CN109651489A - 一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109651489A
CN109651489A CN201811522980.6A CN201811522980A CN109651489A CN 109651489 A CN109651489 A CN 109651489A CN 201811522980 A CN201811522980 A CN 201811522980A CN 109651489 A CN109651489 A CN 109651489A
Authority
CN
China
Prior art keywords
groups
pasteurella multocida
yolk
capsular antigen
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811522980.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109651489B (zh
Inventor
张毓金
严悌昆
谢秉超
杨球
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Yue Yue Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Yue Yue Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Yue Yue Biotechnology Co Ltd filed Critical Guangdong Yue Yue Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811522980.6A priority Critical patent/CN109651489B/zh
Publication of CN109651489A publication Critical patent/CN109651489A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109651489B publication Critical patent/CN109651489B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2‑4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L‑抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。本发明所公开禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高，经济适用。

Description

一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法。
背景技术
禽多杀性巴氏杆菌病又称为禽霍乱，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，PM)引起的一种急性、接触性败血传染病，分布在世界各地，对养禽业的发展有着严重的影响，根据菌株间抗原成分的差异，多杀性巴氏杆菌分为多个血清型，近年来，A菌株为国内主要流行血清型。预防控制该病的最有效途径是疫苗免疫，目前国内外常用的禽巴氏杆菌病疫苗是灭活疫苗，但常规灭活疫苗免疫具有保护率较低约80％左右，免疫谱窄(只对同型菌株具有较好的保护)、保护期短，费用高昂等缺点。
卵黄抗体(IgY)是母禽被外来抗原刺激后，母禽血液中免疫球蛋白转移至其卵黄中对子代产生保护性作用的免疫球蛋白，是在卵黄内所产生的特异性抗体，其浓度远高于血清，并具有高度稳定性和生物学活性，这使应用卵黄抗体防病治病成为可能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纯度、收率高，活性强、易于制备与应用且经济的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明公开一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；
(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2-4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L-抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
所述步骤(3)优选蛋黄液与纯化水的体积比为1:3；搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及5％(m/v)的硫酸葡聚糖；低温放置温度为4℃，放置时间为3小时；低温离心条件为5℃11000r/min离心30分钟。
所述步骤(1)中的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗，其由禽巴氏杆菌标准菌种A群NCTC1502或C48-1制备，灭活疫苗含菌量最好大于1×1010CFU/m L。
本发明所公开禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高，L-抗坏血酸、丙二醇、硫酸葡聚糖的组合可在高浓度液体中有效去除蛋黄中的其它成分，蛋黄液不需要加入过多的纯化水稀释，制得的卵黄抗体液无需浓缩即有较高的浓度，极大的简化了操作流程，耗时短，操作全程都维持在较低的温度，良好的保留了所制备卵黄抗体的活力，且L-抗坏血酸及丙二醇毒性低，可应用于注射剂，无需额外除去残留即可使用。所得的卵黄抗体纯度高，活力好，并意外的可在胃肠道中保持较好的活性，免疫方式除注射给药，也可与饲料混合口服给药，均可提供较好的免疫保护，经济适用。
具体实施方式
以下通过具体实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
用于免疫的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗可采用市售或自行制备，自行制备可应用现有的常规方法，不影响发明效果的实现。以下实施例所用的免疫的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗采用如下方式制备：a)菌种采用禽巴氏杆菌标准菌种C48-1。将菌种接种于加3％灭能鸡血清的脑心浸出液培养基复壮，然后通过鸡体一次，此菌株用于制备荚膜抗原和作为免疫鸡后的攻击菌株；b)生长在加3％灭能鸡血清的脑心浸出液于37℃0～4小时培养的菌液5毫升，接种入盛有加3％灭能鸡血清的含0.2％葡萄糖的脑心浸液琼脂培养基的克氏瓶内，置37℃培养1 8小时。经纯检后，注入2.5％食盐冷溶液，刮取培养瓶中的菌苔，然后置56℃水浴1小时。离心收集上清液，置4℃等渗食盐溶液透析4 8小时，透析液通过0.45μm微孔滤膜除菌),浓缩冻干，得荚膜抗原A，使用时用2 0％氢氧化铝凝胶液配置得灭活疫苗(以菌数计含菌量约为1.5×1010CFU/m L)。
实施例1
制备方法：
(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1％(m/v)的L-抗坏血酸、4％(m/v)的丙二醇及3％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，8℃放置2h，8℃10000r/min离心20min，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
实施例2
制备方法：
(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为3％(m/v)的L-抗坏血酸、8％(m/v)的丙二醇及6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，2℃放置4h，5℃10000r/min离心30min，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
实施例3
制备方法：
(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及4％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，4℃，放置3小时；5℃11000r/min离心30分钟，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
实施例4
制备方法：
(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:3的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及5％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，4℃，放置3小时；5℃11000r/min离心30分钟，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
对比例1样品通过除步骤(3)不加L-抗坏血酸，其它操作同实施例4步骤所制备。
对比例2样品通过除步骤(3)中不加丙二醇，其它操作同实施例4步骤所制备。
对比例3样品通过除步骤(3)中加入4％(m/v)的L-抗坏血酸、10％(m/v)的丙二醇，不加入硫酸葡聚糖，其它操作同实施例4步骤所制备。
对比例4样品通过除步骤(3)中不加L-抗坏血酸、丙二醇，加入终浓度为13％(m/v)的硫酸葡聚糖，其它操作同实施例4步骤所制备。
本发明以上实施例所制备的益生菌复合微粒的试验测试结果如下：
1)以上实施例所制备的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的质量控制：根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》其进行无菌检验、支原体检验、外源性病毒检测，结果显示实施例样品均未检出。
2)以上实施例所制备的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的纯度检测：采用SDS-PAGE分别检测实施例1-4、对比例1-4制得的卵黄抗体纯度，结果显示，实施例的纯度高于对比例。
3)以上实施例所制备的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的安全性试验：选用健康鸡将其分为9组，每组6只，分别肌肉注射和饲料拌食口服给药实施例1-4【20mg(以干重量计)/kg】，剩余一组作为空白对照组。结果显示，各组试验小鸡的精神、食欲和饮欲均正常，注射部位皮肤和肌肉均无异常情况出现，在第7天进行解剖观察，内脏组织无明显的病变。表明本发明实施例1-4制备的卵黄抗体安全。
4)以上实施例所制备的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的免疫保护试验：取20日龄雏鸡180只，分为18组，每组10只。各组同步进行强毒攻击，攻毒株为禽巴氏杆菌标准强毒株C48-1，攻毒剂量为60cfu/只，分两次肌肉注射，每次30cfu/只，间隔1天，间隔日分别肌肉注射和饲料拌食口服给药实施例1-4及对照例1-4，对照组1注射生理盐水，对照组2空白。连续观察20天，统计各组卵黄抗体的保护率，结果显示实施例样品免疫保护效果优于对比例，具体见表1：
表1

Claims (8)

1.一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；
(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2-4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L-抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
2.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于，所述步骤(3)中蛋黄液与纯化水以1:3的体积比混合。
3.如权利要求1所述的所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)中搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及5％(m/v)的硫酸葡聚糖。
4.如权利要求1所述的所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)中低温放置温度为4℃，放置时间为3小时。
5.如权利要求1所述的所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)低温离心条件为5℃11000r/min离心30分钟。
6.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(1)中的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗，其由禽巴氏杆菌标准菌种A群NCTC1502或C48-1制备。
7.如权利要求6所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述灭活疫苗含菌量大于1×1010CFU/m L。
8.根据权利要求1-7任一所述方法制备的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体。
CN201811522980.6A 2018-12-13 2018-12-13 一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法 Active CN109651489B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811522980.6A CN109651489B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811522980.6A CN109651489B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109651489A true CN109651489A (zh) 2019-04-19
CN109651489B CN109651489B (zh) 2019-09-06

Family

ID=66113830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811522980.6A Active CN109651489B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109651489B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875673A (zh) * 2012-09-29 2013-01-16 天津市中升挑战生物工程有限公司 一种用于治疗多杀性巴氏杆菌病的卵黄抗体的制备方法
CN104415330A (zh) * 2013-09-11 2015-03-18 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法与应用
CN108373501A (zh) * 2018-04-08 2018-08-07 倪同艳 一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体
CN108721616A (zh) * 2018-09-05 2018-11-02 广东渔跃生物技术有限公司 一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875673A (zh) * 2012-09-29 2013-01-16 天津市中升挑战生物工程有限公司 一种用于治疗多杀性巴氏杆菌病的卵黄抗体的制备方法
CN104415330A (zh) * 2013-09-11 2015-03-18 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法与应用
CN108373501A (zh) * 2018-04-08 2018-08-07 倪同艳 一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体
CN108721616A (zh) * 2018-09-05 2018-11-02 广东渔跃生物技术有限公司 一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109651489B (zh) 2019-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105153303B (zh) 一种防治鸭细小病毒的卵黄抗体及其制备方法
CN107177001B (zh) 一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法
CN103585626B (zh) 一种鸡新城疫、法氏囊病二联复合灭活疫苗的制备方法
CN102617731A (zh) 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法和应用
CN105671003A (zh) 一种鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗yx10 d90株
CN103495167B (zh) 一种鸡传染性法氏囊病复合活疫苗的制备方法
DE69110997T2 (de) Haemophilus Paragallinarum-Impfstoffe.
CN102743751A (zh) 一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法
CN109207436A (zh) 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用
Timms et al. Laboratory and field trial assessment of protection given by a Salmonella Enteritidis PT4 inactivated, adjuvant vaccine
CN109651489B (zh) 一种禽巴氏杆菌荚膜抗原a群卵黄抗体的制备方法
IE51122B1 (en) Infectious-bronchitis vaccines for poultry,combined infectious-bronchitis vaccines,process for preparing such vaccines,method for preventing infectious bronchitis,and infectious-bronchitis virus strains
CN108465107A (zh) 一种鸭2型腺病毒和番鸭细小病毒病二联灭活疫苗
CN110590946B (zh) 一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法
CN108939063B (zh) 一种番鸭三联灭活疫苗
Finney et al. Studies with a bivalent infectious bronchitis killed virus vaccine
CN101293913A (zh) 一种抗鸡传染性支气管炎病毒转移因子的制备方法
JP4050312B2 (ja) ニワトリ貧血因子ブロイラーワクチン
CN102965344A (zh) 用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗
CN101717445B (zh) 一种卵黄抗体的制备方法
Ianconescu et al. Development of a new vaccine against turkey meningo‐encephalitis using a virus passaged through the Japanese quail (Coturnix coturnix Japonica)
CN102861333B (zh) 一种高活性抗鸡法氏囊病毒、流感病毒复合抗体口服制剂
Iritani et al. Biological activities of crude polysaccharide extracted from two different immunotype strains of Hemophilus gallinarum in chickens
Henning Calf paratyphoid II. Artificial immunization
CN105753949A (zh) 一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant