CN102920944A

CN102920944A - 疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用

Info

Publication number: CN102920944A
Application number: CN201210478230XA
Authority: CN
Inventors: 王放; 王鑫磊; 呼洁; 刘传贵; 刘建伟; 张宇; 李平亚; 李凡
Original assignee: HUAKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd JILIN
Current assignee: HUAKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd JILIN
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2013-02-13

Abstract

本发明涉及一种疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用，属于中药领域。疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用；疏清颗粒在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用；疏清颗粒在制备抗柯萨奇病毒A16型的药物中的应用。本发明证明其还具有治疗手足口病的功效，将为传统抗病毒中药的推广、以及有效地预防、治疗手足口病提供科学依据。

Description

疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，尤其是指疏清颗粒新的药物用途。

背景技术

疏清颗粒是目前正在使用的中药药物，它的处方是石膏950g，大青叶570g，桑叶570g，芦根570g，甘草190g；制备方法是：以上五味，取大青叶、芦根、桑叶、甘草，照流浸膏剂项下渗漉法（中国药典2010年版一部附录10），加65%药材量的75%乙醇浸渍72小时，以100ml/分钟流速渗漉，收集10倍药材量渗漉液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密度1.35~1.38（75℃）的清膏，再取石膏，加7倍药材量的水先煎煮20分钟后，加入浸渣，继续煎煮45分钟，共煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.35~1.38（75℃）的清膏，合并两清膏，搅匀，取清膏1份、糊精1份，混匀，制粒，干燥，制成1000个，即得。功能与主治：清热解毒，宣泄肺胃。用于小儿急性上呼吸道感染属风热证，证见：发热，鼻塞、咽痛、流涕、口渴、咳嗽、汗出、舌红或苔薄黄。用法与用量：口服，1岁以下，一次3g；1～3岁，一次6g；4～6一次9g；7岁以上，一次12g；一日3次。注意：宜饭后服用，禁与茶及含鞣酸类药合用，肝功严重损害者禁用；体弱者慎用。个别患者发生恶心、呕吐、腹泻。规格：每袋装6g。

手足口病是一种儿童传染病，又名发疹性水疱性口腔炎。多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃后形成溃疡为主要临床症状。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），其中以柯萨奇病毒A16型（Cox A16）和肠道病毒71型（EV71）为主。近年来手足口病的流行严重威胁了我国婴幼儿健康，鉴于手足口病重症病例的病死率逐渐上升，中华人民共和国卫生部已将其列入丙类管理的传染病。

Cox A16属小RNA病毒科肠道病毒属Ａ组肠道病毒成员，适合在湿、热的环境下生存与传播, 对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感, 75%酒精和5%来苏亦不能将其灭活, 但对紫外线及干燥敏感。各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒都能灭活病毒。Cox A16感染引起的手足口病由于症状轻微，合并症发生率低和自限性等特点而未得到足够的重视。近年有报道指出Cox A16感染可能与心肌炎、心包炎及其它严重疾病有关,甚至还可引起成人致死性肺炎。所以选择有效的抗Cox A16的药物及治疗迫在眉睫。相对于价格高昂、缺乏理想抗病毒活性的传统西药，选择价格低廉、药源广泛和不易产生抗药性的中药尤为需要。

发明内容

本发明提供一种疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用，以解决目前传统西药价格高昂、抗病毒活性不理想的问题。

本发明采取的技术方案是：疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用。

疏清颗粒在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用。

疏清颗粒在制备抗柯萨奇病毒A16型的药物中的应用。

本发明所述疏清颗粒的处方是石膏900~1000g，大青叶540~600g，桑叶540~600g，芦根540~600g，甘草170~210g；制备方法是：以上五味，取大青叶、芦根、桑叶、甘草，照流浸膏剂项下渗漉法（中国药典2010年版一部附录10），加65%药材量的75%乙醇浸渍72小时，以100ml/分钟流速渗漉，收集10倍药材量渗漉液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密度1.35~1.38（75℃）的清膏，再取石膏，加7倍药材量的水先煎煮20分钟后，加入浸渣，继续煎煮45分钟，共煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.35~1.38（75℃）的清膏，合并两清膏，搅匀，取清膏1份、糊精1份，混匀，制粒，干燥，制成1000个，即得。

本发明所述疏清颗粒的处方是石膏950g，大青叶570g，桑叶570g，芦根570g，甘草190g。

本发明抗病毒中药“疏清颗粒”具有清热解毒，宣泄肺胃之功效，用于小儿急性上呼吸道感染属风热证，证见：发热，鼻塞、咽痛、流涕、口渴、咳嗽、汗出、舌红或苔薄黄。价格低廉、药源广泛和不易产生抗药性等优点。本专利证明其还具有治疗手足口病的功效，将为传统抗病毒中药的推广、以及有效地预防、治疗手足口病提供科学依据。用法与用量：口服，1岁以下，一次3g；1～3岁，一次6g；4～6一次9g；7岁以上，一次12g；一日3次。注意：宜饭后服用，禁与茶及含鞣酸类药合用，肝功严重损害者禁用；体弱者慎用。个别患者发生恶心、呕吐、腹泻。规格：每袋装6g。

具体实施方式

本发明所述疏清颗粒的处方是石膏900~1000g，大青叶540~600g，桑叶540~600g，芦根540~600g，甘草170~210g；

本实施例优选的：

疏清颗粒处方是石膏950g，大青叶570g，桑叶570g，芦根570g，甘草190g；制备方法是：以上五味，取大青叶、芦根、桑叶、甘草，照流浸膏剂项下渗漉法（中国药典2010年版一部附录10），加65%药材量的75%乙醇浸渍72小时，以100ml/分钟流速渗漉，收集10倍药材量渗漉液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密度1.35~1.38（75℃）的清膏，再取石膏，加7倍药材量的水先煎煮20分钟后，加入浸渣，继续煎煮45分钟，共煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.35~1.38（75℃）的清膏，合并两清膏，搅匀，取清膏1份、糊精1份，混匀，制粒，干燥，制成1000个，即得。用法与用量：口服，1岁以下，一次3g；1～3岁，一次6g；4～6一次9g；7岁以上，一次12g；一日3次。

疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用。

疏清颗粒在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用。

疏清颗粒在制备抗柯萨奇病毒A16型的药物中的应用。

下面通过试验来进一步验证本发明的药效。

试验例1疏清颗粒对抗肠道病毒71型（EV71）的体外抗病毒研究

1 材料

1.1细胞横纹肌肉瘤(RD)细胞，吉林大学白求恩医学院分子病毒学实验室保存。细胞培养液分别为含2%、10%胎牛血清（GIBCO）的DMEM培养基（HyClone,批号：NXD0607）和无血清的DMEM液。

1.2病毒及检测试剂盒 EV71病毒为临床分离株，经本实验室分离和qPCR鉴定，使用前经RD细胞扩增，所有毒株均置－80℃保存备用。qPCR检测试剂盒：肠道病毒71型病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法），YZB/国 5939-2011。

1.3 药物疏清颗粒（吉林华康药业股份有限公司，批号：120602），板蓝根颗粒(南宁市维威制药有限公司，批号：120405)。两种药物均用无血清的DMEM培养液配制成质量浓度为100mg/ml，过滤除菌后做为储备液，4℃保存。

2方法

2.1 EV71半数组织培养感染量（TCID₅₀）的测定

超净台内将培养不超过7天，形态良好，生长旺盛的RD细胞，制成1×10⁵/ml细胞悬液，每孔100μl接种于96 孔板中，37℃，5% CO₂培养 24 h至细胞长成单层。生物安全柜内用无血清DMEM液进行10倍倍比稀释制备10^-1-10^-10共10个稀释度的病毒液接种于上述已准备好的细胞中，每个稀释度设3个复孔，每孔100μl，置于37℃，5% CO₂饱和湿度孵箱中继续培养。第 3天开始每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录细胞病变程度（CPE）。CPE判定标准: 无CPE，记录为( - )；0- 25% CPE，记录为( + )；25%-50% CPE，记录为( + + )；50%-75% CPE，记录为( + + + )；75% -100% CPE，记录为( + + + + )。第 7-8 天判定结果，按 Reed-Muench法计算TCID₅₀,判定公式为：

距离比例＝（高于50%病变百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变百分数）

TCID₅₀的对数＝高于50%病变的病毒最高稀释度对数＋距离比例×稀释系数的对数

2.2疏清颗粒和板蓝根颗粒的抗病毒作用及半数有效浓度(IC₅₀)的测定

设细胞空白对照、病毒对照、板蓝根颗粒阳性对照和疏清颗粒药物组,共4个组。在超净台中，将浓度为2×10⁵/ml的RD细胞悬液按每孔100μl接种于96孔板，37℃，5%CO₂培养 24 h，待细胞长成单层后弃去培养液，加入20μl100TCID₅₀的EV71病毒液感染细胞，吸附一小时后，洗去病毒液。板蓝根颗粒及疏清颗粒储备液经10倍倍比稀释为10-0.001 g·L^-1的5个浓度梯度，各孔加入不同浓度的中药100μl，孵育48小时，倒置显微镜观察药物对细胞病变的抑制作用后，弃去药液。每孔加5mg/mlMTT 10μl，继续培养4h后，弃去培养液，加DMSO每孔100μl溶解，用酶标仪测定各孔在波长492nm处吸光度值A₄₉₂。按下列公式计算药物对病毒的抑制率，并用Probit回归法计算药物抑制病毒的IC₅₀。

病毒抑制率=（A_492药物-A_492病毒）/(A_492正常-A_492病毒)×100%

2.3统计学方法

以上各实验重复3次，统计数据采用均数±标准差（x±s）表示，所得数据构成计量资料,采用t检验进行统计分析，P＜0.05为差异有显著性。

3.结果

3.1 EV71病毒经qPCR试剂盒检测，结果为阳性。

3.2 EV71 TCID₅₀的测定

EV71的TCID₅₀=10^-6.32

3.3疏清颗粒的抗病毒作用及半数有效浓度IC₅₀的测定

本研究采用MTT法检测药物的体外抗病毒效应，并计算疏清颗粒及对照药物不同浓度下的病毒抑制率及半数有效浓度IC₅₀，结果如表1所示。

表1 疏清颗粒体外抗EV71病毒作用

注：与对照组相比^*P＜0.05;

4.讨论

EV71是一种嗜神经组织性病毒，以其为主引起的手足口病是临床症状复杂、并发症严重的急性传染性疾病。重型病例主要并发脑炎、脑干脑炎等中枢神经系统(CNS)并发症，病死率高且逐年递升，严重危险着低龄儿童的生命及健康，引起社会广泛担忧。因此，在尚无有效疫苗及药物用于防治EV71感染的严峻现状下，研究有效的治疗药物迫在眉睫。

本研究从手足口病病例成功分离出EV71,并进行了qPCR鉴定，而且通过细胞病变效应(CPE)法及MTT法评价疏清颗粒和板蓝根颗粒的抗病毒作用。结果得出：疏清颗粒及对照药物板蓝根颗粒抗EV71的半数有效浓度IC₅₀分别为（0.136±0.022）和（0.199±0.016）g·L^-1,疏清颗粒组抗病毒效应显著高于对照组（P＜0.05），在体外具有抑制EV71增殖作用，这为疏清颗粒的临床应用提供了实验依据, 为进一步开发推广该药奠定了基础。

试验例2疏清颗粒抗手足口病病原体COXA16的体外研究

材料与方法

1、细胞

RD细胞，吉林大学白求恩医学院分子病毒学实验室保存。

2、柯萨奇病毒A16

临床分离株，经本实验室分离和Real-Time RT-PCR鉴定，使用前经RD细胞扩增，所有毒株均置－80℃保存备用。

3、药物与分组

实验组：疏清颗粒（吉林省华康药业股份有限公司，批号：120602000）

对照组：莲花清瘟胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，批号：111150）；板蓝根颗粒(南宁市维威制药有限公司，批号：120405)

4、研究方法

超净台内将培养不超过7天，形态良好，生长旺盛的RD细胞，制成细胞悬液，每孔100μl接种于96 孔板中，37℃，5% CO₂培养 24 h至细胞长成单层。生物安全柜内用无血清DMEM液进行10倍倍比稀释制备10^-1-10^-10共10个稀释度的病毒液接种于上述已准备好的细胞中，每个稀释度设3个复孔，每孔100μl，置于37℃，5% CO₂饱和湿度孵箱中继续培养。第 3天开始每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录细胞病变程度（CPE）。CPE判定标准: 无CPE，记录为( - )；0- 25% CPE，记录为( + )；25%-50% CPE，记录为( + + )；50%-75% CPE，记录为( + + + )；75% -100% CPE，记录为( + + + + )。第 7-8 天判定结果，按 Reed-Muench法计算TCID₅₀,判定公式为：

4.2疏清颗粒、连花清瘟胶囊、和板蓝根的细胞毒性作用

MTT方法检测疏清颗粒、连花清瘟胶囊和板蓝根对于增殖的细胞（用含10%血清的DMEM和0.01%抗生素培养液进行培养）所产生的细胞毒性作用。细胞铺于96孔板中（1×10⁴个细胞/孔），37℃孵箱培养过夜。加入不同浓度（50mg/ml-1.56mg/ml）的药物，每个浓度分别加3个孔，同时设置阴性对照孔，37度孵箱培养。之后，疏清颗粒和对照药物的细胞毒性测定按照MTT实验的说明进行。每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。终止培养，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD₄₉₂nm处测量各孔的吸光值。对相关数据得出的剂量曲线进行相关分析可以计算出对50%细胞产生毒性作用的浓度（CC₅₀）

4.3疏清颗粒和板蓝根颗粒的抗病毒作用及半数有效浓度(IC₅₀)的测定

设细胞空白对照、病毒对照、板蓝根颗粒阳性对照和疏清颗粒药物组,共4个组。在超净台中，将浓度为2×10⁵/ml的RD细胞悬液按每孔100μl接种于96孔板，37℃，5%CO₂培养 24 h，待细胞长成单层后弃去培养液，加入20μl100TCID₅₀的EV71病毒液感染细胞，吸附2小时后，洗去病毒液。板蓝根颗粒、连花清瘟胶囊及疏清颗粒储备液经10倍倍比稀释为10-0.001 g·L^-1的5个浓度梯度，各孔加入不同浓度的中药100μl，孵育48小时，倒置显微镜观察药物对细胞病变的抑制作用后，弃去药液。每孔加5mg/mlMTT 10μl，继续培养4h后，弃去培养液，加DMSO每孔100μl溶解，用酶标仪测定各孔在波长492nm处吸光度值A₄₉₂。按下列公式计算药物对病毒的抑制率，并用Probit回归法计算药物抑制病毒的IC₅₀。

病毒抑制率=（A_492药物-A_492病毒）/(A_492正常-A_492病毒)×100%

4.3 数据分析

研究结果

1、 CVA16病毒经Real-Time RT-PCR检测，结果为阳性

2、CVA16 TCID₅₀的测定

EV71的TCID₅₀=10^-6

3、疏清颗粒、连花清瘟胶囊和板蓝根的细胞毒性作用CC₅₀的测定

研究根据MTT法检测药物的细胞毒性作用。计算疏清颗粒、连花清瘟胶囊和板蓝根不同药物浓度下的细胞抑制率及半数毒性浓度CC50，结果如表2所示。

表2 疏清颗粒、莲花清瘟胶囊及板蓝根颗粒细胞毒性作用

注：*与莲花清瘟胶囊组相比，P<0.05；#与板蓝根颗粒组相比，P<0.05

4、疏清颗粒、莲花清瘟胶囊及板蓝根颗粒的抗病毒作用及半数有效浓度IC₅₀的测定

根据病毒增殖周期，本研究采用MTT法检测药物的抗病毒作用。计算疏清颗粒及板蓝根颗粒不同药物浓度下的病毒抑制率及半数有效浓度IC₅₀，结果如表3所示。

表3疏清颗粒、连花清瘟胶囊及板蓝根颗粒抗CVA16病毒作用

结论

体外抗CVA16实验结果表明，疏清颗粒能明显抑制CVA16引起的细胞病变效应。

Claims

1.疏清颗粒在制备抗手足口病病原体的药物中的应用。

2.疏清颗粒在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用。

3.疏清颗粒在制备抗柯萨奇病毒A16型的药物中的应用。

4.如权利要求1或2或3所述的疏清颗粒是由如下质量份数的原料制成的：石膏900~1000g，大青叶540~600g，桑叶540~600g，芦根540~600g，甘草170~210g。

5.如权利要求4所述的疏清颗粒是由如下质量份数的原料制成的：石膏950g，大青叶570g，桑叶570g，芦根570g，甘草190g。

6.如权利要求1或2或3所述的疏清颗粒的制备方法是：取大青叶、芦根、桑叶、甘草，照中国药典2010年版一部附录10流浸膏剂项下渗漉法，加65%药材量的75%乙醇浸渍72小时，以100ml/分钟流速渗漉，收集10倍药材量渗漉液，减压回收乙醇，并浓缩至75℃时测相对密度1.35~1.38的清膏，再取石膏，加7倍药材量的水先煎煮20分钟后，加入浸渣，继续煎煮45分钟，共煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至75℃时测相对密度1.35~1.38的清膏，合并两清膏，搅匀，取清膏1份、糊精1份，混匀，制粒，干燥，制成1000个。

7.如权利要求5所述的疏清颗粒的制备方法是：取大青叶、芦根、桑叶、甘草，照中国药典2010年版一部附录10流浸膏剂项下渗漉法，加65%药材量的75%乙醇浸渍72小时，以100ml/分钟流速渗漉，收集10倍药材量渗漉液，减压回收乙醇，并浓缩至75℃时测相对密度1.35~1.38的清膏，再取石膏，加7倍药材量的水先煎煮20分钟后，加入浸渣，继续煎煮45分钟，共煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至75℃时测相对密度1.35~1.38的清膏，合并两清膏，搅匀，取清膏1份、糊精1份，混匀，制粒，干燥，制成1000个。