液体用质量浓度0.1MNaCl溶液透析，这里的饱和度是指每1升中加入固体硫酸铵258克，饱和度正好达到0.45；
③将②步得到的透析液上柱CM-Sepharose，然后用质量浓度为0.05－1.0M NaCl溶液进行梯度洗脱，收集最后流出的液体；
④向③步得到的液体加入硫酸铵直至溶液饱和度达到0.85，这里的饱和度是指每1升中加入固体硫酸铵559克，正好使液体饱和度达到0.85，放置12-16h后抽滤，将得到的沉淀用质量浓度0.05M NaCl溶液透析。将透析液冷冻干燥即可得到木瓜肽酶粉末。
(2)对(1)步酶解后的混合物加热，去除未酶解的卵白蛋白渣滓；
(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。
本实施例中优选采用的提取木瓜肽酶的方法，提取率最高，以下仅列举出示例，来说明选择提取木瓜肽酶方法所进行的试验：
优选的，步骤(2)中卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水采用如下质量比100:10:2.5:2000进行混合，继而发生酶解反应。采用该质量比在成本最低的条件下，水解率较高，并且残渣较少，对比试验验证如下：
优选的，酶解最适温度为45-65℃，PH为6-7，酶解时间为12-24h。
优选的，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白渣滓的具体方法为，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白渣滓的具体方法为，酶解后将温度加热至90-100℃变性5-10分钟，将酶解产物过滤，得到上清液。
进一步的，步骤(4)灭菌的具体方法为，向经步骤(3)处理后的酶解产物中加入质量浓度为0.02-0.05％的抗氧化剂，搅拌均匀后，在温度为121-125℃条件下进行湿热灭菌，所采用的抗氧化剂为焦亚硫酸钠与维生素C按照质量配比10:1的混合物。
本发明还发现了经过本发明方法得到的酶解产物的新用途，一是可以作为制备治疗肝硬化药物的应用，以下借助选取的部分试验病例，说明酶解产物作为制备治疗肝硬化药物的治疗作用：
临床消化科100列肝硬化患者，其中男性52例，女性48例，随机分为两组，每组50例。一组为试验组服用酶解卵白蛋白，另一组为对照组服用蒸馏水。服用方法为每日3次，每次10毫升，疗程4周。服用期见停用利尿药，未输血及静脉注射白蛋白，以消除其对疗效的 影响。最后综合评定疗效，结果见下表：
| 组别 | 显效 | 好转 | 无效 | 合计 |
| 实验组 | 80 | 15 | 5 | 100 |
| 对照组 | 5 | 35 | 60 | 100 |
验证结果发现本发明最后得到的酶解产物含有5肽的物质，这些小分子的多肽有助于肝合成白蛋白，所以对于治疗肝硬化有良好的效果。
本发明得到的酶解产物二是还可以作为制备治疗肝炎药物的应用，以下列举出部分病例用以说明，酶解物作为制备治疗肝炎药物的治疗作用，选取500例肝炎患者，随机分为两组，每组250例。一组为试验组服用酶解卵白蛋白，另一组为对照组服用蒸馏水。服用方法为每日3次，每次10毫升，疗程4周。最后综合评定疗效，结果见下表：
| 组别 | 显效 | 好转 | 无效 | 合计 |
| 实验组 | 450 | 30 | 20 | 500 |
| 对照组 | 0 | 20 | 480 | 500 |
本发明酶解产物中8肽以下含量大于50％，其中5肽含量接近20％，这些小分子的多肽和氨基酸，对肝炎病毒有吞噬作用，并且能够通过合成肝白蛋白，起到修复组织作用。
最后，本发明的酶解产物还可以通过调节蛋白质的代谢，辅助治疗糖尿病，以下是酶解产物作为制备治疗糖尿病药物所起到的治疗作用的试验例：
糖尿病患者有糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱，特别是蛋白质分解代谢增加，多数有低白蛋白血症，容易出现感染。我们将100例糖尿病 患者随机分为2组，一组为蒸馏水对照组。一组为酶解卵蛋白口服液治疗组。每日3次，每次20毫升，连续4周。结果表明，治疗组血浆总蛋白、白蛋白及球蛋白均有显著增加，对照组无变化，见下表：
与治疗前相比，**P＜0.01；*P＜0.05
以上所述并非对本发明作出的限制，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)将卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水均匀混合，进行酶解反应,木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；
(2)对(1)步酶解后的混合物加热，过滤去除未酶解的卵白蛋白残渣；
(3)对步骤(2)处理后的酶解产物进行灭菌即可。
2.根据权利要求1所述酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)提取木瓜肽酶的方法为：①将木瓜粉溶解于0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液中；
②向①步混合液中加入硫酸铵，使混合液的饱和度达到0.45，放置12-16h后抽滤，将上清液体用质量浓度0.1MNaCl溶液透析；
③将②步得到的透析液上柱CM-Sepharose，然后用质量浓度为0.05－1.0M NaCl溶液进行梯度洗脱，收集最后流出的液体；
④向③步得到的液体加入硫酸铵直至溶液饱和度达到0.85，放置12-16h后抽滤，将得到的沉淀用质量浓度0.05M NaCl溶液透析；将透析液冷冻干燥即可得到木瓜肽酶粉末。
3.根据权利要求1所述的酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸馏水的质量比为100:5-10:1-2.5:2000。
4.根据权利要求1所述酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中酶解温度为45-65℃，酶解PH为6-7，酶解时间为12-24h。
5.根据权利要求1所述的酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)去除未酶解的卵白蛋白残渣的具体方法为，酶解后将温度加热至90-100℃变性5-10分钟，将酶解产物过滤，得到上清液。
6.根据权利要求1所述的酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)灭菌的具体方法为，向经步骤(3)处理后的酶解产物中加入质量浓度为0.02-0.05％的抗氧化剂，搅拌均匀后，在温度为121-125℃条件下进行湿热灭菌，所采用的抗氧化剂为维生素C与焦亚硫酸钠按照质量配比10:0.5-1的混合物。
7.权利要求1所述方法得到的酶解产物的应用，其特征在于，将该酶解产物作为制备治疗肝硬化、肝炎、糖尿病药物的应用。
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